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Medicine

नाक और दमा के तरल पदार्थ का अवशोषण: सटीक नमूने मानव श्वसन म्यूकोसा और नमूनों की प्रयोगशाला प्रसंस्करण के

Published: January 21, 2018 doi: 10.3791/56413
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1National Heart and Lung Institute, Faculty of Medicine, Imperial College London, St Mary's Hospital, 2St Mary's Hospital, Imperial College Healthcare Trust

Summary

यह पांडुलिपि नाक और दमा अवशोषण तकनीक के उपयोग का वर्णन करता है, विशेष रूप से सिंथेटिक अवशोषण मैट्रिक्स (सैम) का उपयोग श्लैष्मिक अस्तर द्रव (MLF) ऊपरी और निचले airway के नमूने के लिए । इन तरीकों को बेहतर मानकीकरण और मौजूदा श्वसन नमूना तकनीक की तुलना में सहनशीलता प्रदान करते हैं ।

Abstract

नाक अवशोषण (एनए) और दमा अवशोषण (BA) के तरीकों सिंथेटिक अवशोषण मैट्रिक्स (सैम) का उपयोग करने के लिए मानव श्वसन तंत्र के श्लैष्मिक अस्तर द्रव (MLF) को अवशोषित । NA एक गैर इनवेसिव तकनीक है जो अवर turbinate से द्रव को अवशोषित कर लेता है, और न्यूनतम असुविधा का कारण बनता है । NA प्रतिलिपि परिणाम अक्सर ऊपरी airway के नमूने दोहराने की क्षमता के साथ झुकेंगे है ।

तुलना करके, श्वसन म्यूकोसा के नमूने के वैकल्पिक तरीकों जैसे nasopharyngeal आकांक्षा (एनपीए) और पारंपरिक swabbing, अधिक आक्रामक होते है और अधिक से अधिक डेटा परिवर्तनशीलता में परिणाम हो सकता है । अंय तरीकों की सीमाएं हैं, उदाहरण के लिए, बायोप्सी और दमा प्रक्रियाओं आक्रामक हैं, थूक कई मृत और मर कोशिकाओं शामिल है और द्रवीकरण की आवश्यकता है, exhaled सांस घनीभूत (EBC) पानी और लार शामिल हैं, और लेवेज नमूने पतला कर रहे है और चर.

BA क्लिनिक में एक bronchoscope के कार्य चैनल के माध्यम से किया जा सकता है । नमूना अच्छी तरह से सहन और airway में कई साइटों पर आयोजित किया जा सकता है । MLF नमूनों में बीए परिणाम bronchoalveolar लेवेज (बाल) नमूनों की तुलना में कम पतला किया जा रहा है ।

यह लेख ना और बीए की तकनीकों को प्रदर्शित करता है, साथ ही परिणामस्वरूप नमूनों की प्रयोगशाला प्रसंस्करण, जो वांछित बहाव के लिए सिलवाया जा सकता है, मापा जा रहा है । इन अवशोषण तकनीक पारंपरिक नमूना नैदानिक श्वसन अनुसंधान में इस्तेमाल तकनीक के लिए उपयोगी विकल्प हैं ।

Introduction

सबसे श्वसन रोगों एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के कारण, और वहाँ एलर्जी rhinitis, वायरल और फंगल संक्रमण, तपेदिक, अस्थमा, जीर्ण प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग, फेफड़े में श्वसन श्लैष्मिक सतह से नमूने के लिए एक तत्काल जरूरत है फाइब्रोसिस और फेफड़ों का कैंसर 1. Nasopharyngeal महाप्राण (एनपीए), नाक लेवेज, और bronchoalveolar लेवेज (बाल) ऊपरी और निचले airway के नमूने के लिए आम तकनीक हैं । हालांकि, इन तकनीकों गरीब सहनशीलता, भड़काऊ मध्यस्थों के कमजोर पड़ने सहित काफी समस्याओं मौजूद है, और अक्सर2नमूना दोहराने की अक्षमता । एक विकल्प के लिए एनपीएस नमूना झाड़ू का उपयोग है, या तो नायलॉन आते हैं, कपास, या रेयान3,4, लेकिन ये भी सीमाएं हैं, क्योंकि वे परेशानी और नाक उपकला को नुकसान का कारण, और कुछ मामलों में अपरिवर्तनीय के बंधन भड़काऊ मध्यस्थों5. इन तकनीकों को आम तौर पर एक घंटे से अधिक नहीं दोहराया जा सकता है, और वैकल्पिक तकनीक कम बहुतायत साइटोकिंस और chemokines5,6का पता लगाने के लिए और अधिक प्रभावी हो सकता है । इसके अतिरिक्त, इन तकनीकों से संबंधित उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता डेटा में असंगतताएं जेनरेट कर सकती है, जिसके परिणामस्वरूप बड़ा रोगी पलटने की आवश्यकता होती है ।

वैकल्पिक रूप से, दोनों प्राकृतिक और सिंथेटिक स्पंज का उपयोग कर अवशोषण तकनीक श्लैष्मिक सतहों से MLF इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । प्राकृतिक फाइबर से बना नेत्र स्पंज (जैसे, Weck-cel) लार, ग्रीवा, और योनि स्राव7नमूना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, polyvinyl अल्कोहल (PVA) और hydroxylated polyvinyl एसीटेट (HPVA) से बने सिंथेटिक स्पंज को8का उपयोग किया गया है । सात अलग अवशोषण सामग्री मौखिक द्रव नमूने के लिए की तुलना में किया गया है एंटीबॉडी9को मापने से पहले, जबकि मिनी स्पंज मानव आँसू10इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

फिल्टर कपास संयंत्र से प्राकृतिक फाइबर से मिलकर कागज व्यापक रूप से आलम और सहयोगियों के १९९२11,12में अग्रणी कागज के बाद से नाक के स्राव को अवशोषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है,13,14, 15,16,17. फ़िल्टर पेपर डिस्क फ़िल्टर कार्ड (उदा Shandon) से उत्पादित किया गया है, और नियंत्रित नाक एलर्जी की चुनौतियों के बाद और प्राकृतिक एलर्जी जोखिम के साथ histamines और साइटोकिंस को मापने के लिए उपयोग किया गया है18,19 ,20,21. हालांकि, फिल्टर कागज के विभिंन बैचों प्रोटीन बाध्यकारी की उनकी डिग्री में भिंनता है और कुछ साइटोकिंस जारी करने में विफल । एक सिंथेटिक अवशोषण मैट्रिक्स (सैम) का उपयोग कर तरीके इसलिए2,22,23विकसित किया गया है । SAMs अब आम तौर पर ना करके नाक MLF प्राप्त करते थे. इन शोषक सामग्री का उपयोग करने के लिए आरामदायक है और समय की विस्तारित अवधि में लगातार अंतराल पर सूजन नाक से भी MLF प्राप्त कर सकते हैं ।

नाक अवशोषण परिशुद्धता श्लैष्मिक नमूना का एक रूप है MLF के ऊपरी airway में नमूना के लिए एक सैम का उपयोग कर । ना उपकरणों के रूप में निर्मित कर रहे हैं CE-साफ कमरे का उपयोग चिकित्सा ग्रेड सामग्री से चिकित्सा उपकरणों के रूप में चिह्नित और धूल और एलर्जी से मुक्त हैं. ना पारखी एक संभाल और एक बाँझ cryotube में सैम के होते हैं. सैम पॉलिमर के होते हैं, आमतौर पर फाइबर, लेकिन यह भी फोम के रूप में उपलब्ध है, और इन नरम और अवशोषण होना करने के लिए चुना जाता है, नमूना संग्रह के लिए तेजी से बाती के साथ. SAMs कम प्रोटीन के लिए अवशोषित स्राव के कुशल रेफरेंस की अनुमति बाध्यकारी है । ना एक बहुत ही कोमल, गैर इनवेसिव तकनीक है कि सभी उंर के दाताओं पर किया जा सकता है । इसके अलावा, सीरियल नमूना, यहां तक कि हर कुछ मिनट, संभव है । ना मौजूदा ऊपरी airway नमूना तकनीक के खिलाफ मांय किया गया है5 और दोहराव नमूना है एलर्जी के साथ airway की चुनौती के बाद काइनेटिक डेटा के उत्पादन की अनुमति दी है23,24,25, बैक्टीरियल endotoxin26 और वायरल-प्रकार TLR एगोनिस्ट (झा, ए. एट अल., तैयारी में पांडुलिपि) । ना शिशुओं में भी27,28,29 और वायरल bronchiolitis30के प्राकृतिक इतिहास की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

Bronchoscopic microsampling (बीएमएस) कम airway है कि ओलिंप31,३२,३३द्वारा विकसित किया गया है में MLF के संग्रह के लिए एक प्रक्रिया है । दुर्भाग्यवश, इस बीएमएस सिस्टम का जापान में ही लाइसेंस है । ओलिंप आपूर्ति दो बीएमएस सिस्टम: एक रेशेदार hydroxylated पॉलिएस्टर (FHPE) जांच के साथ३४,३५,३६,३७, और एक कपास की जांच के साथ एक३३,३८, ३९ , ४० , ४१ , ४२ , ४३. एक प्रमुख कारण ब्लॉक किया गया है कि बीएमएस जांच अस्थमा के साथ रोगियों में इस्तेमाल किया श्लैष्मिक संपर्क खून बह रहा है, सभी खून से दूषित नमूनों के आधे के साथ । लेखकों ने निष्कर्ष निकाला कि अस्थमा के रोगियों४३में परिधीय एयरवेज से इस बीएमएस प्रणाली का उपयोग कर MLF का नमूना लेना व्यवहार्य नहीं था ।

एक विकल्प के रूप में, हम विकसित किया है बीए एक नरम सैम कि लोअर एयरवेज के bronchoscopic जांच के दौरान प्रदर्शन किया जा सकता है का उपयोग, राइनोवायरस के साथ दमा विषयों की प्रयोगात्मक संक्रमण निम्नलिखित सहित6. बीए डिवाइस के होते हैं: एक बाहरी खोखले कैथेटर, एक हाथ टुकड़ा है कि सक्रियण पर सैम बाहर निकालना, और एक केंद्रीय प्लास्टिक गाइड तार कि अपने अंत पर सैम है । एनए के लिए के रूप में, बीए किट साफ कमरे का उपयोग कर चिकित्सा ग्रेड सामग्री से निर्मित कर रहे है और धूल और एलर्जी से मुक्त हैं । साथ ही, डिवाइस CE चिह्नित हैं और गामा-विकिरणित प्रदान किए गए हैं । सैम पट्टी नरम, अवशोषण है, और नमूना संग्रह के लिए तेजी से बाती । इसमें भी कम प्रोटीन बाध्यकारी है जो अवशोषित स्रावों के कुशल रेफरेंस की अनुमति देते हैं । डिवाइस एक bronchoscope के वर्किंग चैनल के माध्यम से फिट कर सकते हैं और airway के भीतर ब्याज की विशिष्ट साइटों पर तेजी से और सही नमूना MLF के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बाल या बीएमएस के विपरीत, बीए संपर्क रक्तस्राव या अतिरिक्त रोगी असुविधा के बाद प्रक्रिया में परिणाम नहीं है ।

एनए और बीए के नमूनों की प्रोसेसिंग के लिए सावधान विचार दिया जाना चाहिए । नमूने सीधे जमे हुए और बैचों में संसाधित किया जा सकता है, या तुरंत संसाधित किया जा सकता है । प्रसंस्करण के प्रकार साइटोकिंस, chemokines और इम्युनोग्लोबुलिन, या वायरल, बैक्टीरियल, और मेजबान सेल एसोसिएटेड आरएनए के elutions के लिए immunoassays सहित कुछ बहाव अनुप्रयोगों, की ओर सिलवाया जा सकता है. हम नैदानिक संग्रह और प्रयोगशाला प्रसंस्करण नैदानिक शोधकर्ताओं के लिए एक गाइड के रूप में एनए और बीए के साथ जुड़े तकनीक प्रस्तुत करते हैं ।

Protocol

निम्न प्रोटोकॉल में प्रयुक्त तकनीकों को पश्चिम लंदन अनुसंधान नैतिकता समिति (संदर्भ संख्या 15/lO/0444) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. नाक का अवशोषण (NA)

  1. तैयारी से पहले ना करें सैंपलिंग
    1. जब ना बाहर ले जाने, पहले हाथ धोने और दस्ताने पर डाल, अधिमानतः रोगी के सामने ।
    2. नाक गुहा का निरीक्षण एक सिर मशाल का उपयोग कर, और चिकित्सक अपने गैर प्रमुख अंगूठे का उपयोग करने के लिए रोगी की नाक वापस लेने के लिए नाक गुहा कल्पना ।
      नोट: एक नाक वीक्षक आमतौर पर आवश्यक नहीं है ।
    3. नाक गुहा और अवर turbinate से पहले नमूना कल्पना ।
      नोट: नरेस (नाक) पार अनुभाग में गोल नहीं कर रहे है और वे सीधे पीछे जाना । आम तौर पर, अवर turbinate नाक के पार्श्व दीवार पर एक उभार या इंडेंट के रूप में देखा जा सकता है, पट के साथ चिकनी, फ्लैट औसत दर्जे की दीवार के गठन । हम इस अवर turbinate से नमूना चाहते हैं, के बाद से अंतर्निहित उपकला श्वसन तंत्र की एक सरल oleraceum उपकला है४४.
  2. ना सैंपलिंग
    1. जब नमूना, ना सैम धीरे ऊपर नाक के लुमेन के पास, orientating यह अवर turbinate के खिलाफ फ्लैट होने के लिए ।
    2. दाता से पूछो एक सूचकांक उंगली का उपयोग करने के लिए नाक के श्लेष्म पर सैम प्रेस । ना एक सा गुदगुदी पैदा कर सकता है, संभव आंख पानी के साथ, के रूप में MLF अवशोषित है ।
      नोट: वयस्कों में, हम आम तौर पर न ६० एस के लिए प्रदर्शन करते हैं ।
    3. MLF के अवशोषण के बाद, नाक से ना डिवाइस को हटाने और मूल ट्यूब में वापस डाल दिया ।
    4. नमूने प्रयोगशाला में तुरंत प्रक्रिया या उंहें फ्रीज, के रूप में इस प्रोटोकॉल में बाद में विस्तृत ।
      नोट: ना नाक श्लैष्मिक चैलेंज मॉडल की एक किस्म में अध्ययन किया जा रहा है, और भी अलग एयरवेज रोगों में । हालांकि, अंय श्वसन नमूना तरीकों के खिलाफ सत्यापन प्रत्येक अध्ययन और रोगी जनसंख्या के लिए किया जाना चाहिए ।

2. दमा अवशोषण (BA)

  1. बीए की सैंपलिंग से पहले तैयारी
    नोट: बीए एक ब्रोंकोस्कोपी सुइट में विशेष कर्मियों द्वारा किया जाता है ।
    1. कैथेटर नीचे बीए डिवाइस रखने से पहले, जांच लें कि सैम बाहर निकालने और कैथेटर में वापस ले रहा है ।
    2. एक रोगी पर बीए आयोजित करने से पहले, एक ब्रोंकोस्कोपी सिम्युलेटर पर एक नकली बीए आचरण ।
  2. बीए नमूना
    1. बस सही निचले और सही मध्य पालियों में विभाजन के लिए समीपस्थ, श्वसनी intermediusके स्तर के लिए श्वासनली और सही मुख्य श्वसनी नीचे bronchoscope दर्रा ।
      नोट: हम आमतौर पर श्वसनी intermediusसे नमूना, हालांकि airway के भीतर अंय साइटों का नमूना लिया जा सकता है । जब कैथेटर और सैम अवलोकन, एक bronchoscope टिप नहीं देख सकते हैं । हम बीए के लिए निंनलिखित सरल चरणों का पालन, एक बार bronchoscope वांछित नमूना साइट तक पहुंच गया है ।
    2. कैथेटर नीचे: सफेद टिप सिर्फ airway में दिखाई दे रहा है जब तक bronchoscope के ऑपरेटिंग चैनल के माध्यम से बीए कैथेटर डालें, bronchoscope के अंत करने के लिए बाहर 1 सेमी की एक अधिकतम करने के लिए । airway के लुमेन के केंद्र में bronchoscope और कैथेटर टिप रखें । कैथेटर टिप और श्लेष्मा म्यूकोसा के लिए घर्षण के जोखिम को कम करने के लिए के बीच संपर्क को कम करने के लिए सावधान रहें ।
    3. सैम बाहर: दबाना कि सैम सही मध्य या सही निचली पालि airway के लुमेन में बाहर निकाला जाता है ताकि बीए डिवाइस के हैंडल । प्रत्यक्ष दृष्टि के तहत, bronchoscope की नोक को सुनिश्चित करने के लिए कि सैम airway दीवार पर MLF के साथ संपर्क बना रही है मोड़ । airway के भीतर सैम छोड़ दो, श्लैष्मिक दीवार के लिए फ्लैट 30 एस के लिए ।
    4. सैम में: bronchoscope के माध्यम से देखने के लिए सुनिश्चित करें कि नम सैम जांच सीधे और वापस नहीं है कैथेटर के अंत में । यदि आवश्यक हो, कैथेटर और bronchoscope टिप वापस लाया जा सकता है सैम को सीधा करने के लिए । प्रत्यक्ष दृष्टि के तहत, सीधे सैम वापस लेने कैथेटर में धीरे से ।
      नोट: अगर वहां है कठिनाई कैथेटर में वापस सैम पीछे हटा, सैम के साथ पूरे डिवाइस वापस बाहर airway से बाहर निकाला ।
    5. कैथेटर अप: bronchoscope के ऑपरेटिंग चैनल से पूरे कैथेटर वापस ले लो ।
    6. सैम कट: सैम बाँझ कैंची से काट रहा है और फिर बर्फ पर एक cryotube में डाल दिया है । इन नमूनों को अलग विधियों से संसाधित किया जा सकता है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में बाद में विस्तृत है ।

3. एनए और बीए के नमूनों की प्रोसेसिंग

नोट: ना और बा से उत्पन्न नमूनों के प्रयोगशाला प्रसंस्करण के लिए कई विकल्प हैं । इन प्रोटोकॉल नमूने बाद में उपयोग के लिए संग्रह करने के लिए, और MLF नमूना SAM से elute करने के लिए चाहते हैं ।

  1. एनए और बीए के नमूनों को तत्काल संभालने के लिए विकल्प
    1. विकल्प 1: एक कुछ घंटे के लिए आगे प्रसंस्करण से पहले नम सैम बर्फ पर स्टोर ।
    2. विकल्प 2: तुरंत डीप फ्रीज न SAMs संग्रह ट्यूब में । इसी तरह, SAMs को हटाने के बाद क्रायोजेनिक शीशियों में फ्रीज, कैंची से, नमूना डिवाइस से ।
    3. विकल्प 3: सीधे या गहरी ठंड प्रसंस्करण से पहले रेफरेंस बफर (३०० µ एल) में अलग सैम प्लेस ।
  2. एनए और बीए के नमूनों के लिए रेफरेंस बफर के विकल्प
    नोट: रेफरेंस बफर का चुनाव MLF नमूने में विश्लेषण किया जा करने के लिए क्या हो रहा है पर निर्भर करता है और हम चार मुख्य विकल्प का सुझाव:
    1. एक पूर्व तैयार परख immunoassay प्रक्रियाओं के लिए उपयुक्त बफर का प्रयोग करें । इस तरह के बफर डिटर्जेंट की एक छोटी राशि (०.०५%) और साथ ही प्रोटीन, जैसे, 1% से कम गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) शामिल होना चाहिए ।
    2. वैकल्पिक रूप से, डिटर्जेंट की अधिक मात्रा वाले बफ़र का उपयोग करें, ताकि सेल lysis होती है ।
      नोट: हम 1% एकाग्रता पर ट्राइटन-X या NP40 युक्त बफ़र्स का उपयोग करते हैं । सेल lysis बफ़र्स दोनों intracellular और extracellular साइटोकिंस सैम से eluted करने के लिए सक्षम है, और आम तौर पर साइटोकिंस और chemokines के उच्च स्तर में परिणाम है । इन बफ़र्स भी प्रोटीन शामिल करना चाहिए, और 1% करने के लिए BSA के साथ बना रहे हैं ।
    3. ऐसे वायरल आरएनए की मात्रात्मक पीसीआर या मेजबान आरएनए को मापने के रूप में आरएनए माप, के लिए, सीधे नम सैम के लिए आरएनए निष्कर्षण बफर जोड़ें.
      नोट: Chaotropic आरएनए निष्कर्षण बफ़र्स guanidinium कि प्रोटीन स्वभाव होते हैं । एक विकल्प eluted MLF द्रव immunoassay या सेल lysis बफर में समाहित करने के लिए आरएनए निष्कर्षण बफर जोड़ने के लिए है ।
    4. कार्बनिक सॉल्वैंट्स, जैसे trifluoroacetic एसिड का प्रयोग करें, लिपिड और चयापचयों के निष्कर्षण के लिए, जन-स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मूल्यांकन के लिए ।
      नोट: इन सभी रिएजेंटों का विवरण सामग्री अनुभाग में शामिल हैं ।
  3. रेफरेंस तकनीक
    1. उपरोक्त रेफरेंस तकनीकों में से किसी के लिए, एक 2 मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब में सैम डालें, साथ वांछित निष्कर्षण बफर के साथ ।
    2. भंवर 30 एस के लिए नमूना मिश्रण को ढीला संलग्न तरल पदार्थ और अणुओं के सैम धो लो ।
    3. पूर्ण नमूना वसूली सुनिश्चित करने के लिए, एक स्पिन फिल्टर मिनी स्तंभ है कि एक ही 2 मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब धोने के लिए इस्तेमाल में सम्मिलित करता है के लिए नम सैम जोड़कर केंद्रापसारक रेफरेंस प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: दो प्रकार के स्पिन फिल्टर मिनी-कॉलम का इस्तेमाल किया जा सकता है । पहले केवल एक प्लास्टिक मेष, जो जगह में सैम रखती है, तरल पदार्थ का पूरा रेफरेंस की अनुमति शामिल है । वैकल्पिक रूप से, अगर संक्रामक सामग्री के साथ काम कर रहे, एक ०.२२ µm ताकना आकार के साथ स्पिन फिल्टर का उपयोग करें । इन फिल्टर नमूने निष्फल जाएगा और संदिग्ध माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण के साथ नमूनों के लिए उपयुक्त हैं । हालांकि, गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन के आधार पर मध्यस्थों की बाइंडिंग को कम करने के लिए इन फ़िल्टर्स को बफ़र के साथ पूर्व-मशीन होना चाहिए.
    4. नम सैम को स्पिन फिल् मों में ट्रांसफर करने के लिए निष्फल संदंश का प्रयोग करें । संक्रमण को रोकने के लिए नमूनों के बीच संदंश बदलें ।
    5. एक मिनी में १६,००० x g पर 20 मिनट के लिए नमूनों केंद्रापसारक-4 ° c करने के लिए ठंडा केंद्रापसारक ।
  4. सारांश उदाहरण प्रोटोकॉल
    1. प्रयोगशाला में, लेबल 2 मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों नमूना संग्रह के लिए और रेफरेंस बफर की वांछित मात्रा जोड़ने (आमतौर पर एनए के लिए ३०० µ l, १०० µ एल के लिए बीए). ढक्कन और बर्फ पर जगह सील ।
    2. नमूने के बाद (या तो तुरंत या लैब में) सैम संदंश का उपयोग कर संभाल से हटा दिया जाता है और संग्रह ट्यूब युक्त बफर में रखा (पिछले चरण में उत्पादित) । सुनिश्चित microcentrifuge ट्यूब की टोपी सुरक्षित रूप से बंद कर दिया और नमूनों हस्तांतरण, बर्फ पर, आगे प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला के लिए.
    3. 30 एस के लिए उनके स्थानांतरण कंटेनर और भंवर मिश्रण से सैम और रेफरेंस बफर युक्त ट्यूबों निकालें
    4. बाँझ संदंश का प्रयोग, सैम को हटाने और एक स्पिन कॉलम में जगह (के साथ या बिना ०.२२ µm फाइबर एसीटेट फ़िल्टर).
    5. संग्रह ट्यूब से और बनाए रखने के रेफरेंस बफर ले लीजिए ।
    6. प्लेस स्पिन कॉलम, सैम के साथ, मूल संग्रह ट्यूब में (या एक नया अगर बाँझ-नमूने को छानने) और कॉलम स्पिन करने के लिए संग्रह बफर जोड़ें । इस तरीके में, धोने द्रव स्पिन कॉलम के माध्यम से वापस संग्रह ट्यूब में पारित होगा, सैम से नमूना elute करने में मदद ।
    7. (१६,००० एक्स जी, 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) सील ढक्कन के साथ नमूने केंद्रापसारक ।
    8. एक रैक में केंद्रापसारक और जगह से नमूने निकालें ।
    9. ट्यूबों के सील ढक्कन खोलो और स्पिन सैम युक्त स्तंभ हटा दें । एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में सैम और स्पिन कॉलम के निपटान ।
    10. ध्यान से बला क्रायोजेनिक ट्यूबों में ट्यूब के भीतर निहित eluate aliquot । eluate की कुल मात्रा और प्रत्येक aliquot में मात्रा रिकॉर्ड करें ।
    11. एक-80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर करने के लिए सील क्रायोजेनिक ट्यूबों हस्तांतरण और उपयोग जब तक ईमानदार दुकान ।

Representative Results

ना आसानी से और गैर इनवेसिव श्लैष्मिक सूजन को मापने के लिए अध्ययन की एक संख्या में उपयोग किया गया है । नाक के लिए एलर्जी के बाद प्रशासन, प्रोस्टाग्लैंडीन-D2 (PGD2) के स्तर मिनट के भीतर वृद्धि और गिरावट के लिए मनाया जा सकता है (चित्रा 1), मस्तूल सेल दानेदार (Thwaites एट अल., तैयारी में पांडुलिपि के साथ लाइन में) । इसके अतिरिक्त, प्रकार के मध्यस्थों-II सूजन, जैसे IL-5 (चित्रा 2, 24से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित), नाक एलर्जी को चुनौती के बाद घंटे में मापा जा सकता है23,24. एलर्जी दमा और स्वस्थ नियंत्रण के प्रयोगात्मक संक्रमण में, ना इंटरफेरॉन-गामा (IFN-γ) सहित मध्यस्थों के एक पैनल को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था, 7 दिनों के पाठ्यक्रम पर (चित्रा 3, 6से अनुमति के साथ reprinted). इसके अतिरिक्त, प्राकृतिक श्वसन syncytial वायरस (RSV) शिशुओं के संक्रमण में, ना प्रदर्शन किया RSV भड़काऊ साइटोकिंस के ऊंचा स्तर के साथ जुड़े होने के लिए, जैसे IFN-γ, RSV और स्वस्थ नियंत्रण के साथ गैर-bronchiolitis शिशुओं के सापेक्ष ( चित्रा 4, 30से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित) । दिलचस्प है, RSV और गैर RSV bronchiolitis के बीच यह भेदभाव समय मिलान एनपीए नमूनों में महत्वपूर्ण नहीं था (चित्रा 4) ।

राइनोवायरस के साथ एलर्जी दमा के प्रायोगिक संक्रमण के दौरान भी बीए का इस्तेमाल किया गया । राइनोवायरस संक्रमण के 4 दिन में, IFN के स्तर-γ, CXCL11, il-10, और il-5 आधार रेखा से ऊपर उठाया गया था (चित्र 5; ए, बी, सी और डी, क्रमशः). इसके अतिरिक्त, इस तकनीक राइनोवायरस संक्रमण के दौरान एलर्जी दमा के निचले airway में ऊंचा आईएल-5 के स्तर को प्रदर्शित किया, स्वस्थ नियंत्रण (चित्रा 5d) (चित्रा 5 के सापेक्ष से अनुमति के साथ reprinted 6) ।

इन प्रतिनिधि परिणामों के नमूनों eluted से उत्पंन परख ०.०५% के बीच-20 और 1% BSA युक्त बफर का उपयोग कर रहे थे ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

Figure 1
चित्र 1 : तीव्र उत्पादन और प्रोस्टाग्लैंडीन की मंजूरी-D2 नाक एलर्जी चुनौती के बाद । प्रोस्टाग्लैंडीन के स्तर-D2 (PGD2) तीमुथियुस घास पराग के साथ नाक एलर्जी चुनौती निम्नलिखित सीरियल नमूनों में नाक अवशोषण eluates से मापा (एन = 5). प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्ति से डेटा का प्रतिनिधित्व करती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : आईएल-5 के काइनेटिक माप नाक एलर्जी के बाद चुनौती । नाक एलर्जी चैलेंज के बाद धारावाहिक नाक अवशोषण के नमूनों में आईएल-5 का उत्पादन । तीन दोहराने एलर्जी की चुनौती के अध्ययन, प्रतिभागियों (n = 19) placebo प्राप्त (नीला), कम खुराक (10 मिलीग्राम) मौखिक प्रेडनिसोन (नारंगी), या उच्च खुराक (25 मिलीग्राम) मौखिक प्रेडनिसोन (लाल) एक घंटे से पहले एलर्जी प्रशासन के साथ आयोजित किया गया । लाइनों ज्यामितीय माध्य और त्रुटि पट्टियां निरूपित सभी प्रतिभागियों के ९५% विश्वास अंतराल हैं । (चित्रा लीक एट अल., श्लैष्मिक इम्यूनोलॉजी, २०१७) से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : राइनोवायरस संक्रमण के दौरान इंटरफेरॉन-γ की प्रेरण । स्वस्थ वयस्कों के संक्रमण चुनौती के दौरान (n = 11, नीला) और एलर्जी दमा (n = 28, लाल) राइनोवायरस-16 के साथ, नाक अवशोषण नमूना इंटरफेरॉन-γ (IFN-γ) के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । डेटा के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे है एक) कच्चे व्यक्तियों के स्पेगेटी भूखंडों और बी) त्रुटि interquartile पर्वतमाला टिप्पण सलाखों के साथ माध्य स्तर । (हंसेल एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित चित्रा । 6). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : शिशुओं के RSV इंफेक्शन से जुड़े Nasosorption का भेदभाव ऊंचा इंटरफेरॉन-γ । नाक अवशोषण और nasopharyngeal आकांक्षा (एनपीए) श्वसन syncytial वायरस (RSV) संक्रमण (लाल, एन = 12), एक गैर RSV श्वसन रोगज़नक़ (ग्रीन, एन = 12), और स्वस्थ के साथ जुड़े bronchiolitis के साथ शिशुओं में इंटरफेरॉन-γ स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया नियंत्रण (नीला, n = 9) । एकाधिक तुलना के लिए डन सुधार के साथ एक Kruskall-वालिस परीक्षण का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण किया गया (* * *p< 0.001) । रेखाएं माध्य मान और त्रुटि पट्टियां interquartile श्रेणियां हैं । (Thwaites एट अल से अनुमति के साथ संशोधित आंकड़ा. 30). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5 : राइनोवायरस संक्रमण के दौरान दमा अवशोषण नमूनों में भड़काऊ मध्यस्थों.
निंनलिखित राइनोवायरस-16 स्वस्थ नियंत्रण के संक्रमण (n = 10, नीला) और एलर्जी दमा स्वयंसेवकों (n = 23, लाल), दमा अवशोषण एक के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था) IFN-γ, ख) CXCL11, सी) आईएल-10, और घ) बेसलाइन पर 5 और संक्रमण के दिन 4. Wilcoxon हस्ताक्षरित रैंक टेस्ट (मिलान नमूनों) और मान-Whitney टेस्ट (बेजोड़ नमूने) द्वारा विश्लेषण डेटा. हंसेल एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित चित्रा । ६ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

मौजूदा airway नमूना तकनीकों से परिणाम उच्च चर के रूप में माना जाता है; वैकल्पिक नमूना तकनीक के लिए इस क्षेत्र में अनुसंधान का मानकीकरण की जरूरत है5। एनए और बीए एक गैर इनवेसिव तरीके से MLF के नमूने की अनुमति है, और रोमांचक करने के लिए स्वस्थ और रोगग्रस्त एयरवेज में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को मापने की क्षमता है । इन तकनीकों मौजूदा तकनीक पर कई संभावित लाभ की पेशकश, अधिक से अधिक सहनशीलता, नमूना की गति सहित, अक्सर नमूना दोहराने की क्षमता, कम अंतर उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता, और प्रतिरक्षा मध्यस्थों की कमी हुई5 . अवशोषण की अवधि और प्रसंस्करण तकनीक का इस्तेमाल किया प्रत्येक अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और कड़ाई से नमूना घटनाओं के बीच बनाए रखा । इसके अतिरिक्त, बीए के मामले में, airway के भीतर नमूने की साइट सावधानी से व्यक्तियों के बीच दोहराया जाना चाहिए ।

ना, और विशेष रूप से बीए, नैदानिक अनुसंधान के लिए अभी भी अपेक्षाकृत उपंयास तकनीक हैं । हालांकि, इन तकनीकों का लाभ कई अध्ययनों में उनके उपयोग में हुई है, वैकल्पिक तकनीक के खिलाफ सावधान सत्यापन5सहित । इन उपकरणों अब CE-चिह्नित श्वसन अनुसंधान में व्यापक उपयोग के लिए तैयार उपकरणों के रूप में उपलब्ध हैं । जबकि एनए और अधिक वैकल्पिक नमूना तकनीक से छोटे नमूना मात्रा में बीए परिणाम, उच्च प्राप्त सांद्रता कम बहुतायत प्रतिरक्षा मध्यस्थों के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता में परिणाम कर सकते हैं ।

वांछित बहाव अनुप्रयोगों पर निर्भर करता है, ना और बीए के नमूनों को सीधे बाद में प्रसंस्करण के लिए जम सकता है, एक नैदानिक अनुसंधान वातावरण में अध्ययन व्यवहार्यता को बढ़ाने. नमूना हैंडलिंग के लिए प्रोटोकॉल भी विशेष बहाव अनुप्रयोगों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है । सुझाया प्रसंस्करण तकनीक प्रोटीन या लिपिड प्रतिरक्षा मध्यस्थों या न्यूक्लिक एसिड के संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, MLF अलग बफ़र्स के साथ eluted किया जा सकता है । सबसे पहले, immunoassay बफर श्लैष्मिक साइटोकिंस, chemokines, और एंटीबॉडी6,४५मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उच्च डिटर्जेंट के स्तर के साथ बफ़र्स भी सेल lysis होता है गारंटी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इंट्रा सेलुलर साइटोकिंस के शामिल किए जाने की अनुमति । Chaotropic आरएनए निष्कर्षण बफ़र्स वायरल संक्रमण, वायरल लोड, मेजबान mRNA, और microbiome के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, कार्बनिक सॉल्वैंट्स lipidomics और जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

अंत में, श्लैष्मिक सतहों से MLF के प्रत्यक्ष अवशोषण श्वसन, गैस्ट्रो आंत्र, मूत्रजननांगी, और अन्य श्लैष्मिक रोगों में संभावित उपयोग के साथ एक रोमांचक तकनीक है । हालांकि, इन होनहार अवशोषण तकनीक नमूने और व्यक्तिगत परख के लिए प्रसंस्करण तकनीक के सटीक सत्यापन की आवश्यकता होगी (एक रोग सेटिंग में मार्क्स) । इसके अलावा, इन उपंयास परिशुद्धता श्लैष्मिक नमूना तकनीक ऐसे रक्त, सांस से, और थूक के रूप में पारंपरिक नमूनों, के खिलाफ सत्यापन की आवश्यकता होगी । इन तकनीकों के साथ, MLF रोगाणुओं, साइटोकिंस, chemokines, prostanoids, और एंटीबॉडी को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

धन: यह काम इंपीरियल नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च (NIHR) बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर (BRC), NIHR हेल्थ प्रोटेक्शन रिसर्च यूनिट (HPRU) की भागीदारी में इंपीरियल कॉलेज लंदन में श्वसन संक्रमण में से धन द्वारा समर्थित किया गया पब्लिक हेल्थ इंग्लैंड (PHE) और NIHR इंपीरियल मरीज सेफ्टी ट्रांसलेशनल रिसर्च सेंटर के साथ । व्यक्त विचार लेखकों के है और जरूरी नहीं कि एन एच एस, NIHR, स्वास्थ्य विभाग या सार्वजनिक स्वास्थ्य इंग्लैंड के उन लोगों के हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasosorption (adult, 7mm width) Hunt Developments NSFL-FXI-11 Different sizes are available for different patient groups/ages.
Bronchosorption Hunt Developments BSFL-FXI-11 Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) Sigma Aldrich CLS9301-1000EA
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) Sigma Aldrich CLS8160-24EA For sterilisation of samples with infection risk.
Assay (elution) buffer Millipore AB-33k Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.
NP-40 Cell lysis buffer Life Technologies FNN0021 Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.
Buffer RLT (RNA extraction) Qiagen 79216 Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031-100ML-M For elution of samples to be used in HPLC applications
2.0ml micro-centrifuge tubes Costar 3213 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.

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Thwaites, R. S., Jarvis, H. C., Singh, N., Jha, A., Pritchard, A., Fan, H., Tunstall, T., Nanan, J., Nadel, S., Kon, O. M., Openshaw, P. J., Hansel, T. T. Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples. J. Vis. Exp. (131), e56413, doi:10.3791/56413 (2018).

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