Summary
أسلوب لتحديد نفاذية في غشاء إدراج نظام لوحات متعددة جيدا، وعرضت في السيليكون التحسين المعلمة لحساب معاملات نشر استخدام المحاكاة.
Abstract
نماذج في المختبر يزرع الجلد قد تصبح ذات أهمية متزايدة للتطبيقات الصيدلانية ومستحضرات التجميل، وتستخدم أيضا في تطوير الأدوية، فضلا عن اختبار مادة. هذه النماذج تزرع معظمها في غشاء-إدراج نظم، على نفاذية تجاه مواد مختلفة يجري عاملاً أساسيا. عادة، تتطلب الأساليب المتبعة لتحديد هذه المعلمات عادة ما تكون العينات كبيرة الحجم (مثلاً، خلية نشر فرانز) أو معدات شاقة (مثلاً، الأسفار الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (فراب)). وتقدم هذه الدراسة أسلوب لتحديد معاملات النفاذية مباشرة في أنظمة غشاء-إدراج مع أحجام قطرها من 4.26 و 12.2 مم (المساحة المزروعة). تم التحقق من صحة الأسلوب مع [اغروس] والمواد الهلامية الكولاجين، فضلا عن نموذج خلية الكولاجين تمثل نماذج الجلد. تخلل عمليات المواد مع مختلف الأحجام الجزيئية وتخلل من خلال نماذج مختلفة من الخلية (تتكون من جل الكولاجين وتنتجها الخلايا الليفية هاكات) وصفت بدقة.
وعلاوة على ذلك، أنشئت لدعم الأسلوب التجريبي أعلاه، محاكاة. المحاكاة يناسب البيانات التجريبية جيدا للمواد مع صغر الحجم الجزيئي، وتصل إلى 14 × 10-10 م شعاع ستوكس (4,000 ميغاواط)، بالتالي أداة واعدة لوصف النظام. وعلاوة على ذلك، المحاكاة يمكن أن تقلل إلى حد كبير الجهود التجريبية وهي قوية بما يكفي تمديدها أو تكييفها للأجهزة أكثر تعقيداً.
Introduction
وقد أصبحت الثقافات 3D Organo نموذجية أدوات قوية لتطوير العقاقير ومضمون الاختبار1. وفي هذا الصدد، نماذج جلد الإنسان أهمية خاصة نظراً للمتطلبات التنظيمية، مثل تلك الموجودة في صناعة مستحضرات التجميل. وفي وقت لاحق أدت إلى تطوير العديد من النماذج ثلاثية الأبعاد الجلد، لاستخدامها أما كجهاز واحد ثقافاتهم في لوحات متعددة جيدا، أو متعدد organ الرقائق في تركيبة مع نماذج إضافية الجهاز، مثلاً، الكبد2.
فيما يتعلق بزراعة بما يوازي الجلد، واجهة الهواء السائل (على) عنصرا أساسيا لتمايز البشرة الصحيح3. إدراج ثقافة الخلية تتألف من سفينة مع غشاء سائل-منفذ أسفل تستخدم عادة لإنشاء على. وتستخدم على نطاق واسع ALIs في نماذج الجلد المتاحة تجارياً مثل ابيديرم4وفينيون5ابيسكين6، لثقافة نماذج الجلد مع أحجام من 96-جيدا (4.26 ملم في القطر) حتى لوحات 12-جيدا (12.2 مم في القطر). يحدد الأسلوب الموصوفة هنا تخلل للمواد في نظام إدراج غشاء.
معامل نفاذية معلمة هامة لتقييم نوعية أي مثقف الجلد النموذجي بالمقارنة مع الجلد الأصلي5، وهو يستخدم لتقييم مدى سرعة ترحيل المواد الفعالة من خلال الجلد. خاصة إذا كانت منتجات الأدوية أو مستحضرات التجميل بحاجة إلى أن تطبق على الجلد، هذه المعلمة ضروري لفهم عند التحديد عوامل نشطة المرور عبره. كذلك يمكن أن تساعد محاكاة للتنبؤ بسلوك النظام وبعد ذلك خفض الجهد التجريبي مضيعة للوقت اللازم، ولا سيما عند مجموعة كبيرة من المواد وتشارك.
الخلية نشر فرانز الدولة للفنون تخلل التجارب مع الجلد والجلد نماذج5،،من67،،من89. هذا الجهاز يتكون من مقصورات اثنين مع عينة ثابتة (نشر الجدار) بين بين. يتم تطبيق مضمون لفحصها مباشرة إلى الجزء العلوي من النموذج (حجرة المانحة) ويمكن الكشف عن تركيز المجمع تتخلل في حجرة (acceptor) المعاكس. على الجانب يقبلون، تكفل درجة حرارة ثابتة وتركيز مادة متجانسة من خلال دائرة درجة حرارة ومحرض مغناطيسية. ويمكن أخذ عينات من ذراع أخذ عينات على الجانب يقبلون خلية فرانز. مع نطاق ارتفاع بين 19 سم و 179 سم، وهذا النظام هو كبيرة نسبيا10،11. أسلوب آخر لتحديد معاملات نشر في جل مثل المواد والأنسجة وهو فراب. ويستخدم هذا الأسلوب مبدأ تبيض المسمى فلوريسسينتلي الجسيمات في الجل وثم تحديد وقت الاسترداد من منطقة المبيضة لحساب معامل نشر12،،من1314.
وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التحليل الطيفي فورييه-التحويل-الأشعة تحت الحمراء (FTIR) للكشف عن حركة الجسيمات بامتصاص الضوء الأشعة تحت الحمراء بغية تحديد عملية تخلل المواد في الجلد15،16. ومع ذلك، هذه أو غيرها من أساليب التصوير (مثلاً، الأسفار اثنين-فوتون ارتباط مطيافية17) تحتاج إلى تكلفة الصكوك مكثفة.
في هذه المقالة، يرد أسلوب لقياس مباشرة نفاذية حاجز داخل نظام إدراج غشاء، حيث يمكن أن تكون نموذجا جلد المزروعة. يتيح هذا الأسلوب نفاذية تجارب لتشغيل مع عدد كبير من عينات صغيرة (حجم جيدا تصل إلى 4.26 مم) في نظام التعاقد. هذا على النقيض من الخلية نشر فرانز، حيث جهاز منفصل مطلوب لكل التحقيقات، التي يجب أن تكون مثبتة على الجهاز ومن الصعب أن ندرك لعينات صغيرة (حجم 4.26 مم). وعلاوة على ذلك، نظراً للأسلوب لا تتطلب الأجهزة الرئيسية (مثلاً، مجهر [كنفوكل] أو مولتيفوتون)، هو تحقيق خفض في كل من الوقت والتكلفة.
جميع التجارب التي أجريت في غشاء microporous إدراج نظم بعينه (الحاجز) تتكون من [اغروس] هلام أو نموذج خلية الكولاجين المنشأة على الغشاء. وطبقت المواد الفلورية (المانحين) مع اختلاف الأحجام الجزيئية على الجزء العلوي من النموذج، وتم الكشف عن تركيز مادة تعم في الجزء السفلي (acceptor) باستخدام قارئ لوحة فلورية (انظر الشكل 1). وبغية التحقق من صحة الأسلوب واختبار دقة هذه المحاكاة، أنتجت المواد الهلامية [اغروس] وتستخدم كحاجز. الهلاميات المائية تستخدم عموما لتحقيق عمليات نشر وتخلل في المتوسط المسامية في العلوم البيولوجية13. ثم تم اختبار الأسلوب في نظام الخلية المصنف يتكون من الكولاجين مصفوفة الخلايا الليفية الأولية والكبار انخفاض الكالسيوم عالية درجة الحرارة الكيراتينيه (هاكات) الخلايا البشرية (نموذج خلية المصفوفة)، الذي هو جلد مبسطة نموذج18،19 .
بالإضافة إلى ذلك، تمت محاكاة عملية تخلل عن طريق تدفق المحاكاة مع ديناميات الموائع الحسابية. ووجد أنه عن طريق التحسين المعلمة، ويمكن أن يحسب معامل نشر من البيانات التجريبية. وبوجه عام، يوفر هذا المحاكاة تطبيقات مختلفة؛ على سبيل المثال، فمن الممكن التنبؤ بعملية تخلل استناداً إلى تجارب قصيرة والمحاكاة ويمكن خفض كبير في العدد التجارب.
الأسلوب التجريبي ومحاكاة كانت مصممة للتطبيق نظام الجهاز على رقاقة1،20،21، وعلى وجه التحديد 2-الجهاز--الرقاقة (2-OC) نمواً تجارياً،1،22 23،،من2425. من حيث المبدأ، يمكن وصف عملية تخلل أي نموذج الجهاز استناداً إلى نظم إدراج الغشاء بهذه الطريقة.
Protocol
1-إعداد العينة للدراسات نفاذية
ملاحظة: للتحقق من القياسات تخلل والمحاكاة، استخدمت عينة تتكون من [اغروس] هلام أو نموذج مصفوفة خلايا استناداً إلى زراعة نموذج الجلد.
- [اغروس] هلام
- حل 0.2 غرام مسحوق عالية الدقة [اغروس] في 10 مل ح2س (الماء المقطر مزدوجة).
- مزيج الحل والحرارة تصل إلى 80 درجة مئوية. الحفاظ على درجة الحرارة لمدة 8 دقائق.
- تطبيق ميليلتر 28.6 [اغروس] هلام على الغشاء غشاء 96-جيدا إدراج نظام (4.26 ملم في القطر) أو استخدام 226 ميليلتر للغشاء جيدا 12 إدراج نظام (12 ملم في القطر) (مثلاً، نظام ترانسويل).
- انتظر 10 دقائق حتى هو توطد الهلام.
- جل الكولاجين
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة والحلول التي يتم الاحتفاظ بها على الجليد لإبطاء البلمرة جل الكولاجين.- ميليلتر 125 مزيج من متوازن الملح الحل (حبس هانكس) مع 1 مل من 0.4% الحل الكولاجين R (فأر الذيل الكولاجين).
- تيتراتي الحل مع هيدروكسيد الصوديوم 1 م (هيدروكسيد الصوديوم) (~ 6 ميليلتر) حتى لون التغييرات الفينول الحمراء من اللون الأصفر إلى اللون الأحمر.
- إضافة 125 ميليلتر من دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم) + 10% مصل العجل الجنين (FCS) لجل الكولاجين والمزيج بعناية مع تلميح ماصة.
- تطبيق ميليلتر 28.6 جل الكولاجين للغشاء للنظام إدراج غشاء 96-جيدا أو 226 ميليلتر لنظام إدراج غشاء 12-جيدا.
- ترك الجل في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2) لمدة 30 دقيقة.
- نموذج الخلية الكولاجين مع تنتجها الخلايا الليفية
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة.- إعداد الخلايا الليفية الأولية 5-7 أيام قبل التجربة. زراعة الليفية مع دميم + 10 ٪ السفح في خلية ثقافة قوارير (75 سم2) وتغيير في المتوسط كل 2-3 أيام.
ملاحظة: اعتماداً على الإعداد التجريبية، يمكن استخدام عدد أكبر من الخلايا. - إزالة المتوسطة من قارورة ثقافة الخليوي (روافد 80 ٪) ويغسل مرتين مع 10 مل (ثقافة قارورة 75 سم2) الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). أضف 3 مل من 0.05% التربسين/حمض الإيثيلين (يدتا) واحتضان لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.
- اضغط برفق في قارورة الثقافة لفصل الخلايا من على سطح الأرض. وقف رد الفعل بإضافة 3 مل من دميم + 10 ٪ السفح. نقل الحل في أنبوب الطرد مركزي.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 120 x ز وإزالة المادة طافية ريسوسبيند الخلايا مع 0.5 مل من دميم + 10 ٪ السفح.
- عد الخلايا وضبط لتركيز 0.5 × 106 خلايا/مل.
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية على الجليد لإبطاء البلمرة جل الكولاجين. - 125 مزيج ميليلتر من حبس مع 1 مل من محلول الكولاجين R 0.4 في المائة.
- تيتراتي الحل مع هيدروكسيد الصوديوم م 1 (~ 6 ميليلتر) حتى يتغير لون أحمر الفينول من اللون الأصفر إلى اللون الأحمر.
- إضافة 125 ميليلتر من تعليق خلية (دميم FCS 10% + 0.5 × 106 خلايا/مل) في الكولاجين هلام ويخلط بعناية ماصة.
- تطبيق ميليلتر 28.6 جل الكولاجين في الغشاء للنظام إدراج غشاء 96-جيدا أو 226 ميليلتر لنظام إدراج غشاء 12-جيدا.
- ترك الجل في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2) لمدة 30 دقيقة.
- تطبيق ميليلتر 75 دميم + 10% FCS على سطح هلام و 300 ميليلتر للوحة المتلقي من الغشاء 96-جيدا إدراج النظام. للغشاء 12-جيدا إدراج النظام، استخدام وحدة تخزين من 590 ميليلتر ميليلتر السطحية و 1,846 للوحة المتلقي.
- إزالة المتوسطة من سطح نموذج المصفوفة الخلية (النقل الجوي) وتبني نموذج المصفوفة خلية أخرى لمدة 7 أيام. استخدام 100 ميكروليتر المتوسطة في الجزء السفلي وتغيير في المتوسط كل يوم.
- إعداد الخلايا الليفية الأولية 5-7 أيام قبل التجربة. زراعة الليفية مع دميم + 10 ٪ السفح في خلية ثقافة قوارير (75 سم2) وتغيير في المتوسط كل 2-3 أيام.
- نموذج الخلية الكولاجين مع هاكات
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة.- إعداد هاكات 5-7 أيام قبل الخطوات التالية. زراعة هاكات مع دميم + 5 ٪ السفح في قارورة ثقافة الخليوي (75 مم2) وتغيير في المتوسط كل 2-3 أيام.
ملاحظة: اعتماداً على الإعداد التجريبية، يمكن استخدام عدد أكبر من الخلايا. - إزالة المتوسطة من قارورة ويغسل مرتين مع 10 مل (ثقافة قارورة 75 سم2) في برنامج تلفزيوني. أضف 3 مل من 0.05% التربسين/يدتا واحتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. التوقف عن رد فعل مع 3 مل دميم + 10 ٪ السفح. نقل الحل في أنبوب الطرد مركزي.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 120 x ز وإزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 0.5 مل من دميم + 10 ٪ السفح.
- عد الخلايا وضبط لتركيز 0.5 × 106 خلايا/مل.
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية على الجليد لإبطاء البلمرة جل الكولاجين. - 125 مزيج ميليلتر من حبس مع 1 مل من محلول الكولاجين R 0.4 في المائة.
- تيتراتي الحل مع هيدروكسيد الصوديوم م 1 (~ 6 ميليلتر) حتى يتغير لون أحمر الفينول من اللون الأصفر إلى اللون الأحمر.
- إضافة 125 ميليلتر من دميم + 10% FCS لجل الكولاجين ومزجها بعناية مع ماصة.
- تطبيق 28.6 ميليلتر من تعليق خلية في الغشاء للنظام إدراج غشاء 96-جيدا أو 226 ميليلتر لنظام إدراج غشاء 12-جيدا.
- ترك الجل في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2) لمدة 30 دقيقة.
- تطبيق ميليلتر 75 من تعليق خلية على سطح هلام وإضافة 300 ميليلتر من دميم + 10% FCS إلى لوحة المتلقي من الغشاء 96-جيدا إدراج النظام. للغشاء 12-جيدا إدراج النظام، استخدام وحدة تخزين من 590 تعليق خلية ميليلتر ميليلتر السطحية و 1,846 من دميم + FCS 10% للوحة المتلقي.
- تبني نموذج المصفوفة الخلية لمدة 3 أيام؛ تبادل المتوسط بعد يومين.
- إزالة المتوسطة من سطح نموذج المصفوفة الخلية واحتضان نموذج المصفوفة الخلية لمزيد من يوم 7. استخدام 100 ميليلتر المتوسطة في الجزء السفلي وتغيير في المتوسط كل يوم.
- إعداد هاكات 5-7 أيام قبل الخطوات التالية. زراعة هاكات مع دميم + 5 ٪ السفح في قارورة ثقافة الخليوي (75 مم2) وتغيير في المتوسط كل 2-3 أيام.
- نموذج الخلية الكولاجين مع الخلايا الليفية وهاكات
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة على الجليد لإبطاء البلمرة جل الكولاجين. إعداد الخلايا الليفية كما هو موضح في الخطوة 1، 3 حتى الخطوة 1.3.5، وإعداد يوم هاكات لاحق كما هو موضح في الخطوة 1، 4 حتى الخطوة 1-4-4.- 125 مزيج ميليلتر من حبس في 1 مل من محلول الكولاجين R 0.4 في المائة.
- تحييد الحل مع هيدروكسيد الصوديوم م 1 (~ 6 ميليلتر) حتى يتغير لون أحمر الفينول من اللون الأصفر إلى بنفسجي أحمر.
- إضافة 125 ميليلتر من تعليق خلية تنتجها الخلايا الليفية الأولية تتكون من دميم + FCS 10% + 0.5 × 106 خلايا/مل للكولاجين هلام والمزيج بعناية.
- تطبيق 28.6 ميليلتر من تعليق خلية غشاء النظام إدراج غشاء 96-جيدا أو 226 ميليلتر لنظام إدراج غشاء 12-جيدا.
- ترك الجل في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2) لمدة 30 دقيقة.
- بعد ذلك، تطبيق ميليلتر 75 دميم + 10% FCS على سطح هلام وميليلتر 300 إلى لوحة جهاز استقبال نظام إدراج غشاء 96-جيدا. للغشاء 12-جيدا إدراج النظام، يستخدم حجم 590 ميليلتر ميليلتر السطحية و 1,846 للوحة المتلقي.
- احتضان لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- إزالة المتوسطة من السطح وإضافة تعليق خلية هاكات مع 0.5 × 106 خلايا/مل. وحدة التخزين هو نفسه كما هو موضح من قبل ضمن الخطوة 1.5.6.
- تبني نموذج المصفوفة الخلية لمدة 3 أيام؛ تبادل المتوسط بعد يومين.
- إزالة المتوسطة من سطح نموذج المصفوفة الخلية واحتضان نموذج المصفوفة الخلية لمزيد من يوم 7. استخدام 100 ميليلتر المتوسطة في الجزء السفلي وتغيير في المتوسط كل يوم.
ملاحظة: لهذا التحقيق، وأعدت 3 عينات هلام/خلية-نموذج لنظام إدراج غشاء 12-جيدا. للغشاء 96-جيدا إدراج نظام، استخدمنا 6 عينات لنموذج هلام/خلية. للوسائل الإحصائية، 3 عينات شائعة. ولكن للتجارب في نظام إدراج غشاء 96-جيدا مع نموذج المصفوفة الكولاجين توقعنا الإخفاقات والانحرافات لثقافة الخلية. ولذلك، علينا اختيار عدد أكبر من العينات.
2-نفاذية دراسات في الغشاء إدراج نظام
-
مادة المانحين
ملاحظة: يتم إنتاج أملاح الصوديوم fluorescein اثنين (نفل).- حل نفل في ح2س بتركيز 0.1 مغ/مل و 0.01 ملغ/مل. يتم حله مختلف fluorescein isothiocyanate-ديكسترانيس (FD) مع وزن الجزيئي من 000 4، 10,000، 20,000 و 40,000 غ/مول في ح2س بتركيز 2 ملغ/مل. استخدام هذه الحلول كمضمون المانحة لتجارب النفاذية (انظر الشكل 1) مع [اغروس] هلام.
- لإعداد نموذج الخلية الكولاجين، إعداد جميع الحلول مع دميم + FCS 10% بدلاً من الماء.
ملاحظة: إعداد حلول الأسهم (10 × التركيز العالي) من مضمون المانحين. يمكن أن تؤثر الاختلافات الصغيرة من تركيز الجهات المانحة نتائج التجربة النفاذية.
-
الأسلوب التجريبي
ملاحظة: يتم تنفيذ تجربة النفاذية في 37 درجة مئوية ورطوبة > 90%. هذه المعلمة يضمن استمرارية الخلايا. تأثير الحرارة في عملية نشرها حتى يتم استخدام نفس المعلمات للتجارب مع [اغروس] هلام وجل الكولاجين، والكولاجين نموذج الخلية. معلومات وحدة التخزين في القوس الذي يشير إلى نظام إدراج غشاء 12-جيدا.- تحضير غشاء جيدا 96-(أو 12-) إدراج النظام بحاجز يتألف من [اغروس] هلام (انظر البروتوكول 1-1) أو الخلية النموذجية (انظر بروتوكول 1.2-1.5) ومضمون المانحة الأسفار.
- إعداد تخفيف من 01:10، 01:20، 01:40، 1:80، 1:160، و 1:320 من المواد المانحة لإنشاء منحنى قياسي. "الماصة؛" 300 ميليلتر (1,846 ميليلتر) لكل تمييع في ثلاث آبار لصفيحة المتلقي. للغشاء 12-جيدا إدراج نظام استخدام لوحة استقبال منفصلة. تخفيف المسلسل تستخدم لتحويل fluorescence يقاس [رفو] إلى تركيز مكافئ [مغ/مل].
- إضافة 75 ميليلتر (590 ميليلتر) جوهر المانحين على رأس العينة ([اغروس] هلام أو الخلية النموذجية) و 300 ميليلتر (1,846 ميليلتر) من مضمون يقبلون (ح2س أو دميم + 10 ٪ السفح) في لوحة الاستقبال (انظر الشكل 1).
ملاحظة: ضمان إدراج نظام أسطح السائل في الغشاء وفي لوحة الاستقبال بنفس المستوى لتجنب الضغط الهيدروليكي. - نقل النظام بأكمله على شاكر في الحاضنة. ضبط اهتزاز لتحقيق خلط متجانس (المدار السكتة الدماغية مجموع 1.5 مم، ويتم ضبط السرعة على مستوى 3.5، الذي يتصل بتناوب من ~ 480 1/دقيقة) لتجنب تدرج التركيز، مما يؤثر على عملية الانتشار.
- تحديد الأسفار دورياً كل ساعة. لقياس الأسفار ونقل نظام إدراج غشاء في صفيحة فارغة وقياس الأسفار داخل جهاز الاستقبال باستخدام قارئ لوحة. استخدم طول موجي إثارة من 485 نانومتر والانبعاثات من 535 نانومتر فلوريسسين.
- تشغيل التجربة بالنسبة ح 5.
ملاحظة: أثناء التجارب، يتبخر السائل من النظام بأكمله. تغيير التركيز في البلدان المانحة ويقبلون التبخر ويؤثر النتائج. يتم تجاهل هذا الأثر في حالة وقت تشغيل 5 ح، ولكن لأوقات تشغيل أطول وينبغي النظر.
-
حساب معامل النفاذية
- لإنشاء المنحنى المعياري، ارسم الأسفار لتخفيف المسلسل مقابل تركيز وإجراء انحدار خطي عبر البيانات.
- استخدام الميل لخط الانحدار الخطي لتحويل البيانات fluorescence التجربة تخلل إلى تركيز. غرض المحاكاة، تحويل وحدات mol/م3.
- ارسم تركيز كدالة على مر الزمن ووضع الجزء الخطي للبيانات (انظر الشكل 2).
- تحديد المنحدر من هذا الجزء الخطي وحساب معامل النفاذية وفقا للمعادلة التالية (انظر على سبيل المثال في الشكل 2):
حيث العاصمةA/dt هو تغيير تركيز المواد داخل الجانب يقبلون على مر الزمن (المنحدر)؛ جد هو التركيز على جانب المانحين؛ ف هو معامل نفاذية؛ A هو السطح تخلل، والخامس حجم يقبلون. يتم اشتقاق هذه المعادلة من "أول قانون" فيك ولا يمكن تطبيقه إلا عندما جد » جأ6،22. - ملاحظة: التركيزات في الجهة المانحة يجب أن تكون أعلى بكثير من تركيز اكتشفت في يقبلون. تم التحقق من هذا الإعداد التجريبية.
3-المحاكاة
ملاحظة: تم المحاكاة مع COMSOL Multiphysics 5.1. ويفترض معرفة أساسية بهذا. لمحاكاة نشرها، تصنع الافتراضات التالية: (أ) أن معامل نشر المواد في ح2س أعلى بكثير بالمقارنة بالجل. للتعويض عن هذا الفارق، يستخدم المحاكاة قيمة 1 × 10-9 م2/ق وأعلى بمقدار 10 إلى 100 مقارنة بمعامل نشر نفل عن طريق 2% [اغروس] هلام. (ب) في هذه التجربة، المضمون ينشر عبر الحاجز وثم من خلال الغشاء للغشاء إدراج النظام. وعلى النقيض من الإعداد التجريبية، مصفوفة الظاهري [اغروس] هلام أو الخلية والغشاء تعتبر مرحلة واحدة متجانسة. (ج) يتم تعيين الآثار الحدود على الجدران "لا زلة"، جميع الآثار المتأخرة على الجدران (ليس بين السائل وجل أو سائل وخلية نموذج) نظام إدراج غشاء مهملة وليست هامة لعملية الانتشار.
- الإعداد لنشر المحاكاة
ملاحظة: هذه الخطوات تبين الإعداد لمحاكاة تجربة النفاذية. تم إعداد عمليات المحاكاة لأنظمة إدراج غشاء 96-12 جيدا وعلى حدة. يستخدم الوحدة النمطية "نقل الأنواع الكيميائية" معادلة استناداً إلى قانون فيك الثاني لنشرها:
ج هو تركيز المادة، تي أن الوقت قد حان، u هو السرعة، D هو معامل نشر، حيث R هي معدل رد الفعل. وقد كان مهملاً معدل رد الفعل نظراً لحدوث لا تفاعل كيميائي في عملية نشر.- افتح البرنامج وبدء تشغيل نموذج جديد. اختار "معالج نموذج"، حدد 3D النموذجي، إضافة "النقل لتمييع الأنواع" إلى واجهة الفيزياء في القائمة المنسدلة، انقر فوق "الدراسة" وحدد الدراسة "يتوقف الزمن"، وانقر فوق "تم".
- انتقل إلى "تعاريف عالمية" وإضافة "المعلمات" مع حق انقر. أدخل المعلمات الهندسية والفيزيائية في الشبكة (انظر الجدول 1و الجدول 2و الشكل 3e).
ملاحظة: كان يقترب سطح مقعر [اغروس] هلام في نظام إدراج غشاء 96-جيدا مع كرة غمر. - إعداد هندسة النظام إدراج غشاء من التجارب. في "الخطوة 3، 2"، يتم عرض مثال لكيفية بناء هندسة النظام إدراج غشاء 96-جيدا. يتم تعيين وحدة طولها متر.
ملاحظة: لا تبني الهندسة كله لحفظ وقت الحساب. بدلاً من ذلك، يمكن تقليل الهندسة باستخدام خطوط مركز ربع من الهندسة (انظر الشكل 3 ألف ، و الرقم 3). - إضافة اثنين من "المجال المسابر" في "التعريفات" (الحق انقر على "التعاريف" وحدد موقع "التحقيق") وحدد المسبار واحد كالمجال يقبلون والأخرى كالمجال المانح. اختر لكل نوع "متوسط" وتعبير "ج" مع وحدة "مول/م3".
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ويبين تركيز يقبلون والجهات المانحة خلال عملية المحاكاة. - تعيين معامل نشر (Dc) في "خصائص النقل 1" في "نقل أنواع المخفف" باسم "Dif_w".
ملاحظة: يتم استخدام "خصائص النقل 1" للمجال يقبلون والمانحين على حد سواء. في الخطوة التالية، سيتم الكتابة فوق المجال الحاجز. - إضافة انقر "خصائص نقل 2" مع حق ثانية على "المخفف لنوع النقل" وحدد الحاجز (2) في "تحديد المجال". تبعاً لهدف المحاكاة يمكن تعيين معامل نشر كقيمة للحاجز أو كمتغير دمية "د". لتشغيل اختبار أول، تعيين قيمة 2E-10 م2/ق.
ملاحظة: سوف يعلن لاحقاً في الخطوة 3، 3 "د". - في "النقل لتمييع الأنواع ل" تحديد القيم الأولية 1 "التركيز كصفر.
ملاحظة: يتم استخدام "القيم الأولية 1" للمجال الحاجز ويقبلون. في الخطوة التالية، سيتم الكتابة فوق المجال المانح. - إضافة ثانية "قيم أولية 2" مع حق انقر على "تضعف من أنواع النقل" وحدد الجهة المانحة (3) كالمجال. تعيين التركيز الأولى تركز على مضمون المانحين (مثلاً، C_fl من الجدول 2).
- إضافة "التناظر 1" مع حق انقر على "تضعف من أنواع النقل"، وإضافة واختيار جميع الأسطح "التحديد الحدود"، التي تعكس هندسة كاملة (على سبيل المثال الهندسة في الخطوة 3، 2، هو الحدود رقم 1، 2، 4، 5، 7، 8).
ملاحظة: يمكن إهمال هذه النقطة إذا كان إعداد هندسة كامل. - مع حق انقر على "شبكة" إضافة اثنين "الحرة هرمي ثلاثي". حدد الحاجز (2) كالمجال (تغيير مستوى الكيان هندسية إلى "الملك"). إضافة "حجم" مع حق انقر على "مجاني Tetrahedral 1" وشبكة المعرفة مسبقاً لإدراج "الدقيقة" للغشاء 12-جيدا نظام أو "غرامة إضافية" لغشاء 96-جيدا إدراج نظام.
- حدد في الثانية "مجانية هرمي ثلاثي" يقبلون والمانحين حسب المجال وشبكة المعرفة مسبقاً "عادي" لغشاء 12-جيدا إدراج نظام أو "الدقيقة" لغشاء 96-جيدا إدراج النظام (انظر الشكل 3 جيم و 3d الشكل).
ملاحظة: من الممكن أيضا اختيار شبكة خشونة لحفظ حساب الوقت. هذا قد تقلل من دقة النتائج. انقر فوق "إنشاء كافة" في "الإعداد" مش الهندسة مش. - بدء عملية المحاكاة مع "حساب" "دراسة 1".
- مثال الإعداد للهندسة
ملاحظة: هنا تعطي مثالاً لكيفية إعداد هندسة النظام إدراج غشاء 96-جيدا (مع الحاجز مقعرة). يتم تنفيذ كافة الخطوات في وحدة الهندسة في البرنامج. يتم تعيين وحدة طولها متر.- إنشاء اسطوانة 1 (انقر على الحق في "هندسة 1") مع دائرة نصف قطرها d_w/2 والارتفاع h_a + h_sp + h_b.
- إنشاء اسطوانة 2 مع دائرة نصف قطرها من d_tran/2، ارتفاع موقف h_sp h_b + h_a، و z.
- استخدم الخيار "الفرق" (انقر على الحق في "هندسة 1"، حدد موقع "القيم المنطقية، وقسم") طرح اسطوانة 2 من اسطوانة 1. تنشيط "كائن طرح" اختار "cyl1" في "كائنات لإضافة"، واختيار "cyl2". هندسة يقبلون وحدة التخزين الجديدة.
- إنشاء اسطوانة 3 مع دائرة نصف قطرها من d_a/2، وارتفاع h_b، وموقف z h_sp.
- توليد مجال 1 مع دائرة نصف قطرها r و z r_z الموقف.
- استخدام الخيار "الفرق" لطرح المجال 1 (sph1) من اسطوانة 3 (cyl3). وتسمى وحدة التخزين الجديدة 2 الفرق.
- إنشاء اسطوانة 4 مع دائرة نصف قطرها من d_a/2، وارتفاع h_b + h_a، وموقف ض h_sp.
- استخدام الخيار "الفرق" لطرح اسطوانة 4 (cyl4) من 2 الفرق. هندسة يقبلون وحدة التخزين الجديدة.
- كرر الخطوات 3.2.4-3.2.6 لبناء الجدار الفاصل ([اغروس] هلام أو خلية النموذج في التجربة).
- جعل اتحاد 1 من جميع عناصر الهندسة (الحق انقر على "هندسة 1"، حدد موقع "القيم المنطقية، وقسم").
- إنشاء كتلة 1 مع حواف كل مجموعة على طول d_tran * موقف 2، س d_tran و y d_tran * 2.
- إنشاء كتلة 2 بطول حافة كل من d_tran * 2، موقف العاشر-d_tran * 2 و y من-d_tran.
- استخدام الخيار "الفرق" لطرح الاتحاد 1 من بلوك 1 وبلوك 2.
- إضافة معلمة الأمثل للمحاكاة
ملاحظة: مع مساعدة التحسين المعلمة يمكن تركيبها معامل نشر البيانات التجريبية التي تم إنشاؤها مسبقاً. إظهار الإرشادات التالية كيفية دمج الجزء الأمثل في نشر المحاكاة. تأكد من عمل محاكاة نشرها قبل البدء في هذه الخطوات.- إضافة وحدة الفيزياء "الأمثل" باستخدام "إضافة عالج" (يمكن الأمثل في "الرياضيات" في فئة "التحسين وحساسية") للمحاكاة. انقر فوق "إضافة عنصر".
- إضافة "المتغيرات" مع الحق فوق تحت "التعاريف" (محلي في مكون) واكتب في المتغيرات من الجدول 3.
ملاحظة: التحسين المعلمة يستخدم الإعداد الحقيقية، أي، يجب أن يتم تعريف عامل 1-10 معامل نشر كل على حدة. - إضافة "متوسط 1" مع حق انقر على "التعاريف" في المقطع "اقتران العنصر" واكتب في اسم المشغل "يقبلون".
- إنشاء مستند نص منفصل يحتوي على البيانات التجريبية.
ملاحظة: فاصلة منقوطة تفصل أعمدة؛ فاصل يفصل بين الصفوف. إعلان الوقت يقاس بالثواني، وتركيز في مول/م3. إزالة الأول ونقطة البيانات الثاني في مرحلة انتقالية (انظر الشكل 2) تجارب لتجنب الأخطاء المناسب ممكن. هنا هو مثال على كيفية ظهور نص المستند مثل:
3540؛ 0.00216
7140؛ 0.00724
12240؛ 0.01707
15180؛ 0.02230
18660؛ 0.02697
21540؛ 0.02931
يمكن استخدام هذا المثال لاختبار المحاكاة. - إضافة "المربعات الصغرى الهدف العالمي" مع حق انقر على "الأمثل" وإرفاق مستند نصي من الخطوة 3.3.4 "البيانات التجريبية" وتعريف العمود الأول ك "الوقت العمود 1" مع حق انقر على "المربعات الصغرى الهدف العالمي"، والعمود الثاني ك "قيمة العمود 1" مع حق انقر على "المربعات الصغرى الهدف العالمي". اكتب في "التعبير" عن "قيمة العمود" متغير "ج".
- إضافة "عنصر تحكم المتغيرات العمومية 1" مع حق انقر على "الأمثل" وتعلن "D_search" كمتغير مع قيمة أولية "1"، والحد الأدنى "0" والحد الأعلى "1000".
- إضافة "الأمثل" مع حق انقر على "دراسة 1" واختيار "SNOPT" كأسلوب solver الأمثل. تعيين التسامح المثالية 1E-9.
ملاحظة: إذا كان لا تتلاقى المحاكاة، زيادة التسامح المثالية. ضع في اعتبارك أن المحاكاة ستكون غير دقيقة إذا كان التسامح المثالية كبير جداً. - تبدأ المعلمة الأمثل مع "حساب" في "الدراسة". لا تنسى أن تعيين معامل نشر على الجدار ك "د".
Representative Results
تجارب النفاذية في غشاء 96-جيدا إدراج النظام مع 2% [اغروس] هلام كحاجز أجريت بغية تقييم دقة المحاكاة. واستخدمت للتحقق من أثر حجم الجزيئي للمادة نشرها من 5 × 10-10 م يصل إلى 45 x 10-10 m ستوكس radius (376.27-40,000 mol wt) fluorescein ملح الصوديوم (نفل) و fluorescein isothiocyanate-ديكسترانيس (FD). واستخدمت التحسين المعلمة الأصلية المحاكاة لتناسب المحاكاة إلى البيانات التجريبية.
تحقيقا لهذه الغاية، قورنت المنحدرات فقط الأجزاء الخطية من نفاذية محاكاة لنتائج تجريبية. لأحجام الجزيئات الصغيرة، كانت البيانات التجريبية والمحاكاة في اتفاق جيد مع 99.2 في المائة لنفل و 80.2 في المائة فد 4,000 (انظر الشكل 4a و الشكل 4b). الحجم الجزيئي أكبر ولدت انحرافات أعلى عرض الارتباطات 50.5% "فد 10000" و 79.7 في المائة 20,000 فد 53.6 في المائة ل 40,000 فد. وأظهرت منحنى التدرج في عمليات المحاكاة تأخير في البداية وارتفاع أقوى في دورة أخرى من الرسوم البيانية (انظر الشكل 4 ج–4e).
ترد في معاملات النفاذية ومعاملات نشر المحاكاة الجدول 4- معامل تخلل يتناقص مع زيادة الحجم الجزيئي. الانحراف المعياري بين 0.08 × 10-8 م/ث و 0.47 × 10-8 م/ث (N = 7)، التي تقابل خطأ مطلقة من بين 4.18% 46.15%. وأظهرت التجارب مع جزيئات أكبر خطأ مطلق أكبر. معاملات نشر محاكاة تصرف مشابه جداً لمعاملات النفاذية التجريبية. المواد مع أكبر من إنصاف أقطار ستوكس أظهرت انخفاض انتشار معاملات والخطأ المطلق وتراوحت بين 9.09 في المائة و 18.46 في المائة (N = 3).
في تجارب تخلل إضافية، استخدمت أربعة أنواع نموذج الخلية الكولاجين مختلفة كحواجز في غشاء 12-جيدا إدراج النظام. وتشمل هذه النماذج نموذج الخلية الحرة ونموذج خلية مع مجموعات مختلفة من الخلايا الليفية الأولية في جل الكولاجين وهاكات على السطح. واستخدمت المجموعات التالية: الكولاجين (العقيد) كنموذج الخلية الحرة، الكولاجين + الليفية (العقيد + واو)، الكولاجين، والكولاجين + الليفية + هاكات (العقيد + H.), هاكات (العقيد + واو + ح.). ملح الصوديوم فلوريسسين مع دميم + 10 ٪ السفح كمضمون المانحين. واستخدمت تحليل نموذج الخلية الكولاجين، وتلطيخ والهيماتوكسيلين ويوزين (أنه) للصورة. هذا تلطيخ تم القيام به باستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. ويرد في الشكل 5، وصمة عار مع نموذج كولونيل + واو + H. ممثل. أنه قليلاً بقع بنية الأنسجة المصفوفة الكولاجين. الليفية الموجودة في المصفوفة، ونواة تنتجها الخلايا الليفية والخلايا هاكات ملطخة بالبنفسجي الداكن. أعلى مصفوفة الكولاجين، هناك طبقة تحتوي على العديد من النوى، التي ينبغي أن تكون نواة هاكاتس، بناء طبقة مضمنة على رأس النموذج.
وترد في الجدول 5، معاملات تخلل التجريبية ومعاملات نشر المحاكاة. يمكن رؤية اتجاها لمعظم النماذج مع هاكات، التي لها معاملات تخلل/نشر أقل بالمقارنة مع النماذج دون هاكات. الخطأ المطلق لمعاملات تخلل هو 10.9-24.4 في المائة، و لنشر معاملات 5.2%-12.9%.
رقم 1: منظر جانبي لتجربة نفاذية غشاء إدراج النظام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الرسم البياني المثالية لتجربة النفاذية. يتم رسم تركيز يقبلون مرور الوقت. خطوط متقطعة اثنين قوس الجزء الخطي ما يقرب من الرسم البياني. يتم استخدام منحدر الجزء الخطي لتحديد معامل النفاذية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: هندسة ومش الغشاء إدراج النظام في المحاكاة. () هندسة الغشاء 96-جيدا نظام إدراج. (ب) الهندسة الغشاء 12-جيدا إدراج النظام. (ج) شبكة الغشاء 96-جيدا إدراج النظام. (د) شبكة الغشاء 12-جيدا إدراج النظام. (ﻫ) المقطع العرضي والمعلمات للغشاء إدراج النظام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مقارنة البيانات التجريبية من تجربة تخلل إلى محاكاة الأمثل. ملح الصوديوم فلوريسسين ()، (ب) fluorescein isothiocyanate-ديكستران 4,000 mol الوزن والوزن مول (ج) 10,000، (د) 20,000 مول بالوزن والوزن mol (ﻫ) 40,000 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الممثل أنه تلطيخ نموذج الخلية الكولاجين (هاكات + الكولاجين + الليفية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: معامل النفاذية كوظيفة من وظائف دائرة نصف قطرها 1/ستوكس استخدام ملح الصوديوم fluorescein و fluorescein isothiocyanate-ديكستران في غشاء 96-جيدا إدراج النظام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الاسم | اكسبيريسيون للنظام جيدا 96 مم | اكسبيرشن للنظام 12-جيدا في مم | الوصف |
| d_tran | 5.65 [مم] | 14.7 [مم] | قطر البئر |
| d_a | 4.26 [مم] | 12.1 [مم] | قطر الغشاء |
| d_w | 8.79 [مم] | 21.97 [مم] | قطر يقبلون |
| h_b | 2 [مم] | 2 [مم] | العالية الجدار |
| h_sp | 1 [مم] | 1 [مم] | المسافة بين جيد والسفلي |
| h_a | 4.73 [م] | 5.24 [مم] | عالية من يقبلون |
| ب | h_b/2 | - | عمق الغمر |
| r | ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) | - | نصف قطر الكرة الغمر+ |
| r_z | r + h_b | - | ض-موقف الكرة الغمر+ |
الجدول 1: معلمات الهندسة لمحاكاة "نقل الأنواع الكيميائية"- + فقط ليتم استخدامها للمحاكاة [اغروس] هلام في غشاء جيدا 96 إدراج نظام.
| الاسم | التعبير | القيمة | الوصف |
| C_fl | 0.1 [mg/ml]/376.28 [غ/مول] | 0.26576 mol/م2 | تركيز Fl.So. |
| C_4 | 2 [مغ/مل]/4000 [غ/مول] | 0.5 mol/m2 | تركيز فد 4.000 |
| C_10 | 2 [مغ/مل]/[غ/مول] 10000 | 0.2 mol/m2 | تركيز فد 10.000 |
| C_20 | 2 [مغ/مل]/20000 [غ/مول] | 0.1 mol/m2 | تركيز فد 20.000 |
| C_40 | 2 [مغ/مل]/40000 [غ/مول] | 0.05 mol/m2 | تركيز فد 40.000 |
| Dif_w | 1e-9 [م ^ 2/s] | 1E-9 م2/ق | معامل نشر خلط المياه |
الجدول 2: البارامترات الفيزيائية لمحاكاة "نقل الأنواع الكيميائية".
| الاسم | التعبير | الوصف |
| ج | Acceptor(c) | تعريف التركز يقبلون |
| د | D_search * 1e-10 | تغيير عامل لمد |
الجدول 3: معلمات لمحاكاة "الأمثل".
| تتخلل | معامل النفاذية (m/s) × 10-8 | معامل نشر (m/s2) × 10-10 | شعاع ستوكس من بيرميتي (م) × 10-10 |
| Fl.So. | 4.79 ± 0.20 | 1.94 ± 0.34 | 5 |
| فد 4,000 | 2.37 ± 0.31 | 0.65 ± 0.12 | 14 |
| FD10، 000 | 1.67 ± 0.47 | 0.22 ± 0.02 | 23 |
| فد 20,000 | 0.65 ± 0.30 | 0.29 ± 0.04 | 33 |
| فد 40,000 | 0.27 ± 0.08 | 0.14 ± 0.02 | 45 |
الجدول 4: إدراج معامل النفاذية ونشر المواد مع شعاع ستوكس مختلفة خلال 2% [اغروس] هلام + غشاء في غشاء 96-جيدا للنظام- (ملح الصوديوم فلوريسسين = حتى سائلة، ديكستران فيتك = FD).
| نموذج | معامل النفاذية (m/s) × 10-8 | معامل نشر (m/s2) × 10-10 |
| العقيد | 2.18 ± 0.29 | 1.22 ± 0.06 |
| العقيد + F. | 1.77 ± 0.38 | 0.93 ± 0.12 |
| العقيد + H. | 1.64 ± 0.40 | 0.96 ± 0.05 |
| العقيد + واو + H. | 1.65 ± 0.18 | 0.88 ± 0.11 |
الجدول 5: معامل النفاذية ونشرها من ملح الصوديوم فلوريسسين من خلال نموذج خلية الكولاجين في 12-الغشاء جيدا إدراج نظام (العقيد = الكولاجين، واو = تنتجها الخلايا الليفية، حاء = هاكات).
Discussion
ويوثق هذه الدراسة أسلوب نمواً كمياً تخلل من خلال بنية أنسجة إجراء هندسة عكسية على غشاء. تخلل للمواد مع اختلاف الأحجام الجزيئية عن طريق [اغروس] هلام أول دراسة لاختبار والتحقق من صحة الأسلوب ومحاكاة المقابلة. فمن المعروف جيدا أن تتخلل جزيئات أصغر أسرع من خلال شبكة مصفوفة (باستثناء التأثير في هلام الترشيح اللوني النفاذية). وأبديت ملاحظات مماثلة مع تجارب الاستبعاد حجم المواد الصلبة26وغشاء البشرة البشرية27، وجلد الإنسان17والفئران الجلد28. علاقة عكسية بين معاملات النفاذية وشعاع ستوكس المقابلة (نصف قطر المجال الصعب الذي يتحرك بنفس معدل انتشار الجزيئات الموصوفة، وعادة ما تكون أقل من نصف القطر الفعال للجزيء) وقد تبين 26 , ولوحظ في تجارب بمواد مختلفة الأحجام الجزيئية 28، وعلاقة مماثلة. برسم معاملات النفاذية عبر دائرة نصف قطرها 1/ستوكس، تم العثور على ارتباط خطي على المجموعات الأربع مع أصغر حجم الجزيئي (ص2 = 0.93) (الشكل 6). وهذا يشير إلى أن معاملات النفاذية المحاكاة باستخدام الأسلوب المقترح في مجموعة واقعية.
الخطأ % 46.15 في هذه التجارب أكبر قليلاً من الإبلاغ عنها لتجارب النفاذية مع نظام الخلية نشر فرانز10. أحد التفسيرات المحتملة يمكن أن يكون توزيع حجم فلوريسسين-إيسوثيوسياناتي-ديكستران، التي يتم مناقشتها في وقت لاحق.
يحتوي الأسلوب على وصف الهامة مزايا مقارنة بأساليب استخدام نظام الخلية نشر فرانز. أولاً، أن الإعداد أكثر أحكاما؛ التجارب التي تنفذ مباشرة في نظام إدراج غشاء، التي لديها حجم لوحة جيدا التجارية (∼ 13 سم × 8.5 سم). وهذا يتيح عينات متعددة ليتم تشغيلها في وقت واحد، بينما هناك حاجة خلية نشر فرانز منفصلة لكل عينة. وثانيا، يمكن قياس نفاذية نموذج الجلد مباشرة في إدراج الغشاء، حيث تجري الزراعة. باستخدام خلايا نشر فرانز، العينات يجب أن يؤخذ بها والتي شنت على هذا النظام، الذي هو أكثر تعقيداً لعينات صغيرة، وهو أيضا أكثر استهلاكاً للوقت.
تخلل التجارب مع المصفوفات خلية الكولاجين أظهرت أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها بنجاح على أنظمة خلايا المصنف. تم التحقق من أن النموذج المعروض هنا لنماذج الجلد؛ ومع ذلك، يمكن تطبيق الأسلوب على أنواع أخرى من الثقافات الخلية العضوية، مثلاًأو الكلي أو الكبد.
في هذه الدراسة، تم استخدام نموذج خلايا الكولاجين التي تغطي الخلايا هاكات تماما سطح النموذج (انظر الشكل 5). وهذا أدى إلى انخفاض معامل النفاذية، مما يدل على أن الأسلوب حساسة بما يكفي التمييز بين معامل النفاذية بين نموذج خلايا الكولاجين مع أو بدون طبقة من هاكات. ومن الناحية المثالية، ينبغي بناء نموذج جلد حاجزاً، التي تقترب البشرة الجلد الحقيقي29، ولذلك من المهم للتحقق من النوعية (مثلاً، بناء من باطن الجلد، البشرة) من طراز الجلد قبل الاستخدام الفعلي. ويمكن تصور مع تلطيخ تقنيات تطوير نموذج الجلد وكمياً من الكشف عن الجلد البروتين والكولاجين30،،من3132. معامل النفاذية قد يكون أيضا عاملاً هاما لتقييم وضع النموذج الجلد، ولكن كذلك التجارب مطلوبة لتأكيد ذلك. كما ذكر سابقا، يتيح هذا الأسلوب تشغيل عينات متعددة في نفس الوقت. من الممكن أيضا أخذ عينات من خلال زراعة لقياس النفاذية ومراقبة وبالتالي تطوير هذه المعلمة من طراز الجلد.
تجدر الإشارة إلى أن النفاذية ويقاس من خلال جل/الكولاجين-خلية-نموذج وغشاء في نفس الوقت. معامل النفاذية تم الكشف عنها هو نظام محدد، موجبة لنماذج مختلفة من الجلد يمكن فقط مقارنة النتائج عند استخدام إدراج الغشاء نفسه. وعلاوة على ذلك، يحتاج النموذج الجلد لتغطية منطقة زراعة كاملة لضمان أن سوف تتخلل مضمون الاختبار إلا من خلال النموذج ولا المتاخمة لها، مما من شأنه أن يحفز أخطاء في قياس النفاذية. الجانب الآخر الذي ينبغي النظر في المستقبل في التجارب هو البيئة الطبيعية المحيطة بالجلد. عادة، درجة حرارة سطح الجلد أقل بالمقارنة مع منطقة الداخلية، التي يمكن أن تؤثر الظروف تخلل.
وقدم من أجل التوفيق بين مختبر تجارب المحاكاة الحاسوبية، أسلوب الذي يتيح للمعلمة الأمثل لمحاكاة التطبيقية. وتبين المحاكاة وتتفق تماما مع البيانات التجريبية للمواد مع أحجام الجزيئات الصغيرة. ومع ذلك، لوحظت الانحرافات بين المحاكاة والبيانات التجريبية للمواد مع أحجام جزيئية أكبر. جزيئات السكاريد كبير يمكن زيادة الاحتكاك وتبطئ عملية الانتشار في جل. هذا التأثير يسبب انتشار غير طبيعي، هو سبب المحتمل لهذا الانحراف بين التجريبية ومحاكاة القيم33،34. وهناك تفسير آخر قد يكون وجود جسيمات أصغر أو أكبر في فلوريسسين-إيسوثيوسياناتي-ديكستران. تحدد الشركة المصنعة الوزن الجزيئي للمادة كحجم متوسط مع طائفة معينة، مما يسمح للجزيئات الأصغر والأكبر ليكون حاضرا. غير الواضح أيضا كيف فرقت هذه المواد، كجزيئات صغيرة تتخلل أسرع عن طريق الجل وقناة السائل. فمن الممكن تمديد المحاكاة للنظر في نشر هذه وآثار الاحتكاك.
ووضعت تجربة النفاذية ومحاكاة للاستخدام في 2-قائد. مع مساعدة المحاكاة، يمكن نقل هذا الأسلوب التجريبي مباشرة إلى الأجهزة التجريبية أكثر تطورا. على سبيل المثال، يمكن بسهولة نقل الغشاء إدراج نظام المحاكاة لهندسة 2--قائد أو الأنظمة الأخرى مع مجموعة عمليات مماثلة. يمكن استخدام هذا الخيار لتحوير المحاكاة لدعم تصميم التجارب المقبلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون متكاملة آثار جانبية مثل التبخر ونشرها غير طبيعية، وآثار غشاء لتعزيز عملية المحاكاة، وبالتالي تحسين الدقة. برنامج محاكاة يعطي فرصة لتغيير أو تعزيز المعادلة المحاكاة، كذلك فيما يتعلق بدمج الوحدات النمطية الأخرى المادية من أجل التحقيق في الجوانب الأخرى من الجلد نموذج التنمية. مثال واحد هو محاكاة للإنتاج الاستهلاك ولاكتات الجلوكوز في نموذج خلية الكولاجين.
أحد جوانب المثيرة لاهتمام لا سيما في اختبار المواد الطبية كيفية توزيع هذه المواد في نظام الجهاز على رقاقة. المعلمة النفاذية ومحاكاة مساعدتي للإجابة على أسئلة مثل كيف سريعة تتخلل مادة في النظام فضلا عن تركيز التي ستكون متاحة للأنسجة الأخرى في متعدد organ رقاقة. هذا الأسلوب يمكن دعم وتعزيز تطوير واختبار نظم الجهاز على شريحة من هذا القبيل.
Disclosures
أوفه ماركس هو الرئيس التنفيذي وحملة أسهم وليندنر غيرد مساهم تسوس GmbH، وهي شركة تصنيع وتسويق التكنولوجيا وزارة الثقافة. ويعلن الكتاب الآخرين لا تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذا الكتاب.
Acknowledgments
تم إنشاء هذا العمل بدعم مالي من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) في إطار المنحة لا PO413/12-1 و "لوس أنجليس" 1028/7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Carl Roth | K297.2 | High Resolution Powder |
| Collagen | Serva | 47256.01 | Collagen R solution 0.4 % |
| DMEM | Lonza (Biozym Scientific GmbH) | 880010-12 | High Glucose with L-Glutamine |
| FCS | Biochrom GmbH | S0615 0114F | Fetal Calf Serum |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | 46960-25G-F | |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 46944-500MG | 4000 g/mol |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD10S-250MG | 10 000 g/mol |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD20S-250MG | 20 000 g/mol |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD40S-250MG | 40 000 g/mol |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170120 | no calcium, no magnesium , with phenol red |
| NaOH | Merck | 1.06467.9010 | granulated |
| PBS | Gibco | 18912-014 | tablets |
| Transwell Cell Culture Inserts | Corning | 3391 | 96 well, 0.4 µm pore size |
| Transwell Cell Culture Inserts | Corning (VWR) | 734-1563 | 12 well, 0.4 µm pore size |
| Trypsin | Biochrom GmbH | L2143 | with EDTA |
References
- Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
- Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
- Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
- Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
- Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
- Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
- Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
- Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
- Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
- Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
- Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
- Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
- Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
- Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
- Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
- Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
- Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
- Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
- Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
- Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
- Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
- Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
- Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
- Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
- Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
- Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
- Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
- Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
- Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
- Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
- Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).
