Évaluation de Dictyostelium discoideum réponse à la Stimulation mécanique aiguë

Summary

Nous décrivons ici les méthodes d’évaluation de la réponse cellulaire à la stimulation mécanique aiguë. Dans l’analyse axée sur la microscopie, nous examinons la localisation des biocapteurs fluorescent marqué après stimulation brève avec un écoulement cisaillé. Nous testons également l’activation de différentes protéines d’intérêt en réponse à une stimulation mécanique aiguë biochimiquement.

Abstract

Chimiotactisme, ou la migration vers le haut une pente d’un facteur chimiotactique, est le mode le mieux compris de migration dirigée. Des études utilisant l’amibe sociale Dictyostelium discoideum a révélé qu’un réseau de transduction de signal complexe de voies parallèles amplifie la réponse à chimioattractants et mène à la polymérisation de l’actine biaisée et saillie d’un pseudopodes dans le direction d’un dégradé. En revanche, les mécanismes moléculaires conduisant des autres types de migration dirigée, par exemple, en raison de l’exposition pour cisailler des flux ou des champs électriques, ne sont pas connus. De nombreux régulateurs de la chimiotaxie pièce localisation à la tête ou bord de calorifugeage d’une cellule de migration, ainsi que montrent des changements transitoires localisation ou activation suite à la stimulation globale avec un facteur chimiotactique. Pour comprendre les mécanismes moléculaires d’autres types de migration dirigée, nous avons développé une méthode qui permet l’examen de la réponse cellulaire à la stimulation mécanique aiguë en bref (2 à 5 s) une exposition aux flux de cisaillement. Cette stimulation peut être livrée dans un canal tout en imagerie de cellules exprimant des biocapteurs fluorescent marqué afin d’examiner le comportement des cellules individuelles. En outre, la population de cellules peut être stimulée dans une assiette, lysées et l’immunoblotted en utilisant des anticorps qui reconnaissent les versions actives des protéines d’intérêt. En combinant les deux tests, on peut examiner un large éventail de molécules activées par des changements dans la localisation sous-cellulaire et/ou la phosphorylation. En utilisant cette méthode, nous avons déterminé que la stimulation mécanique aiguë déclenche l’activation des réseaux chimiotactique signal transduction et actine cytosquelette. La possibilité d’examiner les réponses cellulaires à la stimulation mécanique aiguë est importante pour comprendre les événements déclencheurs nécessaires pour la motilité induite par le flux de cisaillement. Cette approche fournit également un outil pour l’étude du réseau de transduction de signal chimiotactique sans l’influence de confusion du récepteur facteur chimiotactique.

Introduction

Migration des cellules eucaryotes est biaisée par divers indices physiques et chimiques dans l’environnement, y compris les gradients des chimioattractants soluble ou substrat-bondissent, rigidité variable des substrats, des champs électriques ou un écoulement cisaillé. Bien qu’il y a eu de nombreux progrès dans notre compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à la chimiotaxie, moins est connu sur les autres types de migration dirigée et comment ces divers signaux est intégrés au niveau cellulaire pour produire un unifié migrateurs réponse.

Réalisé la migration vers une concentration accrue d’un facteur chimiotactique comporte trois composantes comportementales : mobilité, détection directionnelle et polarité¹. Motilité fait référence au mouvement aléatoire des cellules en saillie de pseudopodes. Directionnel de détection est la capacité d’une cellule à détecter la source d’un facteur chimiotactique, qui peut se produire même en immobilisé les cellules. Polarité se réfère à la distribution asymétrique plus stable des composants intracellulaires entre le leader et le bord en retard d’une cellule, ce qui conduit à une persistance accrue en mouvement.

Réponse cellulaire à un facteur chimiotactique dépend de l’activité de quatre réseaux de régulation définis sur le plan conceptuel : récepteur / G protéines, transduction du signal, le cytosquelette d’actine et polarité¹. Chemoattractant liaison à des récepteurs couplés aux protéines G transmet le signal via heterotrimeric G protéines α et βγ au réseau de transduction du signal en aval, qui amplifie le signal directionnel. Des voies multiples au sein du réseau de transduction de signal en parallèle et alimentent le réseau de cytosquelette d’actine à la polymérisation de l’actine biais et saillie de pseudopodes qui en résulte, dans le sens du dégradé. Parmi les importants régulateurs de la chimiotaxie sont Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), phosphatase et tensine homologue (PTEN) et guanylyl cyclase. Mécanismes de rétroaction au sein du réseau de transduction de signal, ainsi qu’entre la transduction du signal et réseaux de l’actine cytosquelette encore amplifient la réponse. Enfin, le réseau de polarité mal définis reçoit l’entrée du cytosquelette d’actine et biaise davantage le réseau de transduction de signal pour promouvoir la migration persistante dans le sens du dégradé.

Une grande partie de notre interprétation mécaniste de la chimiotaxie a été rendue possible en raison du développement de biocapteurs fluorescent-étiquetées pour divers éléments des réseaux de régulation. Beaucoup de régulateurs de chimiotactisme ont une répartition asymétrique de la molécule de réglementation elle-même ou son activité. Par exemple, biocapteurs qui reconnaissent activé versions de petites GTPases Ras et Rap1 – domaines de liaison du Ras de Raf1 (dénommé RBD ici) et RalGDS, respectivement – localiser à la fine pointe de la cellule chemotaxing^2,3. De même, PI3K et son produit phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), reconnu par un domaine d’homologie (PH) pleckstrine, montrent également la localisation à l’avant d’une cellule^4,5. En revanche, un gène PTEN 3-phosphatase, qui reconvertit PIP3 phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, se localise au bord de la cellule⁶en retard de développement. Ce qui est important, ces biocapteurs changent leur localisation en réponse à la stimulation globale avec un facteur chimiotactique. Marqueurs pointe qui sont cytosoliques ou sur les conseils de saillies dans une cellule au repos, relocaliser au cortex, tandis que les balises de bord, qui ont une localisation corticale et sont absents à la traîne depuis le bout des protubérances dans une cellule au repos, devenir cytosolique après stimulation. Analyse de la distribution de biocapteur en réponse à la stimulation globale avec un facteur chimiotactique minimise la contribution de la motilité et de la polarité, qui confond souvent les observations. La stimulation globale ou uniforme d’une suspension de cellules avec un facteur chimiotactique est également utilisée comme un outil pour évaluer l’évolution de l’ensemble de la population dans l’activation de la protéine, souvent détecté par phosphorylation de protéines,^7,8,9 . Ce dosage biochimique est principalement utilisé pour obtenir des informations temporelles, alors que la microscopie sert à recueillir des informations spatiales et temporelles sur le comportement des diverses composantes des réseaux réglementaires.

Le réseau de transduction de signal comporte un système excitables^10,11. Réponses aux stimuli chimiotactiques supraliminaire sont « tout ou rien » et affichent les périodes réfractaires. Les réponses sont également déclenchés de manière stochastique et peuvent montrer des comportement oscillatoire. Événements de transduction de signal sont localisées aux régions du cortex qui se propagent en ondes^12,13,14,15. Avant, arrière, marqueurs sont recrutés à ou dissocient, les zones actives des propagation des ondes. En raison de la région réfractaire à la zone active, les vagues opposées dirigés anéantissement qu’ils se rencontrent. Les propagation des ondes de transduction du signal sous-tendent les protubérances cellulaires qui assurent la médiation cell migration¹⁰.

Une grande partie de l’information susmentionnée sur la chimiotaxie est venu des études sur l’amibe sociale Dictyostelium discoideum, bien que les mécanismes de réglementation semblables sont appliquent également aux neutrophiles et autres types de cellules de mammifères¹⁶ . Dictyostelium est un organisme modèle bien établi qui a une réponse chimiotactique robuste durant le jeûne, quand des milliers de cellules individuelles migrent vers un centre de regroupement, finissent par former une fructification multicellulaire contenant des spores. La chimiotaxie est également essentielle durant la phase de croissance de cellule unique de cet organisme pour localiser les sources de nourriture bactérienne. Ce qui est important, la migration des cellules individuelles de Dictyostelium est remarquablement similaire à la migration des neutrophiles chez les mammifères ou les cellules de cancer métastatique, qui subissent une très rapide de type amiboïdes migration. En fait, les deux la topologie globale des réseaux de régulation, ainsi que de nombreux des voies de transduction de signaux individuels impliqués dans la chimiotaxie sont conservées entre Dictyostelium et leucocytes mammifères¹⁷. Par ailleurs, les autres cellules, comme les fibroblastes, utilisent des récepteurs tyrosine kinase (RTK) au lieu de RCPG ; Cependant, RTK peut alimenter des réseaux similaires.

Contrairement à la chimiotaxie, manque de compréhension approfondie des mécanismes de signalisation qui animent les divers autres modes de migration dirigée. De la même façon aux cellules migrant dans un gradient chimiotactique plusieurs études ont rapporté l’activation et/ou la localisation des marqueurs typiques de pointe, y compris la polymérisation de l’actine, PIP3 et/ou kinase de signal-réglée extracellulaire (ERK) 1/2, à la face avant des cellules subissant dirigée migration en réponse à cisaillement des flux ou des changements dans les champs électriques^18,19,20,21. Toutefois, dans ces études une exposition continue au stimulus a aussi entraîné la migration cellulaire, laissant ouverte la question si, par exemple, les marqueurs pointe localiser spécifiquement en réponse à un stimulus, ou si elles Localisez simplement à la fine pointe en raison de l’augmentation du nombre des pseudopodes à l’avant d’une cellule de migration.

Nous avons développé des analyses qui nous permettent d’observer la réaction des cellules à des perturbations mécaniques Aigues livrée comme un écoulement cisaillé tant au niveau des populations et des cellules individuelles,²². Semblable à la stimulation globale avec un facteur chimiotactique, stimula aiguëtion avec le flux de cisaillement permet l’étude d’une réponse cellulaire à un stimulus mécanique sans la contribution confondant de motilité ou polarité. Combinant ces tests biochimiques et microscopiques avec des perturbations génétiques ou pharmacologiques nous permet d’apprendre sur des stimuli mécaniques comment sont perçus et transmis. En outre, cette approche fournit également une méthode originale pour puiser dans le système en aval du récepteur facteur chimiotactique en l’absence d’un facteur chimiotactique, isolant ainsi les réseaux signal transduction et l’actine cytosquelette du récepteur/G réseau de protéine.

À l’aide des techniques décrites ci-dessous, nous a récemment démontré que cette contrainte de cisaillement aiguë conduit à l’activation de plusieurs composants du signal chimiotactique transduction et l’actine cytosquelette réseaux²². En appliquant le stimulus mécanique aiguë à Vendranges, nous avons démontré que, de même pour chimioattractants, réponse aux stimuli mécaniques aussi pièces dispose d’un système nerveux, y compris le comportement de tout ou rien de la réponse sous conditions de saturation et la présence d’une période réfractaire. Enfin, en combinant la stimulation mécanique et chimique, nous avons montré que les deux stimuli partagent signal transduction et l’actine cytosquelette réseaux, permettant probablement pour l’intégration de multiples stimuli à la migration cellulaire biais.

Protocol

1. préparation des Solutions

1. préparer HL-5 médias utilisant ce qui suit : dextrose 10 g/L, peptone de 10 g/L de Protéose, extrait de levure 5 g/L, 0,965 g/L Na ₂ HPO ₄ ·7H ₂ O, 0,485 g/L KH ₂ PO ₄ et, sauf indication contraire, la streptomycine 0,03 g/L dans l’eau désionisée. Stériliser le milieu et conserver à température ambiante.
   Remarque : En raison des différences entre Protéose peptone et levure extrait acquis auprès de différents fournisseurs, ainsi qu’entre les lots individuels, pH des médias peut devoir être ajustée à la gamme typique de 6,4 à 6.7.
2. Plaques de préparer SM utilisant ce qui suit : dextrose 10 g/L, peptone de 10 g/L, 1 g/L extrait de levure, 2,31 g/L KH ₂ PO ₄, 1 g/L K ₂ HPO ₄ et agar de 20 g/L dans l’eau désionisée. Autoclaver, refroidir et verser 30 mL de la solution d’agar par 10 cm boîte de Pétri. Une fois que l’agar se solidifie, stocker les plaques à 4 ° C pendant environ 1 mois.
3. Préparer 10 x à l’aide du tampon Phosphate (PB) 13,4 g/L de Na ₂ HPO ₄ ·7H ₂ O et 6,8 g/L KH ₂ PO ₄ dans l’eau désionisée. Conserver le stock de 10 x à 4 ° C. diluer à 1 x avec l’utilisation d’eau déionisée.
4. Préparer DB tampon en ajoutant 1 X PB avec 2 mM MgSO ₄ et 0,2 mM CaCl ₂.
5. Préparer 100 mM de caféine dans l’eau désionisée. Conserver à la − 20 ° C.
6. Solution stock cAMP préparer 100 mM en dissolvant le sel de sodium cAMP monohydraté dans l’eau désionisée. Préparer un 1 mM travail stock dans l’eau désionisée. Stocker les deux solutions mères à − 20 ° C. préparer solution finale, cAMP à la concentration voulue en DB le jour de l’expérience.
   NOTE : Solutions mères peuvent être gel-dégel quelques fois.
7. Acide folique préparation 25 mM, 1 x PB. Ajouter quelques gouttes de NaOH N 1 jusqu'à ce que la poudre se dissout complètement. Conserver à la − 20 ° C.
8. Prépare 3 x solution tampon à l’aide de ce qui suit : 187,5 mM Tris-HCl de pH 6,8, 6 % (p/v) dodécylsulfate de sodium (SDS), 30 % de glycérol, 126 mM dithiothréitol et bleu de bromophénol 0,03 % (p/v). Aliquote et magasin à − 20 ° C.
   1. Avant d’utiliser, de fondre dans un bain-marie à 37 ° C et de continuer à préparer la solution tampon avec des inhibiteurs de protéase et phosphatase en diluant 3 x tampon échantillon à 1 x et en ajoutant 50 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO ₄, pyrophosphate de sodium 25 mM et 1 x complet sans EDTA inhibiteur de protéase cocktail dans l’eau désionisée. Ajouter les inhibiteurs immédiatement avant de commencer la procédure décrite dans les étapes 3.1.2-3.1.3.
9. Préparer 5 mM Latrunculine A solution dans le DMSO. Aliquote et magasin à − 20 ° C.

2. Préparation des cellules de d. discoideum

Remarque : maintenir les cellules de d. discoideum HL-5 médias soit en plaques de culture de tissus ou dans une suspension de la culture comme décrit précédemment ²³. Lorsque cela est nécessaire, transformation des cellules avec biocapteurs fluorescent marqué selon norme électroporation protocoles ²⁴. Diverses souches de d. discoideum, ainsi que plasmides codant des biocapteurs ou autres gènes d’intérêt peuvent être obtenus auprès du centre de Stock Dicty (dictybase.org).

1. Croissance et Collection de cellules végétatives discoideum d.
   1. pour l’analyse des cellules végétatives, la croissance de cellules en présence de bactéries à réduire le nombre de macropinosomes, qui sont généralement observées chez ²⁵ de cellules cultivées sur conditions axéniques.
      1. Prepare une culture de Klebsiella aerogenes en inoculant un petit nombre de cellules provenant d’un stock de glycérol ou d’une culture précédente dans le volume souhaité de HL-5 moyen sans antibiotiques. Incuber une culture bactérienne dans un agitateur orbital à 200 tr/min (0,42 x g) à température ambiante (20-22 ° C) pour les 16-18 h.
         Remarque : Le K. aerogenes souche utilisée ici est non pathogènes (voir la Table des matières).
   2. D. discoideum s’accumuler dans la phase de croissance exponentielle partir des plaques de culture de tissus ou d’une culture en suspension et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre selon fabricant ' instructions de s. Étaler 1 x 10 ⁵ cellules de d. discoideum avec 260 K. aerogenes µL de la suspension sur une plaque de SM. Tourner la plaque à l’envers vers le bas le lendemain. La croissance de cellules à température ambiante jusqu'à ce que les cellules de d. discoideum commencent à nettoyer la pelouse bactérienne, mais avant qu’ils commencent à agréger (~ 36-48 h).
   3. Recueillir les cellules de d. discoideum dans 5 mL DB tampon en les grattant avec un épandeur de verre. Cellules de transfert à un tube en polypropylène 50 mL. Rincez la plaque avec un autre tampon 5 mL DB et piscine avec la suspension originale. Remplir le tube de 50 mL de tampon DB.
   4. Centrifuger la suspension d. discoideum à 360 x g pendant 3-4 min. aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 50 mL tampon DB. Répétez les étapes de lavage jusqu'à ce que le liquide surnageant est clairement (environ 3 à 4 lavages). Resuspendre le culot cellulaire finale dans DB tampon à une densité finale de ~ 5 x 10 ⁶ cellules/mL.
2. Préparation de l’agrégation-cellules compétentes discoideum d.
   1. développer discoideum d. cellules de faim 1 h suivie de 4 h de famine et pulsé avec 50 cAMP nM toutes les 6 minutes selon la norme protocoles ²³.
   2. Développement, mesurer le dernier volume de suspension cellulaire.
   3. Basé sur le nombre initial de cellules utilisées pour le développement, calculer la densité des cellules de la suspension définitive.
      NOTE : Si le cAMP est livré dans 100 µL de volume toutes les 6 minutes, volume cellulaire augmente de 1 mL pour chaque heure de pulsation cAMP. Ainsi, les conditions standards à l’aide de 8 x 10 ⁷ cellules dans 4 mL de DB, le volume final est après 4 h de développement 7 mL et la densité finale est ~1.1 x 10 ⁷ cellules/mL.

3. Analyse biochimique de la réponse cellulaire à la Stimulation chimique ou mécanique

1. Aiguë mécanique Stimulation de cellules suivie par lyse cellulaire
   1. plaque de 2 x 10 ⁶ capables d’agrégation des cellules (de l’étape 2.2) après 4 h de développement dans les plats de 35 mm avec 2 mL DB. Laissez les cellules attacher pendant 10 min à température ambiante. Laver les cellules deux fois avec 1 mL DB. Incuber les cellules en DB à 2,5 mM de caféine pendant 30 min sans aucune perturbation des plaques.
      Remarque : Si les cellules ont besoin d’être traités avec un inhibiteur pharmacologique, ajouter la concentration désirée d’inhibiteur ou le même volume de véhicule approprié au cours de la basalation avec de la caféine.
   2. D’appliquer une stimulation mécanique, placer la plaque (un à la fois) dans un agitateur orbital et allumez-le immédiatement à 150 tr/min (0,24 x g) pendant 5 s.
      Remarque : La plaque peut également être manuellement stimulée par mouvement d’une manière transversal pour environ 5 s.
   3. Aspirer le tampon à la fois après le début de la stimulation. Immédiatement de lyser les cellules en ajoutant 100 µL de tampon échantillon avec les inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.
   4. Placer la plaque sur la glace et prélever le lysat dans un tube de 1,5 mL. Pour ' temps 0 ', lyser les cellules sans agitation. Transférer les tubes dans un bloc chauffant de 95 ° C pendant 10 min immédiatement après la lyse. Poursuivre l’immunotransfert ou stocker des lysats à -20 ° C.
2. Stimulation des cellules avec un facteur chimiotactique
   1. Basalate des cellules capables d’agrégation après 4 h de développement en les secouant rapidement en présence de caféine de 5 mM à 200 tr/min (0,42 x g) dans un agitateur orbital pendant 30 min.
      1. Centrifuger la suspension cellulaire à 360 x g pendant 3-4 min. aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL glacee DB tampon. Répétez l’étape lavage.
   2. Resuspendre le culot cellulaire finale dans glacee DB tampon à une densité finale de 4 x 10 ⁷ cellules/mL selon le nombre de cellule initiale utilisé pour développer les cellules (Voir l’étape 2.2). Garder la suspension cellulaire sur la glace avant stimulation.
      1. Pipette 50 µL de 10 cAMP µM ou d’un véhicule dans un gobelet en polystyrène placé dans un agitateur orbital.
   3. Pour stimuler les cellules, ajouter 450 µL de la suspension cellulaire glacée dans la même tasse et activer immédiatement le shaker à 200 tr/min (0,42 x g). À divers moments après le début de la stimulation (par exemple 10, 30, 45, 60, 120 s), brièvement arrêter le shaker, sortir 50 µL d’extraits de suspension cellulaire et lyser les cellules en les ajoutant aux tubes de 1,5 mL contenant 25 µL 3 X tampon échantillon.
      1. Pour ' temps 0 ', utiliser les cellules de la suspension cellulaire glacé non stimulées.
         Remarque : La température finale de la suspension cellulaire au cours de la stimulation est ~ 9 ° C ²⁶. Dans ces conditions, la réponse de crête se produit un peu plus tard que le pic observé pour la stimulation réalisée à température ambiante (par exemple, facteur chimiotactique stimulation des cellules adhérentes sur le microscope, ou une stimulation mécanique des cellules adhérentes).
   4. Les tubes de transfert à un bloc de chaleur de 95 ° C pendant 10 min immédiatement après la lyse. Poursuivre l’immunotransfert ou stocker des lysats à -20 ° C.
3. Analyse de la réponse des lymphocytes par immunotransfert
   1. exécuter lysats (à partir de mesures 3.1.3 ou 3.2.4) sur un gel de polyacrylamide de Tris-HCl de 4 à 15 %, le transfert à une membrane de fluorure de polyvinylidène, bloc et immunoblot avec phospho-PKC Ζ Thr410 (pour détecter la phospho-PKBR1 et phospho-PKBA). Détecter le signal par incubation avec raifort-couplé à la peroxydase anti-lapin anticorps secondaire, suivie par chimiluminescence en utilisant des substrats de chimiluminescence améliorée.
   2. Pour la détection de plusieurs protéines, enlever la tache avec du tampon de décapage et re-tester avec un anticorps primaire contre la phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (pour détecter les phospho-ERK2). Confirmer la protéine égal chargement par coloration de la membrane de fluorure de polyvinylidène avec brillant bleu de Coomassie.

4. Aiguë une Stimulation mécanique et vivre d’imagerie de cellules individuelles sur le Microscope

1. évaluation de la réponse à la stimulation mécanique aiguë à l’aide d’un dispositif d’écoulement
   1. recueillir et diluer végétative ou capables d’agrégation cellules à ~ 1 x 10 ⁶ cellules/mL dans DB comme décrit aux points 2.1 et 2.2, respectivement. Chargez ~ 600 µL dans la diapositive avec un canal (voir la Table des matières pour plus de détails). Permettre à cellules à attacher pour 10 min., s’assurer que toutes les entrées dans la diapositive soient complètement remplis. Haut de la page vers le haut avec un tampon supplémentaire si nécessaire.
      Remarque : La diapositive particulière utilisée pour l’analyse dispose de trois entrées, qui alimentent les canaux étroits, 1 mm, mais ensuite fusionnent vers un canal large, 3 mm. La hauteur du canal est de 0,4 mm. Bien que les cellules sont plaqués tout au long de la chaîne, seule la partie large est imagée.
   2. Passer une des lignes qui est attaché à un réservoir de 50 mL par le biais de la valve droite avant de l’appareil fluidique (voir la Table des matières pour plus de détails). En utilisant le logiciel pour la pompe, assurez-vous que la vanne est fermée (c'est-à-dire vers la gauche). Remplissez le réservoir avec DB.
      1. Régler la pression à 50 mbar et allumez-le. Remplir et rincer la ligne avec DB en cliquant sur la vanne pour l’ouvrir. Mettez la pression à 0 et fermer le robinet après ~ 30 s.
   3. Connecter la ligne à l’un trois prises d’un côté de la glissière de sans piégeage de bulles d’air. Branchez les deux autres entrées. Raccorder la ligne de la canalisation à l’entrée unique sur le second côté de la glissière.
      NOTE : Les tubes utilisés pour les lignes d’entrée et d’évacuation dans cette configuration ayant un diamètre intérieur de 1,6 mm.
   4. Placer la lame sur le microscope dans un objectif d’air 20 X. Pour rincer le canal, basculer la valve pour ouvrir la ligne, puis cliquez sur " la pression ON ", en commençant à pression plus élevée (~ 50 mbar soit ~ 40 dynes/cm ²) pour faire passer le liquide dans le drain.
      1. Une fois que le liquide sort de l’égout, réduire la pression externe à zéro (i.e. gravité flow seulement, 15 ~ dyn/cm ²) et continuer à rincer pour ~ 30 s. commutateur la vanne sur la position inverse pour arrêter l’écoulement.
   5. Acquérir des images avec un éclairage DP ou GFP sur un microscope à fluorescence inversé sous un 40 X objectif à huile à intervalles de 3 s. La vanne en position fermée, allumez la pression à la pression désirée, généralement entre 15 et 40 dynes/cm ² (0 - 50 mbar).
   6. Après l’acquisition de 5 images, livrer le stimulus en changeant le robinet à le " ouvert " position. Désactiver le flux après 2 à 5 s de la vanne de commutation dans la direction opposée.
      Remarque : Pour certains biocapteurs plus faibles (p. ex. PTEN, CynA et RalGDS), il peut être nécessaire aux cellules d’image à l’aide d’un microscope confocal, équipé d’un 40 X objectif huile.
2. Testing effets des inhibiteurs pharmacologiques en réponse à une stimulation mécanique aiguë à l’aide d’un dispositif d’écoulement
   1. plaque de cellules dans la diapositive avec un canal comme indiqué au point 4.1.1. Mis en place deux lignes : passer d’une ligne à travers la valve droite avant comme au point 4.1.2, et la deuxième à l’arrière gauche de vanne. Serrer la ligne gauche puis remettre le clapet dans le " fermé " position (à gauche). Remplir une seule ligne avec DB contenant le véhicule approprié et le second avec la solution contenant un inhibiteur pharmacologique d’intérêt (p. ex. 5 µM Latrunculine A).
      Remarque : Il est nécessaire de bloquer physiquement la ligne gauche parce que le " fermé " position gauche ouvre la vanne pour cette ligne.
   2. De remplissage et rinçage le droit ligne en agissant sur la pression à 50 mbar, la vanne de commutation le " ouvert " position (à droite). Passer la valve vers la gauche après la ~ 30 s. remplissage et rincer la ligne gauche en enlevant la bride pour ~ 30 s. Branchez les deux lignes à deux des prises d’un côté de la lame avec un canal de, brancher l’entrée restante et raccorder le drain à l’entrée unique sur le deuxième côté. < / l J’ai >
   3. laver la lame avec la mémoire tampon dans la ligne droite et effectuer une stimulation dans le même tampon comme décrit aux étapes 4.1.3 et 4.1.4 ci-dessus.
      Remarque : Bien que la ligne droite a été choisie comme la première condition dans cette configuration, l’ordre a pu être renversé.
   4. Après une stimulation, basculer la valve pour ouvrir la ligne droite à pression nulle (c'est-à-dire par écoulement gravitaire seulement, 15 ~ dyn/cm ²). Retirez la pince de la ligne gauche et basculer la valve vers la gauche pour ouvrir cette ligne. Fixez la première ligne.
   5. Après l’exécution de 3 à 5 mL de tampon avec inhibiteur via, basculer la valve vers la droite pour arrêter l’écoulement et incuber les cellules avec l’inhibiteur pour la durée requise (par exemple 15 min). Allumez le flux en changeant la vanne toutes les ~ 10 min pour ~ 15 s pour prévenir la carence en oxygène. Répéter une stimulation avec la deuxième ligne.
3. Autre méthode permettant d’évaluer la réponse à la stimulation mécanique aiguë à l’aide d’une micropipette
   1. mis en place une micropipette remplie de DB selon le protocole standard ²³. Maintenir la pression de compensation à 1 500 lb/po2.
   2. Collecte et diluer les cellules végétatives, tel que décrit à l’étape 2.1. Place 25 gouttes µL de ~7.5 x 10 ⁵ cellules/mL dans une chambre 1 cupule, laisser adhérer pendant au moins 10 min, puis couvrir avec 3 mL DB.
   3. Placer la chambre sur un microscope à fluorescence inversé équipé d’un objectif de huile 40 X. Localiser les cellules. Abaissez doucement la micropipette au milieu du champ de vision jusqu'à ce qu’il touche tout d’abord le fond de la chambre.
      Remarque : Étant donné que la pression de l’indemnisation a été fixée à 1 500 lb/po2, les cellules seront continuellement exposés à un débit très lent de DB de la micropipette.
   4. Commencer à acquérir des images avec un éclairage DP ou GFP à intervalles de 3 s. Appliquer la ' Clean ' fonction de libérer un bolus de liquide de la micropipette. Continuer j’ai imagingn la présence de l’écoulement dû à la pression de compensation seule.
4. Une autre méthode pour évaluer la réponse à la stimulation mécanique aiguë avec addition de tampon en vrac
   1. recueillir et diluer les cellules végétatives, tel que décrit à l’étape 2.1. Placer 20 gouttes µL de cellules à ~ 1 x 10 ⁶ cellules/mL dans DB au milieu d’un puits d’une chambre de 8 puits. Permettre aux cellules d’adhérer pour au moins 10 min.
   2. Commencer à acquérir des images avec un éclairage spécifiques DP ou GFP sur un microscope à fluorescence inversé équipé d’un objectif X 40 à intervalles de 3 s. Se concentrer sur une zone près du bord de la goutte.
   3. Ajouter rapidement 430 µL de DB sur le côté du puits. Continuer d’imagerie.
   4. Pour l’analyse de l’interaction entre les stimuli mécaniques et chimiques, s 12 ou 45 suite à une stimulation mécanique, doucement ajouter 50 µL de l’acide folique (concentration finale 20 nM) ou d’un véhicule (DB) sans induire une réponse mécanique. Continuer d’imagerie.
5. Quantification of Response
   1. Ouvrez l’image TIFF 32 bits dans le logiciel d’analyse de l’Image (voir Table des matières pour plus de détails) ²⁷.
   2. Sous la ' Analyze ' onglet, allez à " la valeur des mesures ". Cochez la case pour ' signifie la valeur de gris '. Assurez-vous que les autres cases ne sont pas vérifiées. Cliquez sur " OK ".
   3. Sous la ' processus ' l’onglet, cliquez sur " soustraire fond ". Garder le rayon roulement de balle à 50 pixels et ne pas cocher les options répertoriées dans le menu. Zoom sur une cellule en utilisant la ' loupe ' outil.
   4. Using le ' Rectangle ' tool, dessiner une case (~2.5 x 2,5 µm ²) dans le cytosol, en veillant ne pas à dessiner sur le noyau ou de la membrane plasmique. Presse " Ctrl " + " M " touches ou aller à la ' Analyze ' onglet et cliquez sur " mesure " pour déterminer la valeur de gris moyenne de la boîte. Avance à trames suivantes et mesure encore une fois, s’assurer que la zone reste dans le cytosol.
      NOTE : Puisque les cellules de d. discoideum se déplacent très rapidement la boîte peut être déplacée d’une image à l’autre pour le garder dans le cytosol.
   5. Après tout des cadres ont été analysées, copier les valeurs dans une feuille de calcul. Pour tenir compte de la variation de la cellule-cellule dans les niveaux d’expression des différents biocapteurs, normaliser les valeurs pour la valeur de gris moyenne observé au temps 0. Calculer l’inverse des valeurs pour tenir compte de l’accumulation du signal sur le cortex.

5. Continue une Stimulation mécanique et vivre d’imagerie de cellules individuelles sur le Microscope

1. mis en place les cellules exactement tel que décrit ci-dessus pour l’analyse de la stimulation mécanique aiguë en étapes 4.1.1 - 4.1.3. Ouvrez la fiche couvrant le réservoir avec le tampon, donc le volume peut être surmonté si la réponse est analysé pendant plus de quelques minutes à la fois.
   NOTE : Parce que le réservoir reste ouvert pendant la durée de l’expérience, ce test se déroule en l’absence de pressions extérieures et s’appuie sur l’écoulement par gravité seul. Pour augmenter la vitesse d’écoulement par gravité, le drain peut être placé sur une table sous le microscope.
2. Commencer d’imagerie de cellules avec illumination DP ou GFP spécifiques sur un microscope à fluorescence inversé équipé d’un objectif X 40 à intervalles de 3 s pour l’analyse des réponses du biocapteur. Sinon, l’image à contraste de phase en utilisant un objectif 20 X à intervalles de 10 s pour l’analyse de la migration cellulaire globale.
3. Activer le flux après plusieurs trames lors du réglage de la pression zéro (c'est-à-dire de flux est en raison de la gravité seule ou ~ 15 dynes/cm ²) en basculant la vanne sur la position ouverte. Lorsque le niveau du liquide descend à 5-10 mL dans le réservoir, remplir avec plus de mémoire tampon. N’oubliez pas d’ajouter du liquide avec soin afin de bulles d’air ne pas être coincés dans les lignes.
   Remarque : Il est important d’ajouter le liquide de la même température afin d’éviter une réaction de choc dans les cellules.
4. Quantifier la vitesse de la cellule et de la persistance à l’aide du logiciel d’analyse de migration (voir la Table des matières pour plus de détails) selon fabricant ' instructions de s.

Representative Results

Réponse temporelle des régulateurs de la chimiotaxie à la stimulation mécanique aiguë

Pour évaluer la réponse des cellules de d. discoideum à la stimulation mécanique, cellules capables d’agrégation adhérentes ont été exposés à une brève impulsion d’un écoulement cisaillé. Discoideum capables d’agrégation D. cellules sécrètent le cAMP, qui pour être perçu par les cellules voisines. Pour remédier à la contribution de la signalisation de cellules, les cellules ont été traitées avec de la caféine, qui inhibe l’adénylate cyclase chez d. discoideum et empêche ainsi la sécrétion cAMP²⁸. En effet, les cellules prétraitement avec caféine avaient de très faible activité basale de PKBR1 et ERK2 et ont montré une augmentation robuste dans la phosphorylation des résidus clés de ces kinases après 5 s stimulation avec flux de cisaillement (Figure 1 a). La réponse était transitoire et a atteint un sommet autour de 10-15 s pour PKBR1 et près de 30 s pour ERK2, de même précédemment publié les conclusions pour l’activation de ces protéines avec un facteur chimiotactique⁷.

Bien qu’il soit difficile d’évaluer l’efficacité de la réponse étant donné le faible niveau basal, des études préliminaires qui ont conduit à l’élaboration de ce test, comparé la stimulation avec un écoulement cisaillé seul (ou avec un véhicule) à cisaillement flux en présence d’un cAMP chemoattractant (Figure 1 b). Cette analyse ne montre pas une augmentation de la réponse du camp, ce qui suggère que la réponse du réseau de transduction de signal aux flux de cisaillement est saturée. Bien que ce test cAMP n’a pas augmenté la phosphorylation de PKBR1, réponse des cellules à facteur chimiotactique peut être observé en utilisant un protocole de stimulation standard où cellules capables d’agrégation sont maintenus en suspension, stimulée avec le cAMP et lysées à diverses suite à la stimulation des points de temps. Comme le montre la Figure 1, dans ces conditions il y a une augmentation transitoire de la phosphorylation de PKBR1 en réponse à chemoattractant, mais pas de véhicule. La réponse de crête est observée à 30 s dans ce test car la température de la suspension cellulaire au cours de l’essai est d’environ 9 ° C, comparativement à ~ 22 ° C pour l’analyse de la stimulation mécanique décrite ci-dessus²⁶.

Spatio-temporelle réponse de capacitive et inductive des balises de bord à la stimulation mécanique aiguë

Étant donné que le dosage de la population ci-dessus fournit uniquement des informations temporelles sur le comportement des régulateurs de la chimiotaxie, cellules ont également été exposés à un bref stimulus mécanique tout en étant observé au microscope. Ce dosage peut être effectué avec capables d’agrégation ou végétative discoideum d. cellules exprimant différents biocapteurs fluorescent marqué dont la localisation a été définie dans les cellules stimulées avec un facteur chimiotactique. Deux marqueurs de bord d’attaque, domaine de PH du Crac et la chaux_Δcoil, qui sont recrutés par PIP3 ou actine nouvellement polymérisés, deux ont montré essentiellement localisation cytosolique dans les cellules au repos comme indiqué précédemment (Figure 2 a, supplémentaire Movie 1 )^4,29. Dans les cellules qui étaient actives à la base, ces biocapteurs voyait également sur les conseils des pseudopodes. Suite à la stimulation avec un écoulement cisaillé pendant 2 s, les biocapteurs relocalisées rapidement vers le cortex avec un pic à environ 6 à 10 s et retourné dans le cytosol par ~ 30 s. En revanche, un marqueur de bord traine PTEN localisée dans le cortex avant la stimulation (Figure 2 a). Après une brève impulsion avec un écoulement cisaillé, cytosolique PTEN intensité a augmenté, quoique avec une dynamique plus lente que pour les bord d’attaque de biocapteurs. Un changement de localisation de biocapteur du cytosol vers le cortex et vice versa, est clairement visible comme un changement dans l’intensité cytosolique permettant la simple quantification de la réponse.

Le comportement observé de le biocapteurs en réponse à une stimulation mécanique aiguë correspond à capacitive et inductive dynamique de localisation de bord en réponse à une stimulation par chemoattractant uniforme. Ce comportement n’était pas unique pour les trois biocapteurs montrés. Comme les modifications publiées précédemment, semblables dans la localisation ont aussi été observées pour les marqueurs pointe RBD et RalGDS, qui reconnaissent activé Ras et Rap1, respectivement, ainsi que pour un autre marqueur de bord traine CynA^22,30.

Un test similaire peut servir à évaluer les effets de divers inhibiteurs par une simple modification de l’installation expérimentale d’une seule ligne d’entrée à un double. En utilisant cette méthode, les cellules peuvent être tout d’abord exposés à des conditions de contrôle et puis passer à la mémoire tampon qui contient l’agent de test désiré. Par exemple, ajout de drogues actine-dépolymérisation LatA bloqua la réponse de RBD, ainsi que de la chaux_Δcoil, à la stimulation mécanique aiguë (Figure 2 b).

Réponse globale précède la migration cellulaire sous une stimulation prolongée avec un écoulement cisaillé

L’approche décrite ici pourrait également être adapté pour étudier les effets du flux de cisaillement sur les migrations de d. discoideum . En fait, si le flux n’était pas éteint après 2 s mais est resté pendant la durée de l’expérience, les cellules végétatives ont réalisé des migrations à contre-courant (Figure 32 de film supplémentaire). Il est à noter que le flux de cisaillement nécessaire pour déclencher une réponse migratoire était inférieur à la pression qui était généralement utilisée pour obtenir une réponse globale avec une stimulation aiguë dans les cellules végétatives (par exemple, comme indiqué dans la Figure 2 b). Cependant, même à la pression, cellules affichent une réponse uniforme robuste, tel que mesuré par un changement de localisation de_Δcoil de chaux, qui a précédé de tout changement dans la position de la cellule elle-même. Ainsi, ces expériences ont montré clairement que 1) la riposte ne dépend pas du mouvement de la cellule et qui précède le 2) la réponse globale migration dirigée.

Approches alternatives de tester la réponse à la stimulation mécanique aiguë

Bien que l’utilisation d’une chambre intermédiaire présente des avantages évidents pour l’étude de la réponse à la stimulation mécanique aiguë, nous avons validé également deux essais supplémentaires pour tester la réponse des cellules individuelles à la stimulation mécanique aiguë. Comme illustré à la Figure 4, chaux_Δcoil rapidement et transitoirement re-localisés du cytosol vers le cortex lorsque les cellules sont stimulées par l’addition de bolus de tampon envoyées soit par une micropipette (Figure 4 a) ou manuellement à l’aide de bulk addition de tampon avec une pipette (Figure 4 b). Il est à noter qu’un désavantage évident des deux de ces essais est que le montant exact de la force de cisaillement à la cellule est inconnu et ne peut pas être modifié facilement. Toutefois, pour les situations où la commutation entre les stimuli mécaniques et chimiques est souhaitée, addition de tampon en vrac offre une alternative solide à la stimulation dans le dispositif d’écoulement.

Figure 1 : représentant des résultats pour une évaluation biochimique de la réponse des cellules de d. discoideum à une stimulation mécanique ou chimique aiguë. Cellules capables d’agrégation ont été exposés à des stimuli mécaniques ou chimiques, lysées à des points de l’heure indiquée, et immunoblotted en utilisant des anticorps qui reconnaissent phosphorylé PKBR1 ou ERK2. (A) les cellules adhérentes sont stimulées dans un agitateur orbital pendant 5 s. La membrane était tachée avec Coomassie brillant bleu (CBB) pour montrer la protéine égal chargement. (B) les cellules adhérentes ont été stimulées par la manœuvre manuelle de la plaque d’une manière transversal qui suit environ 5 s la stimulation chimique en raison de l’ajout de cAMP de 1µm ou tampon (véhicule), ou sans aucune stimulation chimique (-). L’immuno-deux Blot montre l’ampleur de la variation dans l’activation basale de PKBR1 vu au temps 0. Occasionnellement, activation de PKBA pourrait aussi être détectée par cette technique, tel qu’indiqué dans le panneau inférieur. (C) Suspension cellules sont stimulées avec cAMP de 1µm ou tampon (véhicule). De Lara et al., partie (A) de cette figure a été modifiée. (2016) ²². s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : représentant entraîne une stimulation mécanique aiguë et direct d’imagerie de cellules uniques sur le microscope. (A) agrégation-compétente discoideum d. cellules exprimant chaux DP-le tag_Δcoilou GFP-étiquetée PH-Crac ou PTEN ont été stimulées avec unidirectionnel flux laminaire à 15 dynes/cm² pour 2 à 5 s. Images ont été recueillies toutes les 3 s . Représentant cellules montrant la translocation des biocapteurs en réponse à une stimulation mécanique sont indiqués. Accumulation de chaque biocapteur au cortex a été quantifiée comme l’inverse de l’intensité cytoplasmique moyenne normalisée pour le temps 0. La réponse moyenne de 18 (chaux_Δcoil), 20 (PH-Crac) ou 6 cellules (PTEN) s’affiche. Valeurs sont moyennes ± SE. (B) les cellules végétatives exprimant la chaux DP-le tag_Δcoil- DP et GFP-étiquetée RBD ont été traités avec le véhicule ou 5µm LatA pendant au moins 15 minutes et puis stimulées avec unidirectionnel flux laminaire à 41 dynes/cm² pour 2 s. images ont été prélevés tous les 3 s. RBD-GFP et LimE_ΔcoilDP - accumulation dans le cortex a été quantifiée que dans (A). Les valeurs sont des moyennes ± SE. Le nombre de cellules analysées est indiqué à côté de chaque condition. Echelle = 10 µm. Ce chiffre a été modifié par Lara et al. (2016) ²². s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Représentant résulte de la réaction des cellules de d. discoideum à une stimulation prolongée avec écoulement. (A) les cellules végétatives exprimant la chaux DP-le tag_Δcoil ont été exposés à continu unidirectionnel flux laminaire à 15 dynes/cm² et imagés chaque 3 pistes s. 11 cellules sont indiqués en (B). Echelle = 10 µm. Ce chiffre a été modifié par Lara et al. (2016) ²². s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : représentant les résultats d’approches alternatives aux essais de réponse à une stimulation mécanique aiguë. (A) végétative discoideum d. cellules exprimant la chaux DP-le tag_Δcoil ont été exposés à une micropipette (*) à la base libérant du tampon d’essai à un rythme lent. Une brève augmentation de débit a été réalisée par la diffusion rapide d’un bolus de tampon au temps 0. Des images ont été recueillies chaque 3 cellules de végétative discoideum d. s. (B) exprimant la chaux DP-le tag_Δcoil plaqué comme une petite goutte dans une chambre de microscopie sont stimulées mécaniquement par addition d’un grand volume de tampon à la chambre. Des images ont été recueillies toutes les 3 s. échelle bar = 10 µm. partie (A) de cette figure a été modifié par Lara et al. (2016) ²². s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Film supplémentaire 1 : Stimulation mécanique aiguë déclenche une translocation rapide et transitoire de chaux_Δcoil- DP ou PH-Crac-GFP du cytosol vers le cortex en capables d’agrégation discoideum d. cellules exprimant ces biocapteurs. Unidirectionnel flux laminaire a été activée pour 5 s au temps 0 et les cellules ont été photographiés à intervalles de 3 s. Vitesse de lecture est de 5 images/s. Deux exemples pour chaque ligne de la cellule sont affichés. Echelle = 10 µm. Ce film correspond à la Figure 2 a et a été modifié par Lara et al. (2016) ²². s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 2 : Une stimulation mécanique continue déclenche une translocation rapide et transitoire de chaux_Δcoil- DP du cytosol vers le cortex avant la migration des cellules dans le sens inverse de l’écoulement. Les cellules végétatives exprimant la chaux_Δcoil- DP ont été exposés à la contrainte de cisaillement continue à 15 dynes/cm² , commençant au temps 0 et imagés à intervalles de 3 s. Vitesse de lecture est de 10 images/s. échelle bar = 10 µm. Ce film correspond à la Figure 3 et a été précédemment publié dans Lara et al. (2016) ²². s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les méthodes décrites ici offrent un moyen pratique d’évaluer tant la population que les comportement de cellules individuelles en réponse flux de cisaillement. Ce qui est important, alors que des études antérieures analysé localisation de capacitive et inductive des balises de bord pendant la migration, l’approche actuelle permet les effets immédiats en appliquant le flux de cisaillement aiguë. En utilisant cette méthode, nous avons démontré que, en fait, la réponse initiale de cellules aux flux de cisaillement n’exige pas la migration cellulaire. Au lieu de cela, la réponse rapide et transitoire à la stimulation de flux de cisaillement initial précède la migration directionnelle vue avec une exposition prolongée aux flux, similaire à la première réponse globale vue avec un gradient chimiotactique de cisaillement.

Les approches biochimiques et microscopiques d’obtenir des données complémentaires même si chaque méthode a des inconvénients et des avantages distincts. Stimulation suivie par lyse cellulaire et immunoblotting de PKBs, KrsB et ERK, par exemple, analyse de toute une population de cellules et donc en moyenne la variation de cellule-cellule, contrairement à une analyse qui examine le comportement de cellules individuelles. Cependant, les tests basés sur la population tendent à changements subtils de masque dans le comportement de cellules que l'on peut facilement observer en analysant les cellules individuelles. En outre, l’analyse biochimique décrite ici n’est efficace avec des cellules capables d’agrégation, pour des raisons que nous le verrons plus tard. En revanche, l’analyse axée sur la microscopie de la relocalisation de RBD, RalGDS, PH-Crac, chaux_Δcoilet PTEN, par exemple, entre le cortex et le cytosol est efficace pour les cellules végétatives et capables d’agrégation et permet ainsi d’observations qui sont largement applicables aux cellules avec des degrés de polarisation. Ce qui rend les deux approches complémentaires est le fait qu’ils examinent les différentes séries de marqueurs disponibles bord d’attaque/retard, élargissant ainsi la couverture du signal transduction et l’actine cytosquelette réseaux testés avec le test de flux de cisaillement.

On ne sait pas pourquoi les cellules végétatives, qui répondent très robuste dans les tests basés sur la microscopie, ne répondent pas à la stimulation suivie par immunotransfert et lyse cellulaire. Il est possible que la quantité de force de cisaillement appliquée aux cellules lorsque la plaque est tournée ne correspond pas à la force subie par les cellules dans une chambre à flux. Développés cellules, en revanche, pourraient avoir un seuil plus bas pour l’activation et, ainsi, répondre à une condition. Il est peu probable que les biocapteurs dont l’activité est mesurée par le dosage biochimique ne s’expriment pas ou ne sont pas activés dans les cellules végétatives, car la stimulation des cellules végétatives à l’acide folique mène à activation robuste de PKBR1/PKBA et ERK2 (données non montré). De plus, les cellules végétatives montrent claire recrutement de PH-Crac, qui reflète l’accumulation PIP3, dans l’analyse axée sur la microscopie. Étant donné que le recrutement PKBA dépend aussi de PIP3, il semble peu probable que PKBA ne répondrait pas à la stimulation mécanique aiguë, à moins que les conditions du test biochimiques ne sont pas optimales, comme mentionné ci-dessus. Cela reste un domaine de recherche actif.

L’analyse biochimique des régulateurs de la chimiotaxie exigeait la présence de caféine dans l’ensemble de l’expérience. Caféine a été introduite à l’origine pour empêcher la cellule à cellule signalisation due à une sécrétion du cAMP. Toutefois, il semble que caféine a un autre rôle en plus de l’inhibition de l’adénylate cyclase (ACA), étant donné que les cellules null ACA a néanmoins nécessaire caféine pour la phosphorylation de PKBR1 en réponse à la stimulation mécanique aiguë. Caféine a démontré antérieurement pour bloquer TorC2 activité²⁶. Il est possible que l’inhibition de TorC2 bloqué certains motilité basale des cellules et ainsi abaissé l’activation basale de PKBR1 et d’autres composants de réseaux de signal transduction et l’actine cytosquelette. Faible activité basale est impérative pour l’observation de la réponse aux flux de cisaillement. En fait, lorsque les cellules ont été recueillies à des moments plus tôt au cours du développement, ils affichent augmentation de l’activité basale et une réponse de cisaillement-débit réduit induit. Fait intéressant, on sait que les cellules végétatives ont proportionnellement plus d’activité PKBA et moins PKBR1 par rapport à développé des cellules³¹. Il est possible que l’état basal est réglé un peu différemment dans les cellules végétatives et capables d’agrégation, contribuant davantage à l’absence de réponse des cellules végétatives dans l’analyse biochimique. Curieusement, lorsque les cellules ont été collectées à des moments plus tard du développement, ils ont également eu une réponse réduite, probablement en raison de la forte influence de la polarité sur la localisation et l’activation de divers organismes de réglementation de la chimiotaxie examinées dans cet essai.

La stimulation des cellules dans une chambre de microscopie a révélé que la force et la durée du stimulus contribuent ಲde la réponse maximale. En d’autres termes, une réponse maximale est possible même avec une force de cisaillement faible si elle est appliquée pendant une période prolongée de temps (10 s ou 2 s). Cette observation explique pourquoi les cellules ont une réponse globale initiale lorsqu’elles sont exposées d’abord à un stimulus continu, mais faible, qui mène à la migration induite par le flux de cisaillement. Avec l’appareil actuel, nous étions incapables de générer des flux de cisaillement assez bas pour enquêter sur l’extrémité inférieure de la gamme.

L’implication plus importante des études réalisées à l’aide d’une stimulation mécanique aiguë est peut-être que des stimuli mécaniques et chimiques semblent se nourrir dans la transduction du signal commun et réseaux de cytosquelette d’actine. Bien que nous avons montré que les deux stimuli s’intègrent à l’aide de bulk addition de tampon pour la stimulation mécanique, les études à venir aura pour but de développer un système où le facteur chimiotactique peut être livré rapidement dans le canal intermédiaire, qui serait beaucoup plus polyvalent et un moyen puissant pour évaluer l’intégration des stimuli mécaniques et chimiques. Malheureusement, facteur chimiotactique addition à l’aide de la configuration actuelle des deux lignes est associée à un deuxième stimulus de flux de cisaillement car le facteur chimiotactique doit être prononcé en présence de flux. Une alternative viable peut être la libération stimulée par laser d’un facteur chimiotactique d’un précurseur en cage comme a été démontré de façon satisfaisante pour le cAMP de Westendorf et al. ³². dans l’avenir, il serait également intéressant d’examiner l’intégration d’autres stimuli, par exemple, écoulement et les champs électriques variables de cisaillement ou de cisaillement flux et rigidité variable substrat. Le dernier exemple est intéressant car il s’agit de deux types de stimulation mécanique, bien que la réception du signal initial peut-être différer entre eux. Confirmant que tous les stimuli qui provoquent une migration dirigée partagent le même réseau de transduction de signal et varient que dans la perception du stimulus vous expliquera comment les cellules peuvent naviguer dans des environnements complexes. Enfin, nous avons déjà démontré que stimulation aiguë avec un écoulement cisaillé conduit à la propagation des cellules neutrophiles humains²². Travaux futurs seront approfondis, localisation et l’activation des différentes composantes du signal transduction et l’actine cytosquelette réseaux avec des stimuli mécaniques dans les cellules de mammifères.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Dextrose	Fisher	D16-1	Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone	Fisher	DF0120-17-6	Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract	Fisher	50-550-445	Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O	Fisher	S373-500	Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4	Fisher	P386-500	Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate)	Fisher	ICN10040525	Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto)	Fisher	DF0118-17-0	Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4	Fisher	P288-100	Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar	Fisher	BP1423-500	Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4	Fisher	M65-500	Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2	Fisher	C79-500	Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine	Fisher	O1728-500	Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)	Fisher	11-680-1100MG	Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid	Sigma	F7876	Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base	Fisher	BP152-500	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher	BP166-500	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol	Fisher	G33-500	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	1610610	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF	Fisher	S299-100	Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4	Fisher	50-994-911	Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate	Fisher	S390-500	Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)	Sigma	11873580001	Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A	Enzo Life Sciences	BML-T119-0100	Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel	Bio-Rad	3450029	Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane	Bio-Rad	1620177	Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody	Cell Signaling	2060	Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody	Cell Signaling	4370	Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey)	GE Healthcare	NA934-100UL	Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)	Bio-Rad	1705060	Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)	Pierce	PI46430	Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue	Fisher	PI20278	Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic)	Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative)	New Brunswick Scientific		Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish	Fisher	FB0875712	Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer	Fisher	02-671-51B	Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)	Fisher	08-772A	Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL)	VWR	13915-985	Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System)	Ibidi	10902	Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)	Ibidi	80316	Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)	Ibidi	10978	Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)	Ibidi	10964	Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing)	Ibidi	10842	Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative)	Zeiss		Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative)	Perkin-Elmer	DM 16000	An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan	Eppendorf	5252000021D and 5192000027	Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter )	Eppendorf	930000035	Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)	Eppendorf	5242956.003	Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)	Fisher	12-565-472	Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)	Fisher	12-565-338	Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji)	NIH	https://fiji.sc/	Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO)	Gradientech	http://gradientech.se/tracking-tool-pro/	Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)