Summary
En metod för bestämning av permeabilitet i ett membran infoga system för plattor med flera och i silico parametern optimering för beräkning av Diffusionskoefficienterna med hjälp av simulering presenteras.
Abstract
In vitro odlade hud modeller har blivit alltmer relevant för farmaceutiska och kosmetiska applikationer, och används också i läkemedelsutveckling samt ämnet tester. Dessa modeller är mestadels odlas i membran-infoga system, deras permeabilitet mot olika ämnen är en viktig faktor. Vanligtvis, tillämpade metoder för bestämning av dessa parametrar kräver oftast stora urvalsstorlekar (t.ex., Franz diffusion cell) eller mödosamma utrustning (t.ex., fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP)). Denna studie presenterar en metod för bestämning av permeabilitet koefficienter direkt i membran-infoga system med diameter storlekar 4,26 mm och 12,2 mm (odlingområde). Metoden validerades med agarosgelelektrofores och kollagen geler samt en kollagen cell modell som representerar hud modeller. Permeation processerna för ämnen med olika molekylära storlekar och genomträngning genom annan cellmodeller (bestående av kollagen gel och fibroblast HaCaT) var korrekt beskrivna.
Dessutom stöd för ovanstående experimentell metod, var en simulering etablerad. Simuleringen passar experimentella data för ämnen med liten molekylstorlek, upp till 14 x 10-10 m Stokes radie (4 000 MW), och är därför ett lovande verktyg för att beskriva systemet. Dessutom simuleringen kan avsevärt minska experimentella insatserna och är tillräckligt robust för att fördjupa eller anpassade till komplexare uppställningar.
Introduction
Organo-typiska 3D kulturer har blivit kraftfulla verktyg för läkemedelsutveckling och ämne test1. I detta avseende är mänsklig hud modeller av särskilt intresse på grund av myndighetskrav, till exempel i kosmetikaindustrin. De har därefter lett till utvecklingen av många 3D hud modeller, för användning antingen på sina egna som singel-orgel kulturer i plattor med flera eller multi-organ-chips i kombination med ytterligare orgel modeller, t.ex., levern2.
När det gäller odling av en hud motsvarande är luft-vätska gränssnittet (ALI) avgörande för korrekt epidermal differentiering3. Cell kultur skär består av ett kärl med en vätska-permeable membranet längst vanligtvis används för att upprätta en ALI. ALIs är allmänt utnyttjas i kommersiellt tillgängliga hud modeller såsom EpiDerm4, Phenion5och Episkin6, för kulturen i huden modeller med storlekar från 96 brunnar (4,26 mm i diameter) upp till 12-brunn (12,2 mm i diameter) plattor. Den metod som beskrivs här bestämmer genomträngning av ämnen i ett membran infoga system.
Permeabilitetskoefficienten är en viktig parameter för att utvärdera kvaliteten på alla odlade hud-modellen jämfört med infödda hud5, och används för att bedöma hur snabbt verksamma ämnen vandrar genom huden. Särskilt om läkemedel eller kosmetika produkter behöver appliceras på huden, är denna parameter viktigt att förstå när just de aktiva agenterna passera genom den. En simulering kan ytterligare bidra till att förutsäga beteendet hos systemet och därefter minska det krävs tidskrävande experimentella arbetet, särskilt när ett stort antal ämnen är involverat.
Franz diffusion cellen är state-of-the-art för genomträngning experiment med hud och hud modeller5,6,7,8,9. Denna enhet består av två fack med ett fast prov (diffusionsspärr) mellan. Ämnen som testas appliceras direkt på toppen av provet (givare fack) och koncentrationen av permeating föreningen kan upptäckas på motsatta (acceptor) fack. På acceptor sida säkerställs konstant temperatur och homogen koncentration genom en temperatur-kammare och en magnetisk omrörare. Prover kan tas från en provtagning arm på acceptor sida av cellen Franz. Med en höjd varierar mellan 19 cm och 179 cm är detta system relativt stora10,11. En annan metod för bestämning av Diffusionskoefficienterna i gel-liknande ämnen och vävnader är FRAP. Denna teknik använder principen om blekning fluorescently märkt partiklar i gelen och sedan bestämma tiden för återhämtning av blekt området för att beräkna diffusion koefficient12,13,14.
Fourier-transform-infraröd (FTIR) spektroskopi kan dessutom användas för att upptäcka partikel rörelse med infraröd ljusabsorbans för att fastställa permeation processen av ämnen i huden15,16. Dock behöver dessa eller andra avbildningsmetoder (t.ex., två-photon fluorescens korrelation spektroskopi17) kosta intensiv instrument.
I denna artikel presenteras en metod att direkt mäta genomträngligheten av en barriär i ett membran infoga system, där en hud modell kan odlas. Denna metod gör permeabilitet experiment ska köras med ett stort antal små prover (väl storlek upp till 4,26 mm) i ett kompakt system. Detta är i motsats till Franz diffusion cellen, där en separat enhet behövs för varje sond, som måste monteras på enheten och är svårt att inse för små prover (storleken på 4,26 mm). Eftersom metoden inte kräver stora instrumentering (t.ex., en confocal eller multiphoton Mikroskop), uppnås dessutom en minskning av både tid och kostnader.
Alla experimenten utfördes i mikroporös membran infoga system med ett prov (barriär) bestående av agarosgel eller en kollagen cell modell etablerade på membranet. Fluorescerande ämnen (givare) med varierande molekylära storlekar tillämpades till toppen av provet, och koncentrationen av genomsyras ämnet upptäcktes på botten (acceptor) använder en Plattläsare med fluorescens (se figur 1). För att validera metoden och testa riktigheten i denna simulering, agaros gel producerades och använde som en barriär. Hydrogeler används oftast för utredning av diffusion och permeation processer i poröst medium i biologiska vetenskaper13. Metoden testades sedan i en cell-seedade system bestående av en kollagen matris av primära fibroblaster och mänskliga vuxen låg kalcium hög temperatur keratinocyter (HaCaT) celler (cell-matrix modell), som är en förenklad hud modell18,19 .
Dessutom var permeation processen simuleras med hjälp av flödet simuleringar med computational fluid dynamics. Det konstaterades att den diffusionskoefficienten med hjälp av parametern optimering, kunde beräknas från experimentella data. I allmänhet erbjuder denna simulering olika applikationer; exempelvis är det möjligt att förutsäga en genomträngning process baserat på kort experiment och simulering kan avsevärt minska antalet experiment.
Experimentell metod och simulering var avsedd för applicering på en organ-på-ett-chip system1,20,21, specifikt 2-orgel-chip (2-OC) utvecklat kommersiellt1,22, 23,24,25. I princip kan genomträngning processen någon orgel modell baserat på Infoga membransystem beskrivas på detta sätt.
Protocol
1. förbereda provet för permeabilitet studier
Obs: För att kontrollera permeation mätningar och simuleringar, användes ett prov bestående av agarosgel eller en cell matris modell baserad på odling av hud modell.
- Agarosgel
- Lös upp 0,2 g agaros högupplösta pulver i 10 mL H2O (dubbeldestillerat vatten).
- Blanda lösningen och Värm upp till 80 ° C. Hålla temperaturen i 8 min.
- Använda 28,6 µL agarosgel på membranet i 96 brunnar membran infoga systemet (4,26 mm i diameter) eller Använd 226 µL för 12 väl membranet infoga system (12 mm i diameter) (t.ex., Transwell system).
- Vänta 10 min tills gelen är stelnat.
- Kollagen gel
Obs: Alla steg utförs under sterila förhållanden och lösningarna som hålls på is att bromsa polymerisation av kollagen gelen.- Mix 125 µL av Hanks balanserad Salt lösning (HBSS) med 1 mL 0,4% kollagen R lösning (rat tail kollagen).
- Titrera lösningen med 1 M NaOH (natriumhydroxid) (~ 6 µL) tills färgen på fenolrött ändras från gul till röd.
- Tillsätt 125 µL Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) + 10% fetalt kalvserum (FCS) i kollagen gelen och blanda försiktigt med en pipettspetsen.
- Tillsätt 28,6 µL av kollagen gel till membranet i 96 brunnar membran infoga systemet eller 226 µL för 12-väl membranet infoga system.
- Låt gelen i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min.
- Kollagen cell modell med fibroblast
Obs: Alla steg utförs under sterila förhållanden.- Förbereda primära fibroblaster 5-7 dagar innan experimentet. Odla fibroblaster med DMEM + 10% FCS i cell kultur kolvar (75 cm2) och ändra mediet varje 2-3 dagar.
Obs: Beroende på experimentella inställningarna, ett större antal celler kan användas. - Ta bort mediet från cell kultur kolven (80% konfluenta) och tvätta två gånger med 10 mL (kultur kolv 75 cm2) fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Tillsätt 3 mL 0,05% Trypsin / etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och Inkubera under 3 minuter vid 37 ° C.
- Tryck försiktigt på kolven så kultur att lossa cellerna från ytan. Stoppa reaktionen genom att tillföra 3 mL DMEM + 10% FCS. Över lösningen i ett centrifugrör.
- Centrifugera cellsuspension vid 120 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 0,5 mL av DMEM + 10% FCS.
- Räkna cellerna och justera till en koncentration av 0,5 x 106 celler/mL.
Obs: Följande steg utförs på is att bromsa polymerisation av kollagen gelen. - Mix 125 µL HBSS med 1 mL 0,4% kollagen R lösning.
- Titrera lösningen med 1 M NaOH (~ 6 µL) tills färgen på fenolrött ändras från gul till röd.
- Tillsätt 125 µL cellsuspension (DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 celler/mL) i kollagen gel och blanda försiktigt med en pipett.
- Att använda 28,6 µL av kollagen gel på membranet i 96 brunnar membran infoga systemet eller 226 µL för 12-väl membranet infoga system.
- Låt gelen i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min.
- Applicera 75 µL av DMEM + 10% FCS på gel ytan och 300 µL till mottagaren plattan med 96 brunnar membranet sätt system. För 12-väl membranet infoga systemet, använda en volym av 590 µL för den ytan och 1 846 µL för mottagaren plattan.
- Ta bort mediet från ytan av cellen matris modell (luftpumpen) och inkubera cellen matris modellen ytterligare i 7 dagar. Använd 100 μl medium på botten och ändra mediet varje dag.
- Förbereda primära fibroblaster 5-7 dagar innan experimentet. Odla fibroblaster med DMEM + 10% FCS i cell kultur kolvar (75 cm2) och ändra mediet varje 2-3 dagar.
- Kollagen cell modell med HaCaT
Obs: Alla steg utförs under sterila förhållanden.- Förbereda HaCaT 5-7 dagar innan följande steg. Odla HaCaT med DMEM + 5% FCS i en cell kultur kolv (75 mm2) och ändra mediet varje 2-3 dagar.
Obs: Beroende på experimentella inställningarna, ett större antal celler kan användas. - Ta bort mediet från kolven och tvätta två gånger med 10 mL (kultur kolv 75 cm2) PBS. Tillsätt 3 mL 0,05% Trypsin/EDTA och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C. Stoppa reaktionen med 3 mL DMEM + 10% FCS. Över lösningen i ett centrifugrör.
- Centrifugera cellsuspension vid 120 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 0,5 mL av DMEM + 10% FCS.
- Räkna cellerna och justera till en koncentration av 0,5 x 106 celler/mL.
Obs: Följande steg utförs på is att bromsa polymerisation av kollagen gelen. - Mix 125 µL HBSS med 1 mL 0,4% kollagen R lösning.
- Titrera lösningen med 1 M NaOH (~ 6 µL) tills färgen på fenolrött ändras från gul till röd.
- Tillsätt 125 µL DMEM + 10% FCS i kollagen gelen och blanda försiktigt med en pipett.
- Att använda 28,6 µL cellsuspension på membranet i 96 brunnar membran infoga systemet eller 226 µL för 12-väl membranet infoga system.
- Låt gelen i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min.
- Applicera 75 µL cellsuspension till gel ytan och lägga till 300 µL av DMEM + 10% FCS till mottagaren plattan med 96 brunnar membranet infoga system. För 12-väl membranet infoga systemet, använda en volym av 590 µL cellsuspension för den ytan och 1 846 µL av DMEM + 10% FCS för mottagaren plattan.
- Inkubera cellen matris modellen i 3 dagar. Exchange medium efter 2 dagar.
- Ta bort mediet från ytan av cellen matris modellen och inkubera cellen matris modell för ytterligare 7 dag. Använd 100 µl medium på botten och ändra mediet varje dag.
- Förbereda HaCaT 5-7 dagar innan följande steg. Odla HaCaT med DMEM + 5% FCS i en cell kultur kolv (75 mm2) och ändra mediet varje 2-3 dagar.
- Kollagen cell modell med fibroblaster och HaCaT
Obs: Alla steg utförs under sterila förhållanden på is att bromsa polymerisation av kollagen gelen. Förbereda fibroblaster som beskrivs i steg 1.3 tills steg 1.3.5, och förbereda en dag senare HaCaT som beskrivs i steg 1.4 tills steg 1.4.4.- Mix 125 µL HBSS i 1 mL 0,4% kollagen R lösning.
- Neutralisera lösningen med 1 M NaOH (~ 6 µL) tills färgen på fenolrött ändras från gul till en röd violett.
- Tillsätt 125 µL av primära fibroblast cellsuspension bestående av DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 celler/mL till kollagen gel och blanda försiktigt.
- Tillämpa 28,6 µL cellsuspension på membranet i 96 brunnar membran infoga systemet eller 226 µL för 12-väl membranet infoga system.
- Låt gelen i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 30 min.
- Därefter gäller 75 µL av DMEM + 10% FCS på gel ytan och 300 µL vidare till mottagaren plattan med 96 brunnar membranet infoga system. För 12-väl membranet infoga system, en volym av 590 µL används för den ytan och 1 846 µL för mottagaren plattan.
- Inkubera i 1 dag vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ta bort mediet från ytan och Lägg en HaCaT cellsuspension med 0,5 x 106 celler/mL. Volymen är på samma sätt som innan under steg 1.5.6.
- Inkubera cellen matris modellen i 3 dagar. Exchange medium efter 2 dagar.
- Ta bort mediet från ytan av cellen matris modellen och inkubera cellen matris modell för ytterligare 7 dag. Använd 100 µl medium på botten och ändra mediet varje dag.
Obs: För denna undersökning, 3 gel/cell-modell prover var förberedda för 12-väl membran infoga systemet. För 96 brunnar membranet infoga system, vi använde 6 prover för gel/cell modell. För statistiska medelvärden är 3 prover vanliga. Men för experiment i 96 brunnar membran infoga systemet med kollagen matris modell vi förväntade fel och avvikelser för cellkulturen. Därför valde vi ett större antal prover.
2. permeabilitet studier i membranet infoga System
-
Givare ämne
Obs: Två fluorescein natriumsalter (NaFl) produceras.- Lös NaFl i H2O vid en koncentration på 0,1 mg/mL och 0,01 mg/mL. De olika fluorescein isotiocyanat-dextranes (FD) med en molekylvikt av 4 000, 10 000, 20 000 och 40 000 g/mol löses i H2O vid en koncentration på 2 mg/mL. Använda dessa lösningar som givare ämne för permeabilitet experiment (se figur 1) med agarosgel.
- För installation med kollagen cell modell, förbereda alla lösningar med DMEM + 10% FCS istället för vatten.
Obs: Förbereda stamlösningar (10 x högre koncentration) ämnets givare. Små variationer av givare koncentrationen kan påverka resultaten av permeabilitet experimentet.
-
Experimentell metod
Obs: Permeabilitet experimentet utförs vid 37 ° C och en luftfuktighet på > 90%. Den här parametern säkerställer lönsamheten för cellerna. Temperaturen påverkar diffusion processen så samma parametrar används för experiment med agarosgel, kollagen gel och kollagen cell modell. Informationen om volymstorlek i fästet avser 12-väl membran infoga systemet.- Förbereda en 96 - (eller 12-) väl membran infoga system med en barriär bestående av agaros gel (se protokollet 1.1) eller cell modell (se protokollet 1.2-1.5) och fluorescens givare ämnet.
- Preparera utspädningar av 1:10, 1:20, 1:40, 1: 80, 1:160 och 1:320 ämnets givare för att upprätta en standardkurva. Pipettera 300 µL (1 846 µL) av varje utspädning i tre brunnar av mottagaren plattan. För 12-väl membranet infoga system använda en separat mottagare tallrik. De seriella utspädningarna används för att omvandla uppmätta fluorescensen [RFU] till motsvarande koncentration [mg/mL].
- Lägga till 75 µL (590 µL) av givare ämne ovanpå provet (agaros gel eller cellen modell) och 300 µL (1 846 µL) av acceptor ämne (H2O eller DMEM + 10% FCS) i mottagaren plattan (se figur 1).
Observera: Kontrollera att ytorna på vätskan i membran infoga system och i mottagaren plattan har samma nivå att undvika hydrostatiska trycket. - Överför hela systemet på en shaker i inkubatorn. Justera skakar för att uppnå homogen blandning (totala stroke omloppsbana är 1,5 mm, hastighet justeras på nivå 3.5, vilket är relaterat till en rotation av ~ 480 1/min) att undvika en koncentration gradient, vilket påverkar diffusionsprocess.
- Bestämma fluorescens regelbundet varje timme. Att mäta fluorescensen, överföra membran infoga systemet in i en tom platta och mäta fluorescensen inom mottagaren med en spektrofotometer. Använda en magnetisering våglängd 485 nm och utsläpp av 535 nm för fluorescein.
- Köra experimentet i 5 h.
Obs: Under experimenten, vätskan avdunstar från hela systemet. Avdunstningen ändrar koncentrationen i givaren och acceptor och påverkar resultaten. Denna effekt är försummad när det gäller en rinnande tid av 5 h, men för längre rinnande tider bör det övervägas.
-
Beräkning av permeabilitetskoefficienten
- Att upprätta standardkurvan, rita fluorescensen de seriella utspädningar kontra koncentration och utföra en linjär regression över data.
- Använd lutningen av en linjär regressionslinje konvertera fluorescens data av permeation experimentet till koncentration. I syfte att simuleringen, konvertera enheter i mol/m3.
- Rita koncentrationen som en funktion över tid och etablera den linjära segmentet av data (se figur 2).
- Bestäm lutningen på denna linjära del och beräkna permeabilitetskoefficienten enligt följande ekvation (se exempel i figur 2):
där dcA/ dt är ändringen av koncentrationen av ämnet i den acceptor sidan över tid (lutningen); CD är koncentrationen på givarens sida; P är permeabilitetskoefficienten; A är permeation ytan, och VA är volymen av acceptorn. Denna ekvation härleds från ficks första lag och kan endast tillämpas när CD » CA6,22. - Obs: Koncentrationerna i givaren måste vara mycket högre än den koncentration som upptäckts i acceptorn. Detta verifierades i experimentell setup.
3. simulering
Obs: Simuleringen var klar med COMSOL Multiphysics 5.1. En grundläggande kunskap om detta antas. För diffusion simulering, görs följande antaganden: (a) diffusion koefficient substanser i H2O är mycket högre i jämförelse med som i gelen. För att kompensera för denna skillnad, används simuleringen ett värde på 1 x 10-9 m2/s vilket är högre med en faktor på 10-100 jämfört med diffusion koefficient av NaFl genom 2% agarosgel. (b) i experimentet, ämnet diffunderar genom barriären och infoga sedan systemet genom membranet av membranet. I motsats till den experimentella setup anses virtuella agaros gel eller cell matrisen och membran vara en homogen fas. (c) gräns effekter på väggar är inställd på ”ingen slip”, alla glider effekt på väggar (inte mellan vätska och gel eller flytande och cell modell) av membran infoga systemet försummas och inte är betydande för diffusion processen.
- Inställning av diffusion simuleringen
Obs: Dessa steg visar inställningarna för simulering av permeabilitet experimentet. Simuleringarna för 96 - och 12-väl membran infoga system sattes upp separat. ”Kemiska arter Transport” modulen använder en ekvation baserat på ficks andra lag av diffusion:
där c är koncentrationen av ämnet, t är tid, u är hastigheten, D är den diffusionskoefficienten och R är reaktionshastigheten. Reaktionshastigheten försummades eftersom ingen kemisk reaktion inträffade i processen diffusion.- Öppna programmet och starta en ny modell. Valde ”guiden modell”, Välj 3D modell, lägga till ”Transport av utspädd arter” till fysik gränssnitt i den nedrullningsbara menyn, klicka på ”studie”, Välj ”tid beroende” studien och klicka på ”klar”.
- Gå till den ”globala definitioner” och ”parametrar” med högerklick. Ange de geometriska och fysiska parametrarna i rutnätet (se tabell 1, tabell 2och figur 3e).
Obs: Den konkava ytan av agarosgel i ett system med 96 brunnar membran i Infoga var approximeras med en nedsänkning boll. - Ställ in geometri av membranet infoga system från experimenten. I steg 3,2 visas ett exempel på hur man bygger med 96 brunnar membran infoga systemet geometri. Enheten av längden anges till mätaren.
Obs: Inte bygga hela geometri för att spara tid för beräkning. I stället geometri kan minskas med hjälp av center rader av en fjärdedel av geometri (se figur 3a och figur 3b). - Lägg till två ”domän sonder” i ”definitioner” (höger klicka på ”definitioner” och leta upp ”Probe”) och välj en sond som acceptor domänen och den andra som givare domän. Välja för både typ ”genomsnittliga” och uttrycket ”c” med enheten ”mol/m3”.
Obs: Detta steg är valfritt och visar koncentrationen av acceptor och givare under simuleringen. - Fastställa den diffusionskoefficienten (Dc) i ”transportegenskaper 1” i ”Transport av efter utspädning arter” som ”Dif_w”.
Obs: ”transportegenskaper 1” används för både acceptor och givare domän. I nästa steg, kommer att barriär domänen skrivas över. - Lägga till en andra ”transportegenskaper 2” med höger-klicka på ”Transport av utspädd arter” och välj barriären (2) i valet ”domän”. Beroende på syftet med simuleringen kan den diffusionskoefficienten anges som ett värde av barriären eller som en dummy variabel ”D”. För den första testa körningen, ange ett värde av 2E-10 m2/s.
Obs: ”D” kommer att förklaras senare i steg 3.3. - I ”Transport av utspädd arter” för ”initiala värden 1” definierar koncentration som noll.
Obs: ”Initiala värden 1” används för barriär och acceptor domän. I nästa steg, kommer att domänen givare skrivas över. - Lägga till en andra ”initiala värden 2” med höger-klicka på ”Transport av utspädd arter” och väljer givaren (3) som domän. Ange koncentrationen som den ursprungliga koncentrationen av givare ämnet (t.ex., C_fl från tabell 2).
- Lägg till ”symmetri 1” med rätt klick på ”Transport av utspädd arter”, lägga till och välj alla ytor ”gränsen är valt”, som speglar hela geometrin (geometri i exemplet i steg 3,2 är det gränsen nummer 1, 2, 4, 5, 7, 8).
Obs: Denna punkt kan försummas om hela geometrin var inställd. - Lägg till två ”gratis tetraedriska” med ett högerklick på ”Mesh”. Välj barriären (2) som domän (ändra den geometriska entitetsnivå ”egendom”). Lägga till ”Size” med rätt klick på ”gratis Tetrahedral 1” och för fördefinierade nät ”finare” för 12-väl membranet infoga system eller ”extra fin” för en 96 brunnar membran sätter systemet.
- I den andra ”gratis tetraedriska” Välj acceptor och givare som domän och den fördefinierade mesh ”normala” för en 12-väl membran infoga system eller ”finare” för en 96 brunnar membran infoga system (se figur 3 c och figur 3d).
Obs: Det är också möjligt att välja en grövre mesh Spara beräkningstiden. Detta kan minska noggrannheten i resultaten. Klicka på ”bygga All” i ”Mesh inställning” till mesh geometri. - Starta simuleringen med ”beräkna” i den ”studie 1”.
- Exempel installation för en geometri
Obs: Här ges ett exempel på hur man ställer upp med 96 brunnar membran infoga systemet (med konkav barriär) geometri. Alla steg utförs i modulen geometri av programmet. Enheten av längden anges till mätaren.- Generera en cylinder 1 (rätt klick på ”geometri 1”) med radie av d_w/2 och höjden på h_sp + h_b + Efwa.
- Generera en cylinder 2 med radie i d_tran/2, höjden av h_b + Efwa och z ställning i h_sp.
- Använd alternativet ”skillnad” (rätt klick på ”geometri 1”, leta upp ”Booleans och Partition”) att subtrahera cylinder 2 från cylinder 1. Valde ”cyl1” i ”objekt att lägga till”, aktivera ”objekt att subtrahera” och valde ”cyl2”. Den nya volymen är geometri av acceptorn.
- Generera en cylinder 3 med radie av d_a/2, höjden av h_b och z positionen för h_sp.
- Generera en sfär 1 med radie r och z position r_z.
- Använd alternativet ”skillnaden” för att subtrahera sphere 1 (sph1) från cylinder 3 (cyl3). Den nya volymen kallas skillnaden 2.
- Generera en cylinder 4 med radie av d_a/2, höjden av h_b + Efwa och placera z av h_sp.
- Använd alternativet ”skillnaden” för att subtrahera cylinder 4 (cyl4) från skillnaden 2. Den nya volymen är geometri av acceptorn.
- Upprepa steg 3.2.4-3.2.6 för att bygga barriären (agaros gel eller cellen modell i experimentet).
- Göra en union 1 av alla geometri element (höger klicka på ”geometri 1”, leta upp ”Booleans och Partition”).
- Generera ett block 1 med alla kanter inställd på en längd av d_tran * 2, position x i - d_tran och y av d_tran * 2.
- Generera ett block 2 med alla kantalängd av d_tran * 2, position x av - d_tran * 2 och y av - d_tran.
- Använd alternativet ”skillnaden” att subtrahera unionen 1 från block 1 och blockera 2.
- Att lägga till parametern optimering i simuleringen
Obs: Med hjälp av parametern optimering av diffusion koefficient kan monteras tidigare genererade experimentella data. Följande instruktioner visar hur du integrerar den optimering delen till diffusion simuleringen. Kontrollera att diffusion simuleringen fungerar innan du börjar så här.- Lägga till fysik-modulen ”optimering” använda ”Lägg till fysik” (optimering kan hittas i ”matematik” i kategorin ”optimering och känslighet”) till simuleringen. Klicka på ”Lägg till komponent”.
- Lägga till ”variabler” med rätt klick under ”definitioner” (lokal i komponenten) och skriv i variabler från tabell 3.
Obs: Parametern optimering använder verkligt numrerar, dvs, den faktor 1-10 av den diffusionskoefficienten måste definieras separat. - Lägga till en ”genomsnittlig 1” med rätt klick på ”definitioner” i avsnittet ”komponent koppling” och typ i operatörens namn ”Acceptor”.
- Generera ett separat textdokument som innehåller experimentella data.
Obs: Ett semikolon separerar kolumner; en radbrytning separerar rader. Tid deklaration mäts i sekunder, koncentrationen i mol/m3. Ta bort först och andra data pekar i fasen eftersläpning (se figur 2) av de experiment för att undvika möjliga montering fel. Här är ett exempel hur textdokumentet kan se ut:
3540; 0.00216
7140; 0.00724
12240; 0.01707
15180; 0.02230
18660; 0.02697
21540; 0.02931
Detta exempel kan användas för att testa simuleringen. - Lägga till ”den globala minstakvadratmetoden mål” med rätt klick på ”optimering”, bifoga textdokument från steg 3.3.4 till ”experimentella data” och definiera den första kolumnen som ”tidskolumn 1” med höger klicka på ”globala minstakvadrat målet” och den andra kolumnen som ”Värde kolumn 1” med klick rätt på ”globala minstakvadrat målet”. I ett ”uttryck” för ”kolumn” skriv variabeln ”C”.
- Lägga till ”globala kontrollvariabler 1” med rätt klick på ”optimering” och förklara ”D_search” som en variabel med det ursprungliga värdet ”1”, nedre gräns ”0” och övre gräns ”1000”.
- Lägga till ”optimering” med rätt klick på ”studie 1” och valde ”SNOPT” som en optimeringsmetod för Problemlösaren. Ställ in optimalitet toleransen till 1E-9.
Obs: Om simuleringen inte konvergerar, öka optimalitet toleransen. Tänk på att simuleringen blir felaktig om optimalitet toleransen är för stor. - Starta parametern optimering med ”beräkna” i ”studie”. Glöm inte att fastställa den diffusionskoefficienten på barriären som ”D”.
Representative Results
Permeabilitet experiment i en 96 brunnar membran infoga system med 2% agarosgel som en barriär genomfördes för att utvärdera riktigheten av en simulering. Fluorescein natriumsalt (NaFl) och fluorescein isotiocyanat-dextranes (FD) användes för att kontrollera effekterna av molekylär storlek av diffuserande ämnet från 5 x 10-10 m upp till 45 x 10-10 m Stokes radie (376.27-40,000 mol wt). Simuleringens infödda parametern optimering användes att passa simuleringen till experimentella data.
I detta syfte jämfördes sluttningarna av endast de linjära delarna av simulerade permeabilitet experimentella resultat. För små molekylära storlekar var simulering och experimentella data bra överens med 99,2% för NaFl och 80,2% för FD 4.000 (se figur 4a och figur 4b). Större molekylstorlek genereras större avvikelser visar korrelationerna 50,5% för FD 10.000 och 79,7% för FD 20.000 53,6% för FD 40.000. Kurva progression i simuleringarna visade en fördröjning i början och en starkare ökning av det fortsatta förloppet av grafer (se figur 4 c–4e).
Permeabilitet koefficienter och simulerade Diffusionskoefficienterna visas i tabell 4. Permeation koefficienten minskar med ökande molekylstorlek. Standardavvikelse var mellan 0,08 x 10-8 m/s och 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), vilket motsvarade en absolut oriktig mellan 4.18 och 46,15%. Experiment med större molekyler visade en större absolut fel. Simulerade Diffusionskoefficienterna betedde sig mycket på motsvarande sätt till experimentella permeabilitet koefficienter. Ämnen med större Stokes radier visade minskande Diffusionskoefficienterna och absoluta felet varierade mellan 9,09 och 18,46% (N = 3).
I ytterligare permeation experiment användes fyra olika kollagen cell modell som hinder i ett 12-väl membran infoga system. Dessa modeller omfattar en cellfria och en cell modell med olika kombinationer av primära fibroblaster i kollagen gel och HaCaT på ytan. Följande kombinationer användes: kollagen (kol) som cellfria modell, kollagen + fibroblaster (kol + F.), kollagen + HaCaT (kol + H.), och kollagen, fibroblaster + HaCaT (kol + F. + H.). Fluorescein natriumsalt med DMEM + 10% FCS användes som givare ämne. För bild användes analys av kollagen cell modell, färgning med hematoxylin och eosin (han). Denna färgning var gjort med tillverkarens protokollet. I figur 5visas sådan en fläck med en representativ överste + F. + H. modell. Han fläckar lite vävnad struktur av kollagen matris. Fibroblaster ligger i matrisen, och atomkärnor av fibroblast och HaCaT celler färgas i mörkt violett. Ovanpå den kollagenmatrisen finns det ett lager som innehåller många kärnor, som bör vara kärnan av den HaCaTs, bygga ett omslutande lager på toppen av modellen.
I tabell 5listas experimentell permeation koefficienter och simulerade Diffusionskoefficienterna. En trend kan ses för de flesta modeller med HaCaT, som har lägre permeation/Diffusionskoefficienterna jämfört med modeller utan HaCaT. Absoluta felet permeation koefficienter är 10,9-24,4%, och för diffusion koefficienter 5,2% - 12,9%.
Figur 1: sidovy av permeabilitet experimentet i ett membran infoga system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exemplariskt grafen av en permeabilitet experiment. Koncentrationen av acceptorn ritas över tid. Två streckade linjer fäste den nästan linjär delen av grafen. Lutningen på den linjära delen används för att bestämma permeabilitetskoefficienten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: geometri och mesh av membranet infoga system i simuleringen. (en) geometri av 96 brunnar membranet infoga system. (b), geometri av 12-väl membranet infoga system. (c), maska av 96 brunnar membranet infoga system. (d), maska av 12-väl membranet infoga system. (e) tvärsnitt och parametrar av membranet infoga system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse av experimentella data från en genomträngning experiment till optimerad simuleringen. (en) fluorescein natriumsalt, (b) fluorescein isotiocyanat-dextran 4,000 mol WT, (c), 10.000 mol WT, (d), 20.000 mol WT och (e), 40.000 mol WT vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: representant HE färgning av en kollagen cell modell (kollagen + fibroblaster + HaCaT). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: permeabilitetskoefficienten som en funktion av 1/Stokes radien med fluorescein natriumsalt och fluorescein isotiocyanat-dextran i ett 96 brunnar membran infoga system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Experession för 96 väl systemet i mm | Experssion för 12-väl systemet i mm | Beskrivning |
| d_tran | 5,65 [mm] | 14,7 [mm] | Diameter på brunnen |
| d_a | 4,26 [mm] | 12.1 [mm] | Diameter på membranet |
| d_w | 8,79 [mm] | 21,97 [mm] | Diameter på acceptorn |
| h_b | 2 [mm] | 2 [mm] | Höjd av barriären |
| h_sp | 1 [mm] | 1 [mm] | Avstånd mellan brunn och botten |
| Efwa | 4,73 [mm] | 5.24 [mm] | Hög av acceptorn |
| b | h_b/2 | - | Nedsänkningsdjup |
| r | ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) | - | Radie av nedsänkning bollen+ |
| r_z | r + h_b | - | z-ställning nedsänkning bollen+ |
Tabell 1: geometri parametrar för ”kemiska arter Transport” simulering. + Endast för att användas för simulering av agaros gel i 96 väl membran infoga system.
| Namn | Uttryck | Värde | Beskrivning |
| C_fl | 0,1 [mg/ml]/376.28 [g/mol] | 0.26576 mol/m2 | Koncentration av Fl.So. |
| C_4 | 2 [mg/ml] / 4000 [g/mol] | 0,5 mol/m2 | Koncentrationen av FD 4.000 |
| C_10 | 2 [mg/ml] / 10000 [g/mol] | 0,2 mol/m2 | Koncentrationen av FD 10.000 |
| C_20 | 2 [mg/ml] / 20000 [g/mol] | 0,1 mol/m2 | Koncentrationen av FD 20.000 |
| C_40 | 2 [mg/ml] / 40000 [g/mol] | 0,05 mol/m2 | Koncentrationen av FD 40.000 |
| Dif_w | 1e-9 [m ^ 2/s] | 1e - 9m2/s | Diffusion koefficient blanda vatten |
Tabell 2: Fysiska parametrar för ”kemiska arter Transport” simulering.
| Namn | Uttryck | Beskrivning |
| C | Acceptor(c) | Definition av acceptor koncentrationen |
| D | D_search * 1e-10 | Faktor förändring för D |
Tabell 3: Parametrar för ”optimering” simulering.
| Genomsyra | Permeabilitetskoefficienten (m/s) x 10-8 | Diffusion koefficient (m/s2) x 10-10 | Stokes radie av permeate (m) x 10-10 |
| Fl.So. | 4.79 ± 0,20 | 1,94 ± 0,34 | 5 |
| FD 4.000 | 2.37 ± 0,31 | 0,65 ± 0,12 | 14 |
| FD10, 000 | 1,67 ± 0,47 | 0.22 ± 0,02 | 23 |
| FD 20.000 | 0,65 ± 0,30 | 0,29 ± 0,04 | 33 |
| FD 40.000 | 0,27 ± 0,08 | 0,14 ± 0,02 | 45 |
Tabell 4: permeabilitet och diffusion koefficient av ämnen med olika Stokes radie genom 2% agarosgel + membran i en 96 brunnar membran infoga system. (fluorescein natriumsalt = Fl. So., fitc dextran = FD).
| Modell | Permeabilitetskoefficienten (m/s) x 10-8 | Diffusion koefficient (m/s2) x 10-10 |
| Överste | 2.18 ± 0,29 | 1,22 ± 0,06 |
| Överste + F. | 1.77 ± 0,38 | 0,93 ± 0,12 |
| Överste + H. | 1,64 ± 0,40 | 0,96 ± 0,05 |
| Överste + F. + H. | 1,65 ± 0,18 | 0,88 ± 0,11 |
Tabell 5: permeabilitet och diffusion koefficient fluorescein natrium salt genom en kollagen cell modell i en 12-väl membran infoga system (överste = kollagen, F. = Fibroblast, H. = HaCaT).
Discussion
Denna studie dokumenterar en metod utvecklad för att kvantifiera genomträngning genom en vävnad-konstruktion konstruerad på ett membran. Genomträngning av ämnen med varierande molekylära storlekar genom agarosgel undersöktes först för att testa och validera metoden och den motsvarande simuleringen. Det är väl känt att mindre molekyler genomsyra snabbare genom en matris mesh (med undantag av effekten i gelfiltrering av permeabilitet kromatografi). Liknande observationer gjordes med storlek-utslagning experiment av ämnen genom sklera26, human epidermal membran27, mänsklig hud17och råtta hud28. En omvänd korrelation mellan permeabilitet koefficienter och motsvarande Stokes radien (radien av en hård sfär som rör sig med samma diffusion takt som molekylerna beskrivs, vanligtvis mindre än effektiva radien av molekylen) har visat 26 , 28, och ett liknande förhållande observerades i experiment med ämnen av olika molekylära storlekar. Genom att rita permeabilitet koefficienter över 1/Stokes radie, en linjär korrelation över de fyra grupperna med minsta molekylära storlek hittades (R2 = 0,93) (figur 6). Detta indikerar att simulerade permeabilitet koefficienter med metoden föreslog i en realistisk utbud.
Felet för 46,15% i experimenten är något större än vad som rapporterats för permeabilitet experiment med Franz diffusion cell system10. En möjlig förklaring skulle kunna vara storleksfördelning av fluorescein-isotiocyanat-dextran, vilket diskuteras senare.
Den metod som beskrivs har viktiga fördelar jämfört med metoder med hjälp av Franz diffusion cellen systemet. För det första är installationen mer kompakt; experimenten utförs direkt i ett membran infoga system, vilken har omfattningen av en kommersiell väl platta (∼ 13 cm x 8,5 cm). Detta möjliggör flera prover ska köras samtidigt, medan en separat Franz diffusion cell behövs för varje prov. För det andra kan genomträngligheten av en hud modell mätas direkt i membranet Infoga, där odlingen sker. Med Franz diffusion celler, måste proverna tas och monteras på systemet, som är mer betungande för små prover och är också mer tidskrävande.
Permeation experiment med kollagen cell matriser visade att denna metod kan tillämpas framgångsrikt till cell-seedade system. Den modell som presenteras här har verifierats för huden modeller; men kan metoden tillämpas på andra typer av organiska cellkulturer, t.ex., njur- eller leverproblem.
I denna studie användes en kollagen-cell modell där HaCaT celler helt täckt modellens yta (se figur 5). Detta ledde till en minskning av permeabilitetskoefficienten, visar att metoden är tillräckligt känslig för att skilja permeabilitetskoefficienten mellan en kollagen-cell modell med och utan ett lager av HaCaT. Helst en hud modell bör bygga upp en barriär, som närmar sig epidermisen av en riktig hud29, och det är därför viktigt att kontrollera kvaliteten (t.ex., byggnaden av dermis, epidermis) av hud modell före faktiska användning. Utvecklingen av en hud modell kan visualiseras med färgningsteknik och kvantifieras från detektion av huden protein och kollagen30,31,32. Permeabilitetskoefficienten kan också vara en viktig faktor för att bedöma utvecklingen av huden modellen, men ytterligare experiment krävs för att bekräfta detta. Som tidigare nämnts kan denna metod kör flera prover parallellt. Det är också möjligt att ta prov under odling att mäta permeabilitet och därmed följa utvecklingen av denna parameter av hud modell.
Det bör noteras att permeabilitet mäts genom en gel/kollagen-cell-modell och membran samtidigt. Upptäckta permeabilitetskoefficienten är systemspecifik, whereby resultaten av olika hud modeller endast kan jämföras när du använder samma membran vändskär. Dessutom behöver huden modellen omfattar hela odling för att säkerställa att testsubstansen kommer genomsyra endast genom modellen och inte intill det, som skulle framkalla fel i permeabiliteten mätt. En annan aspekt som bör beaktas i framtida experiment är den naturliga miljön som omger huden. Temperaturen på ytan av huden är vanligtvis lägre jämfört med regionen inre, vilket kan påverka permeation villkor.
För att anpassa labbexperiment med datorsimuleringar, presenterades en metod som möjliggör parametern optimering för tillämpad simulering. Simuleringar visar att de sammanfaller väl med experimentella data för ämnen med små molekylära storlekar. Dock observerades avvikelser mellan simulering och experimentella data för ämnen med större molekylära storlekar. Stora polysackarid molekyler kan öka friktionen och långsam diffusion processen i en gel. Denna effekt orsakar onormal diffusion, vilket är en möjlig orsak till avvikelsen mellan experimentell och simulering värden33,34. En annan förklaring kan vara förekomst av mindre eller större partiklar i fluorescein-isotiocyanat-dextran. Tillverkaren anger molekylvikten för ämnet som den genomsnittliga storleken med ett givet intervall, vilket gör att mindre och större partiklar att närvara. Det är också oklart hur spridda dessa ämnen är, som de mindre partiklarna genomsyra snabbare genom gelen och vätska kanalen. Det är möjligt att förlänga simuleringen att överväga dessa diffusion och friktion effekter.
Den permeabilitet experiment och simulering har utvecklats för användning i en 2-OC. Med hjälp av simulering, kan denna experimentella metod överföras direkt till mer sofistikerade försöksuppställningar. Exempelvis kan den membran infoga systemsimulering enkelt överföras till geometrin för en 2-OC eller till andra system med liknande uppställningar. Denna möjlighet för modulerande simuleringen kan användas för att stödja utformningen av framtida experiment. Dessutom kan biverkningar såsom avdunstning, onormal diffusion och membran effekter integreras för att förbättra simuleringen, därigenom förbättra noggrannhet. Programmet simulering ger möjlighet att ändra eller förbättra simulering ekvationen, samt för att integrera andra fysiska moduler för att undersöka andra aspekter av hud modellutveckling. Ett exempel är simulering av produktion av glukos förbrukning och laktat i kollagen cell modell.
En särskilt intressant aspekt för testning av Mediciniska substanser är hur ämnena fördelas i ett organ-på-ett-chip system. Simulering och permeabilitet parametern min hjälp att besvara frågor såsom hur snabbt ett ämne genomsyrar i systemet samt vilken koncentration kommer att vara tillgängliga för andra vävnader i en multi-organ-chip. Denna metod kan stödja och stärka utvecklingen och testningen av sådana organ-på-chip system.
Disclosures
Uwe Marx är VD och delägare och Gerd Lindner är aktieägare i TissUse GmbH, ett företag tillverkning och kommersialisera MOC tekniken. Andra författare förklarar någon intressekonflikt angående offentliggörande av denna uppsats.
Acknowledgments
Detta arbete skapades med ekonomiskt stöd från Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) under lån nej. PO413/12-1 och LA 1028/7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Carl Roth | K297.2 | High Resolution Powder |
| Collagen | Serva | 47256.01 | Collagen R solution 0.4 % |
| DMEM | Lonza (Biozym Scientific GmbH) | 880010-12 | High Glucose with L-Glutamine |
| FCS | Biochrom GmbH | S0615 0114F | Fetal Calf Serum |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | 46960-25G-F | |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 46944-500MG | 4000 g/mol |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD10S-250MG | 10 000 g/mol |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD20S-250MG | 20 000 g/mol |
| Fluorescein Isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | FD40S-250MG | 40 000 g/mol |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170120 | no calcium, no magnesium , with phenol red |
| NaOH | Merck | 1.06467.9010 | granulated |
| PBS | Gibco | 18912-014 | tablets |
| Transwell Cell Culture Inserts | Corning | 3391 | 96 well, 0.4 µm pore size |
| Transwell Cell Culture Inserts | Corning (VWR) | 734-1563 | 12 well, 0.4 µm pore size |
| Trypsin | Biochrom GmbH | L2143 | with EDTA |
References
- Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
- Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
- Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
- Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
- Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
- Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
- Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
- Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
- Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
- Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
- Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
- Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
- Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
- Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
- Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
- Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
- Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
- Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
- Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
- Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
- Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
- Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
- Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
- Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
- Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
- Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
- Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
- Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
- Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
- Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
- Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
- Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).
