Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En metode til bestemmelse og simulering af permeabilitet og Diffusion i en 3D væv Model i en membran indsætte System for multi godt plader

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56412

Summary

En metode til bestemmelse af permeabilitet i en membran indsætte system for multi godt plader og i siliciummangan parameter optimering til beregning af diffusion koefficienter ved hjælp af simulation er præsenteret.

Abstract

In vitro dyrkede hud modeller er blevet mere og mere relevante for farmaceutiske og kosmetiske programmer, og bruges også i udvikling af lægemidler samt stof test. Disse modeller er for det meste dyrket i membran-Indsæt systemer, deres permeabilitet mod forskellige stoffer, som en væsentlig faktor. Typisk kræver anvendte metoder for bestemmelse af disse parametre, der normalt store stikprøvestørrelser (fx, Franz diffusion celle) eller besværlige udstyr (f.eks., fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP)). Denne undersøgelse præsenterer en metode til bestemmelse af permeabilitet koefficienter direkte i membran-Indsæt systemer med diameter størrelser af 4.26 og 12,2 mm (dyrkningsareal). Metoden blev valideret Agarosen og kollagen geler samt en kollagen celle model repræsenterer hud modeller. Permeation processer af stoffer med forskellige molekylære størrelser og gennemtrængning gennem forskellige cell modeller (bestående af kollagen gel, fibroblast og HaCaT) var præcist beskrevet.

Desuden, for at understøtte ovenstående Eksperimentel metode, en simulation blev etableret. Simuleringen passer forsøgsdata godt for stoffer med små molekylære størrelse, op til 14 x 10-10 m Stokes radius (4.000 MW), og er derfor et lovende redskab til at beskrive systemet. Derudover simuleringen kan betydeligt reducere eksperimentel indsats og er robuste nok til at blive udvidet eller tilpasses mere komplekse opsætninger.

Introduction

Organo-typisk 3D kulturer er blevet kraftfulde værktøjer til udvikling af lægemidler og stof test1. I denne henseende er menneskelige hud modeller af særlig interesse på grund af lovkrav, som dem i kosmetikindustrien. De har efterfølgende ført til udviklingen af mange 3D hud modeller til brug enten på deres egen som single-orgel kulturer i multi godt plader eller multi-organ-chips i kombination med yderligere orgel modeller, f.eks., at leveren2.

Med hensyn til dyrkning af en hud ækvivalent er air-liquid interface (ALI) et væsentligt element for ordentlig epidermal differentiering3. Celle kultur skær består af en beholder med en væske-permeabel membran i bunden er typisk bruges til at etablere en ALI. ALIs udnyttes bredt i kommercielt tilgængelige hud modeller som EpiDerm4, Phenion5og Episkin6, for kulturen i huden modeller med størrelser fra 96-brønd (4.26 mm i diameter) op til 12-godt (12,2 mm i diameter) plader. Metoden beskrevet her bestemmer gennemtrængning af stoffer i en membran Indsæt system.

Permeabilitetskoefficienten er en betydelig parameter for evaluering af kvaliteten af enhver kulturperler hud-model i forhold til native hud5, og bruges til at vurdere hvordan hurtigt aktivstoffer vandrer gennem huden. Især hvis medicin eller kosmetik produkter skal anvendes på huden, er denne parameter vigtigt at forstå, når netop de overfladeaktive stoffer passerer igennem den. En simulering kan yderligere bidrage til at forudsige opførsel af systemet og efterfølgende reducere den nødvendige tidskrævende eksperimentel indsats, især når en lang række stoffer, der er involveret.

Franz diffusion celle er state-of-the-art for gennemtrængning eksperimenter med hud og hud modeller5,6,7,8,9. Denne enhed består af to rum med en fast prøve (diffusionsspærre) i mellem. Stoffet skal testes anvendes direkte til toppen af prøven (donor rum) og koncentrationen af den gennemsyrer sammensatte kan blive opdaget på den modsatte (acceptor) rum. Acceptor side sikrer konstant temperatur og koncentration af homogene stof gennem en temperatur kammer og en magnetomrører. Prøverne tages fra en prøveudtagning arm i acceptoren side af cellen Franz. Med en højde interval mellem 19 cm og 179 cm er dette system relativt store10,11. En anden metode til bestemmelse af diffusion koefficienter i gel-lignende stoffer og væv er FRAP. Denne teknik bruger princippet om blegning fluorescently mærket partikler i gelen og derefter fastlægge restitutionstid af det blegede område til at beregne diffusion koefficient12,13,14.

Derudover kan Fourier-transformation-infrarød (FTIR) spektroskopi bruges til at registrere partikel bevægelse med infrarødt lys absorbans for at bestemme, hvilken gennemtrængning proces af stoffer i huden15,16. Men disse eller andre Billeddannende metoder (fx, to-foton fluorescens korrelations-spektroskopi17) behøver koste intensiv instrumenter.

I denne artikel præsenteres en metode direkte foranstaltning permeabilitet af en barriere i en membran Indsæt system, hvor huden model kan være dyrket. Denne metode gør det muligt for permeabilitet eksperimenter skal køres med et stort antal små prøver (godt størrelse op til 4.26 mm) i et kompakt system. Dette er i modsætning til Franz diffusion celle, hvor en separat enhed er nødvendig for hver sonde, som skal monteres på enheden og er vanskelige at realisere for små prøver (størrelse af 4.26 mm). Desuden, da metoden ikke kræver store instrumentation (fx, en Konfokal eller multiphoton mikroskop), en reduktion i både tid og omkostninger er opnået.

Alle eksperimenterne blev udført i Mikroporøs membran indsætte systemer med en prøve (barriere) bestående af agarosegel eller en kollagen celle model etableret på membranen. Fluorescerende stoffer (donor) med varierende molekylære størrelser blev anvendt på toppen af prøven, og koncentrationen af gennemsyrede stof blev opdaget i bunden (acceptor) ved hjælp af et fluorescens-Pladelæser (Se figur 1). For at validere metoden og teste rigtigheden af denne simulering, blev agarosegelitris produceret og brugt som en barriere. Hydrogels er generelt bruges til undersøgelse af diffusion og gennemsivning processer i porøst medium i biologiske videnskaber13. Metoden blev derefter testet i en celle-seedede system bestående af en kollagen matrix af primære fibroblaster og menneskelige voksen lavt Calcium høj temperatur keratinocytter (HaCaT) celler (celle-matrix model), som er en forenklet hud model18,19 .

Derudover blev gennemtrængning proces simuleret med flow simuleringer med computational fluid dynamics. Det blev konstateret, at ved hjælp af parameteren optimering, diffusion koefficient kan beregnes ud fra eksperimentelle data. Generelt tilbyder denne simulation forskellige applikationer; for eksempel, det er muligt at forudsige en gennemtrængning proces baseret på korte eksperimenter og simulering kan reducere antallet af eksperimenter.

Eksperimentelle metode og simulering var designet til anvendelse på et orgel-on-a-chip system1,20,21, specielt 2-orgel-chippen (2-OC) udviklet kommercielt1,22, 23,24,25. I princippet kan gennemtrængning processen med nogen orgel model baseret på membran Indsæt systemer beskrives på denne måde.

Protocol

1. forberede permeabilitet undersøgelser til prøven

Bemærk: For at kontrollere gennemtrængning målinger og simuleringer, en stikprøve af agarosegel eller en celle matrix model baseret på dyrkning af huden model blev brugt.

  1. Agarosegel
    1. 0,2 g Agarosen høj opløsning pulver i 10 mL H2O (dobbeltdestilleret vand) opløses.
    2. Bland løsningen og varme den op til 80 ° C. Holde temperaturen for 8 min.
    3. Anvende 28,6 µL agarosegel på membranen af 96-brønd membran Indsæt system (4.26 mm i diameter) eller brug 226 µL for de 12 godt membran indsætte system (12 mm i diameter) (fx, Transwell system).
    4. Vente 10 min indtil gelen er størknet.
  2. Kollagen gel
    Bemærk: Alle trin er udført under sterile forhold og løsningerne, der holdes på is til at bremse polymerisering af kollagen gel.
    1. Mix 125 µL af Hanks' Balanced Salt løsning (HBSS) med 1 mL 0,4% kollagen R løsning (rotte hale kollagen).
    2. Titreres løsning med 1 M NaOH (natriumhydroxid) (~ 6 µL) indtil farven af phenol rød ændringer fra gul til rød.
    3. Tilsæt 125 µL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) + 10% føtalt kalveserum (FCS) til kollagen gel og blandes omhyggeligt med en pipette spids.
    4. Anvende 28,6 µL af kollagen gel til membranen af 96-brønd membran Indsæt system eller 226 µL til 12-godt membran Indsæt system.
    5. Forlade gel i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min.
  3. Kollagen celle model med fibroblast
    Bemærk: Alle trin udføres under sterile forhold.
    1. Forberede primære fibroblaster 5-7 dage før forsøget. Dyrke fibroblaster med DMEM + 10% FCS i celle kultur kolber (75 cm2) og ændre mediet hver 2-3 dage.
      Bemærk: Afhængigt af opsætningen af eksperimenterende, et større antal celler kan bruges.
    2. Fjern mediet fra celle kultur kolbe (80% sammenflydende) og vaskes to gange med 10 mL (kultur kolbe 75 cm2) af fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Tilføj 3 mL 0,05% Trypsin / ethylendiamintetra syre (EDTA) og Inkuber i 3 minutter ved 37 ° C.
    3. Tryk forsigtigt på kultur kolben Adskil celler fra overfladen. Reaktionen standses ved tilsætning af 3 mL af DMEM + 10% FCS. Opløsningen overføres til et centrifugeglas.
    4. Centrifugeres cellesuspension ved 120 x g og Fjern supernatanten resuspend celler med 0,5 mL af DMEM + 10% FCS.
    5. Tælle cellerne og tilpasse sig til en koncentration på 0,5 x 106 celler/mL.
      Bemærk: Følgende trin udføres på isen for at bremse polymerisering af kollagen gel.
    6. Mix 125 µL af HBSS med 1 mL 0,4% kollagen R løsning.
    7. Titreres løsning med 1 M NaOH (~ 6 µL) indtil phenol rød farve ændres fra gul til rød.
    8. Tilsæt 125 µL af cellesuspension (DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 celler/mL) i kollagen gel og bland forsigtigt med en pipette.
    9. Anvende 28,6 µL af kollagen gel på membranen af 96-brønd membran Indsæt system eller 226 µL til 12-godt membran Indsæt system.
    10. Forlade gel i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min.
    11. Anvende 75 µL af DMEM + 10% FCS på gel overflade og 300 µL til modtageren pladen af 96-brønd membran Indsæt system. For 12-godt membran indsætte system, bruge et volumen på 590 µL til den overflade og 1,846 µL til modtager plade.
    12. Fjern mediet fra overfladen af cellen matrix model (Airliftpumpen) og Inkuber celle matrix model yderligere i 7 dage. Bruge 100 μl medium på bunden og ændre mediet hver dag.
  4. Kollagen celle model med HaCaT
    Bemærk: Alle trin udføres under sterile forhold.
    1. Forberede HaCaT 5-7 dage før følgende trin. Dyrke HaCaT med DMEM + 5% FCS i en celle kultur kolbe (75 mm2) og ændre mediet hver 2-3 dage.
      Bemærk: Afhængigt af opsætningen af eksperimenterende, et større antal celler kan bruges.
    2. Fjern mediet fra kolben og vaskes to gange med 10 mL (kultur kolbe 75 cm2) i PBS. Tilføj 3 mL 0,05% Trypsin/EDTA og inkuberes i 10 min. ved 37 ° C. Stop reaktion med 3 mL af DMEM + 10% FCS. Opløsningen overføres til et centrifugeglas.
    3. Centrifugeres cellesuspension ved 120 x g, Fjern supernatanten og resuspend celler med 0,5 mL af DMEM + 10% FCS.
    4. Tælle cellerne og tilpasse sig til en koncentration på 0,5 x 106 celler/mL.
      Bemærk: Følgende trin udføres på isen for at bremse polymerisering af kollagen gel.
    5. Mix 125 µL af HBSS med 1 mL 0,4% kollagen R løsning.
    6. Titreres løsning med 1 M NaOH (~ 6 µL) indtil phenol rød farve ændres fra gul til rød.
    7. Tilsæt 125 µL af DMEM + 10% FCS til kollagen gel og bland det forsigtigt med en pipette.
    8. Anvende 28,6 µL af cellesuspension på membranen af 96-brønd membran Indsæt system eller 226 µL til 12-godt membran Indsæt system.
    9. Forlade gel i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min.
    10. Anvende 75 µL af cellesuspension til gel overfladen og tilføje 300 µL af DMEM + 10% FCS til modtageren pladen af 96-brønd membran Indsæt system. For 12-godt membran indsætte system, bruge et volumen på 590 µL cellesuspension til den overflade og 1,846 µL af DMEM + 10% FCS for modtageren plade.
    11. Inkuber celle matrix model i 3 dage; udveksle medium efter 2 dage.
    12. Fjern mediet fra overfladen af cellen matrix model og inkuberes celle matrix model for yderligere 7 dag. Bruge 100 µl medium på bunden og ændre mediet hver dag.
  5. Kollagen celle model med fibroblaster og HaCaT
    Bemærk: Alle trin udføres under sterile forhold på isen for at bremse polymerisering af kollagen gel. Forberede fibroblaster, som beskrevet i trin 1.3 indtil trin 1.3.5, og forberede en dag senere HaCaT som beskrevet i trin 1.4 indtil trin 1.4.4.
    1. Mix 125 µL af HBSS i 1 mL 0,4% kollagen R løsning.
    2. Neutralisere løsning med 1 M NaOH (~ 6 µL) indtil phenol rød farve ændres fra gult til en rød violet.
    3. Tilsæt 125 µL af primære fibroblast cellesuspension bestående af DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 celler/mL til kollagen gel og blandes omhyggeligt.
    4. Anvende 28,6 µL af cellesuspension til membranen af 96-brønd membran Indsæt system eller 226 µL til 12-godt membran Indsæt system.
    5. Forlade gel i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min.
    6. Dernæst gælde 75 µL af DMEM + 10% FCS på gel overflade og 300 µL til modtager plade af 96-brønd membran Indsæt system. For 12-godt membran indsætte system, et volumen på 590 µL bruges til den overflade og 1,846 µL til modtager plade.
    7. Inkuber i 1 dag på 37 ° C og 5% CO2.
    8. Fjern mediet fra overfladen og tilsæt en HaCaT cellesuspension med 0,5 x 106 celler/mL. Volumen er den samme som beskrevet før under trin 1.5.6.
    9. Inkuber celle matrix model i 3 dage; udveksle medium efter 2 dage.
    10. Fjern mediet fra overfladen af cellen matrix model og inkuberes celle matrix model for yderligere 7 dag. Bruge 100 µl medium på bunden og ændre mediet hver dag.
      Bemærk: For denne undersøgelse, 3 gel/celle-model prøver blev forberedt til 12-godt membran Indsæt system. 96-brønd membran indsætte system, vi brugte 6 prøver for gel/celle model. Statistiske midler er 3 prøver fælles. Men for eksperimenter i 96-brønd membran Indsæt system med kollagen matrix model vi forventet fejl og afvigelser for cellekultur. Derfor valgte vi et større antal prøver.

2. permeabilitet undersøgelser i membranen indsætte System

  1. Donor stof
    Bemærk: To fluorescein natrium salte (NaFl) er produceret.
    1. Opløs NaFl i H2O ved en koncentration på 0,1 mg/mL og 0,01 mg/mL. De forskellige fluorescein isothiocyanat-næringsvæske (FD) med en molekylevægt på 4.000, 10.000, 20.000 og 40.000 g/mol er opløst i H2O ved en koncentration på 2 mg/mL. Bruge disse løsninger som donor stof for permeabilitet eksperimenter (Se figur 1) med agarosegel.
    2. Opsætning med kollagen celle model, forberede alle løsninger med DMEM + 10% FCS i stedet for vand.
      Bemærk: Forberede stamopløsninger (10 x højere koncentration) af stoffet, donor. Små variationer af donor koncentration kan påvirke resultaterne af permeabilitet eksperiment.
  2. Eksperimentel metode
    Bemærk: Permeabilitet eksperiment udføres ved 37 ° C og en luftfugtighed på > 90%. Denne parameter sikrer levedygtigheden af cellerne. Temperatur påvirker diffusion processen så de samme parametre bruges til eksperimenter med agarosegel, kollagen gel og kollagen celle model. Enhedsoplysninger i beslaget refererer til 12-godt membran Indsæt system.
    1. Forberede en 96 - (eller 12-) godt membran Indsæt system med en barriere bestående af Agarosen gel (se protokollen 1.1) eller celle model (se protokollen 1,2-1,5) og fluorescens donor stof.
    2. Tilberedes fortyndinger på 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 160 og 1:320 af donor stof til oprettelse af en standardkurve. Tilsæt 300 µL (1,846 µL) af hver fortynding i tre wells af modtageren plade. Indsæt systembrug en separat modtager plade for 12-godt membran. De serielle fortyndinger bruges til at konvertere den målte fluorescens [RFU] til den tilsvarende koncentration [mg/mL].
    3. Tilføje 75 µL (590 µL) af donor stof på toppen af prøven (Agarosen gel eller celle model) og 300 µL (1,846 µL) af acceptoren stof (H2O eller DMEM + 10% FCS) i modtager plade (Se figur 1).
      Bemærk: Sikre, at overfladen af flydende i membranen indsætte system og i modtager plade har samme niveau for at undgå hydrostatisk tryk.
    4. Overføre hele systemet på en shaker i rugemaskinen. Justere ryste for at opnå en homogen blanding (samlede slagtilfælde kredsløb er 1,5 mm, hastighed er justeret på niveau 3,5, som er relateret til en rotation af ~ 480 1/min.) at undgå en koncentration gradient, som påvirker diffusion proces.
    5. Bestemme fluorescens regelmæssigt hver time. Til at måle fluorescens, overføre membran Indsæt system til en tom plade og måle fluorescens inden for modtageren ved hjælp af en Pladelæser. Bruge en excitation boelgelaengden 485 nm og emission af 535 nm for fluorescein.
    6. Eksperiment for 5 h.
      Bemærk: Under forsøgene fordamper væsken fra hele systemet. Fordampningen ændrer koncentrationen i donor og acceptor og påvirker resultaterne. Denne effekt er forsømt i forbindelse med en køretid på 5 h, men til længere kører gange det bør overvejes.
  3. Beregning af permeabilitetskoefficienten
    1. At etablere standardkurven, plot fluorescens af de serielle fortyndinger versus koncentration og udføre en lineær regression over dataene.
    2. Bruge hældningen af den lineære regression til at konvertere fluorescens data for forsøget, gennemsivning til koncentration. Med henblik på simulering, konvertere enheder i mol/m3.
    3. Plot af koncentrationen som funktion over tid og etablere den lineære segment af data (Se figur 2).
    4. Bestemme hældningen af denne lineære del og beregne permeabilitetskoefficienten efter følgende ligning (se eksemplet i figur 2):
      Equation 1
      hvor dcA/ dt er ændringen af koncentrationen af dette stof i acceptoren side over tid (hældning); CD er koncentrationen i donor side; P er permeabilitetskoefficienten; A er gennemsivning overflade, og VA er mængden af acceptoren. Denne ligning er afledt af ficks første lov og kan kun anvendes når CD » CA6,22.
    5. Bemærk: Koncentrationer i donor skal være meget højere end koncentrationen opdaget i acceptoren. Dette blev bekræftet i opsætningen af eksperimenterende.

3. simulering

NOTE: Simuleringen blev gjort med COMSOL Multiphysics 5.1. Et grundlæggende kendskab til dette antages. For diffusion simulation, følgende antagelser er lavet: a diffusion koefficient af stoffer i H2O er meget højere i forhold til det i gelen. For at kompensere for denne forskel, bruger simulationen en værdi på 1 x 10-9 m2s, hvilket er højere med en faktor på 10 til 100 i forhold til diffusion koefficient på NaFl gennem 2%-agarosegel. (b) i eksperimentet, stoffet diffunderer gennem barrieren og indsæt derefter system gennem membranen af membranen. I modsætning til opsætningen af eksperimenterende, virtuelle Agarosen gel eller celle matrix og membran er anses for at være en homogen fase. c grænse effekter på væggene er sat til "ingen slip", alle glide effekten på vægge (ikke mellem væske og gel eller væske og celle model) af membran Indsæt system er forsømt og ikke er væsentlige for udbredelsen processen.

  1. Opsætning af diffusion simulering
    Bemærk: Disse trin demonstrere opsætningen af simulering af permeabilitet eksperiment. Simuleringer for 96 - og 12-godt membran Indsæt systemer blev oprettet separat. Modulet "Kemiske arter Transport" bruger en ligning baseret på ficks anden lov om diffusion:
    Equation 9
    hvor c er koncentrationen af stoffet, t er tid, u er hastigheden, D er koefficienten, diffusion og R er reaktionshastigheden. Reaktionshastigheden blev forsømt, fordi ingen kemisk reaktion, der opstod i forbindelse med diffusion.
    1. Åbn programmet og starte en ny model. Valgte "Model-guiden", vælg 3D model, tilføje "Transport af fortyndet arter" til fysik grænseflade i pull-down menuen, klik på "Undersøgelse", Vælg "Tid afhængige" undersøgelsen, og klik på "Gjort".
    2. Gå til "Global definitioner" og tilføje "Parametre" med Højreklik. Angiv de geometriske og fysiske parametre i gitteret (Se tabel 1, tabel 2og figur 3).
      Bemærk: Den konkave overflade af agarosegel i en 96-brønd membran Indsæt system var tilnærmes med en fordybelse bold.
    3. Oprette geometri af membran Indsæt system fra forsøgene. I trin 3.2, er der vist et eksempel på, hvordan at opbygge geometrien af 96-brønd membran Indsæt system. Enhed af længde er indstillet til måleren.
      Bemærk: Må ikke bygge den hele geometri for at spare beregningen tid. I stedet, geometri kan reduceres ved hjælp af center linjer af en fjerdedel af geometri (Se figur 3a og figur 3b).
    4. Tilføje to "domæne sonder" i "Definitioner" (højre klik på "Definitioner" og find "Sonde"), og vælg en sonde som domænet acceptor og den anden som donor domæne. Vælg for både-type "Gennemsnitlige" og udtrykket "c" med enhed "mol/m3".
      Bemærk: Dette trin er valgfrit og viser koncentrationen af acceptor og donor under simuleringen.
    5. Indstille diffusion koefficient (Dc) i "Transport egenskaber 1" i "Transport af udvandet arter"som "Dif_w".
      Bemærk: "Transport egenskaber 1" bruges til både acceptor og donor domæne. I det næste trin, vil blive overskrevet domænet barriere.
    6. Tilføje et andet "Transport egenskaber 2" med højre klik på "Transport af fortyndet arter" og vælg barriere (2) i "Domæne Selection". Målsætning af simuleringen kan diffusion koefficient angives som en værdi af barriere eller en dummy-variabel "D". Den første prøvekørsel, en ØNSKEVÆRDI af 2E-10 m2/s.
      Bemærk: "D" vil blive erklæret senere i trin 3.3.
    7. I "Transport af fortyndet arter" for "indledende værdier 1" definere koncentrationen som nul.
      Bemærk: "Indledende værdier 1" bruges til barriere og acceptor domæne. I det næste trin, vil blive overskrevet domænet donor.
    8. Tilføje et andet "Indledende værdier 2" med højre klik på "Transport af fortyndet arter" og vælg donor (3) som domæne. Angiv koncentrationen som den oprindelige koncentration af donor stof (f.eks.C_fl fra tabel 2).
    9. Tilføje "Symmetri 1" med højre klik på "Transport af fortyndet arter", tilføje og vælge alle overflader af "Grænsen udvalg," som spejl hele geometri (f.eks geometri i trin 3.2 det er grænsen nummer 1, 2, 4, 5, 7, 8).
      Bemærk: Dette punkt kan blive forsømt, hvis hele geometri blev oprettet.
    10. Med et Højreklik på "Mesh" tilføje to "gratis tetrahedrale". Vælg barrieren (2) som domæne (ændring af geometriske enhedsniveau i "Domæne"). Tilføje "Størrelse" med højre klik på "gratis Tetrahedral 1" og for de foruddefinerede mesh "Finere" for 12-godt membran Indsæt system eller "ekstra fin" for en 96-brønd membran Indsæt system.
    11. I den anden "gratis tetrahedrale" Vælg acceptor og donor som domæne og de foruddefinerede mesh "Normal" for en 12-godt membran indsætte system eller "Finere" for en 96-brønd membran indsætte system (Se figur 3 c og figur 3d).
      Bemærk: Det er også muligt at vælge en grovere maskestørrelser gemme beregningen tid. Dette kan reducere nøjagtigheden af resultaterne. Klik på "Bygge alle" i "Mesh indstilling" mesh geometri.
    12. Starte simulering med "Beregn" den "Studie 1".
  2. Eksempel setup for en geometri
    Bemærk: Her et eksempel er givet af opsætning af geometrien af 96-brønd membran Indsæt system (med konkave barriere). Alle trin er udført i modulet geometri af programmet. Enhed af længde er indstillet til måleren.
    1. Generere en cylinder 1 (højre klik på "Geometri 1") med radius af d_w/2 og højden af h_sp + h_b + Bjarke.
    2. Generere en cylinder 2 med radius af d_tran/2, højden af h_b + Bjarke og z position af h_sp.
    3. Bruge indstillingen "Forskel" (Højreklik på "geometri 1", lokalisere "Booleske værdier og Partition") til at subtrahere cylinder 2 fra cylinder 1. De valgte "cyl1" i "Objekter til at tilføje", aktivere "Objekt vil fratrække" og vælger "cyl2". Den nye volumen er geometri af acceptoren.
    4. Generere en cylinder 3 med radius af d_a/2, højden af h_b og z position af h_sp.
    5. Generere en kugle 1 med radius r og z stilling r_z.
    6. Brug indstillingen "Forskel" til at trække kugle 1 (sph1) fra cylinder 3 (cyl3). Den nye volumen kaldes forskellen 2.
    7. Generere en cylinder 4 med radius af d_a/2, højden af h_b + Bjarke, og Placer z af h_sp.
    8. Brug indstillingen "Forskel" til at trække cylinder 4 (cyl4) fra forskellen 2. Den nye volumen er geometri af acceptoren.
    9. Gentag trin 3.2.4-3.2.6 til at bygge barrieren (Agarosen gel eller celle model i eksperimentet).
    10. Gøre en union 1 af alle geometri elementer (højre klik på "Geometri 1", lokalisere "Booleske værdier og Partition").
    11. Generere en blok 1 med alle kanter indstillet til en længde af d_tran * 2, position x af - d_tran og y af d_tran * 2.
    12. Generere en blok 2 med alle kant længde af d_tran * 2, position x af - d_tran * 2 og y af - d_tran.
    13. Brug indstillingen "Forskel" at trække EU 1 fra blok 1 og blok 2.
  3. Føjer Parameter optimeringen til simuleringen
    Bemærk: Ved hjælp af parameteren optimering diffusion koefficient kan monteres på det tidligere genererede forsøgsdata. Følgende instruktioner viser, hvordan optimering del integreres diffusion simulering. Sørg for diffusion simulering er i orden før du starter disse trin.
    1. Tilføje fysik-modul "Optimering" ved hjælp af "Tilføj Physic" (optimering kan findes i "Matematik" i kategorien "Optimering og følsomhed") til simuleringen. Klik på "Tilføj til komponent".
    2. Tilføje "Variabler" med Højreklik under "Definitioner" (lokal i komponent) og skrive i variabler fra tabel 3.
      Bemærk: Parameteren optimering bruger reelle tal, dvs., faktor 1-10 af diffusion koefficient skal defineres separat.
    3. Tilføje en "gennemsnitlig 1" med højre klik på "Definitioner" i afsnittet "Komponent kobling" og type i navnet operatør "Acceptor".
    4. Generer en separat tekstdokument indeholdende eksperimentelle data.
      Bemærk: Et semikolon adskiller kolonner; et linjeskift adskiller rækker. Tid erklæring er målt i sekunder, koncentration i mol/m3. Fjern først og andet datapunkt i den mellemliggende fase (Se figur 2) forsøg at undgå mulige montering fejl. Her er et eksempel hvor tekstdokument kan ligne:
      3540;      0.00216
      7140;      0.00724
      12240;    0.01707
      15180;    0.02230
      18660;    0.02697
      21540;    0.02931
      I dette eksempel kan bruges til at teste simuleringen.
    5. Tilføje "Global mindste kvadraters mål" med højre klik på "Optimering", vedhæfter tekst fra trin 3.3.4 til "eksperimentelle data" og definere den første kolonne som "tid kolonne 1" med højre-klik på "Global mindste kvadraters mål" og den anden kolonne som "Værdi i kolonne 1" med klik højre på "Global mindste kvadraters mål". I den "udtryk" for "Værdikolonne" Skriv variablen "C".
    6. Tilføje "Globale kontrol variabler 1" med højre-klik på "Optimering" og erklærer "D_search" som en variabel med den oprindelige værdi "1", nedre grænse "0" og øvre "1000".
    7. Tilføje "Optimering" med højre klik på "Studie 1" og vælger "SNOPT" som en optimering Problemløser metode. Indstille optimality tolerance til 1E-9.
      Bemærk: Hvis simuleringen ikke konvergerer, øge optimality tolerance. Husk på at simulering vil være unøjagtige hvis optimality tolerance er for stor.
    8. Start parameter optimering med "Beregn" i "undersøgelse". Glem ikke at indstille diffusion koefficient på barrieren som "D".

Representative Results

Permeabilitet eksperimenter i en 96-brønd membran indsætte system med 2%-agarosegel som en barriere blev gennemført for at vurdere nøjagtigheden af en simulering. Fluorescein natriumsalt (NaFl) og fluorescein isothiocyanat-næringsvæske (FD) blev brugt til at kontrollere virkningen af den molekylære størrelse af sprede stoffet fra 5 x 10-10 m op til 45 x 10-10 m Stokes radius (376.27-40.000 mol wt). Simuleringens native parameter optimering blev brugt til at passe simuleringen til eksperimentelle data.

Med henblik herpå, blev skråninger af kun de lineære dele af simulerede permeabilitet sammenlignet med de eksperimentelle resultater. For små molekylære størrelser var simulering og eksperimentelle data i god aftale med 99,2% for NaFl og 80,2% for FD 4.000 (jf. figur 4a og figur 4b). Større molekylære størrelse genereret højere afvigelser viser korrelationer 50,5% for FD 10.000, 79,7% for FD 20.000 og 53.6% for FD 40.000. Kurven progression i simuleringerne viste en forsinkelse i begyndelsen og en stærkere stigning i det videre forløb af grafer (Se figur 4 c-4e).

Permeabilitet koefficienter og simuleret diffusion koefficienter er vist i tabel 4. Gennemsivning koefficienten aftager med stigende molekylære størrelse. Standardafvigelsen var mellem 0,08 x 10-8 m/s og 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), der svarede til en absolut fejl af mellem 4.18% og 46.15%. Eksperimenter med større molekyler viste en større absolutte fejl. Simuleret diffusion koefficienter opførte sig meget på samme måde til eksperimentelle permeabilitet koefficienter. Stoffer med større Stokes radier viste faldende diffusion koefficienter, og den absolutte fejl varierede mellem 9,09 og 18.46% (N = 3).

I yderligere gennemtrængning eksperimenter, blev fire forskellige kollagen celletyper model brugt som barrierer i en 12-godt membran Indsæt system. Disse modeller omfatter en celle-fri model og en celle model med forskellige kombinationer af primære fibroblaster i kollagen gel og HaCaT på overfladen. Følgende kombinationer blev brugt: kollagen (oberst) som en celle-fri model, kollagen + fibroblaster (oberst + F.), kollagen + HaCaT (oberst + H.), og kollagen + fibroblaster + HaCaT (oberst + F. + H.). Fluorescein natriumsalt med DMEM + 10% FCS blev brugt som donor stof. Analyse af kollagen celle model, farvning med hæmatoxylin og eosin (han) blev anvendt for billedet. Denne farvning blev gjort ved hjælp af producentens protokol. I figur 5, er sådan en plet med en repræsentativ oberst + F. + H. model vist. HAN pletter lidt væv struktur af kollagen matrix. Fibroblaster er placeret i matrixen, og kerner af fibroblast og HaCaT celler farves i mørk violet. På toppen af kollagen matrix er der et lag, der indeholder mange kerner, som bør være kerner af HaCaTs, bygning en omsluttende lag på toppen af modellen.

I tabel 5, er eksperimentelle gennemtrængning koefficienter og simuleret diffusion koefficienter angivet. En tendens kan ses for de fleste af de modeller med HaCaT, som har lavere gennemtrængning/diffusion koefficienter i forhold til modeller uden HaCaT. Den absolutte fejl på gennemtrængning koefficienter er 10.9-24,4%, og for diffusion koefficienter 5.2-12,9%.

Figure 1
Figur 1: sideudsigt over permeabilitet eksperiment i en membran Indsæt system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: eksemplarisk grafen for en permeabilitet eksperiment. Koncentrationen af acceptoren er afbildet over tid. To stiplede linjer beslag den næsten lineære del af grafen. Hældningen af den lineære del bruges til at bestemme permeabilitetskoefficienten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: geometri og mesh af membranen indsætte system i simuleringen. (en) geometri af 96-brønd membran Indsæt system. (b) geometri af 12-godt membran Indsæt system. (c) Mesh af 96-brønd membran Indsæt system. (d) Mesh af 12-godt membran Indsæt system. (e) tværsnit og parametre af membranen Indsæt system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Fig. 4: sammenligning af forsøgsdata fra en gennemtrængning eksperiment til optimeret simulering. (en) fluorescein natriumsalt, (b) fluorescein isothiocyanat-dextran 4.000 mol wt., (c) 10.000 mol wt., (d) 20.000 mol wt. og (e) 40.000 mol wt. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: repræsentant HE farvning af kollagen celle model (kollagen + fibroblaster + HaCaT). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: permeabilitetskoefficienten som funktion af 1/Stokes radius ved hjælp af fluorescein natriumsalt og fluorescein isothiocyanat-dextran i en 96-brønd membran Indsæt system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Navn Experession for 96 godt System i mm Experssion for 12-godt System i mm Beskrivelse
d_tran 5,65 [mm] 14,7 [mm] Diameter af brønden
d_a 4,26 [mm] 12.1 [mm] Diameter af membranen
d_w 8,79 [mm] 21.97 [mm] Diameter af acceptoren
h_b 2 [mm] 2 [mm] Højniveau barrieren
h_sp 1 [mm] 1 [mm] Afstand mellem godt og bund
Bjarke 4.73 [mm] 5.24 [mm] Høj af acceptoren
b h_b/2 - Nedsænkning dybde
Rasmussen ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) - Radius af fordybelse bolden+
r_z r + h_b - z-placeringen af fordybelse bolden+

Tabel 1: geometri parametre for "Kemiske arter Transport" simulation. + Kun for at blive brugt til simulering af Agarosen indsætte gel i 96 godt membran system.

Navn Udtryk Værdi Beskrivelse
C_fl 0,1 [mg/ml]/376.28 [g/mol] 0.26576 mol/m2 Koncentrationen af Fl.So.
C_4 2 [mg/ml] / 4000 [g/mol] 0,5 mol/m2 Koncentrationen af FD 4.000
C_10 2 [mg/ml] / 10000 [g/mol] 0,2 mol/m2 Koncentrationen af FD 10.000
C_20 2 [mg/ml] / 20000 [g/mol] 0,1 mol/m2 Koncentrationen af FD 20.000
C_40 2 [mg/ml] / 40000 [g/mol] 0,05 mol/m2 Koncentrationen af FD 40.000
Dif_w 1e-9 [m ^ 2/s] 1e - 9m2/s Diffusion koefficient at blande vand

Tabel 2: Fysiske parametre for "Kemiske arter Transport" simulation.

Navn Udtryk Beskrivelse
C Acceptor(c) Definition af acceptoren koncentration
D D_search * 1e-10 Faktor ændring for D

Tabel 3: Parametre til "Optimering" simulering.

Permeat Permeabilitetskoefficienten (m/s) x 10-8 Diffusion koefficient (m/s2) x 10-10 Stokes radius af Permeatet (m) x 10-10
Fl.So. 4,79 ± 0,20 1,94 ± 0,34 5
FD 4.000 2.37 ± 0.31 0,65 ± 0,12 14
FD10, 000 1,67 ± 0,47 0,22 ± 0,02 23
FD 20.000 0,65 ± 0,30 0,29 ± 0,04 33
FD 40.000 0,27 ± 0,08 0,14 ± 0,02 45

Tabel 4: permeabilitet og diffusion koefficient for stoffer med forskellige Stokes radius gennem 2%-agarosegel + membran i en 96-brønd membran Indsæt system. (fluorescein natriumsalt = Fl. So., fitc dextran = FD).

Model Permeabilitetskoefficienten (m/s) x 10-8 Diffusion koefficient (m/s2) x 10-10
Oberst 2.18 ± 0,29 1.22 ± 0,06
Oberst + F. 1,77 ± 0,38 0,93 ± 0,12
Oberst + H. 1,64 ± 0,40 0,96 ± 0,05
Oberst + F. + H. 1,65 ± 0,18 0,88 ± 0,11

Tabel 5: permeabilitet og diffusion koefficient af fluorescein natriumsalt gennem en kollagen celle model i et 12-godt membran indsætte system (oberst = kollagen, F. = Fibroblast, H. = HaCaT).

Discussion

Denne undersøgelse dokumenterer en metode udviklet til at kvantificere gennemtrængning gennem en væv-konstruere manipuleret på en membran. Gennemtrængning af stoffer med forskellige molekylære størrelser gennem agarosegel blev først undersøgt for at teste og validere metoden og de tilsvarende simulering. Det er velkendt, at mindre molekyler gennemsyre hurtigere gennem en matrix mesh (med undtagelse af effekt i gel filtrering af permeabilitet kromatografi). Lignende observationer blev foretaget med størrelse-udelukkelse eksperimenter af stoffer gennem sclera26, human epidermal membran27, menneskelige hud17og rotte hud28. En invers korrelation mellem permeabilitet koefficienter og den tilsvarende Stokes radius (radius af en hård kugle, der bevæger sig med den samme diffusion sats som molekyler beskrevet, normalt mindre end den effektive radius af molekylet) har vist sig 26 , 28, og et lignende forhold blev observeret i eksperimenter med stoffer i forskellige molekylære størrelser. Ved at plotte permeabilitet koefficienterne over 1/Stokes radius, en lineær korrelation over de fire grupper med den mindste molekylære størrelse blev fundet (R2 = 0,93) (figur 6). Dette angiver, simulerede permeabilitet koefficienter med metoden foreslog i en realistisk rækkevidde.

Fejl på 46.15% i forsøgene er lidt større end rapporteret for permeabilitet eksperimenter med Franz diffusion celle system10. En mulig forklaring kunne være størrelse fordelingen af fluorescein-isothiocyanat-dextran, der diskuteres senere.

Den beskrevne metode har vigtige fordele sammenlignet med metoder, Franz diffusion celle system. For det første, setup er mere kompakt; Forsøgene udføres direkte i en membran Indsæt system, som har skala af en kommerciel godt plade (∼ 13 cm x 8,5 cm). Dette gør det muligt for flere prøver, der skal køres samtidigt, en separat Franz diffusion celle er nødvendigt for hver enkelt prøve. For det andet kan permeabilitet af huden model måles direkte i membranen Indsæt, hvor dyrkningen foregår. Ved hjælp af Franz diffusion celler, skal og prøverne tages og monteres på det system, som er mere besværligt for små prøver og er også mere tidskrævende.

Permeation eksperimenter med kollagen celle matricer viste, at denne metode kan anvendes med succes på celle-seedede systemer. Modellen præsenteres her blev kontrolleret for hud modeller; metoden kan dog anvendes til andre typer af økologisk cellekulturer, fx, nyre eller lever.

I denne undersøgelse, en kollagen-celle model blev brugt som HaCaT cellerne helt dækket modeloverfladen (Se figur 5). Dette førte til en reduktion af permeabilitetskoefficienten, viser, at metoden er følsom nok til at skelne permeabilitetskoefficienten mellem kollagen-celle model med og uden et lag af HaCaT. Ideelt, en hudmodel bør opbygge en barriere, der nærmer sig epidermis af en reel hud29, og det er derfor vigtigt at kontrollere kvalitet (fx, bygning af dermis, epidermis) af hudmodel før faktiske brug. Udvikling af en model, huden kan visualiseres med farvning teknikker og kvantificeres fra påvisning af huden protein og kollagen30,31,32. Permeabilitetskoefficienten kan også være en vigtig faktor for vurderingen af udviklingen af modellens huden, men yderligere eksperimenter er forpligtet til at bekræfte dette. Som tidligere nævnt, giver denne metode mulighed for parallelt flere prøver. Det er også muligt at udtage prøver under dyrkning at måle permeabilitet, og dermed iagttage udviklingen af denne parameter af modellens huden.

Det skal bemærkes, at permeabilitet er målt ved hjælp af en gel/kollagen-celle-model og en membran samtidigt. Den fundne permeabilitetskoefficienten er systemspecifikke, hvorved resultaterne af forskellige hud modeller kun kan sammenlignes når du bruger den samme membran Indsæt. Desuden, huden model skal dække den hele dyrkningsareal for at sikre, at test-kemikaliets vil gennemsyre kun gennem modellen og ikke støder op til det, som ville fremkalde fejl i permeabilitet målt. Et andet aspekt, der bør overvejes i fremtiden eksperimenter er det naturlige miljø omkring huden. Normalt, er hudens overflade temperatur lavere i forhold til den indre region, som kan få indflydelse på gennemtrængning betingelser.

For at justere lab eksperimenter med computersimulationer, blev en metode, som giver mulighed for parameter optimering for anvendt simulation præsenteret. Simuleringer blev fundet til at falde sammen med eksperimentelle data for stoffer med små molekylære størrelser. Dog blev afvigelser mellem simulering og eksperimentelle data observeret for stoffer med større molekylære størrelser. Store polysaccharid molekyler kan øge friktion og bremse udbredelsen proces i en gel. Denne effekt forårsager unormal diffusion, som er en mulig årsag til afvigelsen mellem eksperimentelle og simulation værdier33,34. En anden forklaring kan være tilstedeværelsen af mindre eller større partikler i fluorescein isothiocyanat dextran. Fabrikanten angiver molekylvægt af stoffet som den gennemsnitlige størrelse med et givet område, som giver mulighed for større og mindre partikler til stede. Det er også uklart hvordan spredte disse stoffer er, som de mindre partikler gennemsyre hurtigere gennem gel og væske-kanal. Det er muligt at udvide simulering for at overveje disse diffusion og friktion effekter.

Permeabilitet eksperiment og simulation blev udviklet til brug i en 2-OC. Med hjælp fra simuleringen, kan denne eksperimentelle metode overføres direkte til mere avancerede eksperimentelle opsætninger. Membran Indsæt system simulering kan for eksempel nemt overføres til en 2-OC geometri eller til andre systemer med lignende set-ups. Denne indstilling af modulerende simulering kan bruges til at støtte udformningen af fremtidige eksperimenter. Derudover kan bivirkninger såsom fordampning, unormal diffusion og membran effekter integreres for at forbedre simulation, dermed forbedre nøjagtighed. Simulation program giver mulighed for at ændre eller forbedre simulation ligning, samt for at integrere andre fysiske moduler for at undersøge andre aspekter af huden modeludvikling. Et eksempel er simulering af glucose forbrug og laktat produktion i en kollagen celle model.

Et særligt interessant aspekt til afprøvning af medicinske stoffer er, hvordan stofferne, der er fordelt i et orgel-on-a-chip-system. Parameteren simulering og permeabilitet min hjælp til at besvare spørgsmål, såsom hvor hurtigt et stof, der gennemsyrer ind i systemet og hvilken koncentration vil være tilgængelige for andre væv i en multi-organ-chip. Denne metode kan støtte og forbedre udvikling og afprøvning af sådant orgel-on-chip systemer.

Disclosures

Uwe Marx er den administrerende direktør og en aktionær og Gerd Lindner er aktionær i TissUse GmbH, en virksomhed fremstiller og kommercialisere MOC teknologien. Andre forfattere erklære nogen interessekonflikt med hensyn til offentliggørelsen af dette papir.

Acknowledgments

Dette arbejde blev skabt med finansiel støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under grant nr. PO413/12-1 og LA 1028/7-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Carl Roth K297.2 High Resolution Powder
Collagen Serva 47256.01 Collagen R solution 0.4 %
DMEM Lonza (Biozym Scientific GmbH) 880010-12 High Glucose with L-Glutamine
FCS Biochrom GmbH S0615 0114F Fetal Calf Serum
Fluorescein Sodium Salt Sigma-Aldrich 46960-25G-F
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 46944-500MG 4000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD10S-250MG 10 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD20S-250MG 20 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD40S-250MG 40 000 g/mol
HBSS ThermoFisher Scientific 14170120 no calcium, no magnesium , with phenol red
NaOH Merck 1.06467.9010 granulated
PBS Gibco 18912-014 tablets
Transwell Cell Culture Inserts Corning 3391 96 well, 0.4 µm pore size
Transwell Cell Culture Inserts Corning (VWR) 734-1563 12 well, 0.4 µm pore size
Trypsin Biochrom GmbH L2143 with EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
  23. Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
  26. Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

Tags

Bioteknologi sag 132 hudmodel permeabilitet diffusion membran Indsæt system simulation fluorescein isothiocyanat-dextran fluorescein natriumsalt
En metode til bestemmelse og simulering af permeabilitet og Diffusion i en 3D væv Model i en membran indsætte System for multi godt plader
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsu, H. H., Kracht, J. K., Harder,More

Hsu, H. H., Kracht, J. K., Harder, L. E., Rudnik, K., Lindner, G., Schimek, K., Marx, U., Pörtner, R. A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates. J. Vis. Exp. (132), e56412, doi:10.3791/56412 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter