Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En metode for fastsettelse og simulering av permeabilitet og spredning i en 3D vev modell i en membran setter systemet for flere bra plater

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56412
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Institute of Bioprocess and Biosystems Engineering, Hamburg University of Technology, 2Institute of Biotechnology, Department Medical Biotechnology, Technische Universität Berlin, 3TissUse GmbH

Summary

En metode for bestemmelse av permeabilitet i en membran sett systemet for flere bra plater og i sili parameteren optimalisering for beregning av diffusjon koeffisienter bruker simulering presenteres.

Abstract

In vitro dyrket huden modeller har blitt stadig viktigere for farmasøytisk og kosmetisk programmer, og brukes også i narkotika utvikling, samt stoff tester. Disse modellene er hovedsakelig dyrket i membran-sette systemer, deres permeabilitet mot forskjellige stoffer er en viktig faktor. Vanligvis krever anvendt metoder for fastsettelse av disse parameterne vanligvis store utvalgene (f.eks, Franz diffusjon celle) eller arbeidskrevende utstyr (f.eks, fluorescens utvinning etter photobleaching (FRAP)). Denne studien presenterer en metode for å bestemme permeabilitet koeffisienter direkte i membran-sette systemer med diameter størrelser 4.26 mm og 12.2 mm (dyrking område). Metoden ble validert med agarose og kollagen gels samt en kollagen celle modell som representerer huden modeller. Gjennomtrengning prosessene av stoffer med forskjellige molekylær størrelser og gjennomtrengning gjennom ulike celle modellene (bestående av kollagen gel, fibroblast og HaCaT) var nøyaktig beskrevet.

Videre, for å støtte metoden ovenfor eksperimentelle, en simulering ble etablert. Simuleringen passer eksperimentelle data for stoffer med små molekylære størrelse, opp til 14 x 10-10 m Stokes radius (4000 MW), og er derfor et lovende verktøy for å beskrive systemet. Videre simuleringen kan betydelig redusere eksperimentelle arbeidet og er robuste nok til å bli utvidet eller tilpasset mer komplekse oppsett.

Introduction

Organo-typisk 3D kulturer har blitt kraftig verktøy for narkotika utvikling og stoff tester1. I denne forbindelse er menneskehud modeller av spesiell interesse regulatoriske krav, som de i kosmetikkindustrien. De har senere førte til utviklingen av mange 3D huden modeller for bruk på egenhånd som enkelt-orgel kulturer multi bra plater eller multi-organ-chips i kombinasjon med ekstra orgel modeller, f.eks, lever2.

Når det gjelder dyrking av huden tilsvarende er air-flytende grensesnittet (ALI) en grunnforutsetning for riktig epidermal differensiering3. Celle kultur setter består av et fartøy med en flytende-gjennomtrengelig membran nederst brukes vanligvis til å etablere ALI. ALIs benyttes mye i kommersielt tilgjengelig huden modeller som EpiDerm4, Phenion5og Episkin6av huden modeller med størrelser fra 96-brønnen (4.26 mm i diameter) regler for opp til 12-vel (12.2 mm i diameter) plater. Metoden beskrevet her bestemmer gjennomtrengning av stoffer i en membran sett inn system.

Den permeabilitet koeffisienten er en viktig parameter for å vurdere kvaliteten på noen kulturperler hud-modell i forhold til opprinnelige huden5, og brukes til å vurdere hvor raskt aktive stoffer vandrer gjennom huden. Spesielt hvis narkotika eller kosmetikk produkter må brukes på huden, er denne parameteren viktig å forstå når nøyaktig den aktive agenter passerer gjennom den. En simulering kan videre hjelpe å forutsi oppførselen til systemet og deretter redusere den nødvendige tidkrevende eksperimentelle innsatsen, særlig når en rekke stoffer er involvert.

Franz diffusjon cellen er state-of-the-art gjennomtrengning eksperimenter med hud og hud modeller5,6,7,8,9. Denne enheten består av to deler med et fast utvalg (diffusjon barriere) i mellom. Stoffet skal testes brukes direkte på toppen av prøven (donor rom) og konsentrasjonen av permeating sammensatte kan oppdages på motsatt (acceptor) rommet. På siden acceptor sikres konstant temperatur og homogen stoff konsentrasjon gjennom en temperatur kammer og en magnetisk rørestang. Prøver kan bli tatt fra en prøvetaking arm på acceptor side av Franz cellen. Med en høyde varierer mellom 19 cm og 179 cm er dette systemet relativt stor10,11. En annen metode for fastsettelse av diffusjon koeffisientene i gel-lignende stoffer og vev er FRAP. Denne teknikken bruker prinsippet om bleking fluorescently merket partikler i gel, og deretter bestemme gjenopprettingstiden av området bleket for å beregne diffusjon koeffisienten12,13,14.

Videre kan Fourier-transform-infrarød (FTIR) spektroskopi brukes til å oppdage partikkel bevegelse med infrarødt lys absorbansen for å bestemme gjennomtrengning prosessen av stoffer i huden15,16. Imidlertid må disse eller andre tenkelig metoder (f.eks, to-fotonet fluorescens korrelasjon spektroskopi17) koste intensiv instrumenter.

I denne artikkelen, er en metode presentert for direkte mål permeabilitet av en barriere i en membran sett inn systemet, hvor huden modell kan dyrkes. Denne metoden kan permeabilitet eksperimenter kjøres med et stort antall små utvalg (vel størrelse opp til 4.26 mm) i et kompakt system. Dette er Franz diffusjon cellen, der en separat enhet kreves for hver probe, som må monteres på enheten og er vanskelig å forstå for små (størrelse 4.26 mm). Videre, siden metoden ikke krever store instrumentation (f.eks, mikroskop AC confocal eller multiphoton), en reduksjon i både tid og kostnader er oppnådd.

Alle forsøkene ble utført i mikroporøs membran sett systemer med en prøve (barriere) som består av agarose gel eller en kollagen celle modell på membranen. Fluorescerende stoffer (giveren) med varierende molekylær størrelser ble anvendt på toppen av prøven, og konsentrasjonen av gjennomsyret stoffet ble oppdaget på bunnen (acceptor) med en fluorescens plate leser (se figur 1). For å validere metoden og teste ut nøyaktigheten av denne simuleringen, ble agarose gels produsert og brukes som en barriere. Hydrogels brukes generelt for etterforskningen av diffusjon og gjennomtrengning prosesser i porøse medium i biologi13. Metoden ble testet i en celle-seeded system består av en kollagen matrise av primære fibroblaster og menneskelige voksne lav kalsium høy temperatur keratinocytter (HaCaT) cellene (celle-matrix modell), som er en forenklet hudpleie modell18,19 .

I tillegg var gjennomtrengning prosessen simulert med flyt simuleringer med computational fluid dynamics. Det ble funnet at ved hjelp av parameteren optimalisering, diffusjon koeffisient kan bli beregnet fra eksperimentelle data. Generelt tilbyr denne simuleringen forskjellige programmer. for eksempel, er det mulig å forutse en gjennomtrengning prosess basert på kort eksperimenter og simuleringen kan redusere antall eksperimenter.

Eksperimentell metode og simulering ble beregnet til påføring på orgel på-chip systemet1,20,21, spesielt 2-orgel-brikken (2-OC) utviklet kommersielt1,22, 23,24,25. I prinsippet kan gjennomtrengning prosessen med noen orgel modell basert på membran sett inn systemer beskrives på denne måten.

Protocol

1. forberede prøven for permeabilitet studier

Merk: For å kontrollere gjennomtrengning målinger og simuleringer, et utvalg bestående av agarose gel eller en celle matrix modell basert på kultivering av huden modellen ble brukt.

  1. Agarose gel
    1. Oppløse 0.2 g agarose høy oppløsning pulver i 10 mL av H2O (dobbel-destillert vann).
    2. Bland løsningen og varme den opp til 80 ° C. Opprettholde temperaturen i 8 min.
    3. Gjelder 28.6 µL agarose gel på membranen av 96-brønns membran sett inn systemet (4.26 mm i diameter) eller bruk 226 µL for 12 godt membranen setter systemet (12 mm i diameter) (f.eks, Transwell system).
    4. Vente 10 min til gel er styrket.
  2. Kollagen gel
    Merk: Alle trinnene utføres under sterile forhold og løsninger holdes på is tregere polymerisasjon av kollagen gel.
    1. Mix 125 µL av Hanks' balansert Salt løsning (HBSS) med 1 mL 0,4% kollagen R (rotte hale kollagen).
    2. Sjarmere løsningen med 1 M NaOH (natriumhydroksid) (~ 6 µL) til fargen på fenol red endringer fra gul til rødt.
    3. Legg 125 µL av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) + 10% fosterets kalv serum (FCS) til kollagen gel og bland forsiktig med Pipetter tips.
    4. Bruke 28.6 µL av kollagen gel membranen i 96-brønnen membran sett inn systemet eller 226 µL for 12-vel membran sett inn systemet.
    5. La gel i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) for 30 min.
  3. Kollagen celle modell med fibroblast
    Merk: Alle trinnene utføres under sterile forhold.
    1. Forberede primære fibroblaster 5-7 dager før eksperimentet. Dyrke fibroblaster med DMEM + 10% FCS i celle kultur flasker (75 cm2) og endre mediet hver 2-3 dager.
      Merk: Avhengig av eksperimentelle oppsettet, et større antall celler kan brukes.
    2. Fjerne mediet fra celle kultur kolbe (80% confluent) og vask to ganger med 10 mL (kultur kolbe 75 cm2) fosfat bufret saltoppløsning (PBS). Legge 3 mL 0,05% Trypsin / ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og Inkuber i 3 minutter på 37 ° C.
    3. Trykk forsiktig på kultur kolbe koble cellene fra overflaten. Stoppe reaksjonen ved å legge til 3 mL DMEM + 10% FCS. Overføre løsningen i en sentrifuge rør.
    4. Sentrifuge celle suspensjon 120 x g, fjerne nedbryting og resuspend cellene med 0,5 mL DMEM + 10% FCS.
    5. Telle celler og justere en konsentrasjon på 0,5 x 106 celler/mL.
      Merk: Følgende utføres på is tregere polymerisasjon av kollagen gel.
    6. Mix 125 µL av HBSS med 1 mL 0,4% kollagen R.
    7. Sjarmere løsningen med 1 M NaOH (~ 6 µL) til fargen på fenol red endres fra gul til rødt.
    8. Legge til 125 µL av cellen suspensjon (DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 celler/mL) i kollagen gel og bland forsiktig med en pipette.
    9. Bruk 28.6 µL av kollagen gel membranen i 96-brønnen membran sett inn systemet eller 226 µL for 12-vel membran sett inn systemet.
    10. La gel i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) for 30 min.
    11. Bruke 75 µL DMEM + 10% FCS på gel overflaten og 300 µL av mottakeren platen av 96-brønns membranen sett systemet. Sette inn systemet for 12-vel membranen, bruke et volum på 590 µL for overflate og 1,846 µL for mottaker plate.
    12. Fjerne mediet fra overflaten av cellen matrix modellen (luftbro) og ruge celle matrix modellen videre i 7 dager. Bruk 100 μl medium på bunnen og endre mediet hver dag.
  4. Kollagen celle modell med HaCaT
    Merk: Alle trinnene utføres under sterile forhold.
    1. Forberede HaCaT 5-7 dager før følgende. Dyrke HaCaT med DMEM + 5% FCS i en celle kultur kolbe (75 mm2) og endre mediet hver 2-3 dager.
      Merk: Avhengig av eksperimentelle oppsettet, et større antall celler kan brukes.
    2. Fjerne mediet fra flasken og vask to ganger med 10 mL (kultur kolbe 75 cm2) PBS. Legge 3 mL 0,05% Trypsin/EDTA og Inkuber i 10 min på 37 ° C. Stoppe reaksjonen med 3 mL DMEM + 10% FCS. Overføre løsningen i en sentrifuge rør.
    3. Sentrifuge celle suspensjon 120 x g, fjerne nedbryting og resuspend cellene med 0,5 mL DMEM + 10% FCS.
    4. Telle celler og justere en konsentrasjon på 0,5 x 106 celler/mL.
      Merk: Følgende utføres på is tregere polymerisasjon av kollagen gel.
    5. Mix 125 µL av HBSS med 1 mL 0,4% kollagen R.
    6. Sjarmere løsningen med 1 M NaOH (~ 6 µL) til fargen på fenol red endres fra gul til rødt.
    7. Legge til 125 µL DMEM + 10% FCS kollagen gel og bland det nøye med en pipette.
    8. Bruk 28.6 µL av cellen suspensjon membranen i 96-brønnen membran sett inn systemet eller 226 µL for 12-vel membran sett inn systemet.
    9. La gel i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) for 30 min.
    10. Bruke 75 µL av cellen suspensjon gel overflaten og legger 300 µL DMEM + 10% FCS til mottakeren plate av 96-brønns membranen sette systemet. Sette inn systemet for 12-vel membranen, bruke et volum på 590 µL celle suspensjon for overflate og 1,846 µL DMEM + 10% FCS for mottaker plate.
    11. Inkuber celle matrix modellen for 3 dager; utveksle mediet etter 2 dager.
    12. Fjerne mediet fra overflaten av cellen matrix modellen og ruge celle matrix modellen for ytterligere 7 dag. Bruk 100 µl medium på bunnen og endre mediet hver dag.
  5. Kollagen celle modell med fibroblaster og HaCaT
    Merk: Alle trinnene utføres under sterile forhold på is tregere polymerisasjon av kollagen gel. Forberede fibroblaster som beskrevet i trinn 1.3 trinn 1.3.5, og forberede en dag senere HaCaT som beskrevet i trinn 1.4 til trinn 1.4.4.
    1. Mix 125 µL av HBSS i 1 mL av 0,4% kollagen R løsning.
    2. Nøytralisere løsningen med 1 M NaOH (~ 6 µL) til fargen fenol Red skifter fra gult til en rød fiolett.
    3. Legge til 125 µL av primære fibroblast celle suspensjon bestående av DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 celler/mL til kollagen gel og bland forsiktig.
    4. Bruke 28.6 µL av cellen suspensjon membranen i 96-brønnen membran sett inn systemet eller 226 µL for 12-vel membran sett inn systemet.
    5. La gel i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) for 30 min.
    6. Deretter Bruk 75 µL DMEM + 10% FCS gel overflaten og 300 µL på mottakeren platen i 96-brønnen membran sett inn systemet. Sette inn systemet for 12-vel membranen, et volum på 590 µL brukes for overflate og 1,846 µL for mottaker plate.
    7. Inkuber for 1 dag på 37 ° C og 5% CO2.
    8. Fjerne mediet fra overflaten og legger en HaCaT celle hjuloppheng med 0.5 x 106 celler/mL. Volumet er den samme som beskrevet før under trinn 1.5.6.
    9. Inkuber celle matrix modellen for 3 dager; utveksle mediet etter 2 dager.
    10. Fjerne mediet fra overflaten av cellen matrix modellen og ruge celle matrix modellen for ytterligere 7 dag. Bruk 100 µl medium på bunnen og endre mediet hver dag.
      Merk: For denne undersøkelsen, 3 gel/celle-modell prøver ble utarbeidet for 12-vel membran sett inn systemet. Sette inn systemet for 96-brønns membranen, vi brukt 6 utvalgene for gel/mobiltelefon modellen. For statistiske betyr er 3 prøver vanlig. Men for eksperimenter i 96-brønnen membran sett inn systemet med kollagen matrix modellen vi forventet feil og avvik for cellekultur. Derfor valgte vi flere eksempler.

2. permeabilitet studier i membranen sette System

  1. Donor stoff
    Merk: To fluorescein natrium salter (NaFl) er produsert.
    1. Løs opp NaFl i H2O i en konsentrasjon av 0,1 mg/mL og 0,01 mg/mL. De ulike fluorescein isothiocyanate-dextranes (FD) med en molekylvekt av 4000, 10.000, 20.000 og 40.000 g/mol oppløst i H2O i en konsentrasjon av 2 mg/mL. Bruk disse løsningene som donor stoff for permeabilitet eksperimenter (se figur 1) med agarose gel.
    2. For oppsett med kollagen celle modell, forberede alle løsninger med DMEM + 10% FCS i stedet for vann.
      Merk: Forberede lager løsninger (10 x høyere konsentrasjon) av donor stoffet. Små variasjoner av donor konsentrasjonen kan påvirke resultatene av permeabilitet eksperimentet.
  2. Eksperimentell metode
    Merk: Permeabilitet eksperimentet utføres på 37 ° C og en fuktighet > 90%. Denne parameteren sikrer levedyktigheten til cellene. Temperatur påvirker diffusjon prosessen så de samme parameterne brukes for eksperimenter med agarose gel, kollagen gel og kollagen celle modell. Voluminformasjonen i braketten refererer til 12-vel membran sett inn systemet.
    1. Forberede en 96 - (eller 12-) godt membran sett inn system med en barriere som består av agarose gel (se protokollen 1.1) eller celle modell (se protokollen 1.2-1,5) og fluorescens donor substans.
    2. Forberede fortynninger av 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 og 1:320 av donor stoffet for å etablere en standard kurve. Pipetter 300 µL (1,846 µL) av hver fortynning i tre brønner av mottakeren plate. Sette inn systembruk en egen mottaker plate for 12-vel membranen. De serielle fortynninger brukes til å konvertere den målte fluorescensen [RFU] til tilsvarende konsentrasjonen [mg/mL].
    3. Legge til 75 µL (590 µL) av donor stoff på prøven (agarose gel eller celle modell) og 300 µL (1,846 µL) acceptor stoff (H2O eller DMEM + 10% FCS) i mottaker platen (se figur 1).
      Merk: Kontroller at overflater av væske i membranen sette systemet og mottakeren platen har likt å unngå hydrostatisk trykk.
    4. Overføre hele systemet på en shaker i inkubator. Justere risting for å oppnå homogene blande (totalt slag bane er 1,5 mm, hastigheten justeres på nivå 3.5, som er knyttet til en rotasjon av ~ 480 1/min) å unngå en konsentrasjon gradient, som påvirker spredningen prosessen.
    5. Bestemme fluorescens regelmessig hver time. For å måle fluorescensen, overføre membran sett inn systemet inn en tom plate og måle fluorescens i mottakeren bruker en plate-leser. Bruke en eksitasjon bølgelengden til 485 nm og utslipp av 535 nm for fluorescein.
    6. Utføre eksperimentet 5 h.
      Merk: Under eksperimentene, væsken fordamper fra hele systemet. Fordampning endrer konsentrasjonen i giver og acceptor og påvirker resultatene. Denne effekten er neglisjert i en kjøretid 5 h, men for lengre kjører ganger det bør vurderes.
  3. Beregne permeabilitet koeffisient
    1. Etablere standardkurven, plot fluorescens for de serielle fortynninger versus konsentrasjon og utføre en lineær regresjon over dataene.
    2. Bruk stigningstallet for den lineære regresjonen til å konvertere fluorescens dataene av gjennomtrengning eksperimentet til konsentrasjon. Konvertere enheter i mol/m3for simuleringen.
    3. Plot konsentrasjonen som funksjon over tid og etablere lineær segmentet av data (se figur 2).
    4. Fastslå skråningen av denne lineære delen og beregne den permeabilitet koeffisienten i henhold til denne formelen (se eksemplet i figur 2):
      Equation 1
      hvor dcA/ dt er endring av konsentrasjonen av stoffet i siden acceptor over tid (stigningstallet); CD er konsentrasjonen på donor siden; P er permeabilitet koeffisient; Er gjennomtrengning overflaten og VA er volumet av acceptor. Denne ligningen er avledet fra Ficks første lov og kan bare brukes når CD » CA6,22.
    5. Merk: Konsentrasjonene i donor må være mye høyere enn konsentrasjonen i acceptor. Dette ble bekreftet i eksperimentell oppsettet.

3. simulering

Merk: Simuleringen ble gjort med COMSOL Multiphysics 5.1. En grunnleggende kunnskap om dette antas. Følgende forutsetninger utføres simuleringen diffusion: (a) diffusjon koeffisient av stoffer i H2O er mye høyere i forhold til den i gel. For å kompensere for denne forskjellen, bruker simuleringen verdien 1 x 10-9 m2/s som er høyere med en faktor på 10 til 100 sammenlignet diffusjon koeffisient av NaFl gjennom 2% agarose gel. (b) i forsøket, stoffet diffunderer gjennom barriere og sett deretter systemet gjennom membran av membranen. I motsetning til eksperimentelle oppsett anses virtuelle agarose gel eller cellen matrise og membran å være en homogen fase. (c) grensen effekter på veggene er satt til "ingen slip", alle forsinkede effekt på vegger (ikke mellom flytende og gel eller væske og celle modell) av membran sett inn systemet er neglisjert, og er ikke betydelig for diffusion prosessen.

  1. Oppsett av diffusjon simulering
    Merk: Disse trinnene viser oppsettet for simulering av permeabilitet eksperimentet. Simuleringene for 96 - og 12-godt membran sett inn systemer ble konfigurert separat. Modulen "Kjemiske arter Transport" bruker en formel basert på Ficks andre Diffusjonslov:
    Equation 9
    der c er konsentrasjonen av stoffet, er tiden, u er hastigheten, D er diffusjon koeffisient og R er reaksjon. Reaksjon hastigheten ble neglisjert fordi ingen kjemisk reaksjon oppstod i diffusjon prosessen.
    1. Åpne programmet og start en ny modell. Valgte "Modell Wizard", Velg 3D modell, legge til "Transport av fortynnet arter" til fysikk grensesnitt på rullegardinmenyen, klikk på "Study", velg "Tid avhengig" studien, og klikk på "Ferdig".
    2. Gå til "Global Definitions" og legge til "Parametere" med Høyreklikk. Angi parameterne geometriske og fysisk i rutenettet (se tabell 1og tabell 2 figur 3e).
      Merk: Den konkave overflaten av agarose gel i en 96-brønns membran sett inn system var tilnærmes med en nedsenking ball.
    3. Sett opp geometri i membranen setter systemet fra eksperimenter. I trinn 3.2 vises et eksempel på hvordan du bygger geometrien i 96-brønnen membran sett inn systemet. Enheten lengde er satt til meter.
      Merk: Ikke bygge hele geometrien for å lagre beregning. I stedet geometri kan reduseres ved hjelp av center tekstlinjer en fjerdedel av geometri (se figur 3a og 3b figur).
    4. Legge til to "domene sonder" i "Definitions" (høyre klikk på "Definitions" og Finn "Probe") og velg en sonde som acceptor domenet og den andre som donor domenet. Velg for begge type "Gjennomsnittlig" og uttrykket "c" enheten "mol/m3".
      Merk: Dette trinnet er valgfritt, og viser konsentrasjonen av acceptor og donor under simulering.
    5. Angi diffusjon koeffisient (Dc) i "Transport egenskaper 1" i "Transport av Diluted arter"som "Dif_w".
      Merk: "Transport egenskaper 1" brukes for både acceptor og donor. I neste trinn overskrives barriere domenet.
    6. Legge til en andre "Transport egenskaper 2" med høyre klikk på "Transport av fortynnet arter" og velg barrieren (2) i "Domene valg". Avhengig av formålet med simuleringen kan diffusjon koeffisient angis som verdien barriere eller en dummy variabel "D". For det første testkjøring, angi verdien 2E-10 m2/s.
      Merk: "D" bli erklært senere i trinn 3.3.
    7. I "Transport av fortynnet arter" for "første 1" definerer konsentrasjonen som null.
      Merk: "Første verdier 1" brukes for barriere og acceptor domene. I neste trinn overskrives donor domenet.
    8. Legge til en andre "Første verdier 2" med høyre klikk på "Transport av fortynnet arter" og velg donor (3) som domenet. Angi konsentrasjonen som første konsentrasjonen av donor stoffet (f.eksC_fl fra tabell 2).
    9. Legger til "Symmetri 1" Høyreklikk på "Transport av fortynnet arter", legge til og velge alle overflater på "Grensen markeringen," som speilet hel geometri (for eksempel geometri i trinn 3.2 det er grensen nummer 1, 2, 4, 5, 7, 8).
      Merk: Dette punktet kan bli neglisjert hvis hele geometrien er konfigurert.
    10. Med et høyreklikk på "Mesh" legge til to "gratis Tetrahedral". Velg barrieren (2) som domenet (endre hvilket geometriske enheter i "Domain"). Legge "Størrelse" med høyre klikk på "gratis Tetrahedral 1" og for forhåndsdefinerte nettet "Finere" for 12-vel membranen sette systemet eller "ekstra Fine" for en 96-brønns membran sette inn systemet.
    11. I den andre "gratis Tetrahedral" Merk acceptor og donor som domenet og forhåndsdefinerte mesh "Normal" for en 12-vel membran sette systemet eller "Finere" for en 96-brønns membran setter systemet (se Figur 3 c og 3d, figur).
      Merk: Det er også mulig å velge en grovere mesh lagre beregning tid. Dette kan redusere nøyaktigheten til resultatene. Klikk på "Bygge alle" i "Mesh Setting" for å mesh geometrien.
    12. Starte simuleringen med "Beregn" den "Studere 1".
  2. Eksempel oppsett for en geometri
    Merk: Her et eksempel er gitt av hvordan du setter opp geometri i 96-brønnen membran sett inn systemet (med konkav barriere). Alle trinnene utføres i modulen geometri av programmet. Enheten lengde er satt til meter.
    1. Generere en sylinder 1 (Høyreklikk på "Geometri 1") med radius av d_w/2 og høyden på h_sp + h_b + h_a.
    2. Generere en sylinder 2 med radius av d_tran/2, høyden på h_b + h_a og z plasseringen av h_sp.
    3. Bruke alternativet "Forskjell" (Høyreklikk på "geometri 1", finner "Booleans og deling") trekke sylinder 2 fra sylinder 1. Valgte "cyl1" i "Legge til objekter," aktivere "Objekt trekke" og velger "cyl2". Det nye volumet er geometrien i acceptor.
    4. Generere en sylinder 3 med radius av d_a/2, høyden av h_b og z-posisjonen til h_sp.
    5. Generere en kule 1 med radius r og z posisjon r_z.
    6. Bruke alternativet "Forskjell" trekke sfære 1 (sph1) fra sylinder 3 (cyl3). Det nye volumet kalles forskjellen 2.
    7. Generere en sylinder 4 med radius av d_a/2, høyde h_b + h_a og plasserer z av h_sp.
    8. Bruke alternativet "Forskjell" trekke sylinder 4 (cyl4) fra forskjellen 2. Det nye volumet er geometrien i acceptor.
    9. Gjenta trinn 3.2.4-3.2.6 å bygge barrieren (agarose gel eller celle modell i eksperimentet).
    10. Gjøre en union 1 av alle geometri elementer (høyre klikk på "Geometri 1", finner "Booleans og deling").
    11. Generere en blokk 1 med alle kanter til en lengde på d_tran * 2 posisjon x - d_tran og y av d_tran * 2.
    12. Generere en blokk 2 med alle kanten lengden på d_tran * 2 posisjon x - d_tran * 2 og y av - d_tran.
    13. Bruke alternativet "Forskjell" trekke union 1 fra blokk 1 og blokkere 2.
  3. Å legge til parameteren optimalisering simulering
    Merk: Ved hjelp av parameteren optimalisering diffusjon koeffisient kan monteres tidligere genererte eksperimentelle data. Følgende instruksjoner viser hvordan å integrere delen optimalisering i diffusjon simuleringen. Kontroller diffusjon simuleringen fungerer før du starter denne fremgangsmåten.
    1. Legge til fysikk-modulen "Optimalisering" bruker "Legge Physic" (optimalisering kan bli funnet i "Matematikk" i kategorien "Optimalisering og sensitivitet") til simuleringen. Klikk på "Legg til komponenten".
    2. Legge til "Variabler" med Høyreklikk under "Definitions" (lokalt i komponenten) og skriv inn variablene fra tabell 3.
      Merk: Parameteren optimalisering bruker reelle tall, dvs, faktor 1-10 av diffusjon koeffisient må defineres separat.
    3. Legge til "Gjennomsnittlig 1" med høyre klikk på "Definitions" i delen "Component kopling" og type i operatør navnet "Acceptor".
    4. Generere et eget tekstdokument med eksperimentelle data.
      Merk: Et semikolon skiller kolonner; et linjeskift skiller rader. Tid erklæring måles i sekunder, konsentrasjon i mol/m3. Fjern først og andre datapunktet i lag fase (se figur 2) av eksperimenter for å unngå mulig montering feil. Her er et eksempel hvordan tekstdokumentet kan se ut:
      3540;      0.00216
      7140;      0.00724
      12240;    0.01707
      15180;    0.02230
      18660;    0.02697
      21540;    0.02931
      I dette eksemplet kan brukes til å teste simuleringen.
    5. Legge til "Global minste kvadrater mål" med høyre klikk på "Optimalisering", legge til tekstdokumentet fra trinn 3.3.4 "eksperimentelle data" og definere den første kolonnen som "klokkeslett-kolonne 1" høyre klikk på "Global minste kvadrater mål" og den andre kolonnen som "Verdi kolonne 1" med Høyreklikk på "Global minste kvadrater mål". I "uttrykk" for "Verdi-kolonnen" Skriv inn variabelen "C".
    6. Legge til "Global kontroll variabler 1" med rett falle i staver opp på "Optimalisering" og erklærer "D_search" som en variabel med den opprinnelige verdien "1", nedre grense "0" og øvre grense "1000".
    7. Legge til "Optimalisering" med høyre klikk på "Studere 1" og velger "SNOPT" som en optimalisering Problemløseren metode. Angi optimality toleransen til 1E-9.
      Merk: Hvis simulering ikke konvergerer, øke optimality toleranse. Husk på at simuleringen er unøyaktig hvis optimality toleranse er for stor.
    8. Start parameteren optimalisering med "Beregn" i "studier". Ikke glem å sette diffusjon koeffisient på barrieren som "D".

Representative Results

Permeabilitet eksperimenter i en 96-brønns membran sette systemet med 2% agarose gel som en barriere ble gjennomført for å vurdere nøyaktigheten av en simulering. Fluorescein natrium salt (NaFl) og fluorescein isothiocyanate-dextranes (FD) ble brukt til å kontrollere virkningen av molekylære spre stoffet fra 5 x 10-10 m opp til 45 x 10-10 m Stokes radius (376.27-40,000 mol wt). Simuleringens native parameteren optimalisering ble brukt til å passe simuleringen til eksperimentelle data.

Derfor, var av bare lineær delene av simulert permeabilitet sammenlignet med eksperimentelle resultatene. For små molekylære størrelse var simulering og eksperimentelle data i god avtale med 99,2% for NaFl og 80.2% for FD 4000 (se figur 4a og figur 4b). Større molekylær størrelse generert høyere avvik viser sammenhenger 50,5% for FD 10.000, 79.7% for FD 20.000 og 53.6% for FD 40.000. Kurven progresjon i simuleringene viste en forsinkelse i begynnelsen og en sterkere økning i videre løpet av grafene (se Figur 4 c-4e).

Permeabilitet koeffisienter og simulert diffusjon koeffisienter vises i Tabell 4. Den gjennomtrengning koeffisienten avtar med økende molekylær størrelse. Standardavvik var mellom 0,08 x 10-8 m/s og 0.47 x 10-8 m/s (N = 7), som tilsvarte en absolutt feil mellom 4.18% og 46.15%. Med større molekyler viste en større absolutt feil. Simulert diffusjon koeffisientene oppførte seg veldig likt til eksperimentelle permeabilitet koeffisienter. Stoffer med større Stokes radier viste avtagende diffusjon koeffisienter og absolutt feilen varierte mellom 9.09 og 18.46% (N = 3).

Ekstra gjennomtrengning eksperimenter, ble fire forskjellige kollagen celletyper modell brukt som barrierer i en 12-vel membran sette systemet. Disse modellene utgjør en celle-gratis modell og en celle modell med forskjellige kombinasjoner av primære fibroblaster i kollagen gel og HaCaT på overflaten. Følgende kombinasjoner ble brukt: kollagen (Kol) som cellen-gratis modell, kollagen + fibroblaster (oberst + F.), kollagen + HaCaT (oberst + H.), og kollagen ++ fibroblaster HaCaT (oberst + F. + H.). Fluorescein natrium salt med DMEM + 10% FCS ble brukt som donor stoff. For ble analyse av kollagen celle modell, flekker med hematoxylin og eosin (han) brukes. Denne flekker ble gjort med produsentens protokollen. Figur 5vises slik en flekk med en representant oberst + F. + H. modell. Han flekker litt vev strukturen av kollagen matrix. Fibroblaster ligger i matrisen, og kjerner i de fibroblast og HaCaT er farget mørk fiolett. På toppen av kollagen matrise er det et lag som inneholder mange kjerner, som bør være kjerner i HaCaTs, bygge en omsluttende lag på toppen av modellen.

I tabell 5, er eksperimentelle gjennomtrengning koeffisienter og simulert diffusjon koeffisienter oppført. En trend kan sees for de fleste modellene med HaCaT, som har lavere gjennomtrengning/diffusjon koeffisientene i forhold til modellene uten HaCaT. Absolutt feil gjennomtrengning koeffisientene er 10.9-24,4%, og for diffusion koeffisienter 5,2% - 12,9%.

Figure 1
Figur 1: sidevisning av permeabilitet eksperimentet i en membran sette systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksemplarisk grafen til en permeabilitet eksperiment. Konsentrasjonen av acceptor tegnes over tid. To stiplede linjer braketten den nesten lineære delen av grafen. Stigningstallet for den lineære delen brukes til å bestemme permeabilitet koeffisient. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: geometri og mesh av membranen setter systemet i simuleringen. (en) geometrien i 96-brønnen membranen sett inn system. (b) geometri av 12-vel membranen sett inn system. (c) Mesh av 96-brønns membranen sett inn system. (d) Mesh av 12-vel membranen sett inn system. (e) tverrsnitt og parametere av membranen sette systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: sammenligning av eksperimentelle data fra en gjennomtrengning eksperiment å optimalisert simuleringen. (en) fluorescein natrium salt, (b) fluorescein isothiocyanate-dekstran 4000 mol wt., (c) 10,000 mol wt., (d) 20.000 mol wt. og (e) 40.000 mol wt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant HE farging av kollagen celle modell (kollagen + fibroblaster + HaCaT). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: permeabilitet koeffisient som en funksjon av 1/Stokes radius bruker fluorescein natrium salt og fluorescein isothiocyanate-dekstran i en 96-brønns membran sette systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

navn Experession 96 godt systemet i mm Experssion 12-brønnen systemet i mm Beskrivelse
d_tran 5.65 [mm] 14.7 [mm] Diameter av brønnen
d_a 4.26 [mm] 12.1 [mm] Diameter av membranen
d_w 8.79 [mm] 21.97 [mm] Diameteren på Acceptor
h_b 2 [mm] 2 [mm] Hau av barrieren
h_sp 1 [mm] 1 [mm] Avstand mellom godt og bunn
h_a 4.73 [mm] 5,24 [mm] På Acceptor
b h_b/2 - Nedsenking dybde
r ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) - Radius av nedsenking ballen+
r_z r + h_b - z-posisjonen til nedsenking ballen+

Tabell 1: geometri parametere for simulering av "Kjemiske arter Transport". + Bare skal brukes til simulering av agarose gel i 96 godt membran inn systemet.

navn Uttrykk Verdi Beskrivelse
C_fl 0,1 [mg/ml]/376.28 [g/mol] 0.26576 mol/m2 Konsentrasjon av Fl.So.
C_4 2 [mg/ml] / 4000 [g/mol] 0,5 mol/m2 Konsentrasjonen av FD 4.000
C_10 2 [mg/ml] / 10000 [g/mol] 0,2 mol/m2 Konsentrasjonen av FD 10.000
C_20 2 [mg/ml] / 20000 [g/mol] 0.1 mol/m2 Konsentrasjonen av FD 20.000
C_40 2 [mg/ml] / 40000 [g/mol] 0,05 mol/m2 Konsentrasjonen av FD 40.000
Dif_w 1e-9 [m ^ 2/s] 1e - 9m2/s Diffusjon koeffisient blande vann

Tabell 2: Fysiske parametere for simulering av "Kjemiske arter Transport".

navn Uttrykk Beskrivelse
C Acceptor(c) Definisjon av acceptor konsentrasjonen
D D_search * 1e-10 Faktor endring for D

Tabell 3: Parametere for "Optimalisering" simulering.

Gjennomsyre Permeabilitet koeffisient (m/s) x 10-8 Diffusjon koeffisient (m/s2) x 10-10 Stokes radius av permeate (m) x 10-10
Fl.So. 4.79 ± 0,20 1,94 ± 0,34 5
FD 4000 2.37 ± 0.31 0,65 ± 0,12 14
FD10, 000 1,67 ± 0.47 0.22 ± 0,02 23
FD 20.000 0,65 ± 0,30 0.29 ± 0,04 33
FD 40.000 0,27 ± 0,08 0,14 ± 0,02 45

Tabell 4: permeabilitet og diffusion koeffisient av stoffer med forskjellige Stokes radius via 2% Agarose gel + membranen i en 96-brønns membran sette systemet. (fluorescein natrium salt = Fl. So., fitc dekstran = FD).

Modell Permeabilitet koeffisient (m/s) x 10-8 Diffusjon koeffisient (m/s2) x 10-10
Oberst 2,18 ± 0.29 1,22 ± 0,06
Oberst + F. 1,77 ± 0,38 0.93 ± 0,12
Oberst + H. 1.64 ± 0.40 0.96 ± 0,05
Oberst + F. + H. 1.65 ± 0,18 0,88 ± 0,11

Tabell 5: permeabilitet og diffusion koeffisienten fluorescein natrium salt gjennom en kollagen celle modell i en 12-bra membran sette systemet (oberst = kollagen, F. = Fibroblast, H. = HaCaT).

Discussion

Denne studien dokumenter en metode utviklet for å kvantifisere gjennomtrengning gjennom en vev-konstruere konstruert på en membran. Gjennomtrengning av stoffer med varierende molekylær størrelser gjennom agarose gel ble først undersøkt for å teste og validere metoden og tilhørende simuleringen. Det er velkjent at mindre molekyler gjennomsyre raskere gjennom en matrix-maske (med unntak av effekten i gel filtrering av permeabilitet kromatografi). Lignende observasjoner ble gjort med størrelse-utestenging eksperimenter stoffer gjennom sclera26, menneskelige epidermal membran27, menneskelig hud17og rotten huden28. En invers korrelasjon mellom permeabilitet koeffisienter og tilsvarende Stokes radius (radius av en hard kule som flytter med samme spredningen rate som molekyler beskrevet, vanligvis mindre enn effektiv radius av molekylet) har vist 26 , 28, og en tilsvarende forholdet ble observert i eksperimenter med stoffer i ulike molekylær størrelser. En lineær sammenheng over fire grupper med den minste molekylær størrelsen funnet ved å plotte permeabilitet koeffisientene over 1/Stokes radius, (R2 = 0.93) (figur 6). Dette angir at simulert permeabilitet koeffisienter med metoden foreslått i en realistisk området.

Feil på 46.15% i forsøkene er litt større enn rapportert permeabilitet eksperimenter med Franz diffusjon cellen systemet10. En mulig forklaring kan være størrelsesDistribusjon av fluorescein-isothiocyanate-dekstran, som er omtalt senere.

Metoden beskrevet har viktige fordeler sammenlignet med ved hjelp av Franz diffusjon cellen systemet. For det første er oppsettet mer kompakt; eksperimenter utføres direkte i en membran sett inn system, hvilke har omfanget av en kommersiell godt plate (∼ 13 cm x 8,5 cm). Dette gjør at flere prøver å bli løpe samtidig, mens en egen Franz diffusjon celle er nødvendig for hvert utvalg. Dernest kan permeabilitet av huden modell direkte måles i membranen innsatsen, hvor dyrking finner sted. Bruke Franz diffusjon celler, har prøvene tatt ut og montert på systemet, som er mer tungvint for små og er også mer tidkrevende.

Gjennomtrengning eksperimenter med kollagen celle matriser viste at denne metoden kan brukes med hell til celle-seeded systemer. Modellen presentert her ble bekreftet for huden modeller; metoden kan imidlertid brukes på andre typer organisk cellekulturer, f.eks, nyre eller lever.

I denne studien kollagen-celle modell ble brukt som HaCaT cellene helt dekket modelloverflaten (se figur 5). Dette ført til en reduksjon av permeabilitet koeffisienten, demonstrere at metoden er sensitive nok til å skille permeabilitet koeffisient mellom kollagen-celle modell med og uten en HaCaT. Ideelt sett huden modell skal bygge opp en barriere, som nærmer seg epidermis, en ekte huden29, og det er derfor viktig å kontrollere kvaliteten (f.eks, bygging av dermis, overhuden) på huden modellen før faktisk bruk. Utviklingen av en hud-modell kan visualisere med flekker teknikker og kvantifisert fra påvisning av huden protein og collagen30,31,32. Den permeabilitet koeffisienten kan også være en viktig faktor for å vurdere utviklingen av huden modellen, men ytterligere eksperimenter kreves for å bekrefte dette. Som tidligere nevnt kan denne metoden kjører flere eksempler parallelt. Det er også mulig å ta prøver under dyrking å måle permeabilitet, og dermed observere utviklingen av denne parameteren av huden modellen.

Det bør bemerkes at permeabilitet måles gjennom en gel/kollagen-celle-modell og en membran samtidig. Oppdaget permeabilitet koeffisient er system-spesifikk, der resultatene av ulike huden modeller kan bare sammenlignes ved samme membran innsatsen. Videre må hud modellen dekke hele dyrking området for å sikre at testen stoffet vil gjennomsyre gjennom modellen og ikke tilstøtende, som ville forårsake feil i permeabilitet målt. Et annet aspekt som bør vurderes i fremtiden eksperimenter er naturmiljøet rundt huden. Normalt er temperaturen på hudoverflaten lavere i forhold til indre regionen, som kan påvirke gjennomtrengning forhold.

For å justere lab eksperimenter med datasimuleringer, ble en metode som gjør at parameteren optimalisering for anvendt simulering presentert. Simuleringer fant sammenfaller også med eksperimentelle data for stoffer med liten molekylær størrelse. Imidlertid ble avvik mellom simulering og eksperimentelle data observert for stoffer med større molekylær størrelser. Store polysakkarid molekyler kan øke friksjon og tregere diffusjon prosessen i en gel. Dette forårsaker unormale diffusjon, som er en mulig årsak til avviket mellom eksperimentelle og simulering verdier33,34. En annen forklaring kan være tilstedeværelsen av mindre eller større partikler i fluorescein-isothiocyanate-dekstran. Produsenten angir molekylvekt av stoffet som betyr størrelsen med et gitt område, som gir mindre og større partikler til stede. Det er også uklart hvor spredt disse stoffene er, som mindre partikler gjennomsyre raskere gjennom gel og væske kanalen. Er det mulig å utvide simuleringen å vurdere disse diffusjon og friksjon effekter.

Den permeabilitet eksperiment og simulering ble utviklet for bruk i en 2-OC. Med hjelp av simuleringen, kan denne eksperimentell metode direkte overføres til mer avanserte eksperimentelle oppsett. Membran sett inn systemet simuleringen kan for eksempel enkelt overføres geometrien for en 2-OC eller andre systemer med lignende oppsett. Dette alternativet av modulerende simuleringen kan brukes til støtte for utformingen av senere eksperimenter. I tillegg kan bivirkninger som fordampning, unormal diffusjon og membran effekter integreres bedre simulering, og dermed bedre nøyaktighet. Simulering programmet gir muligheten til å endre eller forbedre simulering ligningen, samt for å integrere andre fysiske moduler for å undersøke andre aspekter av skin modellen utvikling. Et eksempel er simulering av glukose forbruk og laktat produksjon i kollagen celle modell.

En spesielt interessant aspekt i testing av medisinske stoffer er hvordan stoffer er fordelt i et organ-on-a-chip system. Parameteren simulering og permeabilitet min hjelp å besvare spørsmål som hvor raskt et stoff som gjennomsyrer i systemet og som konsentrasjon vil være tilgjengelig for andre vev i en multi-organ-chip. Denne metoden kan støtte og styrke utvikling og testing av slike orgel-on-chip-systemer.

Disclosures

Gerd Lindner er aksjonær TissUse GmbH, et selskap produksjon og kommersialisere MOC teknologien Uwe Marx er konsernsjef og aksjonær. Andre forfattere erklærer ingen interessekonflikt om utgivelsen av dette dokumentet.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble opprettet med økonomisk støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under grant. PO413/12-1 og LA 1028/7-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Carl Roth K297.2 High Resolution Powder
Collagen Serva 47256.01 Collagen R solution 0.4 %
DMEM Lonza (Biozym Scientific GmbH) 880010-12 High Glucose with L-Glutamine
FCS Biochrom GmbH S0615 0114F Fetal Calf Serum
Fluorescein Sodium Salt Sigma-Aldrich 46960-25G-F
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 46944-500MG 4000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD10S-250MG 10 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD20S-250MG 20 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD40S-250MG 40 000 g/mol
HBSS ThermoFisher Scientific 14170120 no calcium, no magnesium , with phenol red
NaOH Merck 1.06467.9010 granulated
PBS Gibco 18912-014 tablets
Transwell Cell Culture Inserts Corning 3391 96 well, 0.4 µm pore size
Transwell Cell Culture Inserts Corning (VWR) 734-1563 12 well, 0.4 µm pore size
Trypsin Biochrom GmbH L2143 with EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
  23. Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
  26. Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

Tags

Bioteknologi problemet 132 hud modell permeabilitet diffusjon membran sett inn system simulering fluorescein isothiocyanate-dekstran fluorescein natrium salt
En metode for fastsettelse og simulering av permeabilitet og spredning i en 3D vev modell i en membran setter systemet for flere bra plater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsu, H. H., Kracht, J. K., Harder,… More

Hsu, H. H., Kracht, J. K., Harder, L. E., Rudnik, K., Lindner, G., Schimek, K., Marx, U., Pörtner, R. A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates. J. Vis. Exp. (132), e56412, doi:10.3791/56412 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter