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Biology

तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए Dictyostelium discoideum प्रतिक्रिया का मूल्यांकन

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

यहाँ हम तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए तरीकों का वर्णन. माइक्रोस्कोपी आधारित परख में, हम, कतरनी प्रवाह के साथ संक्षिप्त उत्तेजना के बाद फ्लोरोसेंट लेबल वाले संवेदीकरण के स्थानीयकरण की जांच । हम भी तीव्र यांत्रिक उत्तेजना जैव रासायनिक के जवाब में ब्याज की विभिन्न प्रोटीन के सक्रियण का परीक्षण.

Abstract

Chemotaxis, या एक chemoattractant का एक ढाल ऊपर प्रवास, निर्देशित प्रवास का सबसे अच्छा समझा विधा है । सामाजिक अमीबा Dictyostelium discoideum का उपयोग कर अध्ययन से पता चला है कि एक जटिल संकेत समानांतर रास्ते के transduction नेटवर्क chemoattractants की प्रतिक्रिया को परिवर्धित, और पक्षपाती actin बहुलकीकरण और में एक pseudopod की दखलंदाजी की ओर जाता है एक ढाल की दिशा । इसके विपरीत, आणविक तंत्र निर्देशित प्रवास के अंय प्रकार के ड्राइविंग, उदाहरण के लिए, कतरनी प्रवाह या बिजली के क्षेत्रों के लिए जोखिम के कारण, ज्ञात नहीं हैं । एक पलायन सेल के अग्रणी या विश्र्व धार में chemotaxis प्रदर्शन स्थानीयकरण के कई नियामकों, साथ ही साथ एक chemoattractant के साथ वैश्विक उत्तेजना के बाद स्थानीयकरण या सक्रियण में परिवर्तनीय परिवर्तन दिखाते हैं । निर्देशित प्रवास के अंय प्रकार के आणविक तंत्र को समझने के लिए हम एक तरीका है कि तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया के संक्षिप्त (2-5 s) कतरनी प्रवाह के लिए जोखिम के आधार पर परीक्षा की अनुमति देता है विकसित की है । यह उत्तेजना एक चैनल में दिया जा सकता है, जबकि इमेजिंग कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट व्यक्त-एक अलग सेल व्यवहार की जांच करने के लिए । इसके अतिरिक्त, कोशिका जनसंख्या एक थाली में उत्तेजित किया जा सकता है, लीजड, और immunoblotted का उपयोग एंटीबॉडी कि ब्याज की प्रोटीन के सक्रिय संस्करणों को पहचान. दोनों परख के संयोजन से, एक उपसेलुलर स्थानीयकरण और/या फास्फारिलीकरण में परिवर्तन के द्वारा सक्रिय अणुओं की एक विस्तृत सरणी की जांच कर सकते हैं । इस विधि का प्रयोग हम निर्धारित किया है कि तीव्र यांत्रिक उत्तेजना chemotactic संकेत transduction और actin cytoskeleton नेटवर्क के सक्रियण से चलाता है । तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच करने की क्षमता कतरनी प्रवाह प्रेरित गतिशीलता के लिए आवश्यक शुरुआत की घटनाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । इस दृष्टिकोण भी chemoattractant रिसेप्टर के पाया प्रभाव के बिना chemotactic संकेत transduction नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है.

Introduction

युकेरियोटिक कोशिकाओं के प्रवास के वातावरण में विविध रासायनिक और भौतिक संकेतों से पक्षपातपूर्ण है, घुलनशील या सब्सट्रेट-बाउंड chemoattractants की ढाल, सब्सट्रेट, बिजली के खेतों, या कतरनी प्रवाह की चर कठोरता सहित. हालांकि chemotaxis ड्राइविंग आणविक तंत्र की हमारी समझ में कई अग्रिम किया गया है, कम निर्देशित प्रवास के अंय प्रकार के बारे में जाना जाता है और कैसे इन विविध संकेतों को सेलुलर स्तर पर एकीकृत कर रहे है एक एकीकृत प्रवासी उत्पादन जवाब.

निर्देशित एक chemoattractant की बढ़ती एकाग्रता की ओर पलायन तीन व्यवहार घटकों: गतिशीलता, दिशात्मक संवेदन, और1ध्रुवीयता शामिल है । गतिशीलता pseudopod की दखलंदाजी से प्राप्त कोशिकाओं के यादृच्छिक आंदोलन को संदर्भित करता है । दिशात्मक संवेदन एक कोशिका की क्षमता एक chemoattractant के स्रोत का पता लगाने के लिए है, जो भी स्थिर कोशिकाओं में हो सकता है । ध्रुवीयता एक सेल है, जो आंदोलन में वृद्धि की दृढ़ता की ओर जाता है की अग्रणी और विश्र्व किनारे के बीच intracellular घटकों के अधिक स्थिर विषम वितरण करने के लिए संदर्भित करता है ।

एक chemoattractant को सेलुलर प्रतिक्रिया चार धारणात्मक परिभाषित विनियामक नेटवर्क की गतिविधि पर निर्भर करता है: रिसेप्टर/जी प्रोटीन, सिग्नल transduction, actin cytoskeleton, और ध्रुवीयता1। Chemoattractant जी प्रोटीन के लिए बाध्यकारी-युग्मित रिसेप्टर heterotrimeric जी प्रोटीन α और बहाव संकेत transduction नेटवर्क है, जो दिशात्मक संकेत प्रवर्धित करने के लिए βγ के माध्यम से संकेत पहुंचाता. समानांतर में संकेत transduction नेटवर्क अधिनियम के भीतर कई रास्ते और actin cytoskeleton नेटवर्क में पूर्वाग्रह actin बहुलकीकरण को फ़ीड, और फलस्वरूप pseudopod दखलंदाजी, ढाल की दिशा में । chemotaxis के महत्वपूर्ण नियामकों में आरएएस GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-कळेनासे (PI3K), फॉस्फेट और tensin homolog (PTEN), और guanylyl cyclase हैं । संकेत transduction नेटवर्क के भीतर और संकेत transduction और actin cytoskeleton नेटवर्क के बीच प्रतिक्रिया तंत्र आगे की प्रतिक्रिया बढ़ाना । अंत में, खराब परिभाषित ध्रुवीकरण नेटवर्क actin cytoskeleton से इनपुट प्राप्त करता है, और आगे के संकेत transduction नेटवर्क पूर्वाग्रहों ढाल की दिशा में लगातार प्रवास को बढ़ावा देने के लिए ।

chemotaxis के बारे में हमारी यंत्रवत समझ के कारण संभव बनाया गया था, क्योंकि विनियामक नेटवर्क के विभिंन घटकों के लिए फ्लोरोसेंट-टैग की गई । कई chemotaxis नियामकों विनियामक अणु ही या अपनी गतिविधि के एक विषम वितरण या तो है । उदाहरण के लिए, कि छोटे GTPases रास और Rap1 के सक्रिय संस्करणों की पहचान-रास-Raf1 की बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी के रूप में यहां भेजा) और RalGDS, क्रमशः-एक chemotaxing सेल2,3के अग्रणी बढ़त के लिए information । इसी तरह, PI3K और उसके उत्पाद phosphatidylinositol (3, 4, 5)-trisphosphate (PIP3), एक pleckstrin समरूपता (पीएच) डोमेन द्वारा मांयता प्राप्त, यह भी एक सेल4,5के मोर्चे पर स्थानीयकरण दिखा । इसके विपरीत, एक 3-फॉस्फेट PTEN, जो PIP3 को वापस phosphatidylinositol (4, 5)-bisphosphate में परिवर्तित करता है, जो सेल6के विश्र्व छोर को स्थानीयकृत करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि इन संवेदी एक chemoattractant के साथ वैश्विक उत्तेजना के जवाब में अपने स्थानीयकरण बदल जाते हैं । अग्रणी एज मार्करों, जो cytosolic या एक विश्राम कक्ष में दखलंदाजी के सुझावों पर कर रहे हैं, प्रांतस्था के लिए reinformation, जबकि विश्र्व धार मार्करों, जो cortical स्थानीयकरण है और एक विश्राम कक्ष में दखलंदाजी के सुझावों से अनुपस्थित रहे हैं, के बाद cytosolic बन उत्तेजना. एक chemoattractant के साथ वैश्विक उत्तेजना के जवाब में गतिशीलता और ध्रुवीकरण के योगदान को कम कर देती है, जो अक्सर टिप्पणियों को पाया के साथ-साथ, एक अनुसंवेदी वितरण का विश्लेषण । एक chemoattractant के साथ एक सेल निलंबन के वैश्विक या वर्दी उत्तेजना भी प्रोटीन सक्रियण में जनसंख्या व्यापक परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, अक्सर प्रोटीन द्वारा पता लगाया फास्फारिलीकरण7,8,9 . इस जैव रासायनिक परख मुख्यतः लौकिक जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि माइक्रोस्कोपी विनियामक नेटवर्क के विभिंन घटकों के व्यवहार के बारे में दोनों लौकिक और स्थानिक जानकारी इकट्ठा किया जाता है ।

सिग्नल transduction नेटवर्क एक उत्तेजित प्रणाली10,11की विशेषताएं शामिल हैं । ऊपर अर्थ का उपसर्ग-सीमा chemotactic उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाएं "सभी या कोई नहीं है" और प्रदर्शन दुर्दम्य अवधियों । प्रतिक्रियाएं भी stochastically ट्रिगर कर रहे है और थरथरानवाला व्यवहार दिखा सकते हैं । संकेत transduction घटनाओं प्रांतस्था के क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत रहे है कि12,13,14,15तरंगों के रूप में प्रचार । मोर्चा, या वापस, मार्करों के लिए भर्ती कर रहे हैं, या से अलग, प्रचार तरंगों के सक्रिय क्षेत्रों । सक्रिय क्षेत्र दुर्दम्य क्षेत्र ट्रेलिंग के कारण, विपरीत तरंगों का सफाया के रूप में वे मिलते हैं । प्रचार संकेत transduction लहरें सेलुलर दखलंदाजी कि मध्यस्थता सेल माइग्रेशन10आबाद ।

chemotaxis पर aforementioned जानकारी के अधिकांश सामाजिक अमीबा Dictyostelium discoideumपर अध्ययन से आया है, हालांकि इसी तरह के नियामक तंत्र भी न्यूट्रोफिल और अंय स्तनधारी सेल प्रकार के लिए लागू कर रहे है16 . Dictyostelium एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है कि भुखमरी के दौरान एक मजबूत chemotactic प्रतिक्रिया है, जब एकल कोशिकाओं के हजारों एक एकत्रीकरण केंद्र की ओर पलायन, अंततः एक कोशिकीय फलने युक्त शरीर बनाने के बीजाणुओं । Chemotaxis भी बैक्टीरियल खाद्य स्रोतों का पता लगाने के लिए इस जीव के एकल सेल वृद्धि चरण के दौरान आवश्यक है । महत्वपूर्ण बात, एकल Dictyostelium कोशिकाओं के प्रवासन उल्लेखनीय स्तनधारी न्यूट्रोफिल या मेटास्टेटिक कैंसर कोशिकाओं के प्रवास के समान है, जिनमें से सभी बहुत तेजी से amoeboid-प्रकार के प्रवास से गुजरना । वास्तव में, दोनों विनियामक नेटवर्क के समग्र टोपोलॉजी, के रूप में अच्छी तरह के रूप में व्यक्तिगत संकेत transduction chemotaxis में शामिल रास्ते के कई Dictyostelium और स्तनधारी ल्यूकोसाइट्स17के बीच संरक्षण कर रहे हैं । इसके अलावा, अंय कोशिकाओं, जैसे fibroblasts, उपयोग रिसेप्टर tyrosine kinases (RTK) के बजाय GPCRs; हालांकि, RTKs इसी तरह के नेटवर्क में फ़ीड कर सकते हैं ।

chemotaxis के विपरीत, संकेतन तंत्र की पूरी तरह से समझ है कि ड्राइव निर्देशित प्रवास के विभिंन अंय साधनों की कमी है । इसी तरह एक chemoattractant ढाल कई अध्ययनों में माइग्रेट कोशिकाओं को सक्रियण और/या विशिष्ट अग्रणी धार मार्करों के स्थानीयकरण, actin बहुलकीकरण, PIP3 और/या extracellular संकेत विनियमित कळेनासे (ERK) 1/2, सहित की सूचना दी है बिजली के खेतों में कतरनी प्रवाह या परिवर्तन के जवाब में निर्देशित प्रवास के दौर से गुजर कोशिकाओं के सामने18,19,20,21। हालांकि, इन अध्ययनों में उत्तेजना के लिए सतत जोखिम भी सेल प्रवास के परिणामस्वरूप, खुले सवाल है कि क्या, उदाहरण के लिए, प्रमुख एज मार्करों विशेष रूप से एक उत्तेजना के जवाब में स्थानीयकरण, या यदि वे बस अग्रणी धार में स्थानीयकरण जा क्योंकि एक पलायन सेल के मोर्चे पर pseudopods की संख्या में वृद्धि की ।

हम परख कि हम तीव्र यांत्रिक गड़बड़ी दोनों जनसंख्या स्तर पर और व्यक्तिगत कोशिकाओं के रूप में22कतरनी प्रवाह के रूप में दिया करने के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का पालन करने की अनुमति विकसित की है । एक chemoattractant, एक्यूट stimula के साथ वैश्विक उत्तेजना के समानकतरनी प्रवाह के साथ tion गतिशीलता या ध्रुवीकरण से प्राप्त योगदान के बिना एक यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक सेलुलर प्रतिक्रिया के अध्ययन की अनुमति देता है । आनुवंशिक या औषधीय perturbations के साथ इन जैव रासायनिक और सूक्ष्म परख के संयोजन हमें कैसे यांत्रिक उत्तेजनाओं माना जाता है और संचारित के बारे में जानने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण भी एक chemoattractant के अभाव में chemoattractant रिसेप्टर की प्रणाली बहाव में दोहन के लिए एक उपंयास विधि प्रदान करता है, जिससे इस रिसेप्टर से संकेत transduction और actin cytoskeleton नेटवर्क को अलग/ प्रोटीन नेटवर्क ।

नीचे वर्णित तकनीकों का प्रयोग हम हाल ही में प्रदर्शित किया कि तीव्र कतरनी तनाव chemotactic संकेत transduction और actin cytoskeleton नेटवर्क के कई घटकों के सक्रियण के लिए सुराग22। अलग अंतराल पर तीव्र यांत्रिक उत्तेजना लागू करके, हम प्रदर्शन किया है कि, इसी तरह chemoattractants करने के लिए, यांत्रिक उत्तेजनाओं के जवाब भी एक उत्तेजित प्रणाली की सुविधाओं का प्रदर्शन, के तहत प्रतिक्रिया के सभी या कोई भी व्यवहार सहित संतृप्ति शर्तों और एक दुर्दम्य अवधि की उपस्थिति । अंत में, यांत्रिक और रासायनिक उत्तेजना के संयोजन से हमें पता चला कि दो उत्तेजनाओं शेयर संकेत transduction और actin cytoskeleton नेटवर्क है, जो संभावना कई उत्तेजनाओं के एकीकरण के लिए पूर्वाग्रह सेल प्रवास के लिए अनुमति देते हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. समाधान की तैयारी

  1. एचएल-5 मीडिया निंन का उपयोग कर तैयार करें: 10 g/l डेक्सट्रोज, 10 g/l proteose peptone, 5 g/l यीस्ट extract, ०.९६५ g/l न 2 HPO 4 & #183; 7H 2 O, ०.४८५ g/l KH 2 पो 4 , और, जब तक अंयथा इंगित, ०.०३ g/L streptomycin जल में । कमरे के तापमान पर मीडियम और स्टोर आटोक्लेव ।
    नोट: proteose peptone और खमीर अलग आपूर्तिकर्ताओं से अधिग्रहीत निकालने के बीच मतभेदों के कारण, के रूप में अच्छी तरह के रूप में व्यक्तिगत बैचों के बीच, मीडिया के पीएच के लिए ६.४ की विशिष्ट रेंज को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती ६.७.
  2. निंन का उपयोग करके SM प्लेट तैयार करें: 10 g/l डेक्सट्रोज, 10 g/l peptone, 1 g/l खमीर निकालने, २.३१ g/l KH 2 पो 4 , 1 g/l K 2 HPO 4 , और 20 गाम/l आगर में जल । आटोक्लेव, शांत, और 10 प्रति आगर समाधान के 30 मिलीलीटर डाल-सेमी पेट्री डिश । एक बार आगर जम जाए तो प्लेट्स को 4 & #176; C पर 1 महीने तक स्टोर कर लीजिये.
  3. 10x फॉस्फेट बफर (पंजाब) का उपयोग कर तैयार १३.४ g/l न 2 HPO 4 & #183; 7H 2 O र ६.८ g/L KH 2 पो 4 जल । 4 & #176 पर 10x शेयर स्टोर; C. उपयोग के लिए जल के साथ 1x को पतला ।
  4. 2 मिमी MgSO 4 और ०.२ मिमी CaCl 2 .
    5. के साथ 1x पंजाब का सप्लीमेंट द्वारा DB बफर तैयार
  5. पानी में १०० mM कैफीन तैयार करते हैं । Store at & #8722; 20 & #176; C.
  6. शिविर को भंग करके १०० mM शिविर स्टॉक समाधान तैयार जल में सोडियम नमक मोनोहाइडे । एक 1 मिमी पानी में काम स्टॉक तैयार करते हैं । भंडार दोनों स्टॉक समाधान पर & #8722; 20 & #176; C. प्रयोग के दिन पर डीबी में वांछित एकाग्रता पर अंतिम शिविर समाधान तैयार करें.
    नोट: स्टॉक समाधान फ्रीज-कई बार गल सकता है ।
  7. 1x पीबी में 25 एमएम फोलिक एसिड तैयार करते हैं । पाउडर पूरी तरह से घुल जब तक 1 N NaOH की कुछ बूंदें जोड़ें । Store at & #8722; 20 & #176; C.
  8. निंनलिखित का उपयोग कर 3x नमूना बफर तैयार: १८७.५ मिमी Tris-एचसीएल पीएच ६.८, 6% (डब्ल्यू/वी) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), 30% ग्लिसरॉल, १२६ mM dithiothreitol, और ०.०३% (डब्ल्यू/वी) bromophenol ब्लू । Aliquot और टोर पर & #8722; 20 & #176; ग.
    1. का उपयोग करने से पूर्व, एक ३७ में गल & #176; सी जल स्नान और कमजोर 3x नमूना बफर द्वारा चिढ़ाने और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ नमूना बफर 1x को तैयार करने के लिए आगे बढ़ना है, और जोड़ने ५० mm NaF, 2 mm Na 3 VO 4 , 25 मिमी सोडियम pyrophosphate, और 1x पूर्ण EDTA-नि: शुल्क चिढ़ाने में पानी की तुरंत कदम 3.1.2-3.1.3 में वर्णित प्रक्रिया शुरू करने से पहले अवरोधकों जोड़ें ।
  9. तैयार 5 एमएम Latrunculin DMSO में हल । Aliquot और टोर पर & #8722; 20 & #176; ग.
< p class = "jove_title" > 2. की तैयारी d. discoideum cells

< p class = "jove_content" > नोट: बनाए d. discoideum कोशिकाओं में एचएल-5 मीडिया या तो टिशू कल्चर प्लेट्स में या एक सस्पेंशन कल्चर में पहले वर्णित के रूप में < सुप class = "xref" > 23 . जब आवश्यक हो, कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट के साथ बदलना-लेबल वाले संवेदी मानक electroporation प्रोटोकॉल के अनुसार < सुप वर्ग = "xref" > २४ . विभिन्न डी. discoideum उपभेदों के साथ-साथ plasmids एंकोडिंग के साथ-साथ Dicty स्टॉक सेंटर (dictybase.org) से ब्याज की अन्य जीन प्राप्त की जा सकती है ।

  1. विकास और वनस्पति के संग्रह D. discoideum कोशिकाओं
    1. वनस्पति कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए, बैक्टीरिया की उपस्थिति में कोशिकाओं को विकसित macropinosomes की संख्या को कम करने के लिए, जो आम तौर पर में मनाया जाता है axenically-प्रमाणावर कक्ष < सुप वर्ग = "xref" > २५ .
      1. Klebsiella aerogenes की एक संस्कृति inoculating द्वारा एक ग्लिसरॉल स्टॉक या एक पिछली संस्कृति से कोशिकाओं की एक छोटी संख्या में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना-5 मध्यम की वांछित मात्रा में तैयार करते हैं । २०० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर मशीन बैक्टीरियल संस्कृति (०.४२ x g) कमरे के तापमान पर (20-22 & #176; C) 16-18 h.
        के लिए नोट: K । aerogenes तनाव यहां इस्तेमाल गैर रोगजनक है (सामग्री के तालिका देखें) ।
    2. एकत्र D. discoideum घातीय वृद्धि चरण में या तो ऊतक संस्कृति प्लेटों से या एक निलंबन संस्कृति से, और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती के अनुसार निर्माता & #39; s निर्देश. वापरला 1 x 10 5 D. discoideum cells with २६० & #181; L K. aerogenes एक SM प्लेट पर सस्पेंशन । अगले दिन प्लेट उल्टा कर दें । कमरे के तापमान पर discoideum जब तक कोशिकाओं को विकसित कोशिकाओं जीवाणु लॉन समाशोधन शुरू लेकिन इससे पहले कि वे एकत्रीकरण शुरू (~ 36-48 ज).
    3. एक गिलास प्रसारकर्ता के साथ उन्हें स्क्रैप द्वारा 5 मिलीलीटर डीबी बफर में डी discoideum कोशिकाओं को इकट्ठा । एक ५० एमएल के लिए सेल स्थानांतरण ट्यूब । एक और 5 मिलीलीटर DB बफर और मूल निलंबन के साथ पूल के साथ प्लेट कुल्ला । DB बफर के साथ ५० मिलीलीटर के लिए ट्यूब भरें ।
    4. केंद्रापसारक D. discoideum ३६० x g पर 3-4 min. महाप्राण के लिए supernatant और गोली reसस्पेंड ५० एमएल DB बफर में । supernatant साफ है जब तक धोने चरणों को दोहराएँ (~ 3 से 4 बहाकर). DB बफर में अंतिम सेल गोली के एक अंतिम घनत्व को reसस्पेंड ~ 5 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल
  2. एकत्रीकरण की तैयारी-सक्षम d. discoideum cells
    1. विकसित d. discoideum कोशिकाओं द्वारा 1 एच भुखमरी के 4 एच द्वारा पीछा किया और ५० एनएम शिविर के साथ स्पंदन हर 6 मिन मानक के अनुसार चलत < सुप वर्ग = "xref" > २३ .
    2. निम्नलिखित विकास, कोशिका निलंबन के अंतिम मात्रा को मापने.
    3. विकास के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या के आधार पर, अंतिम निलंबन के सेल घनत्व की गणना.
      नोट: यदि शिविर में वितरित किया जाता है १०० & #181; एल खंड हर 6 मिनट, सेल मात्रा बढ़ जाती है के लिए 1 मिलीलीटर शिविर स्पंदन के हर घंटे के लिए । इस प्रकार, मानक शर्तों के लिए 8 x 10 7 कोशिकाओं DB के 4 मिलीलीटर में, के बाद 4 विकास के ज अंतिम मात्रा 7 मिलीलीटर है और अंतिम सेल घनत्व है ~ १.१ x 10 7 कोशिकाओं/एमएल
< p class = "jove_title" > 3. यांत्रिक या रासायनिक उत्तेजना के लिए सेल प्रतिक्रिया के जैव रासायनिक विश्लेषण

  1. कोशिकाओं के तीव्र यांत्रिक उत्तेजना सेल Lysis
    1. प्लेट 2 एक्स 10 6 एकत्रीकरण-सक्षम कोशिकाओं के बाद 4 के ज के बाद (चरण २.२ से) 2 मिलीलीटर DB के साथ ३५ मिमी के व्यंजन में विकास । कक्ष के तापमान पर 10 मिनट के लिए अनुलग्न करने के लिए कक्षों की अनुमति दें । 1 मिलीलीटर DB के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें । 30 मिनट के लिए २.५ mM कैफीन के साथ DB में कोशिकाओं की गर्मी & #160 प्लेटों की किसी भी अशांति के बिना;
      नोट: यदि कोशिकाओं को एक औषधीय अवरोध करनेवाला के साथ इलाज की जरूरत है, अवरोध करनेवाला या कैफीन के साथ बेसल के दौरान उपयुक्त वाहन के एक ही मात्रा की वांछित एकाग्रता जोड़ें ।
    2. यांत्रिक उत्तेजना लागू करने के लिए, थाली जगह (एक समय में एक) एक कक्षीय शेखर पर और तुरंत यह १५० rpm पर बारी (०.२४ एक्स जी) 5 एस के लिए
      नोट: प्लेट भी मैंयुअल रूप से लगभग 5 एस
      3. के लिए एक पार वार तरीके से आंदोलन से उत्तेजित किया जा सकता है
    3. महाप्राण उत्तेजना के शुरू होने के बाद संकेत दिया समय पर बफर । तुरंत लाइसे के साथ १०० & #181; L नमूना बफर और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ जोड़कर कोशिकाओं को.
    4. बर्फ पर प्लेट प्लेस, और एक १.५-एमएल ट्यूब में lysate इकट्ठा । के लिए & #39; समय 0 & #39;, लाइसे बिना हिलती हुई कोशिकाएं । lysis के तुरंत बाद 10 मिनट के लिए ट्यूबों एक ९५ & #176; सी हीट ब्लॉक के लिए स्थानांतरण । immunoblotting या store lysates के साथ आगे बढ़ें-20 & #176; C.
  2. उत्तेजना के साथ कोशिकाओं की एक Chemoattractant
    1. Basalate एकत्रीकरण-तेजी से उन्हें २०० rpm (०.४२ एक्स जी) में 5 मिमी कैफीन की उपस्थिति में मिलाते हुए विकास के 4 ज के बाद सक्षम कोशिकाओं 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर.
      1. 3-4 min. महाप्राण supernatant के लिए ३६० x g पर सेल का निलंबन केंद्रापसारक और 10 मिलीलीटर बर्फ ठंड DB बफर में गोली reसस्पेंड । वाशिंग स्टेप दोहराएं ।
    2. बर्फ शीत DB बफर में अंतिम सेल गोली reसस्पेंड 4 एक्स 10 7 कोशिकाओं के अंतिम घनत्व के लिए/एमएल कोशिकाओं को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रारंभिक कोशिका संख्या के आधार पर (चरण २.२ देखें) । stimul से पहले बर्फ पर सेल सस्पेंशन रखेंation.
      1. पिपेट ५० & #181; L के 10 & #181; मी शिविर या वाहन एक polystyrene एक कक्षीय शेखर पर रखा कप में ।
    3. कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, जोड़ें ४५० & #181; एक ही कप में बर्फ शीत कोशिका निलंबन के एल और तुरंत २०० rpm पर (०.४२ x g) पर शेखर बारी । विभिन्ना समय पर उत्तेजना के शुरू होने के बाद ( उदा. 10, 30, ४५, ६०, १२० s), संक्षेप में बंद करो शेखर, बाहर ले ५० & #181; l aliquots ऑफ सेल सस्पेंशन, और लाइसे कोशिकाओं को जोड़कर उन्हें १.५ मिलीलीटर ट्यूब जिसमें 25 & #181; l 3x नमूना बफर है ।
      1. For & #39; समय 0 & #39;, उत्तेजित आइस-कोल्ड सेल सस्पेंशन से कोशिकाओं का प्रयोग करें ।
        नोट: उत्तेजना के दौरान सेल सस्पेंशन का अंतिम तापमान ~ 9 & #176; C < सुप class = "xref" > 26 . इन शर्तों के तहत पीक प्रतिक्रिया थोड़ा बाद में पीक से होता है कमरे के तापमान पर प्रदर्शन उत्तेजना के लिए मनाया (उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप, या अनुयाई कोशिकाओं की यांत्रिक उत्तेजना पर अनुयाई कोशिकाओं के chemoattractant उत्तेजना).
    4. एक ९५ & #176 के लिए स्थानांतरण, lysis के तुरंत बाद 10 मिनट के लिए सी हीट ब्लॉक. immunoblotting या store lysates के साथ आगे बढ़ें-20 & #176; C.
  3. सेल रिस्पांस का विश्लेषण by Immunoblotting
    1. रन lysates (कदम 3.1.3 या 3.2.4 से) एक 4-15% Tris पर-एचसीएल polyacrylamide जेल, एक polyvinylidene फ्लोराइड झिल्ली को हस्तांतरण, ब्लॉक, और immunoblot के साथ phospho-PKC & #950; Thr410 (phospho-PKBR1 और phospho-PKBA का पता लगाने के लिए). सहिजन peroxidase-संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी, बढ़ाया chemiluminescence सब्सट्रेट का उपयोग chemiluminescence द्वारा पीछा के साथ मशीन द्वारा संकेत का पता लगाने.
      2. एकाधिक प्रोटीन का पता लगाने के लिए
    2. , अलग करना बफर के साथ दाग पट्टी, और phospho के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ फिर से जांच-p42/44 MAPK Thr302/304 (phospho-ERK2 का पता लगाने के लिए) । Coomassie शानदार नीले रंग के साथ polyvinylidene फ्लोराइड झिल्ली दाग द्वारा समान प्रोटीन लदान की पुष्टि करें.
< p class = "jove_title" > 4. तीव्र यांत्रिक उत्तेजना और माइक्रोस्कोप पर एकल कोशिकाओं के लाइव इमेजिंग

  1. एक प्रवाह डिवाइस का उपयोग कर तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के जवाब का आकलन
    1. इकट्ठा और पतला वनस्पति या एकत्रीकरण-सक्षम कक्षों के लिए ~ 1 x 10 6 कक्षों/एमएल में वर्णित के रूप में चरण २.१ और २.२, क्रमशः । लोड ~ ६०० & #181; L एक चैनल के साथ स्लाइड में (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें). 10 मिनट के लिए अनुलग्न करने के लिए कक्षों को अनुमति दें । सुनिश्चित करें कि स्लाइड में सभी की सुविधा पूरी तरह से भरी हुई है । अतिरिक्त बफर के साथ शीर्ष यदि आवश्यक हो तो ।
      नोट: विशेष स्लाइड विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है तीन आदानों, जो संकीर्ण में फ़ीड, 1-mm चैनल, लेकिन फिर एक चौड़े, 3 मिमी चैनल को विलय. चैनल की ऊंचाई ०.४ मिमी है । हालांकि सेल चैनल भर में चढ़ाया जाता है, केवल व्यापक भाग imaged है ।
    2. लाइनों है कि एक ५० मिलीलीटर के लिए संलग्न है में से एक पास-द्रव इकाई के सामने सही वाल्व के माध्यम से एमएल (सामग्री के विवरण के लिए तालिका देखें) । पंप के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, वाल्व बंद कर दिया है सुनिश्चित करें ( यानी बाईं ओर ). डीबी के साथ जलाशय भरें ।
      1. ५० mbar पर दबाव सेट और इसे चालू करें । भरें और इसे खोलने के लिए वाल्व पर क्लिक करके डीबी के साथ लाइन कुल्ला । 0 के लिए दबाव वापस बारी है, और के बाद वाल्व बंद ~ 30 एस
    3. किसी भी हवाई बुलबुले को फँसाने के बिना स्लाइड के एक तरफ तीन में से एक करने के लिए लाइन कनेक्ट । अंय दो देता है प्लग । स्लाइड के दूसरी ओर एक प्रवेश करने के लिए नाली से लाइन कनेक्ट.
      नोट: इस सेटअप में इनपुट और नाली लाइनों के लिए इस्तेमाल किया टयूबिंग १.६ mm.
      4. के एक आंतरिक व्यास है
    4. एक 20X हवा उद्देश्य के तहत माइक्रोस्कोप पर स्लाइड जगह है । चैनल को कुल्ला करने के लिए, लाइन खोलने के लिए वॉल्व को स्विच करें और & #34 पर क्लिक करे;P ressure & #34;, उच्च दाब पर शुरू (~ ५० mbar or ~ ४० dyn/सेमी 2 ) के माध्यम से तरल पुश करने के लिए नाली ।
      1. एक बार तरल नाली से बाहर आता है, शून्य करने के लिए बाहरी दबाव को कम ( अर्थात . गुरुत्वाकर्षण प्रवाह केवल, ~ 15 dyn/सेमी 2 ), और के लिए कुल्ला जारी ~ 30 s. प्रवाह को रोकने के लिए विपरीत स्थिति के लिए वाल्व स्विच ।
    5. 3 एस अंतराल पर एक GFP तेल उद्देश्य के तहत एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर आरएफपी या 40X रोशनी के साथ छवियों का अधिग्रहण । बंद की स्थिति में वाल्व के साथ, विशेष रूप से 15 और ४० dyn/सेमी 2 (0-50 mbar) के बीच, वांछित दबाव पर दबाव बारी ।
    6. 5 फ्रेम प्राप्त करने के बाद, वाल्व स्विचन द्वारा उत्तेजना उद्धार & #34; open & #34; वरून. 2-5 एस के बाद प्रवाह बंद विपरीत दिशा में वाल्व स्विचन द्वारा ।
      नोट: कुछ कमजोर संवेदी के लिए ( जैसे PTEN, CynA, और RalGDS) यह एक फोकल माइक्रोस्कोप एक 40X तेल उद्देश्य से सुसज्जित का उपयोग कर छवि कोशिकाओं के लिए आवश्यक हो सकता है.
  2. परीक्षण तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया पर औषधीय अवरोधकों के प्रभाव का उपयोग कर एक प्रवाह डिवाइस
    1. प्लेट कोशिकाओं के रूप में एक चैनल के साथ स्लाइड में कदम शुू में वर्णित है । दो पंक्तियों को सेट करें: चरण 4.1.2 में के रूप में सामने सही वाल्व के माध्यम से एक पंक्ति पास, और वापस बाएं वाल्व के माध्यम से दूसरा । बायीं पंक्ति को दबाना और वॉल्व को & #34 में डालना; बंद & #34; (बाएँ) स्थिति. उपयुक्त वाहन युक्त DB के साथ एक पंक्ति भरें, और एक ब्याज के औषधीय अवरोधक युक्त समाधान के साथ दूसरा ( जैसे 5 & #181; M Latrunculin a).
      नोट: यह आवश्यक है कि शारीरिक रूप से बायीं रेखा को दबाना क्योंकि & #34; बंद & #34; बायां स्थान उस रेखा के लिए वाल्व खोलता है ।
    2. को भरने और कुल्ला करने पर ५० mbar पर दबाव को मोड़ कर और वाल्व को स्विच कर के & #34; खुला & #34; (right) वरून. के बाद छोड़ दिया करने के लिए वाल्व स्विच ~ 30 एस । भरें और ~ 30 एस के लिए क्लैंप को हटाने के द्वारा छोड़ दिया लाइन कुल्ला एक चैनल के साथ स्लाइड के एक तरफ, शेष प्रवेश प्लग, और दूसरी तरफ एक प्रवेश करने के लिए नाली कनेक्ट दोनों लाइनों से कनेक्ट ।
    3. सही लाइन में बफर के साथ स्लाइड धो और चरण 4.1.3 और 4.1.4 ऊपर में वर्णित के रूप में एक ही बफर में उत्तेजना प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: यद्यपि दाईं पंक्ति इस सेटअप में पहले एक के रूप में चुना गया था, आदेश औंधा हो सकता है ।
    4. उत्तेजना के बाद, वाल्व स्विच शूंय दबाव पर सही लाइन खोलने के लिए ( यानी गुरुत्वाकर्षण प्रवाह केवल, ~ 15 dyn/सेमी 2 ) । बाईं पंक्ति से दबाना निकालें और उस पंक्ति को खोलने के लिए बाईं ओर के वाल्व स्विच करें । पहली पंक्ति को दबाना.
    5. के माध्यम से अवरोध करनेवाला के साथ बफर के 3-5 मिलीलीटर चलाने के बाद, प्रवाह को रोकने के लिए सही करने के लिए वाल्व स्विच, और समय की आवश्यकता लंबाई के लिए अवरोधक के साथ कोशिकाओं को मशीन ( उदा 15 मिनट) । वाल्व हर ~ 10 मिनट के लिए स्विचन द्वारा पर प्रवाह बारी ~ 15 एस ऑक्सीजन अभाव को रोकने के लिए । दूसरी पंक्ति के साथ उत्तेजना दोहराएँ.
  3. वैकल्पिक विधि तीव्र यांत्रिक उत्तेजना का उपयोग करने के लिए प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक micropipette
    1. सेट अप micropipette के अनुसार DB से भरा मानक प्रोटोकॉल < सुप वर्ग = "xref" > २३ . १,५०० psi.
      2. पर क्षतिपूर्ति दबाव रखें
    2. कदम २.१ में वर्णित के रूप में वनस्पति कोशिकाओं को इकट्ठा करने और पतला । जगह 25 & #181; L बूंदों की ~ ७.५ x 10 5 कोशिकाओं/एमएल एक 1-अच्छी तरह से कक्ष में, के लिए ंयूनतम 10 मिनट के लिए पालन करने की अनुमति है, और 3 मिलीलीटर DB के साथ कवर ।
    3. एक औंधा प्रतिदीप्ति एक 40X तेल उद्देश्य से सुसज्जित माइक्रोस्कोप पर चैंबर जगह है । कक्षों का पता लगाएं । धीरे से देखने के क्षेत्र के बीच में micropipette कम जब तक यह पहली बार कक्ष के नीचे छूता है ।
      नोट: के बाद से मुआवजा दबाव १,५०० साई में स्थापित किया गया था, कोशिकाओं को लगातार micropipette से DB के एक बहुत धीमी प्रवाह को उजागर किया जाएगा ।
    4. 3 एस अंतराल पर आरएफपी या GFP रोशनी के साथ छवियों को प्राप्त करने शुरू करते हैं । लागू करें & #39; Clean & #39; फ़ंक्शन micropipette से लिक्विड का एक बोल्स जारी करने के लिए । इमेजिंग जारी रखें in मुआवजा अकेले दबाव के कारण प्रवाह की उपस्थिति ।
  4. एक वैकल्पिक विधि तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए थोक बफर इसके अलावा
    1. इकट्ठा करने और २.१ कदम में वर्णित के रूप में वनस्पति कोशिकाओं को पतला. Place 20 & #181; L पर कोशिकाओं की बूँदें ~ 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल में DB में एक अच्छी तरह से एक 8-well चैंबर से के बीच. कक्षों को ंयूनतम 10 min.
      2. के लिए पालन करने की अनुमति दें
    2. 3 एस अंतराल पर एक 40X उद्देश्य से सुसज्जित एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर आरएफपी-या GFP-विशिष्ट रोशनी के साथ छवियों को प्राप्त करने शुरू करते हैं । एक ड्रॉप के किनारे के करीब क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित ।
    3. तेजी से जोड़ने के ४३० & #181; DB के एल के एक तरफ अच्छी तरह से । इमेजिंग.
      4. जारी रखें यांत्रिक और रासायनिक उत्तेजनाओं के बीच बातचीत के विश्लेषण के लिए
    4. , यांत्रिक उत्तेजना के बाद 12 या ४५ एस, धीरे जोड़ें ५० & #181; L फोलिक एसिड की (अंतिम एकाग्रता 20 एनएम) या वाहन (DB) एक यांत्रिक प्रतिक्रिया उत्प्रेरण के बिना । इमेजिंग.
      5. जारी रखें
  5. ठहराव की प्रतिक्रिया
    1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में ३२-bit TIFF छवि खोलें (देखें सामग्री की तालिका विवरण के लिए) < सुप वर्ग = "xref" > २७ .
    2. के तहत & #39; श्लेष & #39; tab, जाने & #34; माप सेट & #34;. & #39 के लिए बॉक्स चेक करें; मतलब ग्रे मान & #39;. सुनिश्चित करें कि अंय बक्से चेक नहीं किए गए हैं । Click & #34; ok & #34;.
    3. के तहत & #39;P rocess & #39; tab, क्लिक करें & #34; घटाना पृष् ठभूमि & #34; । रोलिंग बॉल त्रिज्या को ५० पिक्सेल पर रखें, और मेनू में सूचीबद्ध विकल्पों में से किसी की जांच न करें । & #39 का उपयोग करके एक सेल पर ज़ूम इन करें; शीशा ग् & #39; tool.
    4. का प्रयोग & #39; आयत & #39; उपकरण, एक बॉक्स आरेखित करें (~ २.५ x २.५ & #181; m 2 ) cytosol में, यकीन है कि यह नाभिक या प्लाज्मा झिल्ली पर आकर्षित नहीं कर रही । प्रेस & #34; Ctrl & #34; + & #34; M & #34; कीज या जाने & #39; श्लेष & #39; टैब और पर क्लिक करें & #34; नाप & #34; का मतलब ग्रे मान निर्धारित करने के लिए बॉक्स । बाद में फ्रेम और उपाय करने के लिए अग्रिम, सुनिश्चित करें कि बॉक्स cytosol.
      में रहता है बना नोट: चूंकि D. discoideum कोशिकाओं बहुत तेजी से कदम बॉक्स एक फ्रेम से अगले करने के लिए इसे cytosol में रखने के लिए ले जाया जा सकता है ।
    5. के बाद सभी फ्रेम का विश्लेषण किया गया है, एक स्प्रेडशीट में मूल्यों की प्रतिलिपि । विभिंन-संवेदी के व्यंजक स्तरों में कक्ष-से-कक्ष भिंनता के लिए खाते के लिए, समय 0 पर स्वीकार्य माध्य धूसर मान के लिए मान को सामांय करें । प्रांतस्था.
      6. पर संकेत के संचय को प्रतिबिंबित करने के लिए मानों के पारस्परिक की गणना
< p class = "jove_title" > 5. सतत यांत्रिक उत्तेजना और माइक्रोस्कोप पर एकल कोशिकाओं के लाइव इमेजिंग

  1. चरणों में तीव्र यांत्रिक उत्तेजना विश्लेषण के लिए ऊपर वर्णित कक्षों को सेट करें शुू-4.1.3 । बफर के साथ जलाशय को कवर प्लग खोलें तो मात्रा में सबसे ऊपर है अगर प्रतिक्रिया एक समय में कुछ मिनट से अधिक के लिए विश्लेषण किया है हो सकता है ।
    नोट: क्योंकि जलाशय प्रयोग की अवधि के लिए खुला रहता है, इस परख बाहरी दबाव के अभाव में आयोजित की जाती है और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह पर निर्भर करता है अकेले । गुरुत्वाकर्षण द्वारा प्रवाह की दर को बढ़ाने के लिए, नाली माइक्रोस्कोप के नीचे एक मेज पर रखा जा सकता है ।
  2. आरएफपी के साथ इमेजिंग कोशिकाओं को शुरू-या एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर एक 40X उद्देश्य से सुसज्जित के लिए 3 एस अंतराल पर GFP विशेष रोशनी-संवेदी प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए । वैकल्पिक रूप से, चरण कंट्रास्ट के साथ छवि कुल सेल माइग्रेशन के विश्लेषण के लिए 10 s अंतराल पर एक 20X उद्देश्य का उपयोग कर.
  3. शूंय दबाव सेटिंग में कई फ्रेम के बाद प्रवाह पर बारी ( यानी प्रवाह गुरुत्वाकर्षण अकेले या ~ 15 dyn/सेमी 2 ) के लिए खुले स्थान पर वाल्व स्विचन द्वारा कारण है । जब द्रव का स्तर जलाशय में 5-10 मिलीलीटर तक जाता है, तो अधिक बफर के साथ ऊपर । हवा के बुलबुले लाइनों में फंस नहीं मिलता है तो ध्यान से तरल पदार्थ जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें.
    नोट: यह कोशिकाओं में एक सदमे प्रतिक्रिया से बचने के लिए एक ही तापमान के द्रव को जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है.
  4. सेल गति और माइग्रेशन विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग हठ (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) के अनुसार निर्माता & #39; s निर्देश.

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Representative Results

तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए chemotaxis नियामकों के लौकिक प्रतिक्रिया

यांत्रिक उत्तेजना के लिए डी. discoideum कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए, अनुयाई एकत्रीकरण-सक्षम कोशिकाओं कतरनी प्रवाह की एक संक्षिप्त नाड़ी को उजागर किया गया । एकत्रीकरण-सक्षम डी. discoideum कोशिकाओं गुप्त शिविर, जो पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा महसूस किया जा सकता है । सेल-सेल सिग्नलिंग के योगदान को दूर करने के लिए, कोशिकाओं कैफीन के साथ इलाज किया गया है, जो discoideum में adenylyl cyclase रोकता है और इस तरह शिविर स्राव28रोकता है । वास्तव में, कैफीन के साथ पूर्व उपचार कोशिकाओं PKBR1 और ERK2 के बहुत कम बेसल गतिविधि था, और इन kinases के प्रमुख अवशेषों के फास्फारिलीकरण में एक मजबूत वृद्धि के बाद 5 कतरनी प्रवाह के साथ उत्तेजना (चित्र 1a) के बाद दिखाया । प्रतिक्रिया क्षणिक था और PKBR1 के लिए 10-15 s के आसपास नुकीला, और लगभग 30 ERK2 के लिए एस, इसी तरह एक chemoattractant7के साथ इन प्रोटीन के सक्रियकरण के लिए पहले प्रकाशित निष्कर्षों के लिए ।

हालांकि यह कम बेसल स्तर पर विचार प्रतिक्रिया की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल है, प्रारंभिक अध्ययन है कि इस परख के विकास के लिए नेतृत्व, कतरनी अकेले प्रवाह के साथ उत्तेजना की तुलना में (या एक वाहन के साथ) एक की उपस्थिति में कतरनी प्रवाह के लिए chemoattractant शिविर (चित्र 1b) । इस विश्लेषण शिविर के साथ प्रतिक्रिया में वृद्धि नहीं दिखा था, सुझाव है कि संकेत transduction के लिए कतरनी प्रवाह नेटवर्क की प्रतिक्रिया संतृप्त है । हालांकि इस परख शिविर में PKBR1 के फास्फारिलीकरण वृद्धि नहीं किया था, ' कोशिकाओं chemoattractant को प्रतिक्रिया एक मानक उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग कर देखा जा सकता है, जहां एकत्रीकरण-सक्षम कोशिकाओं निलंबन में रखा जाता है, शिविर के साथ उत्तेजित, और विभिंन लीजड पर समय उत्तेजना निंनलिखित अंक । के रूप में चित्रा 1Cमें दिखाया गया है, इन स्थितियों के तहत वहां chemoattractant के जवाब में PKBR1 फास्फारिलीकरण में एक क्षणिक वृद्धि हुई है, लेकिन वाहन नहीं । पीक प्रतिक्रिया इस परख में 30 एस में मनाया जाता है, क्योंकि परख के दौरान सेल निलंबन के तापमान ~ 9 ° c है, यांत्रिक उत्तेजना परख के लिए ~ 22 डिग्री सेल्सियस की तुलना में26ऊपर वर्णित है ।

तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए अग्रणी और विश्र्व बढ़त मार्करों के Spatiotemporal प्रतिक्रिया

के बाद से जनसंख्या परख ही chemotaxis नियामकों के व्यवहार के बारे में लौकिक जानकारी प्रदान करता है, कोशिकाओं को भी एक संक्षिप्त यांत्रिक उत्तेजना के संपर्क में थे, जबकि एक खुर्दबीन के साथ मनाया जा रहा है । यह परख या तो एकत्रीकरण के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है सक्षम या वनस्पति discoideum कोशिकाओं के विभिंन फ्लोरोसेंट-जो स्थानीयकरण के एक chemoattractant के साथ उत्तेजित कोशिकाओं में परिभाषित किया गया था लेबल व्यक्त । दो अग्रणी धार मार्करों, Crac और चूने के पीएच डोमेनΔcoil, जो PIP3 या नव-बहुलक actin द्वारा भर्ती कर रहे हैं, दोनों के रूप में पहले की रिपोर्ट (चित्रा 2a, पूरक फिल्म 1) आराम कोशिकाओं में ज्यादातर cytosolic स्थानीयकरण दिखाया )4,29. उन कोशिकाओं में, जो बेसल रूप से सक्रिय थीं, इन pseudopods के सुझावों पर भी देखा जा सकता है । 2 एस, के लिए कतरनी प्रवाह के साथ उत्तेजना के बाद तेजी से एक चोटी के साथ प्रांतस्था को स्थानीय ~ 6 से 10 एस, और ~ 30 एस द्वारा cytosol को लौट आए । इसके विपरीत, एक विश्र्व बढ़त मार्कर PTEN उत्तेजना (चित्रा 2a) से पहले प्रांतस्था में स्थानीयकृत । कतरनी प्रवाह के साथ एक संक्षिप्त नाड़ी के बाद, cytosolic PTEN तीव्रता वृद्धि हुई है, हालांकि प्रमुख बढ़त के लिए की तुलना में धीमी गतिशीलता के साथ संवेदी. cytosol से प्रांतस्था करने के लिए, और इसके विपरीत में एक परिवर्तन, स्पष्ट रूप से cytosolic प्रतिक्रिया की सरल ठहराव के लिए अनुमति तीव्रता में परिवर्तन के रूप में देखा जाता है ।

मनाया व्यवहार तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में उपसंवेदी के अग्रणी और एकरूप chemoattractant के साथ उत्तेजना के जवाब में किनारे स्थानीयकरण गतिशीलता के अनुरूप है । यह व्यवहार तीन विसेंसरों को दर्शाने वाला अनोखा नहीं था. के रूप में पहले से प्रकाशित, स्थानीयकरण में इसी तरह के परिवर्तन भी अग्रणी एज मार्करों आरबीडी और RalGDS, जो सक्रिय रास और Rap1, क्रमशः, साथ ही साथ एक और विश्र्व बढ़त मार्कर के लिए की पहचान के लिए मनाया गया CynA22,30।

इसी तरह की परख के लिए एक इनपुट लाइन से प्रयोगात्मक सेटअप के एक साधारण संशोधन द्वारा विभिंन अवरोधकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक डबल एक । इस विधि का उपयोग करते हुए, कक्षों को नियंत्रण शर्तों, और उसके बाद इच्छित परीक्षण एजेंट है जो बफ़र के लिए स्विच करने के लिए पहले उजागर हो सकते हैं । उदाहरण के लिए, actin-depolymerizing दवा लता के अलावा आरबीडी की प्रतिक्रिया को अवरुद्ध, साथ ही चूनेΔcoil, तीव्र यांत्रिक उत्तेजना (चित्रा बीसी) के लिए.

वैश्विक प्रतिक्रिया पहले से ही कतरनी प्रवाह के साथ लंबे समय तक उत्तेजना के तहत सेल माइग्रेशन

दृष्टिकोण यहां भी डी. discoideum प्रवास पर कतरनी प्रवाह के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है वर्णित है । वास्तव में, अगर प्रवाह बंद नहीं था 2 एस के बाद, लेकिन प्रयोग की अवधि के लिए पर बने रहे, वनस्पति कोशिकाओं के प्रवाह के खिलाफ प्रवास का निर्देश दिखाया (चित्रा 3, पूरक फिल्म 2) । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कतरनी एक प्रवासी प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रवाह दबाव है कि आम तौर पर वनस्पति कोशिकाओं में तीव्र उत्तेजना के साथ एक वैश्विक प्रतिक्रिया हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था की तुलना में कम था (उदाहरण के लिए, के रूप में चित्रा बीमें देखा) । हालांकि, यहां तक कि कम दबाव में, कोशिकाओं को एक मजबूत वर्दी प्रतिक्रिया प्रदर्शित, के रूप में चूने केΔcoil स्थानीयकरण में परिवर्तन से मापा, कि सेल की स्थिति में ही किसी भी परिवर्तन से पहले । इस प्रकार, इन प्रयोगों से स्पष्ट रूप से पता चला है कि 1) वैश्विक प्रतिक्रिया सेल के आंदोलन पर निर्भर नहीं करता है, और 2) वैश्विक प्रतिक्रिया से पहले निर्देशित माइग्रेशन ।

तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए परीक्षण प्रतिक्रिया के वैकल्पिक दृष्टिकोण

हालांकि एक प्रवाह के उपयोग के माध्यम से चैंबर तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए स्पष्ट लाभ है, हम भी तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के परीक्षण के लिए दो अतिरिक्त परख मान्य । के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, चूनेΔcoil तेजी से और क्षणिक फिर से cytosol से स्थानीयकृत प्रांतस्था जब कोशिकाओं या तो एक micropipette (चित्र 4a) या मैंयुअल रूप से थोक का उपयोग करके दिया बफर के अलावा बोल्स द्वारा उत्तेजित किया गया एक पिपेट (चित्रा 4B) के साथ बफर अतिरिक्त । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन दोनों परख के एक स्पष्ट नुकसान यह है कि कतरनी बल की सटीक राशि कोशिका को दिया अज्ञात है, और आसानी से विविध नहीं किया जा सकता है । हालांकि, स्थितियों के लिए जहां यांत्रिक और रासायनिक उत्तेजनाओं के बीच स्विचन वांछित है, थोक बफर इसके अलावा प्रवाह डिवाइस में उत्तेजना के लिए एक ठोस विकल्प प्रदान करता है ।

Figure 1

चित्रा 1: तीव्र यांत्रिक या रासायनिक उत्तेजना के लिए D. discoideum कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के जैव रासायनिक आकलन के लिए प्रतिनिधि परिणाम. एकत्रीकरण-सक्षम कोशिकाओं यांत्रिक या रासायनिक उत्तेजनाओं के संपर्क में थे, संकेत दिया समय बिंदुओं पर लीजड, और immunoblotted एंटीबॉडी कि phosphorylated PKBR1 या ERK2 पहचान का उपयोग कर । (क) अनुयाई कोशिकाओं 5 एस के लिए एक कक्षीय शेखर पर उत्तेजित थे । झिल्ली के बराबर प्रोटीन लोडिंग दिखाने के लिए Coomassie शानदार नीली (CBB) से सना हुआ था । (ख) अनुयाई कोशिकाओं के मैनुअल आंदोलन से एक पार वार तरीके से उत्तेजित किया गया लगभग 5 एस के लिए 1 µ मीटर शिविर या बफर (वाहन), या बिना किसी रासायनिक उत्तेजना के अलावा कारण रासायनिक उत्तेजना के बाद (-) । दो immunoblots PKBR1 के बेसल सक्रियण में भिंनता की हद तक दिखाने के समय 0 पर देखा । कभी-कभार, PKBA सक्रियण भी इस तकनीक से पता लगाया जा सकता है, जैसा कि निचले फलक में दिखाया गया है । (C) निलंबन कक्ष 1 µ मीटर शिविर या बफर (वाहन) के साथ उत्तेजित थे । इस आंकड़े का हिस्सा (क) Artemenko एट अलसे संशोधित किया गया है । (२०१६) 22. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: तीव्र यांत्रिक उत्तेजना और माइक्रोस्कोप पर एकल कोशिकाओं के लाइव इमेजिंग के लिए प्रतिनिधि परिणाम. (क) एकत्रीकरण-सक्षम डी. discoideum कोशिकाओं आरएफपी व्यक्त चूनेΔcoil, या GFP-टैग पीएच-Crac या PTEN एकतरफ़ा लामिना प्रवाह के साथ 15 dyn/2 के लिए 2 से 5 एस के लिए प्रेरित किया गया । छवियों हर 3 एस एकत्र किए गए . यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में translocation को दिखाने वाले प्रतिनिधि कोशिकाएँ दिखाई जाती हैं. प्रांतस्था में प्रत्येक के संचय के लिए समय 0 के लिए सामान्यीकृत मतलब cytoplasmic तीव्रता के व्युत्क्रम के रूप में मात्रा था । 18 (चूनाΔcoil), 20 (PH-Crac), या 6 (PTEN) कक्षों का औसत प्रतिसाद दिखाया गया है । मूल्यों का मतलब है ± एसई । (ख) वनस्पति कोशिकाओं आरएफपी-चूनेΔcoil-आरएफपी और GFP-टैग व्यक्त आरबीडी वाहन के साथ इलाज किया गया या 5 µ मीटर लता से कम 15 मिनट के लिए, और फिर ४१ एकतरफ़ा पर लामिना dyn प्रवाह के साथ उत्तेजित 2 के लिए सेमी2 एस छवियों को एकत्र किया गया हर 3 एस आरबीडी-GFP और चूने केΔcoil-आरएफपी संचय प्रांतस्था में (एक) के रूप में मात्रा था । मूल्यों का मतलब है ± एसई । विश्लेषण कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक शर्त के बगल में संकेत दिया है । स्केल बार = 10 µm । यह आंकड़ा Artemenko एट अल से संशोधित किया गया है । (२०१६) 22. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि के परिणाम के लिए D. discoideum कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के प्रवाह के साथ लंबे समय तक उत्तेजना । (क) वनस्पति आरएफपी-टैग चूनेΔcoil व्यक्त कोशिकाओं को 15 dyn/सेमी2 में सतत एकतरफ़ा लामिना प्रवाह के संपर्क में थे और हर 3 की छवि 11 कोशिकाओं की पटरियों में दिखाया गया है (बी) । स्केल बार = 10 µm । यह आंकड़ा Artemenko एट अल से संशोधित किया गया है । (२०१६) 22. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए प्रतिनिधि परिणाम. (क) वनस्पति D. discoideum कोशिकाओं आरएफपी-टैग चूनेΔcoil एक micropipette को उजागर किया गया (*) बेसल एक धीमी दर से परख बफर जारी । प्रवाह की दर में एक संक्षिप्त वृद्धि की परख बफर के एक बोल्स के तेजी से वितरण द्वारा समय पर प्राप्त किया गया था 0 । छवियां एकत्र किए गए हर 3 एस (ख) वनस्पति D. discoideum कोशिकाओं को व्यक्त आरएफपी-टैग चूनेΔcoil एक सूक्ष्म चैंबर में एक छोटी बूंद के रूप में मढ़वाया यांत्रिक रूप से बफर की एक बड़ी मात्रा के अलावा द्वारा उत्तेजित थे चैंबर. छवियां हर 3 s. स्केल पट्टी = 10 µm. Part (A) इस आंकड़े के एकत्र किए गए Artemenko एट अल से संशोधित किया गया है । (२०१६) 22. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

पूरक फिल्म 1: तीव्र यांत्रिक उत्तेजना तेजी से और क्षणिक translocation चूने केΔcoil-आरएफपी या पीएच-Crac-GFP से cytosol को एकत्रीकरण में प्रांतस्था-सक्षम डी. discoideum कोशिकाओं को इन-संवेदी एक्सप्रेस । एकतरफ़ा लामिना प्रवाह 0 समय पर 5 एस के लिए चालू किया गया था और कोशिकाओं 3 एस अंतराल पर imaged थे । प्लेबैक गति है 5 फ्रेंस/ प्रत्येक कक्ष पंक्ति के लिए दो उदाहरण दिखाए जाते हैं । स्केल बार = 10 µm । यह फिल्म चित्रा 2a से मेल खाती है और Artemenko एट अल से संशोधित किया गया है । (२०१६) 22. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

पूरक फिल्म 2: सतत यांत्रिक उत्तेजना तेजी से और translocation के क्षणिकΔcoil-आरएफपी के cytosol से प्रांतस्था करने के लिए प्रवाह की दिशा के खिलाफ कोशिकाओं के प्रवास से पहले की गति से चलाता है । वनस्पति कोशिकाओं चूनेΔcoilव्यक्त-आरएफपी 15 dyn/सेमी2 में निरंतर कतरनी तनाव को उजागर किया गया 0 समय पर शुरू करने और 3 एस अंतराल पर imaged । प्लेबैक गति 10 फ्रेम/एस पैमाने बार = 10 µm है । यह फिल्म चित्रा 3 से मेल खाती है और पहले Artemenko एट अल में प्रकाशित किया गया है । (२०१६) 22. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

तरीके यहां वर्णित एक सुविधाजनक तरीका है दोनों जनसंख्या और कतरनी प्रवाह के जवाब में अलग सेल व्यवहार का आकलन प्रदान करते हैं । महत्वपूर्ण बात, जबकि पिछले अध्ययन के अग्रणी और प्रवास के दौरान धार मार्करों के स्थानीयकरण का विश्लेषण, वर्तमान दृष्टिकोण तीव्र कतरनी प्रवाह को लागू करने से तत्काल प्रभाव की जांच की अनुमति देता है । इस विधि का उपयोग कर हम है कि, वास्तव में, कोशिकाओं के प्रारंभिक प्रतिक्रिया के लिए कतरनी प्रवाह सेल माइग्रेशन की आवश्यकता नहीं है । इसके बजाय, प्रारंभिक कतरनी प्रवाह उत्तेजना के लिए तेजी से और क्षणिक प्रतिक्रिया दिशात्मक विकतरनी प्रवाह के लिए लंबे समय तक जोखिम के साथ देखा प्रवास से पहले, इसी तरह प्रारंभिक वैश्विक एक chemoattractant ढाल के साथ देखा प्रतिक्रिया के लिए ।

जैव रासायनिक और सूक्ष्म दृष्टिकोण पूरक डेटा उपज भले ही प्रत्येक विधि अलग फायदे और नुकसान है । सेल lysis और PKBs, KrsB, और ERK, उदाहरण के लिए, के immunoblotting के बाद उत्तेजना कोशिकाओं की एक पूरी आबादी का विश्लेषण करती है और इस प्रकार सेल के लिए सेल भिंनता है, एक परख है कि व्यक्तिगत सेल व्यवहार की जांच के विपरीत । हालांकि, जनसंख्या आधारित परख कोशिका व्यवहार में सूक्ष्म परिवर्तन है कि आसानी से व्यक्तिगत कोशिकाओं का विश्लेषण करके देखा जा सकता है मुखौटा हैं । इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित जैव रासायनिक परख केवल एकत्रीकरण-सक्षम कक्षों के साथ प्रभावी है, कारणों के लिए जो बाद में चर्चा की जाएगी । इसके विपरीत, आरबीडी, RalGDS, पीएच-Crac, चूनाΔcoil, और PTEN के स्थानीयकरण की सूक्ष्म-आधारित परख, उदाहरण के लिए, प्रांतस्था और cytosol के बीच, वनस्पति और एकत्रीकरण दोनों सक्षम कोशिकाओं के लिए प्रभावी है, और इस तरह टिप्पणियों के लिए अनुमति देता है कि मोटे तौर पर ध्रुवीकरण की डिग्री बदलती के साथ कोशिकाओं पर लागू होते हैं । क्या दो पूरक दृष्टिकोण बनाता है तथ्य यह है कि वे उपलब्ध की विभिंन सेट की जांच अग्रणी/विश्र्व एज मार्करों, इस प्रकार संकेत transduction और actin cytoskeleton नेटवर्क कतरनी प्रवाह परख के साथ परीक्षण के कवरेज का विस्तार ।

यह स्पष्ट नहीं है क्यों वनस्पति कोशिकाओं, जो बहुत मजबूती से सूक्ष्म में प्रतिक्रिया आधारित परख, सेल lysis और immunoblotting द्वारा पीछा उत्तेजना का जवाब नहीं है । एक संभावना है कि कतरनी बल की मात्रा कोशिकाओं को लागू जब प्लेट घुमाया जाता है एक प्रवाह कक्ष में कोशिकाओं द्वारा अनुभवी बल से मेल नहीं खाता । विकसित कोशिकाओं, इसके विपरीत, सक्रियण के लिए एक कम सीमा हो सकता है, और, इस प्रकार, या तो शर्त के तहत जवाब । यह संभावना नहीं है कि जैव सेंसरों जिनकी गतिविधि के द्वारा मापा जाता है रासायनिक परख व्यक्त नहीं कर रहे हैं या वनस्पति कोशिकाओं में सक्रिय नहीं हैं, फोलिक एसिड के साथ वनस्पति कोशिकाओं की उत्तेजना के बाद से दोनों PKBR1 के मजबूत सक्रियण की ओर जाता है/PKBA और ERK2 (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इसके अलावा, वनस्पति कोशिकाओं पीएच के स्पष्ट भर्ती-Crac, जो PIP3 संचय को दर्शाता है, माइक्रोस्कोपी आधारित परख में दिखाते हैं । चूंकि PKBA भर्ती भी PIP3 पर निर्भर करता है, यह संभावना नहीं है कि PKBA तीव्र यांत्रिक उत्तेजना का जवाब नहीं होता, जब तक जैव रासायनिक परख में शर्तों के रूप में ऊपर उल्लेख इष्टतम नहीं हैं । यह सक्रिय जांच का क्षेत्र बना हुआ है ।

chemotaxis नियामकों के जैव रासायनिक विश्लेषण प्रयोग भर में कैफीन की उपस्थिति की आवश्यकता है । मूलतः कैफीन सेल को रोकने के लिए शिविर के स्राव के कारण संकेत करने के लिए जोड़ा गया था । हालांकि, ऐसा लगता है कि कैफीन adenylyl cyclase के निषेध के अलावा एक और भूमिका है (ऐका) के बाद से ऐका-अशक्त कोशिकाओं को अभी भी तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में PKBR1 के फास्फारिलीकरण के लिए कैफीन की आवश्यकता है । कैफीन पहले TorC2 गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए दिखाया गया है26। यह संभव है कि TorC2 के निषेध कोशिकाओं के कुछ बेसल गतिशीलता अवरुद्ध, और इस तरह PKBR1 और संकेत transduction और actin cytoskeleton नेटवर्क के अंय घटकों के बेसल सक्रियण कम । कम बेसल गतिविधि कतरनी प्रवाह के लिए प्रतिक्रिया देख के लिए जरूरी था । वास्तव में, जब कोशिकाओं के विकास के दौरान पहले समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे, वे बेसल गतिविधि और एक कम कतरनी-प्रेरित प्रतिक्रिया प्रवाह बढ़ प्रदर्शित । दिलचस्प है, यह ज्ञात है कि वनस्पति कोशिकाओं को आनुपातिक रूप से अधिक PKBA गतिविधि है और विकसित कोशिकाओं की तुलना में कम PKBR131. यह संभव है कि बेसल राज्य कुछ अलग वनस्पति और एकत्रीकरण-सक्षम कोशिकाओं में विनियमित है, और जैव रासायनिक परख में वनस्पति कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की कमी करने के लिए योगदान । मजे की, जब कोशिकाओं के विकास के बाद के अंक पर एकत्र थे, वे भी एक कम प्रतिक्रिया थी, की संभावना स्थानीयकरण और विभिंन chemotaxis इस परख में जांच नियामकों के सक्रियकरण पर ध्रुवीयता के मजबूत प्रभाव के कारण ।

एक सूक्ष्म कक्ष में कोशिकाओं की उत्तेजना से पता चला कि दोनों ताकत और उत्तेजना की अवधि के लिए अधिक से अधिक प्रतिक्रिया22योगदान । दूसरे शब्दों में, एक अधिक से अधिक प्रतिक्रिया भी एक कम कतरनी बल के साथ प्राप्त किया जा सकता है अगर यह समय की एक लंबी अवधि के लिए लागू है (10 एस बनाम 2 एस) । इस अवलोकन बताते क्यों कोशिकाओं को एक प्रारंभिक वैश्विक प्रतिक्रिया जब वे पहली बार एक सतत के संपर्क में हैं, लेकिन कमजोर, उत्तेजना है कि कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवास की ओर जाता है । वर्तमान उपकरण के साथ, हम सीमा के निचले छोर की जांच करने के लिए कम पर्याप्त कतरनी प्रवाह उत्पन्न करने में असमर्थ थे.

शायद, तीव्र यांत्रिक उत्तेजना का उपयोग किए गए अध्ययनों का सबसे महत्वपूर्ण निहितार्थ यह है कि दोनों यांत्रिक और रासायनिक उत्तेजनाओं आम संकेत transduction और actin cytoskeleton नेटवर्क में फ़ीड करने के लिए दिखाई देते हैं । हालांकि हमने दिखाया है कि दो उत्तेजनाओं यांत्रिक उत्तेजना के लिए थोक बफर इसके अलावा का उपयोग कर एकीकृत, भविष्य के अध्ययन के लिए एक प्रणाली है जहां chemoattractant तेजी से प्रवाह के माध्यम से दिया जा सकता है विकसित करने के लिए लक्ष्य होगा चैनल के माध्यम से, जो एक बहुत अधिक बहुमुखी होगा और यांत्रिक और रासायनिक उत्तेजनाओं के एकीकरण का आकलन करने के लिए शक्तिशाली तरीका है । दुर्भाग्य से, chemoattractant इसके अलावा वर्तमान दो लाइन सेटअप का उपयोग कर एक दूसरे कतरनी प्रवाह उत्तेजना के साथ जुड़ा हुआ है क्योंकि chemoattractant प्रवाह की उपस्थिति में दिया जाना है । एक व्यवहार्य विकल्प लेजर एक बंदी अग्रदूत साबित के रूप में सफलतापूर्वक Westendorf एट अलद्वारा शिविर के लिए दिखाया गया था से एक chemoattractant की रिहाई उत्तेजित हो सकता है । ३२. भविष्य में, यह भी अंय उत्तेजनाओं के एकीकरण की जांच करने के लिए दिलचस्प होगा, उदाहरण के लिए, कतरनी प्रवाह और चर बिजली के खेतों, या कतरनी प्रवाह और चर सब्सट्रेट कठोरता । उत्तरार्द्ध उदाहरण दिलचस्प है क्योंकि यह यांत्रिक उत्तेजना के दो प्रकार शामिल है, हालांकि प्रारंभिक संकेत स्वागत उन दोनों के बीच अलग हो सकता है । पुष्टि की है कि सभी उत्तेजनाओं कि प्रेरित माइग्रेशन एक ही संकेत transduction नेटवर्क का हिस्सा है और केवल में बदलती कैसे उत्तेजना समझा जाएगा कैसे कोशिकाओं जटिल वातावरण में नेविगेट कर सकते हैं । अंत में, हम पहले से ही प्रदर्शन किया है कि कतरनी प्रवाह के साथ तीव्र उत्तेजना मानव न्युट्रोफिल के प्रसार की ओर जाता है-कोशिकाओं की तरह22। भविष्य के काम आगे स्थानीयकरण और संकेत transduction और स्तनधारी कोशिकाओं में यांत्रिक उत्तेजनाओं के साथ actin cytoskeleton नेटवर्क के विभिंन घटकों के सक्रियकरण की जांच करेंगे ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान R35 GM118177 द्वारा PND को समर्थन दिया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक १२९ सिग्नल transduction mechanotransduction कतरनी तनाव chemotaxis rheotaxis कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवास निर्देशित प्रवास जैव सेंसर स्थानीयकरण तीव्र उत्तेजना
तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के लिए <em>Dictyostelium discoideum</em> प्रतिक्रिया का मूल्यांकन
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