Summary
Een protocol wordt gepresenteerd voor de synthese van de core-shell lanthanide-doped upconversion nanokristallen (UCNs) en hun cellulaire toepassingen kanaal eiwit verordening op nabij-infrarood licht (NIR) verlichting.
Abstract
Lanthanide-doped upconversion nanokristallen (UCNs) hebben veel aandacht getrokken in de afgelopen jaren op basis van hun veelbelovende en controleerbare optische eigenschappen, die mogelijk maken voor de absorptie van nabij-infrarood (NIR) licht en kunnen vervolgens worden geconverteerd naar Multiplexed emissies die zich over een groot aantal regio's van de UV naar zichtbaar aan de NIR uitstrekken. Dit artikel presenteert gedetailleerde experimentele procedures voor hoge-temperatuur co neerslag synthese van core-shell UCNs die verschillende lanthanide ionen in nanokristallen voor het efficiënt omzetten van diep-weefsel penetrable NIR excitatie (808 opnemen nm) in een sterke blauwe emissie bij 480 nm. Door het beheersen van de oppervlakte modificatie met biocompatibel polymeer (polyacryl zuur, PAA), de UCNs bereid verwerft grote oplosbaarheid in bufferoplossingen. De hydrofiele nanokristallen zijn verder matiemaatschappij met specifieke liganden (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) voor lokalisatie op het celmembraan. Op NIR licht (808 nm) bestraling, de upconverted blauwe emissie kan effectief activeren het licht-gated kanaal eiwit op de celmembraan en specifiek regelen de toestroom catie (b.v., Ca2 +) in het cytoplasma. Dit protocol biedt een haalbaar methodologie voor de synthese van de core-shell doped lanthanide UCNs en daaropvolgende biocompatibel oppervlakte modificatie voor verder cellulaire toepassingen.
Introduction
In de afgelopen jaren lanthanide-doped upconversion nanokristallen (UCNs) hebben op grote schaal gebruikt als alternatief voor conventionele organische kleurstoffen en quantumdots in biomedische applicaties, die voornamelijk gebaseerd zijn op hun uitstekende chemische en optische eigenschappen, inclusief grote biocompatibiliteit, hoge weerstand tegen photobleaching en smalle bandbreedte emissie1,2,3. Nog belangrijker, kunnen ze dienen als een veelbelovende nanotransducer met uitstekende weefsel penetratie diepte in vivo nabij-infrarood (NIR) excitatie in een breed scala aan emissies van het UV, zichtbare, en het NIR-regio's door middel van een multi foton converteren upconversion proces4,5. Deze unieke eigenschappen maken lanthanide-doped UCNs dienen als een bijzonder veelbelovend vector voor biologische sensing, biomedische beeldbewerking en ziekten theranostics6,7,8.
De algemene onderdelen van de UCNs zijn voornamelijk gebaseerd op de gedoopt lanthanide-ionen in de isolerende host matrix met een sensibiliserende (b.v., Yb3 +, Nd3 +) en een activator (b.v., Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) binnen het kristal homogeen9. De verschillende optische uitstoot van de nanokristallen wordt toegeschreven aan de gelokaliseerde elektronische overgang binnen de 4f -orbitalen van de lanthanide dopants als gevolg van hun ladder-achtige gearrangeerde energie niveau10. Het is daarom van cruciaal belang voor het nauwkeurig bepalen van de grootte en morfologie van samengestelde UCNs met multicomponent lanthanide dopants. Van rechtswege, zijn enkele veelbelovende methoden ook vastgesteld voor de bereiding van lanthanide-doped UCNs, met inbegrip van thermische ontleding, hoge-temperatuur co neerslag, hydrothermale synthese, sol-gel verwerking, etc.11 , 12 , 13 onder deze benaderingen, de co hoge-temperatuur-neerslag-methode is een van de meest populaire en handige strategieën voor UCNs synthese, die strikt kan worden gecontroleerd om te bereiden gewenste kwalitatief hoogwaardige nanokristallen met uniforme vorm en grootteverdeling in een relatief korte reactietijd en goedkope14. Echter, de meeste nanostructuren gesynthetiseerd door deze methode zijn voornamelijk afgetopt met hydrofobe liganden zoals oliezuur en oleylamine, die over het algemeen een belemmering vormen voor hun verdere bioapplication te wijten aan de beperkte voor hydrofobe ligand oplosbaarheid in waterige oplossing 15. Daarom is het noodzakelijk om te voeren geschikt oppervlak modificatietechnieken ter voorbereiding van biocompatibel UCNs in biologische toepassingen in vitro en in vivo.
Hierin presenteren wij de gedetailleerde experimentele procedure voor de synthese van de core-shell UCNs nanostructuren via de co hoge-temperatuur-neerslag-methode en de techniek van een haalbaar wijziging aan biocompatibel polymeer op UCNs oppervlak voor functionalize verder cellulaire toepassingen. Deze UCNs nanoplatform integreert drie lanthanide ionen (Yb3 +Nd3 +en Tm3 +) in de nanokristallen te verwerven sterke blauwe emissie (~ 480 nm) op de lichte excitatie NIR op 808 nm, die meer indringingsdiepte heeft in levend weefsel. Het is bekend dat Nd3 +-gedoopt UCNs geminimaliseerde water absorptie en oververhitting effecten weer te geven op deze spectrale venster (808 nm) in vergelijking met conventionele UCNs op 980 nm bestraling16,17, 18. Bovendien, als u wilt gebruik maken van de UCNs in biologische systemen, zijn de hydrofobe liganden (oliezuur) op het oppervlak van UCNs ten eerste verwijderd met het ultrasoonapparaat in zure oplossing19. Vervolgens zijn de ligand-vrije UCNs verder bewerkt met een biocompatibele polymeer (polyacryl zuur, PAA) te verwerven van grote oplosbaarheid in waterige oplossingen20. Bovendien, als een bewijs-van-concept in cellulaire toepassingen, de hydrofiele UCNs zijn verder matiemaatschappij met moleculaire liganden (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) voor specifieke lokalisatie op de N-3-gelabeld celmembraan. Op NIR licht (808 nm) bestraling, de upconverted blauwe emissie bij 480 nm kan effectief het activeren van een licht-gated kanaal eiwit, channelrhodopsins-2 (ChR2), cel op het oppervlak en dus catie (b.v., Ca2 + ion) toestroom te vergemakkelijken over het membraan van levende cellen.
Deze video protocol voorziet een haalbaar methodologie lanthanide-doped UCNs synthese, biocompatibel oppervlakte modificatie en UCNs bioapplication in levende cellen. Eventuele verschillen in de technieken van de synthese en de chemische reagentia gebruikt in nanocrystal groei beïnvloedt de grootte distributie, morfologie en upconversion luminescentie (UCL) spectra van definitieve UCNs nanostructuren gebruikt in cel experimenten. Dit gedetailleerde video protocol bereid is te helpen nieuwe onderzoekers op dit gebied te verbeteren van de reproduceerbaarheid van UCNs met de mede hoge-temperatuur-neerslag-methode en vermijden de gemeenschappelijkste fouten in UCNs biocompatibel oppervlakte modificatie voor verdere cellulaire toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Gebruik alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van de synthese van UCNs bij een hoge temperatuur (~ 290 ° C), met inbegrip van het gebruik van technische controles (zuurkast) en persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld, veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, en gesloten-teen schoenen).
1. synthese van NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) core-shell nanokristallen
- synthese van NaYF 4: Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) core nanostructuur
- Voorbereiding van de RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F methanol stockoplossing
Opmerking: de zeldzame aarde-(her) lanthanide ionen bevatten Yttrium (Y), Ytterbium (Yb), Thulium (Tm) en Neodymium (Nd).- Los 500 mg Yttrium(III) acetaat hydrate in 5 mL methanol (100 mg/mL), 250 mg Ytterbium (III) acetaat hydraat in 5 mL methanol (50 mg/mL), 10 mg Thulium (III) acetaat hydraat in 1 mL methanol (10 mg/mL), en 10 mg Neodymium (III) acetaat hydraat in 1 mL metha Nol (10 mg/mL) in glazen flesjes met een ultrasoonbad reinigen voor 2 min.
- Combineren van 400 mg NaOH in een centrifugebuis 50 mL met 20 mL methanol met ultrasoonbad reinigen te bereiden NaOH stockoplossing (20 mg/mL).
- 600 mg NH 4 F in een centrifugebuis 50 mL combineren met 30 mL methanol met ultrasoonbad reinigen te bereiden NH 4 F stockoplossing (20 mg/mL).
Opmerking: Plaats de stockoplossing van lanthanide complexen, NaOH en NH 4 F in glazen flesjes, verzegelen met parafilm en bewaar ze in een koelkast op ~ 4 ° C totdat het nodig is. De voorbereide methanol stamoplossingen worden eenmaal per 2 weken vervangen.
- Voorbereiding van NaYF 4: Yb/Tm/Nd kern nanostructuur
- Pipetteer 3 mL oliezuur en 7 mL 1-octadecene in een drie-nek-kolf van 50 mL.
- Combineren 1.089 mL van de Y (CH 3 CO 2) 3 stockoplossing, 0.608 mL van de Yb (CH 3 CO 2) 3 stockoplossing, 83.6 µL van de Tm (CH 3 CO 2) 3 voorraad oplossing, en 128.5 µL van de Nd (CH 3 CO 2) 3-stockoplossing in de destillatiekolf.
- Past een thermometer (0 - 360 ° C bereik) in de kolf en laat haar tip aanraken van de oplossing. Plaats de kolf in een glazen container met phenylmethyl siliconenolie.
- Verwarm de oplossing tot 100 ° C met een warmhoudplaat te verdampen uit de methanol. Verbind de kolf met een Schlenk-lijn met een variëteit van de dubbele vacuüm/gas het reactiemengsel houden onder drukvermindering gedurende 2-3 minuten al roerend te verwijderen van de resterende methanol.
- Verhogen de temperatuur tot 150 ° C en houden deze temperatuur voor 60 min. behouden een opzwepende snelheid van 700 rpm tijdens de synthese.
Opmerking: Stel een matige snelheid roeren om te voorkomen dat de oplossing spatten. - Stoppen met de hete plaat en houden de kolf bij kamertemperatuur toe de oplossing afkoelen langzaam.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Combineren 2 mL NaOH-methanol stockoplossing en 2.965 mL NH 4 F-methanol-stockoplossing in een centrifugebuis 15 mL. Draai de buis met zijn pet en meng de oplossing door krachtige vortexing voor 5 s.
- Toevoegen de NaOH-NH 4 F mengsel langzaam in de kolf door een glazen pipet meer dan 5 min.
- Verhogen de temperatuur van het mengsel tot 50 ° C en houden deze temperatuur voor 30 min.
Opmerking: Stel de temperatuur bij niet meer dan 50 ° C omdat de hoge temperatuur crystal nucleatie en groei zal worden bevorderd. - Verhogen van de temperatuur (~ 100 ° C) tot verdampen uit de methanol en verbind de kolf met een Schlenk-lijn met een dubbele vacuüm/gas variëteit te verwijderen van de resterende methanol en houden het reactiemengsel onder drukvermindering voor min. 2-3
- De positie van de afsluiter te vullen de kolf met stikstof schakelaar.
- Verhoging van de temperatuur tot 290 ° C met een snelheid van de verwarming van ~ 5 ° C/min. houden het reactiemengsel bij 290 ° C gedurende 1,5 h.
- Stoppen met de hete plaat en het verwijderen van de kolf zodat het reactiemengsel langzaam afkoelen bij kamertemperatuur al roerend.
Let op: Wees voorzichtig met de hete plaat met hoge temperatuur (> 400 ° C) om te voorkomen dat ernstige brandwonden op huidcontact. - Breng het mengsel in de kolf in een centrifugebuis 50 mL. Spoel de kolf met 30 mL ethanol en breng de oplossing over in de centrifugebuis.
- Centrifugeren van het product bij 4.000 × g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
- Voeg toe 10 mL hexaan aan de centrifugebuis en opnieuw verspreiden het product met ultrasoonapparaat (60 kHz, 240 W) voor 2 min.
- Voeg 30 mL ethanol aan de buis. Spin naar beneden van het product bij 4.000 × g gedurende 8 minuten en verwijder vervolgens het supernatant.
- Opnieuw verspreiden de solide producten in de bodem van de centrifugebuis met 5 mL hexaan. Bewaar de oplossing in een koelkast op ~ 4 ° C voor een volgende stap.
Opmerking: De upconversion uitstoot van core-shell UCNs wordt getest door het bestralen van de oplossingen met een 808 nm laser (2 W).
- Voorbereiding van de RE (CH 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F methanol stockoplossing
- Voorbereiding van NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) core-shell nanokristallen
- 3 mL oliezuur en 7 mL 1-octadecene in een maatkolf van 50 mL drie-nek combineren. Toevoegen van 1.082 mL van de stockoplossing van de 3 Y (CH 3 CO 2) en 2,87 mL van de stockoplossing van de 3 Nd (CH 3 CO 2) in de destillatiekolf.
- De verkregen kern nanostructuur (80 mg in 5 mL hexaan uit stap 1.1.2.18) in de destillatiekolf al roerend toevoegen.
- Past een thermometer (0 - 360 ° C bereik) in de kolf en laat haar tip aanraking van het mengsel. Plaats de kolf in een glazen container met phenylmethyl siliconenolie.
- Verwarm het mengsel bij 100 ° C op de bovenkant van hete plaat te verdampen uit de methanol en hexaan. Verbind de kolf met een Schlenk-lijn met een variëteit van de dubbele vacuüm/gas het reactiemengsel houden onder drukvermindering gedurende 2-3 minuten al roerend te Verwijder het resterende oplosmiddel.
- Verhogen de temperatuur tot 150 ° C en houd het voor 60 min. behouden de opzwepende snelheid op 700 rpm in de synthese.
Opmerking: Stel een matige snelheid roeren om te voorkomen dat de oplossing spatten. - Stoppen met de hete plaat en het verwijderen van de kolf zodat de oplossing langzaam afkoelen bij kamertemperatuur.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Pipetteer 2 mL NaOH-methanol stockoplossing en 2.965 mL NH 4 F-methanol-stockoplossing in een centrifugebuis 15 mL. Draai de buis met zijn pet en meng de oplossing door krachtige vortexing voor 5 s.
- Het mengsel in de erlenmeyer door een glazen pipet langzaam meer dan 5 min. toevoegen
- Verhogen de temperatuur van het mengsel tot 50 ° C en houd het bij 50 ° C gedurende 30 min.
Opmerking: Stel de temperatuur niet hoger dan 50 ° C omdat de hoge temperatuur crystal nucleatie en groei zal worden bevorderd. - Verhogen van de temperatuur (~ 100 ° C) tot verdampen uit de methanol en verbind de kolf met een Schlenk-lijn met een dubbele vacuüm/gas variëteit te verwijderen van de resterende methanol, houden het reactiemengsel onder drukvermindering voor min. 2-3
- De positie van de afsluiter te vullen de kolf met stikstof schakelaar.
- Verhogen de temperatuur tot 290 ° C met een snelheid van de verwarming van ~ 5 ° C/min. houden het reactiemengsel bij 290 ° C gedurende 1,5 h.
- Stoppen met de hete plaat en het verwijderen van de kolf zodat het reactiemengsel langzaam afkoelen bij kamertemperatuur al roerend.
Let op: Wees voorzichtig met de hete plaat met hoge temperatuur (> 400 ° C) om te voorkomen dat ernstige brandwonden op huidcontact. - Breng het mengsel in de kolf in een centrifugebuis 50 mL. Spoel de kolf met 30 mL ethanol en breng de oplossing over in de centrifugebuis.
- Centrifugeren van het product bij 4.000 × g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
- Voeg toe 10 mL hexaan aan de centrifugebuis en opnieuw verspreiden het product met ultrasoonapparaat (60 kHz, 240 W) voor 2 min.
- Voeg 30 mL ethanol aan de buis. Spin naar beneden van het product bij 4.000 × g gedurende 8 minuten en verwijder vervolgens het supernatant.
- Opnieuw verspreiden de solide producten in de bodem van de centrifugebuis met 5 mL hexaan. Bewaar de oplossing in een koelkast op ~ 4 ° C totdat nodig.
Opmerking: De upconversion uitstoot van core-shell UCNs wordt getest door het bestralen van de oplossingen met een 808 nm laser (2 W).
2. Synthese van biocompatibel UCNs nanostructuren
- voorbereiding van ligand-gratis UCNs nanoparticle
- combineren 30 mL ethanol met de als-bereid OLEAAT-afgetopte UCNs oplossing (stap 1.2.18) in een centrifugebuis 50 mL. Centrifugeer het mengsel bij 4.000 × g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
- Combineren 10 mL zure waterige oplossing (pH = 4) aangepast door HCl (0.1 M) met het precipitaat op in de centrifugebuis 50 mL en los het precipitaat op met het ultrasoonapparaat (60 kHz, 240 W) voor 30 min.
- Overdracht van de oplossing in een glazen ampul met krachtig roeren gedurende 2 h.
- Extract van de waterige oplossing met 30 mL diethylether Herhaal dit drie keer te verwijderen van de oliezuur.
- Toevoegen van 10 mL water in de gecombineerde ether lagen met zacht schudden.
- Verzamelen de waterige fase samen (20 mL) en voeg toe 20 mL aceton met vortexing voor 5 s.
- Spin naar beneden het product bij 35.000 × g gedurende 10 minuten en verwijder vervolgens het supernatant. Los het precipitaat op in 2 mL water.
- Voorbereiding van polymeer bewerkt UCNs (PAA-UCNs)
- 200 mg van polyacryl zuur combineren (PAA, Mw = 1800) met 20 mL water met het ultrasoonapparaat (60 kHz, 240 W) voor 20 min. de bovengenoemde ligand-gratis UCNs in de PAA oplossing met toevoegen krachtig roeren.
- De pH-waarde aan 7.4 aanpassen door NaOH-oplossing (1 M) met ultrasoonapparaat (60 kHz, 240 W), voor 30 min. Houd het mengsel gedurende 24 uur bij kamertemperatuur al roerend.
- Verzamelen de neerslag door centrifugeren op 35.000 × g voor 10 min. resuspendeer de product in 10 mL water met het ultrasoonapparaat (60 kHz, 240 W) voor 5 min en centrifuge weer bij 35.000 × g gedurende 10 min. Herhaal deze stap driemaal.
- Opnieuw verspreiden het product in 8 mL water met het ultrasoonapparaat (60 kHz, 240 W) voor 5 min. slaan de oplossing in een koelkast op ~ 4 ° C totdat nodig.
- Voorbereiding van functionele DBCO-UCNs nanoparticle
- Spin down de PAA@UCNs als voorbereid (1 mg) door middel van centrifugeren op 35.000 × g voor 10 min. resuspendeer de neerslag in 1 mL DMF droog met het ultrasoonapparaat (60 kHz, 240 W) voor 1 min en Centrifugeer nogmaals op 35.000 × g gedurende 10 min. Herhaal deze stap tweemaal.
- Los het precipitaat op in 200 µL droog DMF in een glazen ampul. Toevoegen van HOBT (12.2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) en DIPEA (16 µL) in de flacon met magnetische roeren 24 h.
- Verzamelen van het product door middel van centrifugeren op 35.000 × g voor 10 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer het precipitaat op in 1 mL DMSO en centrifuge op 35.000 × g gedurende 10 minuten opnieuw herhaalt u deze stap driemaal.
- Verspreiden van het product in 0,2 mL DMSO en winkel in een koelkast op ~ 4 ° C vóór gebruik.
3. Bioapplications van DBCO-UCNs in de verordening voor de kanalen van de membraan in levende cellen
- cultuur de HEK293 cellen in Dulbecco ' s gewijzigd Eagle ' s Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, 100 eenheden/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en handhaven in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C. zaad 1 × 10 5 cellen in 1 mL DMEM per putje in een 12-well bord en houd het in de incubator voor 24 h.
- Combineren de plasmide (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 µg) met P3000 transfectiereagens (2 µL) in Eagle ' s Minimum essentiële Media (MEM) (100 µL) in microcentrifuge tube A en voeg transfectiereagens (1,5 µL) in MEM (100 µL) in buis B.
- Het mengsel van oplossingen in de buizen A en B gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Combineren de oplossing in buis A en B met 400 µL MEM. Wassen van de cellen met 1 mL tweemaal serumvrij DMEM.
- De 600 µL transfectie mengsel toevoegen aan elk putje van de plaat van een 12-well en Incubeer de cellen bij 37 ° C incubator voor 4 h. verwijderen het medium en spoel tweemaal met 1 mL DMEM.
- Voeg 1 mL DMEM met 1 µL Ac 4 ManNAz (50 mM in DMSO) in de put en houd het voor 2 dagen in de incubator.
- Verwijderen van het medium en een keer wassen met 1 mL PBS. Voeg 1 mL trypsine-EDTA (0,25%) oplossing in elk putje van de plaat 12-well en Incubeer bij 37 ° C tot cellen hebben losgemaakt (~ 2 min). Cultuur opnieuw de cellen in een confocal schotel bij 1 × 10-5 cellen/well in 1 mL DMEM voor overnachting.
- Verwijderen van het medium en voeg 1 mL verse DMEM met 2 µL (50 mg/mL) DBCO-UCNs in de schotel voor 2 uur bij 37 ° C. Voor confocal imaging, wassen van cellen tweemaal met DMEM en voeg 1 µL Rhod-N 3 (10 mM) voor 30 min.
- Voor de analyse van intracellulair calcium, Incubeer de cellen met het mengsel van 1 µL Rhod-3 AM (10 mM), 10 µL probenecide (250 mM), en 10 µL laden buffer (Pluronic oppervlakteactieve stof polyols,0.1% m/v)) in 1 mL DMEM medium voor 30 min in het donker.
- Wassen van de cellen met serumvrij DMEM en bestralen met 808 nm NIR licht bij de dosering van 0.8 W/cm 2 voor 20 min (5 min pauze na 5 min verlichting).
- Record de resultaten van de beeldvorming op de confocal microscoop (laserbron: 561 nm laser; bereik detector: 610/75 nm; lens: 100 x 1.4 nb olie, belichtingstijd: 100 ms). Voeg 1 mL trypsine-EDTA (0,25%) oplossing in elk putje en Incubeer bij 37 ° C tot cellen hebben losgemaakt (~ 2 min). Resuspendeer de cellen in 1 mL PBS stroom cytometry (FCM) p.a. (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het proces van de schematische synthese van core-shell lanthanide-doped UCNs staan in Figuur 1 en Figuur 2. De transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en de transmissie van hoge resolutie elektronenmicroscopie (HRTEM) afbeeldingen van core en core-shell UCNs nanostructuren respectievelijk werden verzameld (Figuur 1). De UCNs ligand-gratis worden voorbereid door het verwijderen van de hydrofobe oliezuur op het oppervlak van UCNs in zure oplossing, en bewerkt met hydrofiel polymeer (PAA). Vervolgens zijn de COOH-afgetopte PAA-UCNs met DBCO-NH2 matiemaatschappij door condensatiereactie van een amide. De TEM-beelden van ligand-vrije UCNs, PAA-UCNs en DBCO-UCNs zijn afgebeeld in Figuur 2. Spectra van het dynamische lichtverstrooiing (DLS), zeta potentiële resultaten en upconversion luminescentie (UCL) van DBCO-UCNs respectievelijk worden verzameld (Figuur 3). De fourier transformatie (FTIR) infraroodspectroscopie van DBCO-NH2, PAA-UCNs en DBCO-UCNs worden weergegeven in Figuur 4.
In cel experimenten, wordt de succesvolle uitdrukking van ChR2 op de celmembraan bevestigd door de voor de hand liggende groen fluorescente proteïne (GFP) markering (Venus) met behulp van de confocal microscopie (figuur 5A). De DBCO-UCNs zijn het specifiek gelokaliseerd op het oppervlak van cellen van de HEK293 ChR2-uiten door Klik op reactie (figuur 5A). De analyse van intracellulair calcium op NIR lichte stimulatie wordt tevens bevestigd door confocal beeldvorming en stroom cytometry (FCM) gebaseerd op een standaard TL Ca2 + indicator, Rhod-3 AM (figuur 5B, C).
Figuur 1. Synthese van de core-shell lanthanide-doped UCNs. (A) Schematische illustratie van het proces van de synthese van UCNs. (B, C) TEM voor core (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0,5/1 %)) en core-shell (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanostructuren. Schaal bar: 50 nm. Inzet: HRTEM beelden van core en core-shell UCNs nanostructuren. Schaal bar: 5 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Synthese van functionele UCNs nanostructuren. (A) Schematische illustratie van het proces van de synthese van ligand-vrije UCNs, PAA-UCNs en DBCO-UCNs, respectievelijk. (B, C, D) TEM beelden van ligand-vrije UCNs, PAA-UCNs en DBCO-UCNs. Schaal bar: 100 nm in deelvenster B en 50 nm in deelvenster C/D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. FTIR spectroscopie van DBCO-NH2, PAA-UCNs en DBCO-UCNs, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Karakterisatie van DBCO-UCNs in bufferoplossing. (A) DLS resultaten van DBCO-UCNs. (B) Zeta potentiële resultaten van PAA-UCNs en DBCO-UCNs (gemiddelde ± SD). (C) UCL spectra van core en core-shell UCNs in hexaan (1 mg/mL), PAA-UCNs en DBCO-UCNs in water (1 mg/mL) afzonderlijk (Ex: 808 nm). Inzet: luminescentie foto van UCNs met 808 nm bestraling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Cellulaire toepassingen van DBCO-UCNs op NIR licht verlichting. (A) Confocal beeldvorming van uiten van ChR2 N3-gelabeld HEK293 cellen geïncubeerd met DBCO-UCNs (boven) en PAA-UCNs (onder) gedurende 2 uur op 100 µg/mL. Groen: ChR2-Venus (Ex: 488 nm, Em: 530/50 nm), blauwe: UCNs (Ex: 543 nm, Em: 580/50 nm). Schaal bar: 20 µm. (B) cellulaire Ca2 + beeldbewerking met Rhod-3 AM vóór en na de bestraling van de NIR-licht (0,8 W/cm2 voor 20 min). Ex: 561 nm, Em: 610/75 nm. Schaal bar: 10 µm. (C) kwantitatieve FCM analyse van de intensiteit van de genormaliseerde fluorescentie van cellulaire Ca2 + met verschillende lichte doseringen verlichting (gemiddelde ± SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel heeft een methode voor de synthese van de core-shell lanthanide-doped upconversion nanokristallen (UCNs) en hun oppervlakte modificatie met functionele wordt voor mobiele toepassingen. Deze roman nanomateriaal bezit uitstekende optische eigenschappen, die UV en zichtbaar licht op NIR lichte excitatie door middel van een multi foton upconversion proces uitstoten kunnen. In dit protocol, de kern-shell UCNs nanostructuren (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) worden voorbereid door een methode van hoge-temperatuur co neerslag in een mengsel van oliezuur en 1-octadecene. TEM afbeeldingen tonen de morfologie van deze core en core-shell nanokristallen zijn sferisch in vorm met een diameter van 20 nm en 30 nm respectievelijk impliceert een shell dikte van ongeveer 5 nm (Figuur 1). De architectuur van core-shell is ook gebleken door de hoge resolutie TEM beelden in de inzet van Figuur 1, waaruit soortgelijke lattice franjes met die van de kern UCNs nanostructuren blijkt. Bovendien, een typische d-afstand rond 0.52 nm eens goed met de afstand van het (100) vlak van β-NaYF4, waarin staat dat alle de core en core-shell UCNs nanostructuren zijn zeer gekristalliseerd en handhaven van de dezelfde kristalstructuur. Bovendien, de upconversion luminescentie spectra tonen de kern-shell nanokristallen sterke blauwe emissie uitzenden met een veel hogere intensiteit op 480 nm dan de core deeltjes na excitatie met een diodelaser om een continue wave op 808 nm ( Figuur 4C). De verhoogde uitstoot van core-shell UCNs wordt toegeschreven aan de onderdrukte oppervlak blussen effect van Yb3 +Nd3 +en Tm3 + ionen die zijn ingesloten in de interieur laag van de kern-shell nanokristallen21. Deze resultaten bevestigen sterk de succesvolle voorbereiding van lanthanide-doped core-shell UCNs nanomateriaal in dit voorstel.
Er zijn verschillende kritische stappen in de hoge-temperatuur co neerslag synthese van deze nanokristallen. Ten eerste moet de toegevoegde hoeveelheid lanthanide ion stockoplossing in het proces van de synthese van de core en core-shell UCNs strikt worden gecontroleerd (stap 1.1.2.2). Hoog niveau doping ionen zal leiden tot een concentratie-gerelateerde Kruis-ontspanning of effect als gevolg van ion-ion interactie in de nanokristallen21blussen. Ten tweede, de temperatuur moet worden gehouden bij minder dan 50 ° C om ervoor te zorgen volledige nucleatie nadat NaOH en NH4F zijn toegevoegd in de maatkolf (stap 1.1.2.9 en 1.2.9), wat cruciaal is om een uniforme morfologie door het bevorderen van kristalgroei op basis van Ostwald rijping effecten22. Ten derde, de grootte en de optische eigenschappen van kern-shell nanodeeltjes kunnen worden hoofdzakelijk gecontroleerd door de hoeveelheid lanthanide-ionen in de voorlopers van de shell (Y3 + en Nd3 +) en de kern bereid deeltjes (stap 1.2.1) aanpassen. Het is ook belangrijk dat de morfologie van core-shell nanokristallen is gebaseerd op de anisotrope shell groei van verschillende soorten kern deeltjes, die is handig voor het moduleren van de verschillende optische emissies van UCNs op NIR lichte verlichting23.
Het is daarnaast ook een aanzienlijke uitdaging hydrofobe UCNs effectief omzetten in hydrofiele UCNs nanodeeltjes voor verdere biologische toepassingen. Hoewel sommige methoden zijn gemeld bij het verbeteren van de biocompatibiliteit van UCNs in bufferoplossing, met inbegrip van ligand uitwisseling silica coating, OLEAAT-aftopping ligand oxidatie, enz., zij lijden aan onverwachte aggregatie, tijdrovend, en complexe procedures24,25,26. Hierin ontwikkelen we een eenvoudige benadering van water verspreidende ligand-vrije UCNs nanostructuren verkrijgen door het verwijderen van de oliezuur op het oppervlak van OLEAAT-afgetopte UCNs in een oplossing van het zure water (pH = 4). De pH-waarde, aangepast met de HCl is van cruciaal belang om te bepalen van de release van OLEAAT ligand en beïnvloeden de luminescentie van UCNs. Nog belangrijker, een biocompatibele polymeer (polyacryl zuur, PAA) met een groot aantal carboxyl groepen kunnen koppelen met de lanthanide ionen op het oppervlak van UCNs door interactie met de coördinatie, die meer functionele groepen voor verdere chemische vormen zal wijziging. Dus, we functionalize de DBCO-NH2 wordt op het oppervlak van UCNs voor verdere specifieke N3-gelabeld celmembraan lokalisatie. De TEM beelden van ligand-vrije UCNs PAA-UCNs en DBCO-UCNs in Figuur 2 laten zien van de grote dispersiteit en oplosbaarheid van deze nanostructuren in bufferoplossing na oppervlakte modificatie. Bovendien, werd fourier transformatie (FTIR) infraroodspectroscopie uitgevoerd om te karakteriseren de oppervlakte modificatie van DBCO groepen op UCNs nanoplatform. Zoals blijkt uit Figuur 3, de sterke band rond 3.430 cm-1 is te wijten aan de H-O uitrekkende trilling van de carboxylgroepen, en de twee bands gecentreerd op 1550 cm-1 en 1458 cm-1 zijn gekoppeld aan de asymmetrische en symmetrische uitrekkende trillingen modi van het carboxylaat anionen, die de succesvolle coating van COOH groep-bevattende polymeren (PAA) op het UCNP-oppervlak aangeeft. Na reactie met DBCO-NH2 wordt is een voor de hand liggende band aan 1,635 cm-1 aanwezig gebaseerd op de C = C uitrekken van trillingen op de aromatische ring van DBCO groepen, die strookt met het FTIR-spectrum van DBCO-NH2 wordt op hetzelfde Golfgetal. Bovendien, de Dynamische lichtverstrooiing (DLS)-resultaat geeft aan dat de verhoogde hydrodynamische diameter van DBCO-UCNs in waterige oplossing (96.4±10.4 nm) (figuur 4A). De mogelijke resultaten van zeta geven ook de negatieve oppervlak van PAA-UCNs (-26.1±4.4 mV) en DBCO-UCNs (-11.9±5.6 mV) respectievelijk (figuur 4B), aan te tonen de grote oplosbaarheid en stabiliteit van deze nanostructuren in bufferoplossing. Bovendien, de UCL-spectra van PAA-UCNs en DBCO-UCNs aantonen dat zij soortgelijke upconverted emissie bij 480 kunnen uitzenden nm op 808 nm lichte bestraling (figuur 4C), die kan worden gebruikt voor verdere NIR licht-gemedieerde photoactivation in biologische systemen.
Bovendien, als een bewijs-van-concept, om aan te tonen van de bioapplication van matiemaatschappij UCNs in levende cellen, is een licht-gated kanaal eiwit (ChR2) ontworpen op het celoppervlak te regelen van de cellulaire functies door bemiddeling van de toestroom van catie ionen (bijvoorbeeld, Ca2 +) in het cytoplasma27,28,29. De succesvolle uitdrukking van ChR2 op het membraan van de HEK293 cellijn wordt bevestigd door de aanwezigheid van de groen fluorescente proteïne (GFP) markering (Venus) met behulp van de confocal microscopie (figuur 5A). Bovendien, de lokalisatie van de UCNs op de N-3-tagged celmembraan is duidelijk gevisualiseerd op het celoppervlak (blauw) na een incubatieperiode van 2 h, die kan worden toegeschreven aan het feit dat de overblijvende groepen van de DBCO op het oppervlak van UCNs nanostructuren worden gekleurd met een azide-bevattende fluorescente kleurstof (5-carboxytetramethylrhodamine-azide, Rhod-N3) door de koper-vrije bioorthogonal Klik op reactie. Bovendien, NIR licht (808 nm) is gebruikt om het bestralen van de gelokaliseerde UCNs nanotransducer op het celoppervlak, die kan activerende licht-gated ChR2 kanaal van eiwitten en vergemakkelijken van Ca2 + ion toestroom over het membraan. Zoals blijkt uit figuur 5B, een aanzienlijke stijging van rode fluorescentie in het cytosol wordt waargenomen door een standaard TL Ca2 + indicator, Rhod-3 ben, terwijl geen toename van de schijnbare fluorescentie is opgenomen in de afwezigheid van licht verlichting. De kwantitatieve stroom cytometry (FCM) analyse in figuur 5C bewijst verder dat dergelijke NIR-licht-responsieve verhoging van fluorescentie licht-dosisafhankelijk is, duidelijk suggereren dat de biocompatibel DBCO-UCNs effectief kunnen regelen de kanaal eiwitten aan de celmembraan op NIR-licht bestraling.
Kortom, op basis van de bovengenoemde resultaten, we verwachten dat dit protocol niet alleen voorziet in gedetailleerde experimentele procedures voor hoge-temperatuur co neerslag synthese van core-shell UCNs nanostructuren, maar ook een eenvoudige ontwikkelt techniek voor biocompatibel oppervlakte modificatie van UCNs voor verdere NIR licht-gemedieerde photoactivation in biologische toepassingen. Wat nog belangrijker is, gebaseerd op de grondgedachte achter deze methode, de optische eigenschappen van UCNs kunnen verder worden aangepast door verschillende soorten lanthanide ionen doping (bijvoorbeeldErbium (III), Holmium (III), enz.) in de kristallen te stoten UV, groen, rood, en NIR licht op 808 nm lichte bestraling30. Bovendien, het UCNs oppervlak kan worden ook aangepast met verschillende functionele groepen (bijvoorbeeldpeptide, eiwit, lipide, gericht op ligand, enz.) voor verdere biomedische applicaties31,32. Deze voordelen maken biocompatibel UCNs nanomateriaal een geschikte kandidaat voor de studie van fysiologische processen in vitro en in vivo, en kunnen dus fungeren als gepersonaliseerde nanogeneeskunde voor klinische theranostics in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door de NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) en (RG 35/15) uitgereikt in Nanyang Technological University, Singapore en nationale Natural Science Foundation van China (NSFC) (nr. 51628201).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octadecene | Sigma Aldrich | O806 | Technical grade |
| oleic acid | Sigma Aldrich | 364525 | Technical grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | Technical grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | A405 | Technical grade |
| Acetone | Fisher Scientific | A18 | Technical grade |
| Hexane | Sigma Aldrich | H292 | Technical grade |
| Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 367702 | 99.9% trace metals basis |
| Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 325805 | 99.9% trace metals basis |
| Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326011 | 99.9% trace metals basis |
| Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326046 | 99.9% trace metals basis |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | reagent grade |
| Ammonium fluoride (NH4F) | Sigma Aldrich | 338869 | ACS reagent |
| Hydrogen chloride (HCl) | Fisher Scientific | A144 | reagent grade |
| polyacrylic acid (PAA) | Sigma Aldrich | 323667 | average Mw 1800 |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma Aldrich | 54802 | ACS reagent |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E7750 | commercial grade |
| Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) | Sigma Aldrich | 761540 | ACS reagent |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma Aldrich | D125806 | ACS reagent |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231 | Technical grade |
| HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | human embryonic kidney |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | ACS reagent |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) | Addgene | 15753 | Plasmid sent as bacteria in agar stab |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11965092 | High glucose |
| opti-Modified Eagle Medium (MEM) | Thermo Fisher | 51985034 | Reduced Serum Media |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000015 | Lipid-Based Transfection |
| N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) | Sigma Aldrich | A7605 | ACS reagent |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | Phenol red |
| Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | R10145 | Fluorescence dye |
| 5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) | Sigma Aldrich | 760757 | Azide-fluor 545 |
| Confical dish | ibidi GmbH | 81158 | Glass Bottom, 35 mm |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | Polypropylene |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Polypropylene |
| 1.5 ml conical microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | Polypropylene |
| Phenylmethyl silicone oil | Clearco Products | 63148-52-7 | Less than 320 degrees Celsius |
| Glass thermometer | GH Zeal | L0111/10 | From -10 to 360 degrees Celsius |
| 12-well plate | Sigma Aldrich | Z707775 | Polystyrene |
References
- Wang, F., et al. Tuning upconversion through energy migration in core-shell nanoparticles. Nat Mater. 10 (12), 968-973 (2011).
- Liu, Y., et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy. Nature. 543 (7644), 229-233 (2017).
- Fan, W., Bu, W., Shi, J. On The Latest Three-Stage Development of Nanomedicines based on Upconversion Nanoparticles. Adv Mater. 28 (24), 3987-4011 (2016).
- Zhu, X., et al. Temperature-feedback upconversion nanocomposite for accurate photothermal therapy at facile temperature. Nat Commun. 7, 10437-10446 (2016).
- Li, W., Wang, J., Ren, J., Qu, X. Near-infrared upconversion controls photocaged cell adhesion. J Am Chem Soc. 136 (6), 2248-2251 (2014).
- Min, Y., Li, J., Liu, F., Yeow, E. K., Xing, B. Near-infrared light-mediated photoactivation of a platinum antitumor prodrug and simultaneous cellular apoptosis imaging by upconversion-luminescent nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, D., Ma, P., Hou, Z., Cheng, Z., Li, C., Lin, J. Current advances in lanthanide ion (Ln(3+))-based upconversion nanomaterials for drug delivery. Chem Soc Rev. 44 (6), 1416-1448 (2015).
- Wang, C., Cheng, L., Liu, Z. Upconversion nanoparticles for photodynamic therapy and other cancer therapeutics. Theranostics. 3 (5), 317-330 (2013).
- Li, L. L., et al. Biomimetic surface engineering of lanthanide-doped upconversion nanoparticles as versatile bioprobes. Angew Chem Int Ed. 51 (25), 6121-6125 (2012).
- Wang, J., Ming, T., Jin, Z., Wang, J., Sun, L. D., Yan, C. H. Photon energy upconversion through thermal radiation with the power efficiency reaching 16%. Nat Commun. 5, 5669-5678 (2014).
- Zou, W., Visser, C., Maduro, J. A., Pshenichnikov, M. S., Hummelen, J. C. Broadband dye-sensitized upconversion of near-infrared light. Nat Photonics. 6 (8), 560-564 (2012).
- Liu, Y., Tu, D., Zhu, H., Li, R., Luo, W., Chen, X. A strategy to achieve efficient dual-mode luminescence of Eu(3+) in lanthanides doped multifunctional NaGdF(4) nanocrystals. Adv Mater. 22 (30), 3266-3271 (2010).
- Min, Y., Li, J., Liu, F., Padmanabhan, P., Yeow, E. K., Xing, B. Recent Advance of Biological Molecular Imaging Based on Lanthanide-Doped Upconversion-Luminescent Nanomaterials. Nanomaterials. 4 (1), 129-154 (2014).
- Li, X., Zhang, F., Zhao, D. Lab on upconversion nanoparticles: optical properties and applications engineering via designed nanostructure. Chem Soc Rev. 44 (6), 1346-1378 (2015).
- Gu, Z., Yan, L., Tian, G., Li, S., Chai, Z., Zhao, Y. Recent advances in design and fabrication of upconversion nanoparticles and their safe theranostic applications. Adv Mater. 25 (28), 3758-3779 (2013).
- Dong, H., Sun, L. D., Yan, C. H. Energy transfer in lanthanide upconversion studies for extended optical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1608-1634 (2015).
- Ai, X., et al. In vivo covalent cross-linking of photon-converted rare-earth nanostructures for tumour localization and theranostics. Nat Commun. 7, 10432-10440 (2016).
- Lu, S., et al. Multifunctional Nano-Bioprobes Based on Rattle-Structured Upconverting Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 54 (27), 7915-7919 (2015).
- Bogdan, N., Vetrone, F., Ozin, G. A., Capobianco, J. A. Synthesis of ligand-free colloidally stable water dispersible brightly luminescent lanthanide-doped upconverting nanoparticles. Nano Lett. 11 (2), 835-840 (2011).
- Zheng, W., Huang, P., Tu, D., Ma, E., Zhu, H., Chen, X. Lanthanide-doped upconversion nano-bioprobes: electronic structures, optical properties, and biodetection. Chem Soc Rev. 44 (6), 1379-1415 (2015).
- Chen, X., Peng, D., Ju, Q., Wang, F. Photon upconversion in core-shell nanoparticles. Chem Soc Rev. 44 (6), 1318-1330 (2015).
- Wang, F., Deng, R., Liu, X. Preparation of core-shell NaGdF4 nanoparticles doped with luminescent lanthanide ions to be used as upconversion-based probes. Nat Protoc. 9 (7), 1634-1644 (2014).
- Chen, G., Agren, H., Ohulchanskyy, T. Y., Prasad, P. N. Light upconverting core-shell nanostructures: nanophotonic control for emerging applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1680-1713 (2015).
- Yang, Y., et al. In vitro and in vivo uncaging and bioluminescence imaging by using photocaged upconversion nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 51 (13), 3125-3129 (2012).
- Sedlmeier, A., Gorris, H. H. Surface modification and characterization of photon-upconverting nanoparticles for bioanalytical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1526-1560 (2015).
- Hu, M., et al. Near infrared light-mediated photoactivation of cytotoxic Re(I) complexes by using lanthanide-doped upconversion nanoparticles. Dalton Trans. 45 (36), 14101-14108 (2016).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Ai, X., et al. Remote Regulation of Membrane Channel Activity by Site-Specific Localization of Lanthanide-Doped Upconversion Nanocrystals. Angew Chem Int Ed. 56 (11), 3031-3035 (2017).
- Xie, R., et al. In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5173-5178 (2016).
- Bansal, A., Zhang, Y. Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications. Acc Chem Res. 47 (10), 3052-3060 (2014).
- Yang, Y., Aw, J., Xing, B. Nanostructures for NIR light-controlled therapies. Nanoscale. 9 (11), 3698-3718 (2017).
- Ai, X., Mu, J., Xing, B. Recent Advances of Light-Mediated Theranostics. Theranostics. 6 (13), 2439-2457 (2016).
