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Bioengineering

दृढ़ संकल्प और बहु के लिए एक झिल्ली डालने प्रणाली में एक 3 डी ऊतक मॉडल में पारगम्यता और प्रसार के अनुकरण के लिए एक विधि-अच्छी तरह से प्लेटों

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56412
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Institute of Bioprocess and Biosystems Engineering, Hamburg University of Technology, 2Institute of Biotechnology, Department Medical Biotechnology, Technische Universität Berlin, 3TissUse GmbH

Summary

बहु के लिए एक झिल्ली डालने प्रणाली में पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए एक विधि-अच्छी तरह से प्लेटें और सिमुलेशन का उपयोग कर प्रसार गुणांक की गणना के लिए silico पैरामीटर अनुकूलन में प्रस्तुत कर रहे हैं.

Abstract

इन विट्रो में खेती की त्वचा मॉडल तेजी से दवा और कॉस्मेटिक अनुप्रयोगों के लिए प्रासंगिक हो गए हैं, और भी दवा के विकास में इस्तेमाल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पदार्थ का परीक्षण । इन मॉडलों ज्यादातर झिल्ली डालने प्रणालियों में खेती कर रहे हैं, विभिंन पदार्थों की ओर उनकी पारगम्यता एक आवश्यक कारक जा रहा है । आमतौर पर, इन पैरामीटर्स के निर्धारण के लिए लागू विधियों में आमतौर पर बड़े नमूना आकारों (उदा., फ्रांज प्रसार सेल) या श्रमसाध्य उपकरण (उदा., प्रतिदीप्ति रिकवरी के बाद photobleaching (frap है)) की आवश्यकता होती है । यह अध्ययन ४.२६ मिमी और १२.२ मिमी (खेती क्षेत्र) के व्यास आकार के साथ झिल्ली डालने प्रणालियों में सीधे पारगम्यता गुणांक का निर्धारण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. विधि agarose और कोलेजन जैल के साथ ही एक कोलेजन सेल त्वचा मॉडल का प्रतिनिधित्व मॉडल के साथ मांय किया गया । विभिंन आणविक आकार और विभिंन सेल मॉडल के माध्यम से permeation के साथ पदार्थों की permeation प्रक्रियाओं (कोलेजन जेल, fibroblast, और HaCaT से मिलकर) सही बताया गया ।

इसके अलावा, ऊपर प्रयोगात्मक विधि का समर्थन करने के लिए, एक अनुकरण स्थापित किया गया था । सिमुलेशन छोटे आणविक आकार के साथ पदार्थों के लिए अच्छी तरह से प्रयोगात्मक डेटा फिट बैठता है, अप करने के लिए 14 x 10-10 एम स्टोक्स त्रिज्या (४,००० मेगावाट), और इसलिए एक आशाजनक उपकरण प्रणाली का वर्णन करने के लिए है । इसके अलावा, सिमुलेशन काफी प्रयोगात्मक प्रयासों को कम करने और काफी मजबूत करने के लिए विस्तारित या अधिक जटिल setups के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

Organo-ठेठ 3 डी संस्कृतियों दवा के विकास और पदार्थ के परीक्षण के लिए शक्तिशाली उपकरण बन गए है1। इस संबंध में, मानव त्वचा मॉडल विशेष रुचि के कारण इस तरह के सौंदर्य प्रसाधन उद्योग में उन के रूप में विनियामक आवश्यकताओं, के हैं । वे बाद में कई 3d त्वचा मॉडल के विकास के लिए नेतृत्व किया है, या तो बहु में एकल अंग संस्कृतियों के रूप में अपने दम पर अच्छी तरह से प्लेटें, या बहु में अंग-चिप्स अतिरिक्त अंग मॉडल के साथ संयोजन में, जैसे, जिगर2.

एक त्वचा के बराबर की खेती के संबंध में, हवा तरल इंटरफेस (अली) उचित एपिडर्मल भेदभाव के लिए एक आवश्यक तत्व है3। कोशिका संस्कृति आवेषण एक तरल-तल पर पारगंय झिल्ली के साथ एक पोत की रचना आमतौर पर एक अली स्थापित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । ALIs व्यापक रूप से ऐसे EpiDerm4के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध त्वचा मॉडल में उपयोग किया जाता है, Phenion5, और Episkin6, ९६ से आकार के साथ त्वचा मॉडल की संस्कृति के लिए अच्छी तरह से (व्यास में ४.२६ मिमी) 12-अच्छी तरह से (१२.२ मिमी व्यास में) प्लेटों । यहां वर्णित विधि एक झिल्ली डालने प्रणाली में पदार्थों की permeation निर्धारित करता है ।

पारगम्यता गुणांक किसी भी संस्कृतिपूर्ण त्वचा की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है-मूल त्वचा की तुलना में मॉडल5, और कैसे जल्दी से सक्रिय पदार्थों त्वचा के माध्यम से स्थानांतरित का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । खासकर अगर दवाओं या सौंदर्य प्रसाधन उत्पादों त्वचा के लिए लागू करने की जरूरत है, इस पैरामीटर को समझने के लिए जब ठीक सक्रिय एजेंटों के माध्यम से गुजरना आवश्यक है । एक सिमुलेशन आगे प्रणाली के व्यवहार की भविष्यवाणी करने के लिए और बाद में आवश्यक समय लेने वाली प्रयोगात्मक प्रयास को कम करने में मदद कर सकते हैं, खासकर जब पदार्थों का एक बड़ा सेट शामिल है ।

फ्रांज प्रसार सेल त्वचा और त्वचा मॉडल के साथ permeation प्रयोगों के लिए राज्य के अत्याधुनिक है5,6,7,8,9। इस उपकरण के बीच में एक निश्चित नमूना (प्रसार बाधा) के साथ दो डिब्बों के होते हैं. परीक्षण किया जा करने के लिए पदार्थ का नमूना (दाता डिब्बे) और permeating यौगिक की एकाग्रता के शीर्ष पर सीधे लागू होता है विपरीत (स्वीकारकर्ता) डिब्बे पर पता लगाया जा सकता है । स्वीकार्य पक्ष पर, लगातार तापमान और सजातीय पदार्थ एकाग्रता एक तापमान चैंबर और एक चुंबकीय सरगर्मी के माध्यम से सुनिश्चित कर रहे हैं । नमूने फ्रांज सेल के स्वीकारकर्ता पक्ष पर एक नमूना हाथ से लिया जा सकता है । 19 सेमी और १७९ सेमी के बीच एक ऊंचाई सीमा के साथ, यह प्रणाली अपेक्षाकृत बड़ी है10,11। जेल की तरह पदार्थों और ऊतकों में प्रसार गुणांक के निर्धारण के लिए एक अंय विधि frap है है । यह तकनीक जेल में ब्लीचिंग फ्लोरोसेंट लेबल वाले कणों के सिद्धांत का उपयोग करती है और फिर प्रसार गुणांक12,13,14की गणना करने के लिए ब्लीचिंग क्षेत्र की रिकवरी समय का निर्धारण करता है ।

इसके अलावा, रूपान्तर-रूपांतरण-अवरक्त (स्विचेज) स्पेक्ट्रोस्कोपी त्वचा में पदार्थों की permeation प्रक्रिया निर्धारित करने के क्रम में अवरक्त प्रकाश अवशोषक के साथ कण आंदोलन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है15,16। हालांकि, इन या अंय इमेजिंग तरीकों (जैसे, दो फोटॉन प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी17) लागत गहन उपकरणों की जरूरत है ।

इस अनुच्छेद में, एक विधि सीधे एक झिल्ली डालने प्रणाली है, जहां एक त्वचा मॉडल खेती किया जा सकता है के भीतर एक बाधा की पारगम्यता को मापने के लिए प्रस्तुत किया है । इस विधि छोटे नमूनों की एक बड़ी संख्या के साथ चलाने के लिए पारगम्यता प्रयोगों को सक्षम करता है (अच्छी तरह से आकार ४.२६ मिमी करने के लिए) एक कॉंपैक्ट सिस्टम में । यह फ्रांज प्रसार सेल के विपरीत है, जहां प्रत्येक जांच के लिए एक अलग डिवाइस की जरूरत होती है, जिसे डिवाइस पर माउंट किया जाना है और छोटे नमूनों (४.२६ mm का आकार) के लिए एहसास करना मुश्किल है । इसके अलावा, के बाद से विधि प्रमुख उपकरण की आवश्यकता नहीं है (जैसे, एक फोकल या multiphoton माइक्रोस्कोप), दोनों समय और लागत में कमी हासिल की है ।

सभी प्रयोगों सूक्ष्मदर्शी झिल्ली डालने प्रणालियों में एक नमूना (बैरियर) agarose जेल या एक कोलेजन कोशिका झिल्ली पर स्थापित मॉडल से मिलकर के साथ प्रदर्शन किया गया । फ्लोरोसेंट पदार्थों (अलग आणविक आकार के साथ दाता) नमूने के शीर्ष पर लागू किया गया, और रिस पदार्थ की एकाग्रता नीचे (स्वीकारकर्ता) एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग ( चित्रा 1देखें) पर पाया गया था । आदेश में इस पद्धति को मांय करने और इस अनुकरण की सटीकता का परीक्षण करने के लिए, agarose जैल का उत्पादन किया और एक बाधा के रूप में इस्तेमाल कर रहे थे । Hydrogels आम तौर पर जैविक विज्ञान13में छिद्रित माध्यम में प्रसार और permeation प्रक्रियाओं की जांच के लिए प्रयोग किया जाता है । विधि तो एक सेल वरीयता प्राप्त प्राथमिक fibroblasts और मानव वयस्क कम कैल्शियम उच्च तापमान keratinocytes (HaCaT) कोशिकाओं (सेल मैट्रिक्स मॉडल) है, जो एक सरलीकृत त्वचा मॉडल है की एक कोलेजन मैट्रिक्स से मिलकर प्रणाली में परीक्षण किया गया था18,19 .

इसके अतिरिक्त, permeation प्रक्रिया गणना द्रव गतिशीलता के साथ प्रवाह सिमुलेशन के माध्यम से अनुकरणीय था । यह पाया गया कि, पैरामीटर अनुकूलन के माध्यम से, प्रसार गुणांक प्रयोगात्मक डेटा से गणना की जा सकती है. सामान्य रूप में, इस अनुकरण विभिन्न अनुप्रयोगों प्रदान करता है; उदाहरण के लिए, यह एक permeation लघु प्रयोगों पर आधारित प्रक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए संभव है और अनुकरण काफी प्रयोगों की संख्या को कम कर सकते हैं.

प्रयोगात्मक विधि और सिमुलेशन एक अंग के लिए आवेदन के लिए डिजाइन किए गए थे पर एक चिप प्रणाली1,20,21, विशेष रूप से 2 अंग-चिप (2-OC) वाणिज्यिक रूप से विकसित1,22, 23,24,25. सिद्धांत रूप में, झिल्ली डालने प्रणालियों पर आधारित किसी भी अंग मॉडल की permeation प्रक्रिया इस तरह से वर्णित किया जा सकता है ।

Protocol

1. पारगम्यता अध्ययन के लिए नमूना तैयार करना

नोट: आदेश में permeation माप और सिमुलेशन, agarose जेल या एक सेल मैट्रिक्स त्वचा मॉडल की खेती पर आधारित मॉडल से मिलकर एक नमूना सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

  1. Agarose जेल
    1. एच2ओ (डबल आसुत जल) के 10 मिलीलीटर में agarose उच्च संकल्प पाउडर के ०.२ जी भंग ।
    2. मिश्रण समाधान और यह ८० ° c करने के लिए गर्मी । 8 मिनट के लिए तापमान बनाए रखें ।
    3. लागू करें २८.६ µ एल agarose जेल की झिल्ली पर ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली (४.२६ मिमी व्यास में) या का उपयोग २२६ µ एल के लिए 12 अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली (व्यास में 12 मिमी) (उदा., Transwell सिस्टम) ।
    4. 10 मिनट रुको जब तक जेल जम जाता है ।
  2. कोलेजन जेल
    नोट: सभी कदम बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं और समाधान बर्फ पर कोलेजन जेल के बहुलकीकरण को धीमा करने के लिए रखा जाता है ।
    1. मिश्रण १२५ µ के एल ' हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ 1 मिलीलीटर की ०.४% कोलेजन आर समाधान (चूहा पूंछ कोलेजन) ।
    2. अनुमापन को 1 M NaOH (सोडियम हीड्राकसीड) (~ 6 µ l) के साथ घोल को phenol लाल रंग के पीले से लाल होने तक बदलता है ।
    3. जोड़ें १२५ µ Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के एल + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) कोलेजन जेल के लिए और एक पिपेट टिप के साथ ध्यान से मिश्रण ।
    4. लागू करें २८.६ µ एल कोलेजन जेल की झिल्ली को ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली या २२६ µ एल के लिए 12-well झिल्ली डालने प्रणाली ।
    5. 30 मिनट के लिए एक मशीन (३७ ° c, 5% सह2) में जेल छोड़ दें ।
  3. fibroblast के साथ कोलेजन सेल मॉडल
    नोट: सभी कदम बाँझ शर्तों के तहत निष्पादित कर रहे हैं.
    1. प्रयोग से पहले प्राथमिक fibroblasts 5-7 दिन तैयार करें । सेल कल्चर की कुप्पी (७५ cm2) में DMEM + 10% FCS के साथ fibroblasts की खेती करें और मीडियम को हर 2-3 दिन में बदलें ।
      नोट: प्रायोगिक सेटअप के आधार पर, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. सेल कल्चर कुप्पी (८०% धाराप्रवाह) से मध्यम निकालें और 10 मिलीलीटर (संस्कृति कुप्पी ७५ सेमी2) फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पंजाब) के साथ दो बार धो लें । ०.०५% Trypsin/ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 3 मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए मशीन ।
    3. सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए संस्कृति कुप्पी पर धीरे से टैप करें । DMEM के 3 मिलीलीटर + 10% FCS जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो । एक केंद्रापसारक ट्यूब में समाधान स्थानांतरण ।
    4. १२० x g पर सेल सस्पेंशन, supernatant निकालें, और DMEM + 10% FCS की ०.५ मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    5. कोशिकाओं गिनती और ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए समायोजित करें ।
      नोट: निंनलिखित चरणों बर्फ पर मार डाला कोलेजन जेल के बहुलकीकरण को धीमा कर रहे हैं ।
    6. मिक्स ०.४% कोलेजन आर समाधान की 1 मिलीलीटर के साथ HBSS के १२५ µ एल ।
    7. अनुमापन 1 M NaOH (~ 6 µ l) के साथ घोल को phenol लाल रंग के पीले से लाल होने तक बदलता है ।
    8. सेल निलंबन के १२५ µ एल जोड़ें (DMEM + 10% FCS + ०.५ एक्स 106 कोशिकाओं/एमएल) कोलेजन जेल में और एक पिपेट के साथ ध्यान से मिश्रण ।
    9. लागू करें २८.६ µ एल की झिल्ली पर कोलेजन जेल के ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली या २२६ µ एल के लिए 12-well झिल्ली डालने प्रणाली.
    10. 30 मिनट के लिए एक मशीन (३७ ° c, 5% सह2) में जेल छोड़ दें ।
    11. ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली की रिसीवर प्लेट के लिए जेल सतह और ३०० µ एल पर DMEM + 10% FCS के ७५ µ एल लागू करें । 12-well झिल्ली डालने प्रणाली के लिए, रिसीवर प्लेट के लिए सतह और १,८४६ µ एल के लिए ५९० µ एल की एक मात्रा का उपयोग करें ।
    12. सेल मैट्रिक्स मॉडल की सतह से मध्यम निकालें (एयर लिफ्ट) और 7 दिनों के लिए आगे सेल मैट्रिक्स मॉडल मशीन । तल पर १०० μl मध्यम का उपयोग करें और मध्यम हर दिन बदल जाते हैं ।
  4. HaCaT के साथ कोलेजन सेल मॉडल
    नोट: सभी कदम बाँझ शर्तों के तहत निष्पादित कर रहे हैं.
    1. HaCaT 5-7 दिन पहले निंन चरणों के लिए तैयार करें । एक सेल कल्चर कुप्पी (७५ mm2) में DMEM + 5% FCS के साथ HaCaT की खेती करें और मीडियम को हर 2-3 दिन में बदलें ।
      नोट: प्रायोगिक सेटअप के आधार पर, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. मध् यम को कुप्पी से निकालें और पंजाब के 10 एमएल (कल्चरल कुप्पी ७५ cm2) के साथ दो बार धो लें । ०.०५% Trypsin/EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन । DMEM के 3 मिलीलीटर + 10% FCS के साथ प्रतिक्रिया बंद करो । एक केंद्रापसारक ट्यूब में समाधान स्थानांतरण ।
    3. १२० x g पर सेल सस्पेंशन, supernatant निकालें और DMEM + 10% FCS की ०.५ मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    4. कोशिकाओं गिनती और ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए समायोजित करें ।
      नोट: निंनलिखित चरणों बर्फ पर मार डाला कोलेजन जेल के बहुलकीकरण को धीमा कर रहे हैं ।
    5. मिक्स ०.४% कोलेजन आर समाधान की 1 मिलीलीटर के साथ HBSS के १२५ µ एल ।
    6. अनुमापन 1 M NaOH (~ 6 µ l) के साथ घोल को phenol लाल रंग के पीले से लाल होने तक बदलता है ।
    7. DMEM के १२५ µ एल जोड़ें + 10% FCS कोलेजन जेल के लिए और इसे एक पिपेट के साथ ध्यान से मिश्रण ।
    8. 12-well झिल्ली डालने प्रणाली के लिए ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली या २२६ µ एल की झिल्ली पर सेल निलंबन के २८.६ µ एल लागू करें ।
    9. 30 मिनट के लिए एक मशीन (३७ ° c, 5% सह2) में जेल छोड़ दें ।
    10. जेल की सतह के लिए सेल निलंबन के ७५ µ एल लागू करें और ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली के रिसीवर प्लेट को DMEM + 10% FCS के ३०० µ एल जोड़ें । 12-well झिल्ली डालने प्रणाली के लिए, ५९० µ एल सेल निलंबन की सतह और १,८४६ µ एल के DMEM + 10% FCS के लिए रिसीवर प्लेट के लिए एक खंड का उपयोग करें ।
    11. 3 दिनों के लिए सेल मैट्रिक्स मॉडल मशीन; 2 दिनों के बाद माध्यम विनिमय ।
    12. सेल मैट्रिक्स मॉडल की सतह से मध्यम निकालें और आगे 7 दिन के लिए सेल मैट्रिक्स मॉडल गर्मी । तल पर १०० µ l मीडियम का प्रयोग करें और मीडियम को हर दिन बदलते रहें ।
  5. fibroblasts और HaCaT के साथ कोलेजन सेल मॉडल
    नोट: सभी कदम बर्फ पर बाँझ शर्तों के तहत मार डाला कोलेजन जेल के बहुलकीकरण को धीमा कर रहे हैं । चरण 1.3.5 तक चरण १.३ में वर्णित के रूप में fibroblasts तैयार करें, और एक दिन बाद HaCaT चरण 1.4.4 तक चरण १.४ में वर्णित के रूप में तैयार है ।
    1. मिक्स ०.४% कोलेजन आर समाधान के 1 मिलीलीटर में HBSS के १२५ µ एल ।
    2. 1 M NaOH (~ 6 µ l) के साथ समाधान को बेअसर करें जब तक पीले से लाल बैंगनी रंग में phenol लाल परिवर्तन न हो जाए ।
    3. जोड़ें १२५ µ प्राथमिक fibroblast सेल निलंबन के DMEM + 10% FCS + ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल कोलेजन जेल के लिए और मिश्रण ध्यान से शामिल ।
    4. 12-well झिल्ली डालने प्रणाली के लिए ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली या २२६ µ एल की झिल्ली को सेल निलंबन के २८.६ µ एल लागू करें ।
    5. 30 मिनट के लिए एक मशीन (३७ ° c, 5% सह2) में जेल छोड़ दें ।
    6. अगले, DMEM के µ एल लागू करें + 10% FCS पर जेल की सतह और ३०० µ l पर रिसीवर प्लेट के लिए ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली. 12-well झिल्ली डालने प्रणाली के लिए, ५९० µ एल का एक खंड रिसीवर प्लेट के लिए सतह और १,८४६ µ एल के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    7. ३७ ° c और 5% CO2पर 1 दिन के लिए मशीन ।
    8. सतह से मध्यम निकालें और ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल के साथ एक HaCaT सेल निलंबन जोड़ें । चरण 1.5.6 अंतर्गत पहले वर्णित के रूप में वॉल्यूम समान है ।
    9. 3 दिनों के लिए सेल मैट्रिक्स मॉडल मशीन; 2 दिनों के बाद माध्यम विनिमय ।
    10. सेल मैट्रिक्स मॉडल की सतह से मध्यम निकालें और आगे 7 दिन के लिए सेल मैट्रिक्स मॉडल गर्मी । तल पर १०० µ l मीडियम का प्रयोग करें और मीडियम को हर दिन बदलते रहें ।
      नोट: इस जांच के लिए, 3 जेल/सेल-मॉडल नमूने 12-well झिल्ली डालने प्रणाली के लिए तैयार किया गया था । ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली के लिए, हम जेल/सेल मॉडल के लिए 6 नमूनों का इस्तेमाल किया । सांख्यिकीय अर्थ के लिए, 3 नमूने आम हैं । लेकिन में प्रयोगों के लिए ९६-अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली कोलेजन मैट्रिक्स मॉडल के साथ हम आशा विफलताओं और सेल संस्कृति के लिए विचलन. इसलिए, हम नमूनों की एक बड़ी संख्या को चुना है ।

2. झिल्ली डालने प्रणाली में पारगम्यता अध्ययन

  1. दाता पदार्थ
    नोट: दो fluorescein सोडियम साल्ट (NaFl) का उत्पादन किया जाता है ।
    1. ०.१ मिलीग्राम/एमएल और ०.०१ मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में एच2O में NaFl भंग । अलग fluorescein isothiocyanate-dextranes (एफडी) के एक आणविक वजन के साथ ४,०००, १०,०००, २०,०००, और ४०,००० ग्राम/2 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में एच2O में भंग कर रहे हैं । पारगम्यता प्रयोगों के लिए दाता पदार्थ के रूप में इन समाधानों का उपयोग करें ( चित्रा 1देखें) agarose जेल के साथ ।
    2. कोलेजन सेल मॉडल के साथ सेटअप के लिए, DMEM के साथ सभी समाधान तैयार + 10% पानी की बजाय FCS ।
      नोट: तैयार स्टॉक समाधान (10x उच्च एकाग्रता) दाता पदार्थ की । दाता एकाग्रता के छोटे रूपों पारगम्यता प्रयोग के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं ।
  2. प्रायोगिक विधि
    नोट: पारगम्यता प्रयोग ३७ डिग्री सेल्सियस और > ९०% की आर्द्रता पर मार डाला है । यह पैरामीटर कक्षों की व्यवहार्यता सुनिश्चित करता है । तापमान प्रसार प्रक्रिया को प्रभावित करता है तो एक ही पैरामीटर agarose जेल, कोलेजन जेल, और कोलेजन सेल मॉडल के साथ प्रयोग के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । कोष्ठक में वॉल्यूम जानकारी 12-well झिल्ली डालने प्रणाली को संदर्भित करता है ।
    1. तैयार एक ९६-(या 12-) agarose जेल से मिलकर एक बाधा के साथ अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली (देखें प्रोटोकॉल १.१) या सेल मॉडल (देखें प्रोटोकॉल 1.2-1.5) और प्रतिदीप्ति दाता पदार्थ ।
    2. 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, और एक मानक वक्र की स्थापना के लिए दाता पदार्थ के 1:320 के कमजोर पड़ने तैयार करते हैं । पिपेट ३०० µ एल (१,८४६ µ एल) रिसीवर प्लेट के तीन कुओं में हर कमजोर पड़ने की । 12-well झिल्ली डालने प्रणाली के लिए एक अलग रिसीवर प्लेट का उपयोग करें । धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए मापा प्रतिदीप्ति [RFU] बराबर एकाग्रता में परिवर्तित करने के लिए उपयोग किया जाता है [मिलीग्राम/एमएल] ।
    3. नमूना (agarose जेल या सेल मॉडल) के शीर्ष पर दाता पदार्थ के ७५ µ l (५९० µ l) को जोड़ें और ३०० µ l (१,८४६ µ l) के स् वीकारकर्ता पदार्थ (H2O या DMEM + 10% FCS) रिसीवर प्लेट में (देखें चित्रा 1) ।
      नोट: यह सुनिश्चित करें कि झिल्ली डालने प्रणाली में तरल की सतहों और रिसीवर प्लेट में एक ही स्तर हीड्रास्टाटिक दबाव से बचने के लिए है ।
    4. मशीन में एक शेखर पर पूरे सिस्टम स्थानांतरण । मिलाते हुए समरूप मिश्रण को प्राप्त करने के लिए समायोजित करें (कुल स्ट्रोक कक्षा १.५ मिमी है, गति ३.५ स्तर पर समायोजित किया गया है, जो एक रोटेशन से संबंधित है ~ ४८० 1/मिनट) एक एकाग्रता ढाल से बचने के लिए, जो प्रसार प्रक्रिया को प्रभावित करता है.
    5. हर घंटे प्रतिदीप्ति का समय निर्धारित करें । प्रतिदीप्ति को मापने के लिए, एक खाली थाली में झिल्ली डालने प्रणाली हस्तांतरण और एक प्लेट रीडर का उपयोग कर रिसीवर के भीतर प्रतिदीप्ति उपाय । ४८५ एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें और fluorescein के लिए ५३५ एनएम के उत्सर्जन ।
    6. 5 ज के लिए प्रयोग चलाएं ।
      नोट: प्रयोगों के दौरान, पूरे सिस्टम से तरल वाष्पित होता है । वाष्पीकरण दाता और स्वीकार्यता में एकाग्रता बदलता है और परिणाम को प्रभावित करता है । यह प्रभाव 5 एच के चल रहे समय के मामले में उपेक्षित है, लेकिन लंबे समय तक चलने के लिए इस पर विचार किया जाना चाहिए ।
  3. पारगम्यता गुणांक की गणना
    1. मानक वक्र स्थापित करने के लिए, प्रतिदीप्ति एकाग्रता बनाम धारावाहिक कमजोर पड़ने की साजिश और डेटा पर एक रैखिक प्रतिगमन प्रदर्शन करते हैं ।
    2. permeation प्रयोग के प्रतिदीप्ति डेटा को एकाग्रता में परिवर्तित करने के लिए रेखीय प्रतिगमन की ढलान का उपयोग करें. सिमुलेशन के प्रयोजन के लिए, मॉल में इकाइयों कंवर्ट/
    3. समय के साथ एक समारोह के रूप में एकाग्रता प्लॉट और डेटा के रैखिक खंड की स्थापना ( चित्र 2देखें) ।
    4. इस रैखिक भाग की ढलान का निर्धारण और निंनलिखित समीकरण के अनुसार पारगम्यता गुणांक की गणना ( चित्रा 2में उदाहरण देखें):
      Equation 1
      जहां dcA/dt समय के साथ स्वीकार्य पक्ष के भीतर पदार्थ की एकाग्रता का परिवर्तन (ढलान) है; CD दाता ओर एकाग्रता है; P पारगम्यता गुणांक है; एक permeation सतह है, और वीa स्वीकारकर्ता की मात्रा है । यह समीकरण फिक के पहले कानून से व्युत्पंन है और केवल जब सीडी » सीए6,22सी लागू किया जा सकता है ।
    5. नोट: दाता में एकाग्रता को स्वीकारकर्ता में पाया एकाग्रता की तुलना में बहुत अधिक है । यह प्रायोगिक सेटअप में सत्यापित किया गया था ।

3. सिमुलेशन

नोट: सिमुलेशन COMSOL Multiphysics ५.१ के साथ किया गया था । इसका एक बुनियादी ज्ञान ग्रहण किया जाता है. प्रसार सिमुलेशन के लिए, निम्नलिखित मांयताओं बना रहे हैं: (क) एच2में पदार्थों का प्रसार गुणांक O जेल में उस की तुलना में बहुत अधिक है । इस अंतर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, सिमुलेशन 1 x 10-9 m2/4 के एक कारक है जो 2% agarose जेल के माध्यम से NaFl के प्रसार गुणांक की तुलना में १०० के एक पहलू से अधिक है के एक मूल्य का उपयोग करता है । (ख) प्रयोग में, पदार्थ बाधा के माध्यम से और फिर झिल्ली डालने प्रणाली की झिल्ली के माध्यम से फैलाना. प्रायोगिक सेटअप के विपरीत, आभासी agarose जेल या कोशिका मैट्रिक्स और झिल्ली एक समरूप चरण माना जाता है । (ग) दीवारों पर सीमा प्रभाव "कोई पर्ची" के लिए सेट कर रहे हैं, सभी दीवारों पर प्रभाव फिसल (तरल और जेल या तरल और सेल मॉडल के बीच नहीं) झिल्ली डालने प्रणाली की उपेक्षा कर रहे हैं और प्रसार प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैं.

  1. प्रसार सिमुलेशन के सेटअप
    नोट: इन चरणों पारगम्यता प्रयोग के अनुकरण के सेटअप प्रदर्शित करता है । ९६-और 12-well झिल्ली डालने प्रणालियों के लिए सिमुलेशन अलग से स्थापित किया गया था । "रासायनिक प्रजातियों के परिवहन" मॉड्यूल एक फिक प्रसार के दूसरे कानून के आधार पर समीकरण का उपयोग करता है:
    Equation 9
    जहां सी पदार्थ की एकाग्रता है, टी समय है, यू वेग है, D प्रसार गुणांक है, और आर प्रतिक्रिया दर है । प्रतिक्रिया की दर उपेक्षित रही क्योंकि प्रसार प्रक्रिया में कोई रासायनिक अभिक्रिया नहीं हुई.
    1. प्रोग्राम खोलें और एक नया मॉडल प्रारंभ करें । "मॉडल जादूगर" चुना, 3 डी मॉडल का चयन करें, पुल-डाउन मेनू में भौतिकी इंटरफेस के लिए "पतला प्रजातियों के परिवहन" जोड़ें, "अध्ययन" पर क्लिक करें, "समय निर्भर" अध्ययन, और पर क्लिक करें "पर" का चयन किया ।
    2. "वैश्विक परिभाषा" पर जाएं और सही क्लिक के साथ "पैरामीटर" जोड़ें । ग्रिड में ज्यामितीय और भौतिक पैरामीटर्स दर्ज करें ( तालिका 1, तालिका 2, और आकृति 3e) देखें ।
      नोट: एक ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली में agarose जेल के गुफा की सतह एक विसर्जन गेंद के साथ अनुमानित था ।
    3. प्रयोगों से झिल्ली डालने प्रणाली की ज्यामिति सेट । चरण ३.२ में, एक उदाहरण कैसे ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली की ज्यामिति का निर्माण करने के लिए दिखाया गया है । लंबाई की इकाई मीटर निर्धारित है ।
      नोट: गणना समय को बचाने के लिए पूरी ज्यामिति का निर्माण नहीं है । इसके बजाय, ज्यामिति ज्यामिति के एक चौथाई के केंद्र लाइनों का उपयोग करके कम किया जा सकता है ( चित्र 3 ए और चित्र बी) देखें ।
    4. "परिभाषाओं" में दो "डोमेन जांच" जोड़ें ("परिभाषा" पर राइट क्लिक करें और "जांच" का पता लगाने और स्वीकारकर्ता डोमेन और दाता डोमेन के रूप में अंय के रूप में एक जांच का चयन करें । दोनों प्रकार के लिए चुनें "औसत" और अभिव्यक्ति "सी" इकाई "के साथ" मॉल/3।
      नोट: यह कदम वैकल्पिक है और अनुकरण के दौरान स्वीकारकर्ता और दाता की एकाग्रता से पता चलता है ।
    5. प्रसार गुणांक (Dc) में "ट्रांसपोर्ट गुण 1" में "Dif_w" के रूप में "पतला प्रजातियों का परिवहन" सेट करें ।
      नोट: "ट्रांसपोर्ट गुण 1" दोनों स्वीकारकर्ता और दाता डोमेन के लिए उपयोग किया जाता है । अगले चरण में, बाधा डोमेन अधिलेखित कर दिया जाएगा ।
    6. "पतला प्रजातियों के परिवहन" पर सही क्लिक के साथ एक दूसरा "परिवहन गुण 2" जोड़ें और बैरियर का चयन करें (2) "डोमेन चयन" में । सिमुलेशन के उद्देश्य के आधार पर प्रसार गुणांक बाधा के एक मूल्य के रूप में या एक डमी चर "डी" के रूप में स्थापित किया जा सकता है । पहले टेस्ट रन के लिए 2E-10 मीटर2का वैल्यू सेट करें/s.
      नोट: "D" चरण ३.३ में बाद में घोषित किया जाएगा ।
    7. "में प्रारंभिक 1 मान" के लिए पतला प्रजातियों के परिवहन "शून्य के रूप में एकाग्रता को परिभाषित.
      नोट: "प्रारंभिक मान 1" बाधा और स्वीकारकर्ता डोमेन के लिए उपयोग किया जाता है । अगले चरण में, दाता डोमेन अधिलेखित कर दिया जाएगा ।
    8. "पतला प्रजातियों के परिवहन" पर सही क्लिक के साथ एक दूसरा "प्रारंभिक मान 2" जोड़ें और डोमेन के रूप में दाता (3) का चयन करें । दाता पदार्थ की आरंभिक एकाग्रता के रूप में एकाग्रता सेट करें (उदा., 2 टेबल से C_fl) ।
    9. "पतला प्रजातियों के परिवहन" पर सही क्लिक के साथ "समरूपता 1" जोड़ें, जोड़ें और "सीमा चयन," जो पूरे ज्यामिति दर्पण (चरण ३.२ में ज्यामिति उदाहरण के लिए, यह सीमा संख्या 1, 2, 4, 5, 7, 8 है) की सभी सतहों चुनें ।
      नोट: यदि पूरे ज्यामिति स्थापित किया गया था इस बिंदु उपेक्षित किया जा सकता है ।
    10. "मेष" दो जोड़ें "मुक्त Tetrahedral" पर एक सही क्लिक के साथ । अवरोध (2) डोमेन के रूप में चुनें (ज्यामितीय एंटिटी स्तर को "डोमेन" में बदलें) । "पर नि: शुल्क Tetrahedral 1" सही क्लिक के साथ "आकार" जोड़ें और पूर्वनिर्धारित मेष के लिए "महीन" 12-अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली या एक ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली के लिए "अतिरिक्त ठीक" के लिए ।
    11. दूसरी में "नि: शुल्क Tetrahedral" और डोमेन के रूप में प्रदाता और पूर्वनिर्धारित मेष "सामांय" के लिए एक 12-अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली या एक ९६ के लिए "महीन"-अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली का चयन करें (देखें चित्रा 3 सी और चित्रा 3 डी) ।
      नोट: यह भी एक मोटे जाल का चयन करने के लिए गणना समय बचाने के लिए संभव है. इससे परिणामों की सटीकता कम हो सकती है. ज्यामिति मेष करने के लिए "जाल की स्थापना" में "निर्माण सभी" पर क्लिक करें ।
    12. "अध्ययन 1" में "गणना" के साथ सिमुलेशन प्रारंभ करें ।
  2. उदाहरण के लिए एक ज्यामिति सेटअप
    नोट: यहां एक उदाहरण के कैसे स्थापित करने के लिए ९६ की ज्यामिति-अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली (गुफा बाधा के साथ) दिया जाता है । सभी कदम कार्यक्रम के ज्यामिति मॉड्यूल में मार डाला है । लंबाई की इकाई मीटर निर्धारित है ।
    1. d_w/2 की त्रिज्या और h_sp + h_b + h_a की ऊंचाई के साथ एक सिलेंडर 1 (सही पर क्लिक करें "ज्यामिति 1") उत्पंन ।
    2. d_tran/2, h_b की ऊंचाई + h_a, और h_sp के जेड स्थिति के त्रिज्या के साथ एक सिलेंडर 2 उत्पंन करें ।
    3. "अंतर" विकल्प का प्रयोग करें (सही पर क्लिक करें "ज्यामिति 1", का पता लगाने "बूलियन और विभाजन") सिलेंडर 1 सिलेंडर से 2 घटाना. "ऑब्जेक्ट को जोड़ने के लिए" में "cyl1" को चुना है, को सक्रिय "वस्तु को घटाना" और चुना "cyl2" । नई मात्रा स्वीकारकर्ता की ज्यामिति है ।
    4. d_a/2, h_b की ऊंचाई, और h_sp के जेड स्थिति के त्रिज्या के साथ एक सिलेंडर 3 उत्पंन करें ।
    5. त्रिज्या आर और जेड स्थिति r_z के साथ एक क्षेत्र 1 उत्पन्न करते हैं ।
    6. 1 क्षेत्रः (sph1) सिलेंडर 3 (cyl3) से घटाना करने के लिए "अंतर" विकल्प का उपयोग करें । नई मात्रा अंतर 2 कहा जाता है ।
    7. d_a/2, h_b की ऊंचाई + h_a की त्रिज्या के साथ एक सिलेंडर 4 उत्पंन, और h_sp की स्थिति जेड ।
    8. अंतर 2 से सिलेंडर 4 (cyl4) घटाना करने के लिए "अंतर" विकल्प का उपयोग करें । नई मात्रा स्वीकारकर्ता की ज्यामिति है ।
    9. चरण 3.2.4-3.2.6 अवरोध (agarose जेल या प्रयोग में सेल मॉडल) बनाने के लिए दोहराएँ ।
    10. सभी ज्यामिति तत्वों के एक संघ 1 बनाओ ("ज्यामिति 1" पर दायां क्लिक करें, "बूलियन और विभाजन" का पता लगाने ") ।
    11. d_tran * 2 की लंबाई के लिए सेट सभी किनारों के साथ एक ब्लॉक 1 उत्पन्न, की स्थिति एक्स-d_tran और d_tran के y * 2.
    12. d_tran * 2 के सभी एज लंबाई के साथ एक ब्लॉक 2 उत्पंन, की स्थिति एक्स-d_tran * 2 और के y-d_tran ।
    13. 1 ब्लॉक और 2 ब्लॉक से यूनियन 1 घटाना करने के लिए "अंतर" विकल्प का प्रयोग करें ।
  3. सिमुलेशन के लिए पैरामीटर अनुकूलन जोड़ना
    नोट: पैरामीटर अनुकूलन की मदद के साथ प्रसार गुणांक पहले से उत्पंन प्रयोगात्मक डेटा के लिए लगाया जा सकता है । निंनलिखित निर्देश दिखाने के लिए कैसे प्रसार सिमुलेशन में अनुकूलन भाग को एकीकृत करने के लिए । सुनिश्चित करें कि इन चरणों को शुरू करने से पहले प्रसार सिमुलेशन काम कर रहा है ।
    1. भौतिकी जोड़ें-मॉड्यूल "अनुकूलन" का उपयोग "जिस्मानी जोड़ें" (अनुकूलन में पाया जा सकता है "गणित" श्रेणी में "अनुकूलन और संवेदनशीलता") अनुकरण करने के लिए. "घटक में जोड़ें" पर क्लिक करें ।
    2. "परिभाषा" (घटक में स्थानीय) के तहत सही क्लिक के साथ "चर" जोड़ें और तालिका 3से चर में लिखें ।
      नोट: पैरामीटर ऑप्टिमाइज़ेशन वास्तविक संख्याओं का उपयोग करता है, यानी, प्रसार गुणांक का कारक 1-10 अलग से निर्धारित किया जाना चाहिए.
    3. "परिभाषा" अनुभाग में "घटक युग्मन" और प्रकार में ऑपरेटर नाम "स्वीकारकर्ता" पर राइट क्लिक के साथ एक "औसत 1" जोड़ें ।
    4. प्रयोगात्मक डेटा वाले एक अलग पाठ दस्तावेज़ जनरेट करें ।
      नोट: कोई अर्धविराम स्तंभों को अलग करता है; पंक्ति विराम पंक्तियों को अलग करता है । समय घोषणा सेकंड में मापा जाता है, मॉल में एकाग्रता/ संभव फिटिंग त्रुटियों से बचने के लिए प्रयोगों के अंतराल चरण (देखें चित्रा 2) में पहला और दूसरा डेटा बिंदु निकालें. यहां एक उदाहरण कैसे पाठ दस्तावेज़ की तरह लग सकता है:
      ३५४०;      ०.००२१६
      ७१४०;      ०.००७२४
      १२२४०;    ०.०१७०७
      १५१८०;    ०.०२२३०
      १८६६०;    ०.०२६९७
      २१५४०;    ०.०२९३१
      इस उदाहरण के लिए अनुकरण परीक्षण किया जा सकता है ।
    5. "ऑप्टिमाइज़ेशन" पर दायां क्लिक करके "वैश्विक कम-वर्ग उद्देश्य" जोड़ें, "प्रायोगिक डेटा" के लिए चरण 3.3.4 से पाठ दस्तावेज़ अनुलग्न करें और "समय स्तंभ 1" के रूप में पहले स्तंभ को "वैश्विक ंयूनतम-वर्ग उद्देश्य" और दूसरे स्तंभ के रूप में सही क्लिक के साथ परिभाषित करें "मान स्तंभ 1" पर राइट क्लिक के साथ "वैश्विक ंयूनतम-वर्ग उद्देश्य" । "व्यंजक" के "मान स्तंभ" चर "C" टाइप करें ।
    6. "अनुकूलन" पर सही क्लिक के साथ "वैश्विक नियंत्रण चर 1" जोड़ें और प्रारंभिक मान "1" के साथ एक चर के रूप में "D_search" की घोषणा, कम बाउंड "0", और ऊपरी बाउंड "१०००".
    7. "अध्ययन 1" पर सही क्लिक के साथ "अनुकूलन" जोड़ें और एक अनुकूलन सॉल्वर विधि के रूप में "SNOPT" चुना है. 1E-9 के लिए इष्टतम सहिष्णुता सेट ।
      नोट: यदि सिमुलेशन एकाग्र नहीं किया, इष्टतम सहिष्णुता में वृद्धि । ध्यान रखें कि यदि इष्टतम सहिष्णुता बहुत बड़ी है तो अनुकरण गलत होगा ।
    8. "गणना" में "अध्ययन" के साथ पैरामीटर अनुकूलन प्रारंभ करें । "डी" के रूप में बाधा पर प्रसार गुणांक सेट करने के लिए मत भूलना ।

Representative Results

एक ९६ में पारगम्यता प्रयोगों-एक बाधा के रूप में अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली 2% agarose जेल के साथ एक अनुकरण की सटीकता का मूल्यांकन करने के क्रम में आयोजित किया गया. Fluorescein सोडियम नमक (NaFl) और Fluorescein isothiocyanate-dextranes (एफडी) से प्रसार पदार्थ के आणविक आकार के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया 5 x 10-10 मीटर तक ४५ x 10-10 एम स्टोक्स त्रिज्या (376.27-40, 000 मॉल wt) । सिमुलेशन के मूल पैरामीटर अनुकूलन प्रयोगात्मक डेटा के लिए सिमुलेशन फिट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

कि अंत करने के लिए, केवल रैखिक भागों की नकली पारगम्यता की ढलान प्रयोगात्मक परिणामों की तुलना में थे. छोटे आणविक आकार, सिमुलेशन और प्रयोगात्मक डेटा के लिए NaFl के लिए ९९.२% के साथ अच्छे समझौते में थे और ८०.२% एफडी ४,००० के लिए ( चित्रा 4a और चित्रा 4b) देखें । बड़ा आणविक आकार एफडी १०,०००, एफडी २०,००० के लिए ७९.७% के लिए ५०.५% के सहसंबंध दिखा उच्च विचलन, और एफडी ५३.६ के लिए ४०,०००% उत्पंन । सिमुलेशन में वक्र प्रगति शुरुआत में एक देरी और रेखांकन के आगे पाठ्यक्रम में एक मजबूत वृद्धि दिखाया ( चित्र 4c-4e) देखें ।

पारगम्यता गुणांक और नकली प्रसार गुणांक तालिका 4 में दिखाए जाते हैं. permeation गुणांक आणविक आकार में वृद्धि के साथ कम हो जाती है । मानक विचलन ०.०८ x 10-8 मी और ०.४७ x 10-8 मी (N = 7) के बीच था, जो ४.१८% और ४६.१५% के बीच की एक निरपेक्ष त्रुटि से मेल खाती है । बड़े अणुओं के साथ प्रयोग एक बड़ा निरपेक्ष त्रुटि दिखाई । नकली प्रसार गुणांक प्रयोगात्मक पारगम्यता गुणांक के लिए बहुत इसी तरह से व्यवहार किया. बड़े स्टोक्स radii के साथ पदार्थ प्रसार गुणांक कम दिखाया गया है, और निरपेक्ष त्रुटि ९.०९% और १८.४६% (एन = 3) के बीच की दूरी पर ।

अतिरिक्त permeation प्रयोगों में, चार अलग कोलेजन सेल मॉडल प्रकार एक 12-well झिल्ली डालने प्रणाली में बाधाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया । इन मॉडलों को एक सेल मुक्त मॉडल और कोलेजन जेल में प्राथमिक fibroblasts के विभिंन संयोजनों और सतह पर HaCaT के साथ एक सेल मॉडल शामिल हैं । निंनलिखित संयोजनों का इस्तेमाल किया गया: कोलेजन (कर्नल) एक सेल के रूप में मुक्त मॉडल, कोलेजन + Fibroblasts (कर्नल. + एफ.), कोलेजन + HaCaT (कर्नल. + एच.), और कोलेजन + Fibroblasts + HaCaT (कर्नल. + एफ. + एच.) । DMEM + १०% FCS के साथ Fluorescein सोडियम नमक का उपयोग दाता पदार्थ के रूप में किया जाता था. कोलेजन सेल मॉडल के छवि विश्लेषण के लिए, hematoxylin और eosin (वह) के साथ धुंधला इस्तेमाल किया गया था । यह धुंधला निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था । चित्रा 5में, एक प्रतिनिधि कर्नल के साथ इस तरह के एक दाग + F. + एच मॉडल दिखाया गया है. वह थोड़ा कोलेजन मैट्रिक्स के ऊतक संरचना दाग । fibroblasts मैट्रिक्स में स्थित हैं, और fibroblast और HaCaT कोशिकाओं के नाभिक गहरे बैंगनी रंग में दाग रहे हैं । कोलेजन मैट्रिक्स के शीर्ष पर, वहां एक कई नाभिक, जो HaCaTs के नाभिक होना चाहिए युक्त परत है, मॉडल के शीर्ष पर एक संलग्न परत का निर्माण ।

तालिका 5में, प्रायोगिक permeation गुणांक और नकली प्रसार गुणांक सूचीबद्ध हैं । एक प्रवृत्ति HaCaT के साथ मॉडलों के अधिकांश के लिए देखा जा सकता है, जो HaCaT बिना मॉडल की तुलना में कम permeation/ permeation गुणांकों की निरपेक्ष त्रुटि 10.9-24.4% है, और प्रसार गुणांकों के लिए 5.2%-१२.९% है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक झिल्ली डालने प्रणाली में पारगम्यता प्रयोग के पक्ष को देखने. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक पारगम्यता प्रयोग के अनुकरणीय ग्राफ. स्वीकार्यता की एकाग्रता समय के साथ रची जाती है । दो धराशायी लाइनों ब्रैकेट ग्राफ के लगभग रैखिक हिस्सा । रैखिक भाग की ढलान पारगम्यता गुणांक निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ज्यामिति और सिमुलेशन में झिल्ली डालने प्रणाली के जाल । (क) ९६ की ज्यामिति-अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली । (ख) 12-well झिल्ली डालने प्रणाली की ज्यामिति । (ग) ९६-अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली के जाल । (घ) 12-well झिल्ली डालने प्रणाली के जाल । (ई) झिल्ली डालने की प्रणाली के पार अनुभाग और मापदंडों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक permeation प्रयोग से अनुकूलित सिमुलेशन करने के लिए प्रयोगात्मक डेटा की तुलना. (क) fluorescein सोडियम नमक, (ख) fluorescein isothiocyanate-dextran ४,००० मॉल wt., (ग) १०,००० मॉल wt., (घ) २०,००० मॉल wt., और (ई) ४०,००० मॉल wt. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि वह एक कोलेजन सेल मॉडल के धुंधला (कोलेजन + Fibroblasts + HaCaT) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एक ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली में fluorescein सोडियम नमक और fluorescein isothiocyanate-dextran का उपयोग कर 1/स्टोक्स त्रिज्या के एक समारोह के रूप में पारगम्यता गुणांक. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नाम एमएम में ९६ वेल सिस्टम के लिए Experession मिमी में 12-well प्रणाली के लिए Experssion विवरण
d_tran ५.६५ [mm] १४.७ [mm] वेल का व्यास
d_a ४.२६ [mm] १२.१ [mm] झिल्ली का व्यास
d_w ८.७९ [mm] २१.९७ [mm] स्वीकारकर्ता का व्यास
h_b 2 [mm] 2 [mm] अहो बाधा का
h_sp 1 [mm] 1 [mm] अच्छी तरह से और नीचे के बीच दूरी
h_a ४.७३ [mm] ५.२४ [mm] स्वीकारकर्ता के उच्चाधिकारी
बी h_b २/ - विसर्जन गहराई
आर ((d_a) ^ 2 + 4 * b ^ 2)/(8 * b) - विसर्जन गेंद की त्रिज्या+
r_z r + h_b - z-विसर्जन गेंद की स्थिति+

तालिका 1: "रासायनिक प्रजातियों परिवहन" सिमुलेशन के लिए ज्यामिति मापदंडों. + केवल ९६ में agarose जेल के अनुकरण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली ।

नाम अभिव्यक्ति मान विवरण
C_fl ०.१ [मिलीग्राम/एमएल]/376.28 [जी/ ०.२६५७६ मॉल/2 Fl.So की एकाग्रता ।
C_4 2 [मिलीग्राम/एमएल]/4000 [जी/ ०.५ मॉल/ ४.००० एफडी की एकाग्रता
C_10 2 [मिलीग्राम/एमएल]/10000 [जी/ ०.२ मॉल/ १०.००० एफडी की एकाग्रता
C_20 2 [मिलीग्राम/एमएल]/20000 [जी/ ०.१ मॉल/ २०.००० एफडी की एकाग्रता
C_40 2 [मिलीग्राम/एमएल]/40000 [जी/ ०.०५ मॉल/ ४०.००० एफडी की एकाग्रता
Dif_w 1e-9 [एम ^ 2/ 1E-9m2/ मिश्रण पानी के गुणांक प्रसार

तालिका 2: "रासायनिक प्रजातियों परिवहन" सिमुलेशन के लिए शारीरिक मापदंडों ।

नाम अभिव्यक्ति विवरण
सी स्वीकारकर्ता (c) स्वीकार्यता एकाग्रता की परिभाषा
डी D_search * 1e-10 डी के लिए फैक्टर बदलें

तालिका 3: "अनुकूलन" सिमुलेशन के लिए पैरामीटर्स ।

घुलते पारगम्यता गुणांक (मी) x10-8 प्रसार गुणांक (मी/x10-10 स्टोक्स (एम) x10 की त्रिज्या-10
Fl.So । ४.७९ ± ०.२० १.९४ ± ०.३४ 5
एफडी ४,००० २.३७ ± ०.३१ ०.६५ ± ०.१२ 14
FD10, 000 १.६७ ± ०.४७ ०.२२ ± ०.०२ 23
एफडी २०,००० ०.६५ ± ०.३० ०.२९ ± ०.०४ ३३
एफडी ४०,००० ०.२७ ± ०.०८ ०.१४ ± ०.०२ ४५

तालिका 4: एक ९६-well झिल्ली डालने प्रणाली में पारगम्यता और प्रसार अलग स्टोक्स 2% Agarose जेल + झिल्ली के माध्यम से त्रिज्या के साथ पदार्थों का गुणांक । (fluorescein सोडियम सॉल्ट = Fl. सू., fitc dextran = FD).

मॉडल पारगम्यता गुणांक (मी) x10-8 प्रसार गुणांक (मी/x10-10
कर्नल. २.१८ ± ०.२९ १.२२ ± ०.०६
कर्नल + एफ. १.७७ ± ०.३८ ०.९३ ± ०.१२
कर्नल + एच. १.६४ ± ०.४० ०.९६ ± ०.०५
कर्नल + F. + H. १.६५ ± ०.१८ ०.८८ ± ०.११

तालिका 5: पारगम्यता और प्रसार एक कोलेजन सेल मॉडल के माध्यम से fluorescein सोडियम नमक के गुणांक में एक 12-अच्छी तरह से झिल्ली डालने प्रणाली (कर्नल = कोलेजन, F. = Fibroblast, H. = HaCaT) ।

Discussion

इस अध्ययन के एक ऊतक के माध्यम से permeation यों तो विकसित विधि दस्तावेजों-एक झिल्ली पर इंजीनियर का निर्माण । agarose जेल के माध्यम से अलग आणविक आकार के साथ पदार्थों की Permeation पहले परीक्षण और विधि और इसी अनुकरण सत्यापित करने के लिए जांच की थी । यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि छोटे अणुओं तेजी से एक मैट्रिक्स जाल के माध्यम से रिस (जेल निस्पंदन में प्रभाव के अपवाद के साथ पारगम्यता क्रोमैटोग्राफी द्वारा). इसी तरह की टिप्पणियों श्वेतपटल26, मानव एपिडर्मल झिल्ली27, मानव त्वचा17, और चूहा त्वचा28के माध्यम से पदार्थों के आकार अपवर्जन प्रयोगों के साथ किया गया । पारगम्यता गुणांक और इसी स्टोक्स त्रिज्या (एक कठिन क्षेत्र है कि अणुओं के रूप में एक ही प्रसार दर के साथ चलता है की त्रिज्या, आमतौर पर अणु के प्रभावी त्रिज्या से छोटे) के बीच एक व्युत्क्रम सहसंबंध दिखाया गया है 26 , 28, और एक समान संबंध विभिंन आणविक आकारों के पदार्थों के साथ प्रयोगों में मनाया गया । 1/स्टोक्स त्रिज्या पर पारगम्यता गुणांक साजिशन द्वारा, छोटे आणविक आकार के साथ चार समूहों पर एक रैखिक सहसंबंध पाया गया था (R2 = ०.९३) (चित्रा 6). यह इंगित करता है कि सुझाई गई विधि के साथ नकली पारगम्यता गुणांक एक यथार्थवादी श्रेणी में हैं ।

प्रयोगों में ४६.१५% की त्रुटि फ्रांज प्रसार सेल सिस्टम10के साथ पारगम्यता प्रयोगों के लिए रिपोर्ट की तुलना में थोड़ा बड़ा है. एक संभव विवरण fluorescein-isothiocyanate-dextran, जो बाद में चर्चा की है के आकार वितरण हो सकता है ।

विधि वर्णित फ्रांज प्रसार सेल प्रणाली का उपयोग कर तरीकों के साथ तुलना में महत्वपूर्ण लाभ है । सबसे पहले, सेटअप और अधिक कॉंपैक्ट है; प्रयोगों सीधे एक झिल्ली डालने प्रणाली है, जो एक वाणिज्यिक अच्छी तरह से थाली (∼ 13 cm x ८.५ cm) के पैमाने पर है में मार डाला । यह एक साथ एक अलग फ्रांज प्रसार कक्ष प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक है, जबकि एक साथ चलाने के लिए एकाधिक नमूने सक्षम करता है । दूसरे, एक त्वचा मॉडल की पारगम्यता सीधे झिल्ली डालने में मापा जा सकता है, जहां खेती जगह लेता है । फ्रांज प्रसार कोशिकाओं का उपयोग करना, नमूनों को बाहर ले जाने के लिए और सिस्टम पर मुहिम शुरू की है, जो छोटे नमूनों के लिए अधिक बोझिल है और यह भी अधिक समय लेने वाली है ।

कोलेजन सेल मैट्रिक्स के साथ Permeation प्रयोगों से पता चला कि इस विधि को सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है सेल-वरीयता प्राप्त प्रणालियों । यहां प्रस्तुत मॉडल त्वचा मॉडल के लिए सत्यापित किया गया था; हालांकि, विधि कार्बनिक कोशिका संस्कृतियों के अंय प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे, गुर्दे या जिगर ।

इस अध्ययन में, एक कोलेजन सेल मॉडल का उपयोग किया गया था जिसमें HaCaT कोशिकाओं को पूरी तरह से मॉडल की सतह को कवर ( चित्रा 5देखें) । यह पारगम्यता गुणांक की कमी करने के लिए नेतृत्व, का प्रदर्शन है कि विधि काफी संवेदनशील के साथ एक कोलेजन सेल मॉडल के बीच और HaCaT की एक परत के बिना गुणांक पारगम्यता भेद है. आदर्श रूप में, एक त्वचा मॉडल ऊपर एक बाधा है, जो एक असली त्वचा29के एपिडर्मिस दृष्टिकोण का निर्माण करना चाहिए, और यह इसलिए गुणवत्ता (उदा, dermis के निर्माण, एपिडर्मिस) के वास्तविक उपयोग से पहले त्वचा मॉडल की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक त्वचा मॉडल का विकास त्वचा प्रोटीन और कोलेजन30,31,३२का पता लगाने से धुंधला तकनीक और quantified के साथ visualized किया जा सकता है । पारगम्यता गुणांक भी त्वचा मॉडल के विकास का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है, लेकिन आगे प्रयोगों इस की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं. पहले उल्लेखित के रूप में, इस विधि समानांतर में एकाधिक नमूने चल सक्षम करता है । यह भी खेती के दौरान नमूने लेने के लिए पारगम्यता को मापने के लिए संभव है, और इस तरह त्वचा मॉडल के इस पैरामीटर के विकास का पालन.

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पारगम्यता एक जेल के माध्यम से मापा जाता है/ पाया पारगम्यता गुणांक सिस्टम-विशिष्ट है, जिससे अलग त्वचा मॉडल के परिणाम केवल तुलना किया जा सकता है जब एक ही झिल्ली डालने का उपयोग कर. इसके अलावा, त्वचा मॉडल के लिए पूरी खेती क्षेत्र को कवर करने की जरूरत है ताकि यह सुनिश्चित करें कि परीक्षण पदार्थ केवल मॉडल के माध्यम से और यह आसंन नहीं है, जो पारगम्यता मापा में त्रुटियों को प्रेरित करेगा के माध्यम से रिस जाएगा । एक और पहलू है कि भविष्य के प्रयोगों में विचार किया जाना चाहिए प्राकृतिक त्वचा के आसपास के वातावरण है । आम तौर पर, त्वचा की सतह के तापमान भीतरी क्षेत्र है, जो permeation शर्तों को प्रभावित कर सकते है की तुलना में कम है ।

आदेश में कंप्यूटर सिमुलेशन, लागू सिमुलेशन के लिए पैरामीटर अनुकूलन सक्षम बनाता है जो एक विधि के साथ प्रयोगशाला प्रयोगों को संरेखित करने के लिए प्रस्तुत किया गया था । सिमुलेशन के लिए छोटे आणविक आकारों के साथ पदार्थों के लिए प्रयोगात्मक डेटा के साथ अच्छी तरह से मेल पाया गया । हालांकि, सिमुलेशन और प्रयोगात्मक डेटा के बीच विचलन बड़े आणविक आकार के साथ पदार्थों के लिए मनाया गया । बड़े polysaccharide अणुओं घर्षण बढ़ाने के लिए और एक जेल में प्रसार प्रक्रिया को धीमा कर सकते हैं । इस आशय असामांय प्रसार है, जो प्रयोगात्मक और सिमुलेशन मूल्यों के बीच विचलन के लिए एक संभावित कारण है३३,३४का कारण बनता है । एक अंय व्याख्या fluorescein-isothiocyanate-dextran में छोटे या बड़े कणों की उपस्थिति हो सकती है । निर्माता एक दिया सीमा है, जो छोटे और बड़े कणों को उपस्थित होने की अनुमति देता है के साथ मतलब आकार के रूप में पदार्थ के आणविक वजन निर्दिष्ट करता है । यह भी स्पष्ट नहीं है कैसे फैलाया इन पदार्थों रहे हैं, के रूप में छोटे कणों तेजी से जेल और द्रव चैनल के माध्यम से रिस । यह इन प्रसार और घर्षण प्रभाव पर विचार करने के लिए अनुकरण का विस्तार करने के लिए संभव है ।

पारगम्यता प्रयोग और सिमुलेशन एक 2-ओसी में उपयोग के लिए विकसित किया गया. अनुकरण की मदद के साथ, इस प्रायोगिक विधि सीधे और अधिक परिष्कृत प्रयोगात्मक setups को हस्तांतरित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, झिल्ली डालने प्रणाली सिमुलेशन आसानी से एक 2-OC की ज्यामिति के लिए या समान सेट अप के साथ अंय प्रणालियों के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है । सिमुलेशन मॉडुलन का यह विकल्प भविष्य के प्रयोगों के डिजाइन का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस तरह के वाष्पीकरण के रूप में साइड इफेक्ट, असामान्य प्रसार, और झिल्ली प्रभाव अनुकरण बढ़ाने के लिए एकीकृत किया जा सकता है, जिससे सटीकता में सुधार. सिमुलेशन कार्यक्रम को बदलने या सिमुलेशन समीकरण को बढ़ाने का अवसर देता है, साथ ही साथ अंय शारीरिक मॉड्यूल को एकीकृत करने के लिए त्वचा मॉडल विकास के अंय पहलुओं की जांच करने के लिए । एक उदाहरण के एक कोलेजन सेल मॉडल में ग्लूकोज की खपत और स्तनपान उत्पादन का अनुकरण है ।

चिकित्सा पदार्थों के परीक्षण में एक विशेष रूप से दिलचस्प पहलू यह है कि कैसे पदार्थ एक अंग पर एक चिप प्रणाली में वितरित कर रहे हैं । सिमुलेशन और पारगम्यता पैरामीटर मेरी मदद जैसे सवालों का जवाब देने के लिए कैसे तेजी से एक पदार्थ प्रणाली में रिस के रूप में अच्छी तरह से जो एकाग्रता एक बहु अंग चिप में अन्य ऊतकों के लिए उपलब्ध हो जाएगा. इस विधि का समर्थन और विकास और ऐसे अंग के परीक्षण-पर चिप सिस्टम को बढ़ाने कर सकते हैं ।

Disclosures

Uwe मार्क्स सीईओ और एक शेयरधारक और गर्ड Lindner TissUse GmbH, एक कंपनी के निर्माण और MOC प्रौद्योगिकी के व्यावसायीकरण का एक शेयरधारक है । अंय लेखक इस पत्र के प्रकाशन के संबंध में हितों का कोई विरोध नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

यह काम ग्रांट नो के तहत ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से वित्तीय सहायता से बनाया गया था. PO413/12-1 और LA 1028/7-1 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Carl Roth K297.2 High Resolution Powder
Collagen Serva 47256.01 Collagen R solution 0.4 %
DMEM Lonza (Biozym Scientific GmbH) 880010-12 High Glucose with L-Glutamine
FCS Biochrom GmbH S0615 0114F Fetal Calf Serum
Fluorescein Sodium Salt Sigma-Aldrich 46960-25G-F
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 46944-500MG 4000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD10S-250MG 10 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD20S-250MG 20 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD40S-250MG 40 000 g/mol
HBSS ThermoFisher Scientific 14170120 no calcium, no magnesium , with phenol red
NaOH Merck 1.06467.9010 granulated
PBS Gibco 18912-014 tablets
Transwell Cell Culture Inserts Corning 3391 96 well, 0.4 µm pore size
Transwell Cell Culture Inserts Corning (VWR) 734-1563 12 well, 0.4 µm pore size
Trypsin Biochrom GmbH L2143 with EDTA

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References

  1. Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
  23. Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
  26. Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

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समस्या १३२ त्वचा मॉडल पारगम्यता प्रसार झिल्ली डालने प्रणाली सिमुलेशन fluorescein isothiocyanate-dextran fluorescein सोडियम नमक
दृढ़ संकल्प और बहु के लिए एक झिल्ली डालने प्रणाली में एक 3 डी ऊतक मॉडल में पारगम्यता और प्रसार के अनुकरण के लिए एक विधि-अच्छी तरह से प्लेटों
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Hsu, H. H., Kracht, J. K., Harder,… More

Hsu, H. H., Kracht, J. K., Harder, L. E., Rudnik, K., Lindner, G., Schimek, K., Marx, U., Pörtner, R. A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates. J. Vis. Exp. (132), e56412, doi:10.3791/56412 (2018).

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