Summary
Detta manuskript beskriver användningen av nasal och bronkiell absorption tekniker, specifikt använder syntetiska absorptive matriser (SAM) för att prova slemhinna slemhinnan vätskan (MLF) av övre och nedre luftvägarna. Dessa metoder ger bättre standardisering och tolerabilitet än befintlig respiratoriska urvalsmetoder.
Abstract
Metoder för nasal absorption (NA) och bronkial absorption (BA) använda syntetiska absorptive matriser (SAM) för att absorbera den slemhinna slemhinnan vätskan (MLF) av människans luftvägar. NA är en icke-invasiv teknik som absorberar vätska från sämre Concha, och orsakar minsta möjliga obehag. NA har gett reproducerbara resultat med möjlighet att ofta upprepa provtagning av de övre luftvägarna.
I jämförelse, alternativa metoder för provtagning respiratoriska slemhinnan, såsom nasofaryngealt aspiration (NPA) och konventionella badda, är mer invasiv och kan resultera i större data variabilitet. Andra metoder har begränsningar, till exempel biopsier och bronkial förfaranden är invasiva, sputum innehåller många döda och döende celler och kräver kondensering, utandningsluften kondens (EBC) innehåller vatten och saliv och lavage prover är utspädd och variabel.
BA kan utföras genom arbetar kanalen av en bronkoskopet i klinik. Provtagning är väl tolererad och kan bedrivas på flera platser i luftvägarna. BA resulterar i MLF prover vara mindre utspädd än bronkoalveolär lavage (BAL) prover.
Denna artikel visar tekniker för NA och BA, samt laboratorium bearbetning av de resulterande tar prov, som kan anpassas till den önskade nedströms biomarkör som mäts. Dessa absorption tekniker är användbara alternativ till de konventionella provtagning tekniker som används i kliniska respiratorisk forskning.
Introduction
De flesta respiratoriska sjukdomar orsakar en inflammatorisk reaktion, och det finns ett akut behov för provtagning från luftvägarna slemhinneepitel i allergisk rinit, virus-och svampinfektioner, tuberkulos, astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, pulmonell fibros och lung cancer 1. Nasofaryngealt aspirera (NPA), nasal lavage och bronkoalveolär lavage (BAL) är vanliga tekniker för provtagning övre och nedre luftvägarna. Dock närvarande dessa tekniker avsevärda problem inklusive dålig tolerabilitet, utspädning av inflammatoriska mediatorer och oförmågan att ofta upprepa provtagning2. Ett alternativ till NPA provtagning är användningen av kompresser, antingen nylon flockade, bomull eller rayon3,4, men dessa har också begränsningar, eftersom de orsakar obehag och skador på nasal epitel, och i vissa fall irreversibla bindning av inflammatoriska mediatorer5. Dessa tekniker kan inte generellt upprepas seriellt över en timme, och alternativa tekniker kan vara effektivare för upptäckt av låga överflöd cytokiner och chemokiner5,6. Dessutom kan användaren variabiliteten är associerad med dessa tekniker genererar inkonsekvenser i data, vilket resulterar i kravet på större patientgrupper.
Alternativt har absorption-tekniker som utnyttjar både naturliga och syntetiska svampar använts för att samla MLF från slemhinnorna. Oftalmologiska svampar består av naturlig cellulosa (t.ex., Weck-cel) har använts till exempel saliv, livmoderhalscancer, och slidsekret7. Dessutom syntetiska svampar tillverkad av polyvinylalkohol (PVA) och hydroxylerade polyvinylacetat (HPVA) har varit utnyttjad8. Sju olika absorberande material har jämförts för provtagning oral vätska före mätning antikroppar9, medan polyuretan mini-svampar har använts för att samla mänskliga tårar10.
Filter papper bestående av naturlig cellulosa från bomullsväxten har använts i stor utsträckning att absorbera nasala secretions sedan banbrytande papperet Alam och kollegor 199211,12,13,14, 15,16,17. Filtrerpapper skivor har framställts från filtret kort (t.ex. Shandon) och har använts för att mäta histaminer och cytokiner efter kontrollerade nasal allergen utmaningar och med naturliga allergen exponering18,19 ,20,21. Olika partier av filterpapper varierar dock i deras grad av proteinbindning och vissa misslyckas att släppa cytokiner. Metoder med en syntetisk absorptive matris (SAM) har därför varit utvecklade2,22,23. SAMs är nu allmänt används att erhålla nasal MLF av NA. Dessa absorberande material är bekväma att använda och kan få MLF även från inflammerade näsor med täta intervall över längre tidsperioder.
Nasal absorption är en form av Precision slemhinnor provtagning med hjälp av en SAM för provtagning av MLF i de övre luftvägarna. NA enheter tillverkas som CE-märkta medicintekniska produkter från medicinsk kvalitet material med rena rum och är fria från damm och allergener. NA Provtagaren består av ett handtag och SAM i en steril cryotube. SAM består av polymerer, typiskt fibrer, men det finns också som skum, och dessa är valda för att vara mjuk och absorberande, med snabba fuktspridande för provinsamling. SAMs har minimal proteinbindning att tillåta den effektiva elueringen av absorberad sekret. NA är en mycket mild, icke-invasiv teknik som kan utföras på givare i alla åldrar. Dessutom är seriell provtagning, även varje några minuter, möjligt. NA har validerats mot befintliga övre luftvägarna provtagning tekniker5 och upprepad provtagning har gjort generation av kinetiska data efter utmaning av luftvägarna med allergen23,24,25, bakteriell endotoxin26 och viral-typen TLR agonister (RIF, A. et al., manuskript i förberedelse). NA har också använts i spädbarn att undersöka den naturliga historien om atopi27,28,29 och viral bronkiolit30.
Bronkoskopiska microsampling (BMS) är ett förfarande för uppbörd av MLF i de nedersta luftvägarna som har utvecklats av Olympus31,32,33. Tyvärr är detta BMS system endast licensierade i Japan. Olympus levererar två BMS system: en med en fibrös hydroxylerade polyester (FHPE) sond34,35,36,37, och en med en bomull sond33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. en stor stötesten har varit att BMS sonden används hos patienter med astma orsakas slemhinnor blödning, med hälften av alla prover som förorenats med blod. Författarna drog slutsatsen att det inte var möjligt att provet MLF med detta BMS system från perifera luftvägarna astma patienter43.
Som ett alternativ, har vi utvecklat BA använder en mjuk SAM som kan utföras under Bronkoskopiska utredningen av de nedersta luftvägarna, inklusive efter experimentell infektion av astmatiska patienter med rhinovirus6. BA enheten består av: en extern ihåliga kateter, en hand-pjäs som på aktiveringen strängpressar SAM och en central plast ledare som har SAM på högkant. När det gäller NA, BA kit är tillverkade av medicinsk kvalitet material med rena rum och är fria från damm och allergener. Enheter är dessutom CE-märkt och tillhandahålls gamma-bestrålade. SAM remsan är mjuk, absorberande och har snabb fuktspridande för provinsamling. Det har också minimal proteinbindning att tillåta den effektiva elueringen av absorberad sekret. Enheten kan passa genom kanalen arbeta av en bronkoskopet och kan användas för att snabbt och prova exakt MLF på specifika platser av intresse i luftvägarna. Till skillnad från BAL eller BMS leder inte BA i kontakt blödning eller ytterligare patientens obehag efter ingreppet.
Noggrann hänsyn bör tas till behandling av NA och BA prover. Prover kan vara direkt fryst och bearbetas i omgångar eller kan behandlas omedelbart. Vilken typ av behandling kan skräddarsys mot vissa nedströms tillämpningar, inklusive immunanalyser för cytokiner, chemokiner och immunglobuliner eller elutions av virala, bakteriella, och värdcell associerade RNA. Vi presenterar kliniska insamling och laboratorium bearbetningsmetoder som är associerad med NA och BA som en guide för kliniska forskare.
Protocol
De tekniker som används i följande protokoll har godkänts av West London forskning etikkommittén (referensnummer 15/lO/0444).
1. nasal Absorption (NA)
-
Förberedelser före NA provtagning
- När de utför NA, först tvätta händerna och sätta på handskar, helst framför patienten.
- Inspektera näshålan med en pannlampa och har klinikern använder deras icke-dominanta tumme att dra tillbaka patientens näsa för att visualisera näshålan.
Obs: En nasal spekulum krävs inte vanligtvis. - Visualisera näshålan och sämre Concha före provtagningen.
Obs: Näsborrarna (näsborrar) är inte runda tvärsnitt och de går rakt bakåt. I allmänhet sämre Concha kan ses som en utbuktning eller indrag på den laterala väggen i näsborren, med nässkiljeväggen bildar slät, platt mediala väggen. Vi vill att prov från detta sämre Concha, eftersom det underliggande epitelet är en enkel cilierade epitel av luftvägarna44.
-
NA provtagning
- När provtagning, passera NA SAM försiktigt upp lumen i näsborren, kartkanten det vara platt mot sämre Concha.
- Fråga givaren att använda ett pekfinger för att trycka SAM på nässlemhinnan. NA kan orsaka en lätt kittlande, med möjligt ögat vattning, som MLF absorberas.
Obs: I vuxna, utför vi generellt NA för 60 s. - Efter absorptionen av MLF, bort NA enheten från näsborren och sätta tillbaka till den ursprungliga rör.
- Bearbeta proverna omedelbart i laboratoriet eller frysa dem, som beskrivs senare i detta protokoll.
Obs: NA är studeras i en mängd nasal slemhinnor utmaning modeller, och även i olika luftvägssjukdomar. Validering mot andra respiratoriska provtagningsmetoder bör dock utföras för varje studie och patient populationen.
2. bronkial Absorption (BA)
-
Förberedelser före BA provtagning
Obs: BA utförs av specialiserad personal i en bronkoskopi svit.- Innan du placerar BA enheten ner katetern, kontrollera att SAM är extrudering och drar tillbaka i katetern.
- Innan BA på en patient, genomföra en mock BA på en bronkoskopi simulator.
-
BA provtagning
- Passera bronkoskopet ner i luftstrupen och rätt huvudsakliga luftrör till nivån för den luftrör intermedius, strax proximalt till uppdelningen i de högra nedre och höger mellersta loberna.
Obs: Vi normalt prov från den luftrör intermedius, även om andra platser inom luftvägarna kan avsmakas. När att observera katetern och SAM, se inte en bronkoskopet spetsen. Vi observerar följande enkla steg för BA, när bronkoskopet har nått den önskade provtagningsplatsen. - KATETER ner: Infoga BA katetern genom operativa kanalen av bronkoskopet tills den vita spetsen är bara synliga i luftvägarna, till högst 1 cm distalt i slutet av bronkoskopet. Hålla bronkoskopet och katetern spetsen i mitten av lumen av luftvägarna. Var noga med att minimera kontakt mellan kateterspetsen och bronkial slemhinna att minska risken för nötning till slemhinnan.
- SAM OUT: Tryck in handtaget på BA enheten så att SAM är extruderas till lumen av just mitten eller nedre högra loben luftvägarna. Under direkt uppsikt, böj toppen av bronkoskopet att se till att SAM kontakt med MLF på luftvägarna väggen. Lämna SAM inom luftvägarna, platta till slemhinnor väggen för 30 s.
- SAM IN: Titta igenom bronkoskopet för att fuktig SAM sonden är raka och inte böjt tillbaka över avsluta av katetern. Om så krävs, kan katetern och bronkoskopet spetsen föras tillbaka till räta SAM. Under direkt uppsikt, återkalla den raka SAM försiktigt tillbaka in i katetern.
Obs: Om det finns svårigheter Upprullningskraften SAM tillbaka in katetern, återkalla hela enheten med SAM extruderade tillbaka ut ur luftvägarna. - KATETERN upp: Återkalla hela katetern från driftskanal för bronkoskopet.
- SKÄR av SAM: SAM är avskuren med steril sax och sätts sedan in i en cryotube på isen. Dessa prover kan behandlas med olika metoder, som beskrivs senare i detta protokoll.
- Passera bronkoskopet ner i luftstrupen och rätt huvudsakliga luftrör till nivån för den luftrör intermedius, strax proximalt till uppdelningen i de högra nedre och höger mellersta loberna.
3. bearbetningen av NA och BA prover
Obs: Det finns många alternativ för laboratoriet bearbetning av prover som härrör från NA och BA. Dessa protokoll försöka lagra prover för senare användning, och eluera MLF provet från SAM.
-
Alternativ för omedelbar hantering av prover NA och BA
- Alternativ 1: Lagra fuktig SAM på is under några timmar före vidare bearbetning.
- Alternativ 2: Omedelbart djupfryst NA SAMs i samlingen tube. På samma sätt frysa BA SAMs i kryogena injektionsflaskor efter avlägsnande, med sax, från provtagningsanordningen.
- Alternativ 3: Placera den fristående SAM i eluering buffert (300 µL) före bearbetning direkt eller djup frysning.
-
Alternativ för eluering buffert för NA och BA prover
Obs: Valet av eluering buffert beror på vad som ska analyseras i MLF provet och vi föreslår fyra huvudalternativ:- Använd en färdiga analysbuffert passar immunoassay förfaranden. Dessa buffertar bör innehålla en liten mängd av tvättmedel (0,05%) samt protein, t.ex., bovint serum albumin (BSA) på 1%.
- Alternativt använda en buffert som innehåller en större mängd diskmedel, så att cellen lysis uppstår.
Obs: Vi använder buffertar som innehåller Triton-X eller NP40 vid koncentration av 1%. Cell lysis buffertar aktivera både intracellulär och extracellulär cytokiner att vara elueras från SAM och allmänt leda till högre halter av cytokiner och chemokiner. Dessa buffertar bör också innehålla protein och görs med BSA att 1%. - För RNA mätningar, såsom kvantitativa PCR av viralt RNA eller mäta värd RNA, lägga till RNA extraktion buffert direkt fuktig SAM.
Obs: Chaotropic RNA extraktion buffertar innehåller guanidinium som denaturerar proteiner. Ett alternativ är att lägga till RNA extraktion buffert den eluerade MLF fluid i immunoassay eller cell lyseringsbuffert. - Använda organiska lösningsmedel, såsom trifluorättiksyra, för utvinning av lipider och metaboliter, för utvärdering av mass-spektrometri.
Obs: Detaljer för alla dessa reagenser ingår i avsnittet material.
-
Eluering teknik
- För någon av de ovanstående eluering teknikerna, infoga SAM i en 2 mL mikro-centrifugrör, tillsammans med önskad utvinning bufferten.
- Vortex blanda provet för 30 s att tvätta SAM av löst bifogade vätskor och biomolekyler.
- För att säkerställa full prov återhämtning, utföra centrifugal eluering genom att lägga till fuktig SAM en spin filter mini kolumn som infogar i samma 2 mL mikro-centrifugröret tvättvatten.
Obs: Två typer av spin filter mini kolumnen kan användas. Först innehåller endast ett plastnät, som håller SAM på plats, så att full eluering av vätskor. Alternativt, om arbetar med smittsamt, använda spin filter med en 0,22 µm porstorlek. Dessa filter kommer att sterilisera prover och lämpar sig för prover med misstänkta mykobakteriella infektioner. Dessa filter bör dock före ruvade med buffert, att minimera bindningen av medlare till filtret genom icke-specifika interaktioner. - Använd steriliserad pincett för att överföra fuktig SAM till spin filtret. Ändra tången mellan prover att förhindra kontaminering.
- Centrifugera proverna för 20 min vid 16 000 x g i en mini centrifug kylas till 4 ° C.
-
Sammanfattning exempel protokoll
- I laboratoriet, etikett 2 mL mikro-centrifugrör för provinsamling och tillsätt önskad mängd eluering buffert (normalt 300 µL för NA; 100 µL för BA). Förslut locket och placera på is.
- Efter provtagning (antingen omedelbart eller i labbet) SAM avlägsnas från handtaget med hjälp av pincetten och placeras in i bufferten som innehåller insamling tube (produceras i föregående steg). Se till att locket på mikrocentrifug röret är ordentligt stängd och överföra proverna, på isen, till laboratoriet för vidare bearbetning.
- Ta bort rör som innehåller SAM och eluering buffert från deras överföring behållaren och vortex mix för 30 s.
- Med hjälp av steril pincett, ta bort SAM och placera i en spin kolumn (med eller utan 0,22 µm cellulosaacetat filter).
- Samla eluering bufferten från samling röret och behålla.
- Placera den spin kolumnen, med SAM, i ursprungliga samling röret (eller en ny om filtrering av sterila prover) och lägga till samling buffert för att snurra kolumn. På detta sätt passerar tvättvätskan genom kolumnen snurra tillbaka in i samling röret, hjälper till att eluera provet från SAM.
- Centrifugera proverna med lock förseglade (16 000 x g, 20 min, 4 ° C).
- Ta bort proverna från centrifugen och placera i ett rack.
- Öppna rören förseglat lock och ta bort den spin kolumn som innehåller SAM. Kassera SAM och spin kolumn i en lämplig avfallsbehållare.
- Noggrant slangar alikvot eluatet i röret in märkt kryogen. Anteckna den totala volymen av eluatet och volymen i varje delprov.
- Överföra de förseglade kryogena rören till-80 ° C frys och förvaras upprätt fram till användning.
Representative Results
NA har utnyttjats i ett antal studier för att enkelt och icke-invasivt mäta slemhinneinflammation. Efter administrering av allergen till näsan, prostaglandin-D2 (PGD2) nivåer kan observeras att stiga och falla inom minuter (figur 1), i linje med mast cell degranulering (Thwaites et al., manuskript i förberedelse). Medlare av typ II inflammation, till exempel IL-5 (figur 2, omtryckt med tillåtelse från 24), kan dessutom mätas i timmarna efter nasal allergen utmaning23,24. I experimentell infektion av allergiska astmatiker och friska kontroller användes NA för att mäta en panel av mediatorer, inklusive interferon-gamma (IFN-γ), under loppet av 7 dagar (figur 3, återges med tillstånd från 6). Dessutom i naturlig respiratory syncytial virus (RSV) infektion av spädbarn visade NA RSV som ska associeras med förhöjda nivåer av inflammatoriska cytokiner, såsom IFN-γ, i förhållande till icke-RSV spädbarn med bronkiolit och friska kontroller ( Figur 4, omtryckt med tillåtelse från 30). Denna diskriminering mellan RSV och icke-RSV bronkiolit var intressant, inte signifikant i tidsmatchade NPA prover (figur 4).
BA användes även under experimentell infektion av allergiska astmatiker med rhinovirus. På dag 4 av rhinovirus infektion, nivåer av IFN-γ, CXCL11, var IL-10 och IL-5 förhöjda från baslinjen (figur 5. A, B, C och D, respektive). Dessutom, visat denna teknik förhöjt IL-5 nivåer i de nedersta luftvägarna av allergiska astmatiker under rhinovirus infektion, jämfört med friska kontroller (figur 5 d), (figur 5 återges med tillstånd från 6).
Dessa representativa resultat genererades från prover som elueras med Analysbuffert innehållande 0,05% Tween-20 och 1% BSA (se Tabell för material).
Figur 1 : Snabb generering och clearance av prostaglandin-D2 efter nasal allergen utmaning. Nivåer av prostaglandin-D2 (PGD2) mätt från nasal absorption eluat i seriell prover efter nasal allergen utmaning med Timothy gräspollen (n = 5). Varje rad representerar data från en privatperson. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Kinetic mätning av IL-5 efter nasal allergen utmaning. Produktion av IL-5 i seriell nasal absorption prover efter nasal allergen utmaning. Tre upprepa allergen utmaning studier utfördes, med deltagarna (n = 19) som fick placebo (blå), låg dos (10 mg) peroralt prednison (orange), eller hög dos (25 mg) peroralt prednison (röd) en timme före administrering av allergen. Linjerna beteckna geometriska medelvärdet och felstaplar är 95% konfidensintervallen för alla deltagare. (Diagram återges med tillstånd från Leaker et al., Mucosal immunologi, 2017). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Induktion av Interferon-γ under rhinovirus infektion. Under infektion utmaning av friska vuxna (n = 11, blå) och allergiska astmatiker (n = 28, röd) med rhinovirus-16, nasal absorption provtagning användes för att mäta nivåerna av interferon-γ (IFN-γ). Data representeras A) rå spaghetti tomter individer och B) median nivåer med felstaplar som betecknar interquartile spänner. (Diagram återges med tillstånd från Hansel o.a. 6). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Nasosorption diskriminerar förhöjda Interferon-γ är associerad med RSV-infektion av spädbarn. Nasal absorption och nasofaryngealt aspiration (NPA) användes för att mäta interferon-γ hos spädbarn med bronkiolit associerad med respiratoriska syncytial virus (RSV) infektion (röd, n = 12), en icke-RSV respiratory patogen (grön, n = 12), och friska kontroller (blå, n = 9). Data analyserades med en Kruskall-Wallis test med Dunns korrigering för multipla jämförelser (***p< 0,001). Linjerna anger medianvärden och felstaplar är interquartile spänner. (Bild med tillstånd från Thwaites o.a. 30). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Inflammatoriska mediatorer i bronkial absorption prover under rhinovirus infektion.
Efter rhinovirus-16 infektion av friska kontroller (n = 10, blå) och allergiska astmatiker frivilliga (n = 23, röd), bronkial absorption användes för att mäta nivåerna av A) IFN-γ, B) CXCL11, C) IL-10 och IL-5 D) vid baseline och på dag 4 av infektion. Data analyseras av Wilcoxon undertecknade rank-test (matchade prover) och Mann-Whitney test (oöverträffad prover). Figur återges med tillstånd från Hansel o.a. 6 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Resultat från befintliga luftvägarna urvalsmetoder betraktas som mycket varierande; alternativa urvalsmetoder behövs för att standardisera forskning inom detta fält5. NA BA tillåter provtagning av MLF på ett icke-invasivt sätt och har spännande potential att mäta immunsvar hos friska och sjuka luftvägarna. Dessa tekniker erbjuder många potentiella fördelar jämfört med befintliga tekniker, inklusive större tolerabilitet, hastigheten på provtagning, förmåga att ofta upprepa provtagning, lägre mellan användaren variabilitet, och minskade utspädning av immun medlare5 . Varaktigheten av absorption och den bearbetningsteknik som används bör vara optimerad för varje studie och upprätthålls noggrant mellan provtagning händelser. Dessutom, när det gäller BA, bör platsen för provtagning inom luftvägarna noggrant replikeras mellan individer.
NA och särskilt BA, är fortfarande relativt ny tekniker för klinisk forskning. Fördelarna med dessa tekniker har dock resulterat i deras användning i många studier, inklusive noggrann validering mot alternativa tekniker5. Dessa enheter är nu tillgängliga som CE-märkta enheter redo för utbredd användning i respiratorisk forskning. Även NA och BA resultera i mycket mindre provvolymer än alternativa urvalsmetoder, kan högre erhållna koncentrationer leda till större känslighet för låga överflöd immun medlare.
Beroende på önskad nedströms tillämpningar, kan NA och BA prover direkt frysas för senare bearbetning, förbättra studie genomförbarhet i en miljö med klinisk forskning. Protokollet för provhantering kan också anpassas efter särskilda nedströms applikationer. De föreslagna behandlingen teknikerna kan användas för insamling av protein eller lipid immun medlare eller nucleic syror, men bör optimeras för varje studie. MLF kan i synnerhet vara elueras med olika buffertar. För det första kan immunoassay buffert användas för att mäta slemhinnor cytokiner, chemokiner och antikroppar6,45. Buffertar med högre tvättmedel kan också användas för att garantera cellys inträffar, att tillåta införandet av inom cellulär cytokiner. Chaotropic RNA-extraktion buffertar bör användas för bestämning av virusinfektion, viral load, värd mRNA, och mikrobiomet. Organiska lösningsmedel kan alternativt användas för gammaldags och masspektrometri.
Sammanfattningsvis, är direkt upptagning av MLF från slemhinnorna en spännande teknik med potentiella användning i luftvägarna, gastrointestinal, urogenital och andra slemhinnor sjukdomar. Dock kommer dessa lovande absorption tekniker kräver exakt validering av provtagning och bearbetning teknik för enskilda analyser (biomarkörer) i varje sjukdom inställning. Dessutom kräver dessa roman precision slemhinnor urvalsmetoder validering mot konventionella prover, såsom från blod, andetag och sputum. Med dessa tekniker, kan MLF användas för att mäta mikrober, cytokiner, chemokiner, prostanoider och antikroppar.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering: Detta arbete stöddes av finansiering från Imperial nationella institutet för hälsa forskning (NIHR) Biomedical Research Centre (BRC), den NIHR hälsa skydd Research Unit (HPRU) i luftvägsinfektioner vid Imperial College London i partnerskap med Public Health England (PHE) och NIHR Imperial patientsäkerhet translationell forskningscentrum. De åsikter som framförs är författarnas och inte nödvändigtvis de av NHS, NIHR, Institutionen för hälsa eller folkhälsan England.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nasosorption (adult, 7mm width) | Hunt Developments | NSFL-FXI-11 | Different sizes are available for different patient groups/ages. |
| Bronchosorption | Hunt Developments | BSFL-FXI-11 | Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) | Sigma Aldrich | CLS9301-1000EA | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) | Sigma Aldrich | CLS8160-24EA | For sterilisation of samples with infection risk. |
| Assay (elution) buffer | Millipore | AB-33k | Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA. |
| NP-40 Cell lysis buffer | Life Technologies | FNN0021 | Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels. |
| Buffer RLT (RNA extraction) | Qiagen | 79216 | Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031-100ML-M | For elution of samples to be used in HPLC applications |
| 2.0ml micro-centrifuge tubes | Costar | 3213 | 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these. |
References
- Hansel, T. T., Johnston, S. L., Openshaw, P. J. Microbes and mucosal immune responses in asthma. Lancet. 381 (9869), 861-873 (2013).
- Lu, F. X., Esch, R. E. Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers. J Immunol Methods. 356 (1-2), 6-17 (2010).
- Esposito, S., et al. Collection by trained pediatricians or parents of mid-turbinate nasal flocked swabs for the detection of influenza viruses in childhood. Virol J. 7 (1), 85 (2010).
- Macfarlane, P., Denham, J., Assous, J., Hughes, C. RSV testing in bronchiolitis: which nasal sampling method is best? Arch Dis Child. 90 (6), 634-635 (2005).
- Jochems, S. P., et al. Novel Analysis of Immune Cells from Nasal Microbiopsy Demonstrates Reliable, Reproducible Data for Immune Populations, and Superior Cytokine Detection Compared to Nasal Wash. PLoS One. 12 (1), e0169805 (2017).
- Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma Increased Interferons (IFN-gamma and IFN-lambda) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. , (2017).
- Rohan, L. C., et al. Optimization of the weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (1), 45-48 (2000).
- Castle, P. E., et al. Comparison of ophthalmic sponges for measurements of immune markers from cervical secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (2), 399-405 (2004).
- Chang, C. K., Cohen, M. E., Bienek, D. R. Efficiency of oral fluid collection devices in extracting antibodies. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 231-235 (2009).
- Lopez-Cisternas, J., Castillo-Diaz, J., Traipe-Castro, L., Lopez-Solis, R. O. Use of polyurethane minisponges to collect human tear fluid. Cornea. 25 (3), 312-318 (2006).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Sim, T. C., Grant, J. A., Hilsmeier, K. A., Fukuda, Y., Alam, R. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 149 (2 Pt 1), 339-344 (1994).
- Sim, T. C., Reece, L. M., Hilsmeier, K. A., Grant, J. A., Alam, R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am J Respir Crit Care Med. 152 (3), 927-933 (1995).
- Weido, A. J., Reece, L. M., Alam, R., Cook, C. K., Sim, T. C. Intranasal fluticasone propionate inhibits recovery of chemokines and other cytokines in nasal secretions in allergen-induced rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 77 (5), 407-415 (1996).
- Linden, M., et al. Immediate effect of topical budesonide on allergen challenge-induced nasal mucosal fluid levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 162 (5), 1705-1708 (2000).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Riechelmann, H., Deutschle, T., Friemel, E., Gross, H. J., Bachem, M. Biological markers in nasal secretions. Eur Respir J. 21 (4), 600-605 (2003).
- Wagenmann, M., et al. Bilateral increases in histamine after unilateral nasal allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 155 (2), 426-431 (1997).
- Wagenmann, M., Schumacher, L., Bachert, C. The time course of the bilateral release of cytokines and mediators after unilateral nasal allergen challenge. Allergy. 60 (9), 1132-1138 (2005).
- Baumann, R., et al. The release of IL-31 and IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms. Clin Transl Allergy. 2 (1), 13 (2012).
- Baumann, R., et al. Nasal levels of soluble IL-33R ST2 and IL-16 in allergic rhinitis: inverse correlation trends with disease severity. Clin Exp Allergy. 43 (10), 1134-1143 (2013).
- Chawes, B. L., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Scadding, G. W., et al. Optimisation of grass pollen nasal allergen challenge for assessment of clinical and immunological outcomes. J Immunol Methods. 384 (1-2), 25-32 (2012).
- Leaker, B. R., et al. The nasal mucosal late allergic reaction to grass pollen involves type 2 inflammation (IL-5 and IL-13), the inflammasome (IL-1beta), and complement. Mucosal Immunol. 10 (2), 408-420 (2017).
- Nicholson, G. C., et al. The effects of an anti-IL-13 mAb on cytokine levels and nasal symptoms following nasal allergen challenge. J Allergy Clin Immunol. 128 (4), 800-807 (2011).
- Dhariwal, J., et al. Nasal Lipopolysaccharide Challenge and Cytokine Measurement Reflects Innate Mucosal Immune Responsiveness. PLoS One. 10 (9), e0135363 (2015).
- Folsgaard, N. V., et al. Neonatal cytokine profile in the airway mucosal lining fluid is skewed by maternal atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Folsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Thwaites, R. S., et al. Nasosorption as a Minimally Invasive Sampling Procedure: Mucosal Viral Load and Inflammation in Primary RSV Bronchiolitis. J Infect Dis. 215 (8), 1240-1244 (2017).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), L1088-L1094 (2004).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Yamazaki, K., Ogura, S., Ishizaka, A., Oh-hara, T., Nishimura, M. Bronchoscopic microsampling method for measuring drug concentration in epithelial lining fluid. Am J Respir Crit Care Med. 168 (11), 1304-1307 (2003).
- Kikuchi, J., Yamazaki, K., Kikuchi, E., Ishizaka, A., Nishimura, M. Pharmacokinetics of telithromycin using bronchoscopic microsampling after single and multiple oral doses. Pulm Pharmacol Ther. 20 (5), 549-555 (2007).
- Kikuchi, E., et al. Comparison of the pharmacodynamics of biapenem in bronchial epithelial lining fluid in healthy volunteers given half-hour and three-hour intravenous infusions. Antimicrob Agents Chemother. 53 (7), 2799-2803 (2009).
- Kodama, T., et al. A technological advance comparing epithelial lining fluid from different regions of the lung in smokers. Respir Med. 103 (1), 35-40 (2009).
- Sasabayashi, M., Yamazaki, Y., Tsushima, K., Hatayama, O., Okabe, T. Usefulness of bronchoscopic microsampling to detect the pathogenic bacteria of respiratory infection. Chest. 131 (2), 474-479 (2007).
- Kipnis, E., et al. Proteomic analysis of undiluted lung epithelial lining fluid. Chest. 134 (2), 338-345 (2008).
- Kanazawa, H., Kodama, T., Asai, K., Matsumura, S., Hirata, K. Increased levels of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in epithelial lining fluid from peripheral airways in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study. Clin Sci (Lond). 119 (3), 143-149 (2010).
- Sugasawa, Y., et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 25 (2), 170-177 (2011).
- Sugasawa, Y., et al. Effects of sevoflurane and propofol on pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 26 (1), 62-69 (2012).
- Cohen, J., et al. Ciclesonide improves measures of small airway involvement in asthma. Eur Respir J. 31 (6), 1213-1220 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- de Silva, T. I., et al. Comparison of mucosal lining fluid sampling methods and influenza-specific IgA detection assays for use in human studies of influenza immunity. J Immunol Methods. , (2017).
