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Biology

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々 な蛋白質の活性化をテストします。

Abstract

走化性、または、走化性因子のグラデーションを移行は、指示移行の最高の理解できるモードです。社会的なアメーバを用いた研究キイロタマホコリカビは並列経路の複雑なシグナル伝達ネットワーク走化性因子への応答を増幅し、偏ったアクチンの重合との仮足の突起が生じることを明らかにした、グラデーションの方向。対照的に、作用するせん断流れまたは電界への暴露による指示の移行などの他の種類の運転機構は知られていません。走化性の多くのレギュレータはローカリゼーションまたはグローバル刺激、走化性因子の活性化に一時的な変更を表示し同様、リーディング エッジまたは遅れエッジ移行細胞の局在を示します。指示移行の他の種類の分子機構を理解するには、せん断流れに (2-5 s) の簡単な露出に基づく急性の機械的刺激に対する細胞応答の検討を可能にする方法を開発しました。この刺激は、個々 のセルの動作を調べるバイオ センサーの蛍光標識を発現する細胞をイメージしながら、チャネルで配信できます。さらに、溶解し, プレートとエスディーエス興味の蛋白質のアクティブなバージョンを認識する抗体を使用してセル人口を刺激できます。両測定法を組み合わせることによって 1 つは変化細胞内局在および/またはリン酸化によって活性化分子の広い配列を調べることができます。このメソッドを使用して急性の機械的刺激が走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークの活性化を引き起こすことを求めました。急性の機械的刺激に対する細胞応答を調べる機能せん断流動誘起運動に必要な開始のイベントを理解するために重要です。このアプローチは、走化性因子受容体の交絡影響なし走化性シグナル伝達ネットワークを勉強するためのツールを提供します。

Introduction

真核細胞の移行は水溶性または基質結合塩基のグラデーション、基板、電気フィールド、またはせん断流の可変剛性を含む環境の多様な化学と物理の合図によってバイアスされています。走化性を運転する分子機構の理解に多くの進歩をされているが、以下は指示移行と統合を生成する細胞レベルでこれらの多様な信号を統合する方法の他の種類について知られている渡り鳥応答。

監督、走化性因子の集積が進む方向への移動には行動の 3 つのコンポーネントが含まれます: 運動方向検出、極性1。運動は、仮足突起により細胞のランダムな動きを指します。方向性、走化性因子の原因を検出する細胞の能力は、センシングでも発生することができます細胞を固定化しました。極性は、リーディング エッジと運動の増加の永続につながる細胞の遅行エッジ間細胞内コンポーネントのより安定した非対称的な配分を指します。

4 つの概念上定義された制御ネットワークの活動に依存する、走化性因子への細胞応答: 受容体/極性1アクチン細胞骨格、シグナル伝達蛋白質 G。G タンパク質共役型受容体への走化性因子のバインドは、ヘテロ三量体 G タンパク質 α と βγ 方向信号を増幅する下流のシグナル伝達ネットワークを経由で信号を送信します。シグナル伝達ネットワーク内の複数経路並行行為し、アクチン細胞骨格ネットワーク バイアス アクチン重合とグラデーションの方向に、結果として仮足突起にフィードします。走化性の重要な規制当局の間では、しますグアニル酸シクラーゼ、ホスファターゼとは、テンシンの相同物 (PTEN) ホスホイノシチド 3-キナーゼ (PI3K) Ras GTPase、TorC2。シグナル伝達ネットワークの内で、およびシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワークをさらにフィードバック機構は、応答を増幅します。最後に、定義が不十分な極性ネットワークはアクチン細胞骨格から入力を受け、さらにグラデーションの方向で永続的な移行を促進するシグナル伝達ネットワーク バイアスがかかります。

走化性のメカニズム理解の多くは、制御ネットワークのさまざまなコンポーネントのタグ付きの蛍光バイオ センサーの開発のために可能になった。多くの走化性規制規制分子自体またはその活動の非対称的な配分があります。たとえば、認識バイオ アクティブ バージョンの小さな低分子量 g 蛋白質 Ras や Rap1-Ras 結合ドメイン (称します RBD) Raf1 のモデル、それぞれ-chemotaxing 携帯2,3のリーディング エッジにローカライズします。同様に、PI3K およびその製品ホスファチジルイノシトール (3,4,5)-三リン酸 (PIP3)、プレクストリン相同性 (PH) ドメインで認識もセル4、5の前面にローカリゼーションを表示します。対照的に、3 ホスファターゼ PTEN 変換 PIP3 ホスファチジルイノシトール (4, 5) に戻る-ビスリン酸、ローカライズ セル6のラギングの端に。重要なは、これらのバイオ センサーは、走化性因子とグローバルの刺激への応答への局在を変更します。ゾル性細胞質または皮質局在と欠席しているエッジ マーカーの遅れをとっているに対し、皮質に戻して静止細胞の突起の先端にリーディング エッジ マーカー静止細胞の突起の先端からなる後ゾル性細胞質刺激。バイオ センサー、走化性因子とグローバルの刺激への応答分布の解析は、運動と極性、観測をしばしば混同の貢献を最小化します。走化性因子、細胞懸濁液のグローバルまたは一様刺激はしばしばタンパク質リン酸化7,8,9によって検出される蛋白質のアクティブ化人口全体の変更を評価するツールとして使用も.顕微鏡制御ネットワークのさまざまなコンポーネントの動作に関する時間的・空間的情報を収集するために使用に対し主、この生化学的な試金は時間情報を取得する使用されます。

シグナル伝達ネットワークには、興奮性システム10,11の機能が組み込まれています。スープラしきい値走化性刺激に対する応答は「全か無か」であり、不応期が表示されます。応答が確率的に発生しても、振動現象を示すことができます。シグナル伝達イベント波12,13,14,15として伝播する大脳皮質の領域に局在しています。前面、または背面、マーカー、募集または伝播する波のアクティブ ・ ゾーンから切り離します。末尾のアクティブなゾーン ・難治性地域のため逆方向の波を彼らを満たして全滅させます。伝搬波の信号伝達細胞移行10を仲介する細胞の突起の根底にあります。

同じような調節機構が好中球とその他哺乳類の細胞の種類16 に該当するも、走化性については前述の多くはキイロタマホコリカビ、社会的なアメーバの研究から来た.細胞性粘菌単一細胞の何千もを最終的に胞子を含む多細胞の子実体を形成集計センターへ移行と飢餓では、堅牢な走化性応答のある確立されたモデル有機体をあります。走化性は、この生物の細菌の食料源を検索するための単一細胞の成長段階も重要です。重要なは、単一の細胞性粘菌の移行は、哺乳類の好中球または非常に急速なアメーバ型移行を受けるすべての転移性癌細胞の移行に似ています。実際には、両方全体的な制御ネットワークのトポロジと同様、走化性に関与する個々 のシグナル伝達経路の多くは、細胞性粘菌と哺乳類白血球17の間保存されます。さらに、線維芽細胞など、他のセルは、Gpcr; 代わりに受容器のチロシンのキナーゼ (RTK) を使用します。ただし、RTKs は同じようなネットワークにフィード可能性があります。

走化性と対照をなして指示移行の他の各種のモードを駆動する信号メカニズムの理解が欠けています。同様に細胞走化性因子のグラデーションで移行するいくつか報告されている活性化および/または局在アクチン重合、PIP3 および/または細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) 1/2 を含む典型的なリーディング エッジ マーカーで、経るセルの前面は、作用するせん断流れまたは電界18,19,20,21の変更への応答で移行を指示しました。しかし、これらの研究の刺激に連続暴露も結果細胞遊走と疑問が残ったかどうか、具体的には、刺激に対する反応のリーディング エッジ マーカーのローカライズなど、または彼らは単にリーディング エッジにローカライズために移行するセルの前面に仮足数の増加。

人口レベルで両方のせん断流れと個々 のセル22として配信される急性の力学的摂動に対する細胞の反応を観察することができるアッセイを開発しました。走化性因子、急性 stimula グローバル刺激に似ていますせん断流のグローバリゼ-ションは、運動または極性から交絡の貢献をせず機械的刺激に対する細胞応答の研究をことができます。遺伝的または薬理学的摂動とこれらの生化学的および顕微鏡的アッセイを組み合わせることにより、私たちはどのように力学的刺激については、認識されて学ぶことして転送します。また、このアプローチはまた走化性因子、受容体/G からシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワーク分離のない状態で走化性因子の受容体の下流のシステムへのタッピング法を提供しますタンパク質ネットワーク。

最近我々 は以下の方法を使用して、走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク22の複数のコンポーネントの活性化につながるその急性のせん断応力を示した。さまざまな間隔で急性の機械的刺激により、我々 は、同様にする走化性因子、力学的刺激に対する応答も展示下応答の全か無かの動作を含む、興奮性システムの機能実証飽和条件と不応期の存在。最後に、機械的、化学的刺激を組み合わせることによって示したシグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク、可能性があります複数バイアス細胞遊走刺激の統合を可能にする、2 つの刺激を共有します。

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Protocol

1 ですソリューションの準備

  1. 以下を使用して準備 HL 5 メディア: ブドウ糖 10 g/L、10 g/L プロテオース ・ ペプトン 5 g/L 酵母エキス、0.965 グラム/L の Na 2 HPO 4 ·7H 2 O、0.485 g/L KH 2。PO 4、そして、特記されない場合は、脱イオン水で 0.03 g/L ストレプトマイシン。オートクレーブ中、室温で保管します
    。 注: プロテオース ペプトン、酵母エキスの異なるサプライヤーから入手した間だけでなく、個々 のバッチ間の違いによるメディアの pH は 6.4 に 6.7 の典型的な範囲に調整する必要があります
    2. 。
  2. 準備 SM 板次を使用して: ブドウ糖 10 g/L、10 グラム/L のペプトン 1 g/L 酵母エキス、2.31 g/L KH 2 PO 4、1 g/L K 2 HPO 4、および脱イオン水 20 グラム/L の寒天。オートクレーブ、クール、そして 10 cm シャーレごと寒天溶液 30 mL を注ぐ。寒天が固化したら 1 ヶ月の 4 ° C でプレートを保存します
    3. 。
  3. 準備 10 リン酸バッファー (PB) を使用して x 13.4 グラム/L の Na 2 HPO 4 ·7H 2 O および 6.8 g/L KH 2 PO 4 脱イオン水。4 で 10 x の在庫を格納を使用するために脱イオン水で 1 x ° C. Dilute
    4. 。
  4. X 2 mm MgSO 4 PB と 0.2 mM CaCl 2 1 を補うことで DB バッファーを準備します
    5. 。
  5. 脱イオン水で準備 100 mM カフェイン。デパート − 20 ° C
  6. 準備 100 mM キャンプ原液は脱イオン水でキャンプ ナトリウム一水和物の溶解によって。脱イオン水で通常在庫 1 mM を準備します。両方の原液を保存 − 20 ° c. の準備最終キャンプ ソリューション実験の日に DB に必要な濃度で
    。 注: 在庫ソリューションすることができます凍結融解に数回
    7. 。
  7. 1 x で準備 25 mM 葉酸 PB。パウダーが完全に溶けるまでは、1 N NaOH を数滴を追加します。デパート − 20 ° C
  8. 準備 3 x サンプルバッファー次を使用して: 187.5 mM トリス塩酸 pH 6.8, 6% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS)、30% のグリセロール、126 mM ジチオトレイトール、0.03% (w/v) ブロモフェノール ブルー。因数と店で − 20 ° C
    1. 前に使用し、37 ° C の水浴で解凍 3 x 1 x サンプルバッファーを希釈して 1 x、ピロりん酸ナトリウム 25 mM, 2 mM Na 3 VO 4 50 mM NaF を追加プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤サンプル バッファーを準備します。完全無料の EDTA プロテアーゼ抑制剤のカクテル脱イオン水で。手順 3.1.2-3.1.3 で説明されている手順を開始する前にすぐに、阻害剤を追加します
      2. 。
  9. 5 mM Latrunculin A DMSO 溶液を準備します。因数と店で − 20 ° C

2。D. キイロタマホコリカビ 細胞の調製

注: HL 5 メディアにおける D. キイロタマホコリカビ 細胞培養プレートのいずれかを維持または懸濁液の文化は、 23 を前述しました。必要に応じて、変換は標準エレクトロポレーション プロトコル 24 によると蛍光標識したバイオ センサーによる細胞します。バイオ センサーや関心の他の遺伝子をプラスミドと同様、様々 な D. キイロタマホコリカビ 株 Dicty ストック センター (dictybase.org) から入手できます

。
  1. 成長と栄養 D. キイロタマホコリカビ 細胞のコレクション
    1. 分析栄養細胞の成長、macropinosomes の数を減らすために通常見られる細菌の存在下で細胞axenically 成長細胞 25。
      1. 準備 機構の解析 文化を抗生物質なし HL 5 媒体の任意のボリュームに少数のグリセロール ストックからまたは以前の文化からの細胞を接種。16-18 のため室温 (20-22 ° C) で 200 rpm (0.42 x g) で軌道シェーカーで細菌培養を孵化させなさい
        注: K。ここで使用される 水素生成菌 株は非病原性 (材料の表 を参照してください).
    2. 組織培養プレートまたは懸濁培養から指数関数的成長段階に D. キイロタマホコリカビ を収集し、メーカーによると検定を使用してセルをカウント ' の指示。SM 板 260 μ k. 食 サスペンションを 1 x 10 5 D. キイロタマホコリカビ 細胞を拡散します。次の日ダウン上下プレートの電源を入れます。D. キイロタマホコリカビ 細胞細菌の芝生をクリアして起動するまでが、集計を開始する前に室温で細胞を成長 (36 ~ 48 h).
    3. 収集 D. キイロタマホコリカビ 細胞ガラス スプレッダーとそれらを削って 5 mL DB バッファー。50 mL ポリプロピレン チューブに細胞を転送します。別の 5 mL DB バッファーとプレートとオリジナルの懸濁液をプールにすすいでください。DB バッファーを 50 mL チューブを入力します
      4. 。
    4. 3-4 分間 360 x g で d. 菌 懸濁液遠心、上清を吸引し、50 mL にペレットを再懸濁します DB バッファー。洗浄のステップ上清までクリア (3 〜 へ 4 洗浄) を繰り返します。〜 10 6 セル/mL x 5 の最終密度 DB バッファー内の最後のセルのペレットを再懸濁します
      5. 。
  2. 集計の準備-主務 D. キイロタマホコリカビ 細胞
    1. 標準に従ってすべての 6 分後に飢餓と 50 nM のキャンプとパルスの 4 h 1 h 飢餓による細胞の開発 D. キイロタマホコリカビ 23 のプロトコルします
      2. 。
    2. の次の開発、細胞懸濁液の最終的な量を測定します
      3. 。
    3. 開発のため使用するセル数の初期値に基づく最終的な懸濁液の細胞密度を計算します
      。 注: キャンプは 6 分毎、100 μ L のボリュームで配信された場合、細胞容積により 1 mL キャンプ パルスのすべての時間の。したがって、DB の 4 mL で 8 x 10 の 7 セルを使用して標準的な条件のため開発の 4 h 後最終巻は 7 mL、最終セル密度 ~1.1 x 10 7 セル/mL
      4. 。

3。機械や化学的刺激に対する細胞応答の生化学的解析

の 4 h 後 (手順 2.2) から
    1. プレート 2 x 10 6 集計主務を 急性機械的刺激の細胞に続いてセル換散 の細胞2 ml の DB 35 mm 料理の開発。室温で 10 分間を付けるセルを許可します。1 mL DB で 2 回細胞を洗浄します。プレートの妨害なしで 30 分間 2.5 mM カフェインと DB のセルをインキュベートします
      。 注: 場合細胞薬理学的阻害剤と扱われる必要があります、追加希望濃度の阻害または適切な車両の同じボリューム カフェインと basalation 中です
      2. 。 機械的刺激を適用する
    2. 軌道シェーカーに (一度に 1 つずつ) プレートを置き、すぐに 150 rpm (0.24 x g) 5 でオン s.
      注: プレートも手動では刺激を受けて動き約 5 cross-wise 方法で s.
      3. 刺激の開始後の時間が
    3. 吸引で指定されたバッファー。すぐにプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤 100 μ L のサンプル バッファーを追加することによって、細胞を溶解します
      4. 。
    4. は、氷の上プレートを置き、1.5 mL チューブに液を収集します。' 時間 0 '、振ることがなく細胞を溶解させます。溶解後すぐにチューブを 10 分間 95 ° C の熱ブロックに転送します。免疫ブロットを続行または-20 の lysates を格納 ° C
  2. 、走化性因子と細胞の刺激
    1. 開発の 4 h 後急速に 30 分間軌道シェーカーで 200 rpm (0.42 x g) で 5 mM カフェインの存在下でそれらを揺することによって集約有能なセルを Basalate。
      1. 360 x 細胞懸濁液を遠心分離機 g で 3-4 分間、上清を吸引し、10 mL にペレットを再懸濁します冷たい DB バッファー。洗濯の手順を繰り返します
        2. 。
    2. 4 × 10 の 7 セル/mL の初期細胞数 (手順 2.2 参照) 電池を開発するために使用に基づいての最終的な密度に冷たい DB バッファーで最終的な細胞ペレットを再懸濁します。刺激応答性の前に氷の上細胞懸濁液を保つバッテリ。
      1. 軌道シェーカーにピペット 50 μ 10 μ M のキャンプまたはポリスチレン カップに車両配置します
        2. 。
    3. 細胞を刺激、同じカップに冷たい細胞懸濁液の 450 μ L を追加し、すぐに 200 rpm (0.42 x g) でシェーカーをオンにします。様々 な時代、刺激開始後で (例えば 10、30、45、60、120 s)、一時的に停止、シェーカー、細胞懸濁液の 50 μ 因数を取るし、25 μ L 3 X サンプルバッファーを含む 1.5 mL チューブにそれらを追加することによって、細胞を溶解します。
      1. の ' 時間 0 '、些細の冷たい細胞懸濁液から細胞を使用します
        。 注: 刺激中に細胞懸濁液の最終的な温度は 26 〜 9 ° C です。これらの条件の下でピーク応答に室温 (顕微鏡の付着性細胞の走化性因子刺激や付着性細胞の機械的刺激など) で実行される刺激の観察されたピークより少し後発生します
        2. 。
    4. 溶解後すぐにチューブを 10 分間 95 ° C の熱ブロックに転送します。免疫ブロットを続行または-20 の lysates を格納 ° C
  3. イムノブロット細胞応答の解析
    1. トリス-HCl、4-15% のポリアクリルアミドゲルの lysates (から 3.1.3 または 3.2.4 の手順) を実行、ポリフッ化ビニリデン フッ化物膜、ブロック、およびリン PKC とイムノブロットに転送Ζ (リン PKBR1 とリン PKBA を検出) を Thr410。西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗家兎二次抗体、化学発光基板を用いた化学発光が続くと孵化によって信号を検出します
      2. 。
    2. 複数のタンパク質の検出、除去バッファーでしみを除去し、再一次抗体リン-p42/44 MAPK Thr302/304 (リン ERK2 を検出) するために、プローブします。Coomassie ブリリアント ブルーとポリフッ化ビニリデン フッ化物膜の汚損によって読み込み同じ蛋白質を確認します
      3. 。

4。急性の機械的刺激とライブ イメージング 1 つ上のセルの顕微鏡

  1. フロー装置を用いた急性の機械的刺激に対する応答の評価
    1. を収集し、植生や集計主務を希釈~ DB それぞれ手順 2.1 と 2.2 で説明されているように 10 の 6 セル/mL x 1 のセルです。チャネルを使用してスライドに ~ 600 μ L を読み込む (詳細については 材料の表 を参照してください)。ために 10 分のスライドで入り江のすべては、完全に満ちていることを確認します。必要に応じて余分なバッファーをトップします
      。 注: 分析に使用する特定のスライドが狭く、1 mm のチャンネルにフィードが広い、3 ミリメートルの 1 つのチャンネルにマージし、3 つの入力。チャネルの高さは 0.4 mm です。広い部分だけがイメージ化されるセルは、チャネル全体でメッキが
      2. 。
    2. 流体ユニットのフロント右弁を通して 50 mL タンクに接続されているラインの 1 つを渡す (詳細については 材料の表 を参照してください)。バルブが閉じていることを確認、ポンプ用ソフトウェアを使用して (すなわち 左に)。DB と、リザーバーします。
      1. 50 mbar の圧力を設定し、それを入れます。埋めるし、バルブをそれを開きをクリックして DB の行をすすいでください。0 に戻って圧力を切り、30 ~ 後、バルブを閉め、s.
    3. 空気の泡をトラップすることがなくスライドの 1 つの側面の 3 つの入口の 1 つにラインを接続します。他の 2 つの入り江に差し込みます。スライドの 2 番目の側の単一の入口にドレーンからの線を接続します
      。 注: このセットアップで入力とドレイン線用チューブは、1.6 mm の内径
      4. 。
    4. は、顕微鏡 20 X 空気目的の下にスライドを配置します。チャネルを洗浄するラインを開きをクリックするバルブを切り替える " 力 " (~ 50 mbar または 40 〜 dyn/cm 2) ドレインにを介して液体をプッシュするより高い圧力で始まって。
      1. 液体は下水管から出てくる、一度ゼロに外部からの圧力を減らす (すなわち 重力流れのみ 〜 15 dyn/cm 2)、洗い 〜 30 s. スイッチの反対位置に流れを止めるバルブを続けますと。
        2. 。
    5. 3 秒間隔でオイル目的 X 40 の下で倒立蛍光顕微鏡に RFP または GFP 照明画像を取得します。閉じた状態でバルブと圧力でオンに 15 と 40 dyn/cm 2 の間に通常、所望の圧力 (0 - 50 mbar).
    6. バルブを切り替えることにより、刺激を提供 5 フレームを取得した後、" を開く " 位置。反対方向にバルブを切り替えることによって 2-5 秒後流れをオフします
      。 注: 特定の弱いバイオ センサー (例えば PTEN、サイナ、17 歳、およびモデル) の必要があります石油目的 X 40 を搭載した共焦点顕微鏡を使用してイメージ セルにします
      7. 。
  2. フロー装置を用いた急性の機械的刺激に対する反応の薬理学的阻害剤の試験効果
    1. 4.1.1 の手順で説明するようチャネルをスライドで細胞をプレートします。2 つの明細行の設定: ステップ、4.1.2 のようにフロントの右弁で 1 行を渡す 2 番目後ろから左右の弁。左の線をクランプし、バルブを入れて、" 閉 " (左) の位置。興味 (例えば 5 μ M Latrunculin A) の薬理学的阻害剤を含む溶液を適切な車両と 2 番目を含むデータベースの 1 行を入力します
      。 注: ので、物理的に左の線をクランプする必要がある、" 閉 " 左の位置がそのラインのバルブを開ける
      2. 。
    2. 塗りとリンス 50 mbar の圧力をオンとバルブの切り替え線の右、" を開く " (右) の位置。バルブに切り替えて左 〜 30 s の塗りつぶしと 〜 30 s. 接続のクランプを外して左ラインを洗浄後 2 つのチャネルを使用してスライドの 1 つの側面の入口の両方の行、残りのインレット プラグ、2 番目の側の単一の入口にドレインを接続
    3. は右の行のバッファーを使用してスライドを洗って 4.1.3 および 4.1.4 上記の手順で説明されているように同じバッファーに刺激を実行します
      。 注: このセットアップでの最初の 1 つとして右の行を選択するが順序反転可能性がありますされる
      4. 。
    4. 次の刺激、圧力ゼロ (すなわち 重力流のみ、15 ~ dyn/cm 2) で右の行を開くにバルブを切り替えます。左の線からクランプを外し、バルブを開いてその行に左に切り替えます。最初の行をクランプします
      5. 。
    5. を介して阻害剤と 3-5 mL のバッファーを実行した後右に流れを止めるバルブを切り替えるし、時間の必要な長さの阻害剤で細胞を孵化させなさい (例えば 15 分)。切換弁 〜 15 〜 10 分毎によって流れをオン酸素の剥奪を防ぐために s。2 行目での刺激を繰り返します
      6. 。
  3. マイクロ ピペットを使用して急性の機械的刺激に対する応答を評価するための代替メソッド
    1. によると標準プロトコル 23 DB でいっぱいマイクロ ピペットを設定。1,500 psi で補正圧力を維持します
      2. 。
    2. は、収集し、手順 2.1 栄養細胞を希釈します。少なくとも 10 分付着し、3 ml の DB をカバーできるように ~7.5 x 10 5 セル/mL 1 よくチャンバーの場所 25 μ L 滴
      3. 。
    3. は、40 X 石油目的を搭載した倒立蛍光顕微鏡でチャンバーを配置します。セルを探します。それがまずチャンバーの底に触れるまで優しくビューのフィールドの真ん中にマイクロ ピペットを下げる
      。 注: 1,500 Psi で補正圧力が設定されているのでセル連続にさらされる DB の非常に遅い流れ、マイクロ ピペットから
      4. 。
    4. は、3 秒間隔で RFP または GFP のイルミネーションの画像を取得を開始します。適用、' クリーン ' ピペットから液の塊をリリースします。私をイメージングを続けるn 単独で補正圧力による流量の存在
      5. 。
  4. バルク バッファーによる急性の機械的刺激に対する応答を評価するために別の方法
    1. を収集し、手順 2.1 栄養細胞を希釈します。1 ~ 10 6 セル/mL で DB 8 ウェル室からよく途中で × 20 μ L 細胞滴を配置します。少なくとも 10 分の付着する細胞を許可
    2. は、3 秒間隔で 40 × 対物装備倒立蛍光顕微鏡に RFP または GFP 固有照明の画像を取得を開始します。ドロップのエッジに近い領域に焦点を当てるです
      3. 。
    3. は急速に井戸の 1 つの側面に DB の 430 μ L を追加します。イメージングを続行します
      4. 。
    4. 、機械的、化学的刺激との相互作用の分析 12 または 45 秒の機械的刺激、優しく追加 50 μ L (DB) の車や葉酸 (最終濃度 20 nM) の力学的応答を誘発することがなく。イメージングを続行します
      5. 。
  5. 反応の定量化
    1. 画像解析ソフトで 32 ビット TIFF イメージを開く 27 (詳細については、材料表 を参照してください)
      2. 。
    2. の下で、' 分析 ' タブへ " 設定測定 "。チェックのボックスをオン ' 平均グレー値 '。その他のボックスがチェックされていないことを確認します。クリックして " OK ".
    3. の下で、' プロセス '] タブをクリックして " を引く背景 "。50 ピクセルでローリングの球の半径を保持し、メニューに記載されているオプションのいずれかをチェックしません。1 つのセルを使用してズームイン、' 虫眼鏡 ' ツール
      4. 。
    4. 使用の ' 四角形 ' ツール、細胞質、核や細胞膜上にそれを描画しないように作るのボックス (~2.5 2.5 μ m 2 x) を描画します。プレス " Ctrl " + " M " かへのキー、' 分析 ' タブをクリックして " メジャー " ボックスの平均グレー値を決定します。細胞質のままボックスを確かめて後続のフレーム ・再びメジャーへ進出
      。 注: D. キイロタマホコリカビ 細胞は非常に急速に動くのでボックスに移動できます 1 つのフレームから次に細胞質でそれを維持します
      5. 。
    5. 結局フレームの分析されている、値をワークシートにコピーします。様々 なバイオ センサーの表現のレベルで細胞に変化のために、時間 0 で観測された平均グレー値の値を正規化します。大脳皮質の信号の蓄積を反映する値の逆数を計算します
      6. 。

5。連続の機械的刺激とライブ イメージング 1 つ上のセルの顕微鏡

  1. 上記手順 4.1.1 - 4.1.3 で急性の力学刺激負荷分析のとおりセルを設定します。一度に数分以上の応答を分析した場合、ボリュームを越えることができるのでバッファー付きタンクをカバー プラグを開きます
    。 注: ため貯水池は、実験の間開いたままになります、この試金は外圧のない状態で実施し、重力流だけに依存しています。顕微鏡下の表に、重力によって流れの速度を増加するドレインを配置できます
    2. 。
  2. は、バイオ センサーの応答の分析の 3 s 間隔で 40 × 対物装備倒立蛍光顕微鏡に RFP または GFP 固有照明と細胞のイメージングを開始します。また、全体のセル移動の分析 10 秒間隔で 20 × 対物を使用して位相コントラスト画像します
    3. 。 ゼロ圧力設定にいくつかのフレームの後の流れをオンに
  3. (すなわち 流れが重力だけであったり 〜 15 dyn/cm 2) オープンの位置にバルブを切り替えることによって。流体のレベルは 5-10 ml 貯水池に該当するときより多くのバッファーを持つトップします。空気の泡を行う行に閉じ込め得ること流体を慎重に追加してください
    。 注: セルにショック反応を避けるために同じ温度の液を追加することが重要です
    4. 。
  4. セル速度と永続化移行解析ソフトウェアを用いた定量化 (詳細については 材料の表 を参照してください) メーカーによると ' の指示
    5. 。

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Representative Results

急性の機械的刺激に対する走化性の規制当局の時間応答

D. キイロタマホコリカビ細胞の機械的刺激に対する反応を評価するために付着凝集有能なセルはせん断流れの短いパルスにさらされました。集計主務+ キイロタマホコリカビ細胞分泌するキャンプは、隣接する細胞で感知することができます。細胞シグナリングの貢献を克服するために細胞は、カフェイン、 d. 菌のアデニル酸シクラーゼを抑制し、キャンプ分泌28を防止することと扱われました。確かに、セルと前処理をカフェイン PKBR1 および ERK2 の非常に低い基底活性を持っていた、これらのキナーゼ (図 1 a) せん断流 5 秒刺激の重要な残基のリン酸化の強力な増加を示した。応答一時的なされ、ピークの周り 10-15 s、PKBR1 と 30 前後、ERK2 の s 同様に以前に調査結果を発表7走化性因子とこれらの蛋白質の活性化のため。

低レベル、このアッセイの開発につながった予備の研究を考慮した応答の効率を評価することは困難だが (または車) せん断流の刺激を比較してせん断流れの存在下で、走化性因子のキャンプ (図 1 b)。この分析は、せん断流れにシグナル伝達ネットワークの応答が飽和していることを示唆、キャンプの応答の増加を示しませんでした。懸濁液の凝集有能なセルが保管される標準刺激プロトコルを使用してキャンプ、刺激し、さまざまな分離このアッセイでのキャンプは PKBR1 のリン酸化を増加しなかったが細胞の走化性因子応答が観察できます。タイム ポイント刺激します。図 1に示すように、これらの条件の下である PKBR1 リン酸化、走化性因子がない車両に応答の一時的な増加。30 でピーク応答が観察されるこの試験で s アッセイ中に細胞懸濁液の温度が 〜 9 ° C に比べて26上記機械的刺激試金のための ~ 22 ° C。

導くおよび急性の機械的刺激に対するエッジ マーカーをラギングの時空間的応答

上記人口アッセイは、走化性のレギュレータの動作の時間についてのみを提供するので細胞いた顕微鏡で観察しながら簡単な機械的刺激にさらされています。この試金は集計主務や栄養のいずれか行うことがローカリゼーションは、走化性因子刺激で定義されたさまざまな蛍光標識したバイオ センサーを発現するD. キイロタマホコリカビ細胞。2 リーディング エッジ マーカー、クラックとライムのΔcoilの PH ドメイン PIP3 または新しく重合のアクチンを募集して、両方示したゾル性細胞質局在主静止期細胞の以前に報告した (図 2 a、補足の映画 1)4,29。基肥にアクティブだったセルにこれらのバイオ センサーは、仮足の先端にも見ることができます。2 せん断流刺激 s、~ 6 に 10 をピークと皮質に急速に relocalized バイオ センサー s 〜 30 から細胞質へ返されると s。対照的に、遅れてエッジ マーカー PTEN は刺激 (図 2 a) 前に、皮質に局在しました。シアー流を含む、短いパルスの後最先端バイオ センサーのより遅いダイナミクスを伴いゾル性細胞質の PTEN 輝度が上昇。バイオ センサー、細胞質から局在の変化、皮質と逆に示されている変更として応答の簡易定量化を可能にするゾル性細胞質の強度。

急性の機械的刺激に対する応答にバイオ センサーの動作、導くおよび均一な走化性因子の刺激によるエッジ局在化ダイナミクスをラギングと一致。この現象は、示されている 3 つのバイオ センサーへユニークなでした。ローカライゼーションの以前に発行された、同じような変更は、リーディング エッジ マーカー RBD とモデルにも認められた、認識を活性化 Ras や Rap1、だけでなく、それぞれ別の遅行エッジ マーカー サイナ、17 歳22,30に関しては。

似たようなアッセイは、二重 1 つに単一の入力行から実験のセットアップの簡単な修正によって様々 な阻害剤の効果を評価するために使用できます。このメソッドを使用して、セル最初制御条件にさらされてでき、目的のテスト エージェントを含むバッファーに切り替えた。たとえば、アクチン脱重合剤コンジロームの RBD の応答はブロックだけでなくライムのΔcoil、急性機械的刺激 (図 2 b)。

グローバルな対応の前にシアー流を含む長期にわたる刺激下での細胞移動

ここで説明したアプローチはD. キイロタマホコリカビ移行に及ぼすせん断流を研究に適応できます。実際、流れだった 2 の後シャット ダウンしない場合に s に実験の持続期間のために残った、栄養細胞を示した (図 3、補足の映画 2) 流れに逆らって移行を監督します。せん断流の渡り鳥の応答を引き出すために必要だった (たとえば、図 2 bに見られる)、栄養細胞の急性刺激とグローバル応答を達成するために使用された通常の圧力よりも低いことに注意してください。ただし、低圧でもセルはセル自体の位置の変更に先行するライムΔcoil局在の変化によって測定された堅牢な均一な応答を表示されます。したがって、これらの実験は、1) グローバル応答は細胞の運動に依存しない、2) グローバル応答指示移行の前に明確に示した。

急性の機械的刺激に対する応答をテストの代替的なアプローチ

フロースルー区域の使用には、急性の機械的刺激に対する応答の調査のための明確な利点がありますが、また急性の機械的刺激に対する細胞の応答をテストするための 2 つの追加アッセイを検証しました。図 4に示すとおり、ライムΔcoil急速かつ一過性再にローカライズされて細胞質から皮質細胞がいずれか (図 4 a) マイクロ ピペットを配信または一括を使用して手動でバッファーの追加により食塊によって刺激されたときピペット (図 4 b) とさらにバッファー。セルに配信されるせん断力の正確な量は不明と簡単に変更できないことこれらのアッセイの両方の明確な欠点があることに注意してください。しかし、機械的、化学的刺激の切り替えが必要な場合、一括バッファー追加はフロー デバイスで刺激する固体の代替を提供します。

Figure 1

図 1: 急性機械的又は化学的刺激にD. キイロタマホコリカビ細胞の反応の生化学的評価結果を代表します。集計有能なセルは、機械的又は化学的刺激にさらされました。、指定された時点で分離、エスディーエスを認識する抗体を使用して PKBR1 または ERK2 をリン酸化します。(A) 付着性のセルが 5 の軌道シェーカーで刺激された s。膜と Coomassie ブリリアント ブルー (CBB) 等しい蛋白質をロードを表示するに染まりました。(B) 付着性のセルが約 5 秒以下の cross-wise 方法でプレートの手動運動によって刺激されたバッファー (車)、または 1 μ M のキャンプのまたは任意の化学的刺激 (-) なしの添加による化学刺激。2 つの immunoblots は時間 0 で見られる PKBR1 の基底の活性化で変化の範囲を示します。時折、下部のパネルに示すように、PKBA の活性化をこの手法により検出でした。(C) 懸濁液 1 μ M のキャンプまたはバッファー (車) と細胞が刺激されました。この図の (A) の部分は、Artemenkoらから変更されています。(2016)22.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 代表結果急性機械的刺激と顕微鏡の単一セルのライブ イメージングします。(A) 集計-主務D. キイロタマホコリカビ細胞表現する RFP タグ ライムΔcoil、または GFP 付けられた PH クラックまたは PTEN 15 dyn/cm2で一方向流と刺激された 2 に 5 s. の画像が収集されたすべての 3 s.機械的刺激に対する応答で、バイオ センサーの転座を示す代表的なセルが表示されます。皮質における各バイオ センサーの蓄積の時間 0 に正規化された平均細胞質強度の逆数として定量化を行った。18 (ライムΔcoil)、20 (PH Crac)、または 6 (PTEN) セルの平均の応答が表示されます。値が意味 ± RFP タグ ライムΔcoilを発現する SE (B) 植物細胞 RFP、GFP タグ RBD は車または 5 μ m と扱われたコンジローム、少なくとも 15 分間と、2 の 41 の dyn/cm2で一方向流と刺激。s. 画像が収集されたすべての 3 s の RBD GFP と皮質における石灰ΔcoilRFP の蓄積が (A) のように定量化されました。値は、平均 ± SE です。分析のセルの数は、それぞれの条件の横に示されます。スケール バー = 10 μ m。この図は、Artemenkoらから変更されています。(2016)22.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 代表結果D. キイロタマホコリカビ細胞の応答フローの長期刺激にします。(A) 植物細胞 RFP タグ ライムΔcoil 15 dyn/cm2で連続的な一方向流にさらされ、11 セルのすべての 3 の s. トラックのイメージを表現する、(B) に示すように。スケール バー = 10 μ m。この図は、Artemenkoらから変更されています。(2016)22.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 代表が急性の機械的刺激に対する応答をテストする代替的なアプローチの結果します。(A) 栄養D. キイロタマホコリカビ細胞表現する RFP タグ ライムΔcoilマイクロ ピペット (*) 基肥アッセイバッファー遅い速度でを解放にさらされていた。流量の一時的な上昇は、0 時にアッセイバッファーのボーラスの迅速な配達によって達成されました。画像が収集されたすべて 3 s. (B) 栄養D. キイロタマホコリカビ細胞 RFP タグ ライムΔcoil顕微鏡室に小さなドロップとしてメッキを表現する機械的に大量にバッファーの添加によって刺激された、商工会議所。画像が収集されたすべての 3 s のスケール バー = 10 μ m この図の (A) 部分から変更されている Artemenko et al. 。(2016)22.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

補足映画 1: 急性の機械的刺激がトリガー ライムΔcoilの迅速かつ一時的な転流 - RFP または PH-クラック-GFP 集計主務D. キイロタマホコリカビにおける皮質細胞質から細胞のこれらのバイオ センサーを表現します。一方向流がになっていたため 5 時 0 s とセルを 3 秒間隔でイメージしました。再生速度は 5 フレーム/秒です。セルの行ごとに 2 つの例のとおりです。スケール バー = 10 μ m。この映画は、図 2 aに対応し、Artemenkoらから変更されています。(2016)22.ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。

補足映画 2: 継続的な機械的刺激トリガー ライムΔcoilの迅速かつ一時的な転流 - 流れの方向に対して細胞の移行前に皮質細胞質から RFP 。ライムΔcoilを発現する植物細胞 RFP 15 dyn/cm2時間 0 から始まる連続せん断応力にさらされる、3 秒間隔でイメージします。再生速度は 10 フレーム/秒スケール バー = 10 μ m。この映画は図 3に対応し、Artemenkoらに以前掲載されています(2016)22.ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。

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Discussion

ここで説明する方法は、人口とせん断流れに対する個々 のセル動作の両方を評価するために便利な方法を提供しています。重要なは、以前の研究は、導くおよび移行中にエッジ マーカーをラギングの局在解析、現在のアプローチは鋭くせん断流を適用することによって即時の効果の調査をできます。このメソッドを使用して、実際には、せん断流れに細胞の初期応答必要がないこと細胞の移動を行った。代わりに、初期せん断流刺激に対する迅速かつ過渡応答せん断流れ、走化性因子のグラデーションを見て初期グローバル応答と同様に、長時間見られる方向の移行の前に。

各メソッドは異なる長所と短所を持っているにもかかわらず、生化学的およびミクロ的アプローチは補完的なデータを生成します。続いてセル換散、PKBs、KrsB、および、ERK のイムノブロット刺激はたとえば、菌の全人口を分析し、こうして個々 のセルの動作を検査するアッセイとは異なり、細胞間変動の平均値します。ただし、人口に基づく試金は個々 の細胞を分析することによって簡単に観察できる細胞行動の微妙な変化をマスクする傾向があります。さらに、ここで説明した生化学的アッセイのみ理由は後ほど集計有能なセルに有効です。対照的に、RBD、モデル、PH Crac、石灰ΔcoilPTEN の染色体の顕微鏡を用いた測定はたとえば、皮質と細胞質の間は栄養生長と集計有能な細胞の効果的なしたがっての観測が可能偏光の度合いと細胞に広く適用されます。異なるせん断流れの試金のテスト シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークのカバレッジを拡大使用可能なリード/遅れエッジ マーカーのセットを調査する事実である相補的な 2 つのアプローチを作るもの。

顕微鏡観察に基づく試金の非常にしっかり対応、栄養細胞がセル換散および続く刺激に応答しない理由は不明のまま。1 つの可能性は、せん断プレートが回転したときにセルに適用される量が流れ区域のセルによって経験される力を一致しないことです。開発した細胞は、対照的に、可能性があります活性化の下限しきい値を持つ、したがって、いずれかの条件の下で対応します。その活性の測定は生化学的な試金でバイオ センサーが表されないまたは葉酸栄養細胞の刺激 PKBR1/PKBA と ERK2 の堅牢な活性化につながるので、ない栄養細胞で活性化されてそうだ (データないです。図)。また、栄養細胞は顕微鏡を用いた測定で PH-クラック、PIP3 の蓄積を反映して、明確な募集を表示します。PKBA 募集 PIP3 にも依存しているので考えにくい PKBA が急性の機械的刺激に対する応答は生化学的な試金の条件が上記のように最適でない限り。これは活発な調査の区域のまま。

走化性調節物質の生化学的解析は実験を通してカフェインの存在を必要です。もともとカフェインがキャンプの分泌によるシグナル伝達細胞を防ぐために追加されました。ただし、カフェインは、アデニル酸シクラーゼ (ACA) の抑制以外にも別の役割 ACA null のセルはまだ応答の PKBR1 のリン酸化のためカフェインを必要なので急性の機械的刺激するようであります。カフェインは、以前 TorC2 活動26ブロックに示されています。TorC2 の抑制細胞のいくつかの基底の運動をブロックされ、従って PKBR1 の基底の活性化とシグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークの他のコンポーネントを下げることは可能です。基底少ないせん断流れへの応答を観察するために不可欠だった。実際には、細胞は、開発中に以前の時点で収集された、彼らは基底活動の増加と減少せん断流応答を表示しました。興味深いことに、栄養細胞は比例してより多くの PKBA 活性を持つと比較すると少ない PKBR1 開発細胞31も知られています。生化学的な試金で栄養細胞の応答の欠如に貢献するさらに基底状態が栄養と集計有能なセルに幾分別様に規制されて可能です。不思議なことに、開発の後で、細胞を集めとき、減らされた応答、ローカリゼーションに極性の強い影響とこのアッセイで検討した様々 な走化性調節物質の活性化のため可能性がありますもいた。

顕微鏡室で細胞の刺激強度と刺激の持続時間が最大応答22に貢献することを明らかにしました。つまり、最大応答できますでも達成できる低剪断力それが時間の長時間にわたって適用される場合 (10 対 2 s s)。この観測は、なぜ細胞初期グローバル応答がある最初せん断流動誘起移行につながる継続的なしかし弱い刺激にさらされる場合について説明します。現在の装置の範囲の低い方の端のための十分に低いせん断流を生成することができませんでした。

おそらく、急性の機械的刺激による調査の最も重要な意義は、機械的、化学的刺激が共通のシグナル伝達と細胞骨格のアクチン ネットワークに供給する現れることです。今後の研究、走化性因子ははるかに汎用性になる流れをチャネルで急速に配信できるシステムを開発することを目指す、2 つの刺激を統合して機械的刺激のため一括バッファー追加を使用して示したが機械的、化学的刺激の統合を評価するために強力な方法です。残念ながら、現在 2 回線セットアップを使用して走化性因子の添加は、フローの存在下で配信されるように、走化性因子を持っているので 2 番目のせん断流れ刺激に関連付けられます。ヴェステンドルフらによってキャンプのため正常に示された代替ケージ前駆体から、走化性因子のレーザー刺激リリース可能性があります。32。 将来、それも興味深いだろうせん断流れと変数の電界やせん断流と可変基板剛性などの他の刺激の統合を検討します。後者の例はそれらの間初期の電波受信状態が異なる場合がありますがそれは機械的刺激の 2 つのタイプを含むので興味深いです。監督の遊走を誘導するすべての刺激が同じシグナル伝達ネットワークを共有し、異なるだけで刺激を知覚する方法を確認することは、細胞が複雑な環境で移動できる方法について説明します。最後に、我々 はすでにシアー流を含む急性刺激はひと好中球のような細胞22の広がりにつながることを実証しました。今後の作業はさらに哺乳類細胞における機械的刺激のシグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークのさまざまなコンポーネントのローカライゼーションやアクティベーションを検討します。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、国立衛生研究所健康付与 R35 GM118177 PND によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

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References

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細胞生物学、問題 129、シグナル伝達、明らかでない、剪断応力、走化性、逆さ流れ走性、せん断流動誘起移行、指示移行、バイオ センサーのローカリゼーション、急性刺激
<em>キイロタマホコリカビ</em>急性の機械的刺激に対する応答の評価
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Artemenko, Y., Devreotes, P. N.… More

Artemenko, Y., Devreotes, P. N. Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation. J. Vis. Exp. (129), e56411, doi:10.3791/56411 (2017).

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