Summary
프로토콜은 란타넘족 실수로 업 코어-쉘 나노 (UCNs)의 합성 및 근 적외선 (NIR) 빛 조명에 따라 채널 단백질 규제에 대 한 그들의 휴대 전화 애플 리 케이 션에 대 한 제공 됩니다.
Abstract
란타넘족 실수로 업 나노 (UCNs) 속성에 따라 그들의 유망 하 고 제어할 수 있는 광학, 근처-적외선 (NIR) 빛의 흡수에 대 한 허용 하 고 나중에 그것을 변환할 수 있습니다 최근 몇 년 동안에 많은 관심을 받고 있다 다중화는 NIR에 표시 하는 UV에서 지역의 광범위 한 범위에 걸쳐 있는 배출. 이 문서에서는 자세한 실험 절차를 효율적으로 변환 하는 깊은 조직 꿰 뚫을 수 NIR 여기 (808 나노도 다른 란타넘족 이온 통합 코어-쉘 UCNs의 높은 온도 공동 강수량 합성 제공 nm) 480에 강한 파란 방출에 nm. 생체 고분자 (polyacrylic 산, PAA)와 표면 처리를 제어 하 여로 준비 UCNs 버퍼 솔루션에서 좋은 용 해도 획득 합니다. 친수성 나노는 더 공업화 특정 ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO)와 세포 막에 지역화에 대 한. NIR 빛 따라 (808 nm) 조사, upconverted 블루 방출 효과적으로 세포 막에 빛-문이 채널 단백질을 활성화 하 고 특히 세포질에 (예를 들어, 캘리포니아2 +) 양이온 유입 규제 수. 이 프로토콜의 코어-쉘 란타넘족 실수로 UCNs 및 후속 생체 표면 수정 추가 휴대 전화 응용 프로그램에 대 한 합성에 대 한 실현 가능한 방법론을 제공합니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 란타넘족 실수로 업 나노 (UCNs) 널리 사용 된 기존의 유기 염료와는 주로 그들의 뛰어난 화학 및 광학 속성에 따라, 생명 의학 어플리케이션에 양자 점 하는 대신 좋은 생체 적합성, photobleaching, 및 좁은 대역폭 방출1,2,3에 높은 저항을 포함 하 여. 더 중요 한 것은, 그들은 우수한 조직 침투 깊이 vivo에서 UV, 표시에서 방출의 광범위 한 범위에 근 적외선 (NIR) 여기와 다중 광자 통해 NIR 영역 변환 하는 유망한 nanotransducer로 사용할 수 있습니다. 업 프로세스4,5. 이러한 독특한 속성 란타넘족 실수로 UCNs 생물 감지, 생체 이미징, 및 질병 theranostics6,,78특히 유망한 벡터 역할을 확인 합니다.
UCNs의 일반적인 구성 요소는 주로 단 열 호스트 매트릭스 감광 (예를 들어, Yb3 +, Nd3 +) 및 (예를 들어, Tm3 +, 응급실3 +, 호는 활성기에에서도 핑된 란타넘족 이온 기반 3 +) 크리스탈 내에서 균질9. 나노에서 다른 광학 방출 그들의 사다리 같은 배열된 에너지 레벨10인 란타넘족 dopants의 4f 궤도 내에서 지역화 된 전자 전환에 기인 된다. 따라서, 그것은 정확 하 게 크기와 multicomponent 란타넘족 dopants와 합성된 UCNs의 형태를 제어 하는 중요 한입니다. 오른쪽으로 유망한 방법 몇 가지 잘 설립 되었습니다 란타넘족 실수로 UCNs, 열 분해, 높은-온도 공동 강 수, 열 수 합성, 솔-젤 처리, 등11 등의 준비를 위해 , 12 , 13 이러한 방법 중 높은 온도 공동 강 수 방법 중 하나입니다 UCNs 합성, 균일 한 모양으로 원하는 양질의 나노 준비를 엄격 하 게 통제 될 수 있는 가장 인기 있는 하 고 편리한 전략 및 상대적으로 짧은 반응 시간 및 낮은 비용14크기 분포. 그러나,이 방법에 의해 합성 대부분 nanostructures는 주로 덮인 올레산 및 oleylamine, 일반적으로 수 용액에서 소수 성 리간드 가용성의 제한 때문에 그들의 더 bioapplication를 방해 같은 소수 성 ligands 15. 따라서, 그것은 생물 학적 응용 체 외 및 생체 내에서생체 UCNs 준비에 적당 한 표면 처리 기법을 수행 하는 데 필요한.
여기, 우리는 높은 온도 공동 강수량 메서드 및 functionalize 위한 UCNs 표면에 생체 고분자를 가능한 수정 기술을 통해 코어-쉘 UCNs nanostructures의 합성에 대 한 상세한 실험 절차 제시 또한 휴대 전화 응용 프로그램입니다. 이 UCNs nanoplatform 통합 3 란타넘족 이온 (Yb3 +, Nd3 +및 Tm3 +) 강한 블루 방출 얻으려고 나노 (~ 480 nm) 808에서 NIR 빛 자극에 더 침투 깊이 nm에 조직 생활입니다. 그것은 잘 알려져 해당 Nd3 +-도 핑된 UCNs이 스펙트럼 창에 최소화 물 흡수 및 과열 효과 표시 (808 nm) 980 nm 방사선16,17, 에 따라 기존의 UCNs 비교 18. 또한, 생물 학적 시스템에는 UCNs 활용, UCNs의 표면에 소수 성 ligands (올레산) 첫째로 의해 제거 된다 산 성 솔루션19쥡니다. 다음 ligand 무료 UCNs 수성 솔루션20에서 좋은 용 해도 얻으려고 생체 고분자 (polyacrylic 산, PAA)와 수정 추가 됩니다. 또한,-의 증거-개념 셀룰러 애플리케이션에서 친수성 UCNs는 더 기능성 분자 ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) N3에 특정 지역화와-태그 세포 막. NIR 빛 따라 (808 nm) 조사, 480에서 블루 upconverted 방출 수 있습니다 효과적으로 빛-문이 채널 단백질, channelrhodopsins-2 (ChR2)를 활성화, 세포 표면에 및 따라서 양이온 (예를 들어, 캘리포니아2 + 이온) 유입 촉진 살아있는 세포의 막.
이 비디오 프로토콜 란타넘족 실수로 UCNs 합성, 생체 표면 개 질, 및 살아있는 세포에서 UCNs bioapplication에 대 한 실현 가능한 방법론을 제공합니다. 합성 기술과 nanocrystal 성장에 사용 되는 화학 시 약의 차이 세포 실험에 사용 되는 최종 UCNs nanostructures의 크기 분포, 형태, 및 업 컨버전 (UCL) 발광 스펙트럼을 좌우할 것 이다. 이 상세한 비디오 프로토콜은 높은 온도 공동 강수량 방법 UCNs의 재현성을 향상 하 고 추가 UCNs 생체 표면 수정에 대 한 가장 일반적인 실수를 피하기에이 분야에서 새로운 연구 수 있도록 준비 휴대폰 응용 프로그램입니다.
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Protocol
주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 공학적 통제 (증기 두건) 및 개인 보호 장비 (예를 들어, 안전 고글, 장갑, 실험실 코트의 사용을 포함 하 여 고온 (~ 290 ° C)에서 UCNs의 합성을 수행할 때 모든 적절 한 안전 관행을 사용 하시기 바랍니다 전체 길이 바지, 그리고 폐쇄 발가락 신발).
1. 합성의 NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) 코어-쉘 나노
- 합성의 NaYF 4: Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) 코어 nanostructure
- 다시 (채널 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F 메탄올 재고 솔루션의 준비
참고: (재) 란타넘족 이온 희토류는 이트륨 (Y),이 터 븀 (Yb), Thulium (Tm), 및 네오디뮴 (Nd). 5 mL 메탄올 (100 mg/mL), 250 mg이 터 븀 (III) 아세테이트 수화물 5 mL 메탄올 (50 mg/mL), 10 mg에 1 mL 메탄올 (10mg/mL), 툴 륨 (III) 아세테이트 수화물에에서 고 10 mg 1 mL metha에 네오디뮴 (III) 아세테이트 수화물- 분해 500 mg Yttrium(III) 아세테이트 수 화 2 분에 대 한 초음파 청소 욕실 유리 튜브에 nol (10mg/mL)
- NaOH 재고 솔루션 (20 mg/mL)을 준비 하 초음파 청소 욕실 20 mL 메탄올 50 mL 원심 분리기 튜브에 400 밀리 그램 NaOH 결합.
- NH 4 F 재고 솔루션 (20 mg/mL)을 준비 하 초음파 청소 욕실 30 mL 메탄올 600 mg NH 4 F 50 mL 원심 분리기 튜브에서 결합.
참고: 배치 란타넘족 단지, NaOH와 뉴 햄프셔의 재고 솔루션 유리 튜브에서 4 F parafilm으로 밀봉 하 고 필요할 때까지 ~ 4 ° C에서 냉장고에 보관. 준비 된 메탄올 재고 솔루션 2 주마다 한 번 바뀝니다.
- 준비의 NaYF 4: Yb/Tm/Nd 코어 nanostructure
- 올레산 및 1 octadecene의 7 mL 3 mL 50 mL 3 목 플라스 크에 플라스틱.
- Y (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션, Yb (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션의 Tm (채널 3 CO 2) 3 주식의 83.6 µ L 0.608 mL의 결합 1.089 mL 솔루션 그리고 플라스 크에 Nd (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션의 128.5 µ L.
- 는 온도계 (0-360 ° C 범위) 플라스 크에 적합 하 고 솔루션을 터치 팁. Phenylmethyl 실리콘 오일 플라스 크를 유리 용기에 배치.
- 는 메탄올을 증발 하는 핫 플레이트와 100 ° C에 솔루션을 열. 잔여 메탄올을 제거 하 고 2-3 분 교 반 하면서 진공에서 반응 혼합물을 유지 하는 듀얼 진공/가스 매니폴드 Schlenk 라인에 플라스 크를 연결.
- 150 ° C의 온도 증가 시키고 60 분 유지에 대 한이 온도 700 rpm의 교 반 속도 합성 중.
참고: 솔루션을 splashing 피하기 위해 적절 한 교 반 속도 설정. - 핫 플레이트를 중지 하 고 플라스 크 솔루션 수 있도록 실내 온도에 차가운 유지 아래로 천천히.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기. - NaOH 메탄올의 결합 2 mL 재고 솔루션 그리고 NH 4 F 메탄올 15 mL 원심 분리기 관으로 재고 솔루션의 2.965 mL. 모자와 튜브를 강화 하 고 5에 대 한 강력한 vortexing 솔루션 혼합 미
- 추가 유리 피 펫 5 분 이상 하 여 플라스 크에 서서히 NaOH NH 4 F의 혼합물
- 50 ° C에 혼합물의 온도 증가 시키고 30 분이이 온도
참고: 높은 온도 크리스탈 nucleation 및 성장을 추진 하기 때문에 더 이상 50 ° C에서 온도 설정. - 잔여 메탄올을 제거 하 고 2-3 분 위한 진공에서 반응 혼합물을 유지 하는 듀얼 진공/가스 매니폴드 Schlenk 선 플라스 크를 연결 하 고 메탄올을 증발을 (~ 100 ° C) 온도 증가
- 질소로 플라스 크를 채우기 위해 자 지의 위치 전환.
- 증가 290 ° c ~ 5 ° C/분의가 열 속도로 온도 유지 1.5 헤 290 ° C에서 반응 혼합물
- 핫 플레이트를 중지 하 고 플라스 크를 천천히 교 반 하면서 실 온에서 반응 혼합물을 허용 하도록 제거.
주의: 높은 온도와 뜨거운 접시의 조심 (> 400 ° C) 피부 접촉 시 심한 화상을 피하기 위해. - 50 mL 원심 분리기 튜브에 플라스 크에서 혼합물을 전송합니다. 에탄올의 30 mL로 플라스 크를 헹 구 고 원심 분리기 튜브 솔루션 전송.
- 원심 실 온에서 8 분 4000 × g에서 제품 하 고는 상쾌한 삭제.
- 원심 분리기 튜브와 다시 분산 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 2 분을 가진 제품을 헥 산의 추가 10 mL
- 튜브에 에탄올 30 mL를 추가합니다. 8 분 4000 × g에서 제품 아래로 회전 하 고 다음 삭제는 상쾌한.
- 다시 hexane 5 mL와 원심 분리기 튜브의 아래쪽에 고체 제품 분산. 다음 단계에 대 한 ~ 4 ° C에서 냉장고에서 솔루션을 저장.
참고: 808 nm 레이저 (2 승) 솔루션을 해 하 여 코어-쉘 UCNs의 업 방출 테스트.
- 다시 (채널 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F 메탄올 재고 솔루션의 준비
- 준비의 NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) 코어-쉘 나노
- 올레산 및 1 octadecene의 7 mL 3 mL 50 mL 3 목 플라스 크에 결합. Y (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션 및 Nd (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션의 2.87 mL 1.082 mL 플라스 크에 추가.
- 교 반 하면서 플라스 크에 얻은 핵심 nanostructure (단계 1.1.2.18에서에서 헥 산 5 mL에에서 80 밀리 그램)를 추가.
- 는 온도계 (0-360 ° C 범위) 플라스 크에 적합 하 고 혼합물을 터치 팁. Phenylmethyl 실리콘 오일 플라스 크를 유리 용기에 배치.
- 혼합물 메탄올, 헥 산 증발 하 핫 플레이트 위에 100 ° C에서 열. 잔류 용 매를 제거 하 고 2-3 분 교 반 하면서 진공에서 반응 혼합물을 유지 하는 듀얼 진공/가스 매니폴드 Schlenk 라인에 플라스 크를 연결.
- 150 ° C의 온도 증가 시키고 그것은 60 분 유지에 대 한 교 반 속도 합성에서 700 rpm에서.
참고: 솔루션을 splashing 피하기 위해 적절 한 교 반 속도 설정. - 핫 플레이트를 중지 하 고 실 온에서 천천히 냉각 솔루션을 수 있도록 플라스 크를 제거.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기. - NaOH 메탄올의 피 펫 2 mL 재고 솔루션 그리고 NH 4 F 메탄올 15 mL 원심 분리기 관으로 재고 솔루션의 2.965 mL. 모자와 튜브를 강화 하 고 5에 대 한 강력한 vortexing 솔루션 혼합 미
- 추가 유리 피 펫 5 분 이상 천천히 하 여 플라스 크에 혼합
- 50 ° C에 혼합물의 온도 증가 하 고 30 분 50 ° C에서 유지
참고: 설정 온도 50 ° C 보다 높은 온도 크리스탈 nucleation 및 성장 촉진 것입니다 때문에. - 2-3 분 위한 진공에서 반응 혼합물을 유지 하는 잔여 메탄올을 제거 하는 이중 진공/가스 매니폴드 Schlenk 선 플라스 크를 연결 하 고 메탄올을 증발을 (~ 100 ° C) 온도 증가
- 질소로 플라스 크를 채우기 위해 자 지의 위치 전환.
- 290 ° C의 온도 증가 ~ 5 ° C/분의가 열 속도로 1.5 헤 290 ° C에서 반응 혼합물을 유지
- 핫 플레이트를 중지 하 고 플라스 크를 천천히 교 반 하면서 실 온에서 반응 혼합물을 허용 하도록 제거.
주의: 높은 온도와 뜨거운 접시의 조심 (> 400 ° C) 피부 접촉 시 심한 화상을 피하기 위해. - 50 mL 원심 분리기 튜브에 플라스 크에서 혼합물을 전송합니다. 에탄올의 30 mL로 플라스 크를 헹 구 고 원심 분리기 튜브 솔루션 전송.
- 원심 실 온에서 8 분 4000 × g에서 제품 하 고는 상쾌한 삭제.
- 원심 분리기 튜브와 다시 분산 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 2 분을 가진 제품을 헥 산의 추가 10 mL
- 튜브에 에탄올 30 mL를 추가합니다. 8 분 4000 × g에서 제품 아래로 회전 하 고 다음 삭제는 상쾌한.
- 다시 hexane 5 mL와 원심 분리기 튜브의 아래쪽에 고체 제품 분산. 필요할 때까지 ~ 4 ° C에서 냉장고에서 솔루션을 저장.
참고: 808 nm 레이저 (2 승) 솔루션을 해 하 여 코어-쉘 UCNs의 업 방출 테스트.
2. 생체 UCNs Nanostructures의 합성
- ligand 무료 UCNs 나노의 준비
- 결합 30 mL 에탄올으로 준비 oleate 출장 UCNs 솔루션 (단계 1.2.18) 50 mL 원심 분리기 튜브에서. 실 온에서 8 분 4000 × g에서 혼합물을 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 결합 10 mL 산 성 용액 (pH = 4) 50 mL 원심 분리기 튜브에 침전 된 HCl (0.1 M)으로 조정 하 고 침전 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 30 분에 의해 분해
- 전송 활발 한와 유리에서 솔루션 유리병 2 헤에 대 한 교 반
- 올레 산을 제거, 3 번 반복을 30 mL diethyl 에테르와 용액 추출.
- 부드러운 떨고와 결합 된 에테르 층에 10 mL 물을 추가.
- 는 수성 수집 (20 mL)를 함께 상 고 5에 대 한 vortexing와 20 mL 아세톤을 추가 s.
- 스핀 10 분 35000 × g에서 제품 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 2 물에 침전을 분해.
- 폴리머의 준비 수정 UCNs (PAA UCNs)
- 200mg polyacrylic 산의 결합 (PAA, Mw = 1800) PAA 솔루션에서 상기 ligand 무료 UCNs 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 20 분 대에 의해 20 mL 물 추가 활발 한 교 반.
- 30 분 교 반 하면서 실 온에서 24 h에 대 한 혼합물을 계속 쥡니다 (60 kHz, 240 W)와 7.4에 pH 값 NaOH 솔루션 (1 M)을 조정.
- 35000 × g에서 원심 분리 하 여 침전을 5 분 및 10 분에 35000 × g에서 다시 원심이이 단계를 세 번 반복에 대 일 분 다시 쥡니다 (60 kHz, 240 W)에 의해 10 mL 물에 제품 일시 중단에 대 한 수집.
- 5 분 ~ 4 ° C까지 필요에 냉장고에서 솔루션을 저장 하는 동안 다시 쥡니다 (60 kHz, 240 W)에 의해 8 mL 물에 제품을 분산.
- 기능 DBCO UCNs 나노의 준비
- 스핀 35000 × g에서 원심 분리에 의해 서 준비 된 PAA@UCNs (1 mg) 다운 10 분 다시 1 mL에 침전을 일시에 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 1 분 여 DMF 건조 그리고 원심 분리기 다시 35000 × g에서 10 분에 대 한이 단계를 반복 하 여 두 번.
- 디졸브 200 µ L에서 침전 DMF 유리 유리병에서 건조. HOBT (12.2 m g), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5mg), 및 DIPEA 추가 (16 µ L) 24 헤에 대 한 자석 교 반으로 유리병에서
- 35000 × g에서 원심 분리 하 여 제품을 10 분은 상쾌한을 제거 하 고 다시 1 mL DMSO에에서 침전을 일시 중단 하 고 다시 10 분 35000 × g에서 원심 분리기는 세 번이이 단계를 반복 수집.
- 분산 0.2 mL DMSO에 제품 및 매장에서 냉장고에 ~ 사용 하기 전에 4 ° C.
3. 생활 세포에서 막 채널의 규칙에서 Bioapplications의 DBCO-UCNs
Dulbecco에- 문화는 HEK293 세포 ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM) 10 %FBS, 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충 및 24 h. 위해 인큐베이터에서 유지 하 고 12-잘 접시에 1 ml DMEM/잘 37 ° C. 씨앗 1 × 10 5 셀에 5% CO 2 습도 인큐베이터에서 유지
- 결합 플라스 미드 (pCAGGS-ChR2-금성, 1 µ g) P3000 transfection 시 약 (2 µ L)이 글에서와 ' s 최소 필수 미디어 (MEM) (100 µ L) microcentrifuge에 A, 튜브 및 메모리에 transfection 시 약 (1.5 µ L)를 추가 (100 µ L) 튜브 나
- 솔루션 실 온에서 10 분 관 A와 B의 혼합물을 품 어.
- 는 400 µ L MEM 관 A와 B에서에서 솔루션을 결합 한 제품. 1 mL로 세포 세척 혈 청 무료 DMEM 두 번.
- 12-잘 접시의 각 음에 600 µ L transfection 혼합물을 추가 하 고 품 어 4 h. 제거에 대 한 37 ° C 배양 기에서 세포 매체 1 mL DMEM 두 번 씻어.
- 1 mL DMEM 1 µ L Ac 4 ManNAz (DMSO에 50 m m)를 포함 하는 잘 추가 하 고 인큐베이터에 2 일 동안 그것을 유지.
- 매체를 제거 하 고 1 mL PBS로 한 번 씻어. 12-잘 접시의 각 음에 1 mL 트립 신-EDTA (0.25%) 솔루션을 추가 하 고 셀 (~ 2 분)를 분리 할 때까지 37 ° C에서 품 어. 다시 하룻밤을 위해 셀/잘 DMEM 1 mL에에서 1 × 10 5에서 confocal 접시에 셀 문화.
- 매체를 제거 하 고 1 mL을 추가 2 µ L로 신선한 DMEM DBCO-UCNs (50 mg/mL) 2 h 37 ° c.에 대 한 접시에 Confocal 영상에 대 한 셀 DMEM 두 번 세척 하 고 1 µ L 로드-N 3 (10 mM) 30 분에 대 한 추가
- 세포내 칼슘 분석, 셀 1 µ L의 혼합물을 품 어 로드-3 오전 (10 mM), 10 µ L Probenecid (250 m m), 및 10 µ L 로드 버퍼 (Pluronic 계면 활성 제 polyols,0.1% w/v)) 어둠 속에서 30 분 동안 1 mL DMEM 매체에서.
- 셀 세럼 무료 DMEM 세척 하 고 20 분 (5 분 조명 후 5 분 휴식) 0.8 W/c m 2의 복용량에 808 nm의 NIR 빛 비추는.
- Confocal 현미경에 이미징 결과 기록 (레이저 소스: 561 nm 레이저, 검출기 범위: 610/75 nm; 렌즈: 100 x 1.4 나 기름, 노출 시간: 100 ms). 각 잘에서 1 mL 트립 신-EDTA (0.25%) 솔루션을 추가 하 고 셀 (~ 2 분)를 분리 할 때까지 37 ° C에서 품 어. 다시 1 ml PBS 흐름 cytometry (FCM) 분석에 대 한 셀을 일시 중단 (예: 561 nm, Em: 582/15 nm).
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Representative Results
코어-쉘 란타넘족 실수로 UCNs의 도식 합성 과정은 그림 1 과 그림 2에 표시 됩니다. 전송 전자 현미경 (TEM)와 코어 및 코어-쉘 UCNs nanostructures의 고해상도 전송 전자 현미경 (HRTEM) 이미지 각각 수집 했다 (그림 1). Ligand 무료 UCNs UCNs의 표면에 소수 올레산 산 성 솔루션을 제거 하 여 준비 하 고 친수성 폴리머 (PAA) 수정 됩니다. 다음 COOH 출장 PAA-UCNs는 기능성 DBCO-NH2 아 미드 응축 반응에 의해. Ligand 무료 UCNs, PAA UCNs 및 DBCO UCNs의 TEM 이미지는 그림 2에 표시 됩니다. 동적 산란 (DL), 제타 잠재적인 결과 DBCO UCNs의 업 (UCL) 발광 스펙트럼을 각각 수집 됩니다 (그림 3). DBCO-NH2, PAA UCNs 및 DBCO UCNs의 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 분광학은 그림 4에 표시 됩니다.
세포 실험, 세포 막에 ChR2의 성공적인 식 confocal 현미경 검사 법 (그림 5A)를 사용 하 여 분명 한 녹색 형광 단백질 (GFP) 마커 (금성)에 의해 확인 된다. DBCO-UCNs 클릭 반응 (그림 5A)에 의해 ChR2 표현 HEK293 세포의 표면에 특히 지역화 됩니다. NIR 빛 자극에 따라 세포내 칼슘 분석은 또한 confocal 영상 및 흐름 cytometry (FCM)는 표준 형광 캘리포니아2 + 표시기, 로드-3에 기반 하 여 확인 오전 (그림 5B, C).
그림 1입니다. 코어-쉘의 합성 란타넘족 실수로 UCNs. UCNs의 합성 과정의 (A) 회로도 그림. (B, C) 코어의 가장 (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1 %)) 및 코어-셸 (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanostructures. 눈금 막대: 50 nm. 코어 및 코어-쉘 UCNs nanostructures의 인세트: HRTEM 이미지. 눈금 막대: 5 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 기능 UCNs nanostructures의 합성. Ligand 무료 UCNs, PAA UCNs 및 DBCO-UCNs의 합성 과정의 (A) 회로도 그림 각각. (B, C, D) Ligand 무료 UCNs, PAA UCNs 및 DBCO UCNs의 TEM 이미지. 눈금 막대: 100 패널 B에 50 nm nm 패널 C/D.에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. DBCO-NH2, PAA UCNs 및 DBCO-UCNs의 FTIR 분광학 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 버퍼 솔루션에 DBCO UCNs의 특성화. DBCO-UCNs의 (A) DL 결과. (B) 제타 PAA UCNs 및 DBCO-UCNs (평균 ± SD)의 잠재적인 결과. 제 초 제 (1 mg/mL), PAA UCNs와 물 (1 mg/mL)에 DBCO UCNs의 코어 및 코어-쉘 UCNs의 (C) UCL 스펙트럼 별도로 (예: 808 nm). 808 nm 방사선 조사와 UCNs의 인세트: 발광 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. NIR에 DBCO UCNs의 셀룰러 응용 프로그램 빛 조명. 표현 하는 ChR2 N3의 (A) Confocal 영상-100 µ g/mL에서 2 h에 대 한 DBCO-UCNs (위)와 PAA UCNs (아래) incubated HEK293 세포 태그. 그린: ChR2-금성 (예: 488 nm, Em: 530/50 nm), 파랑: UCNs (예: 543 nm, Em: 580/50 nm). 눈금 막대: 20 µ m. (B) 세포질 캘리포니아2 + 이미지 로드-3와 NIR 빛 조사 (0.8 W/c m2 20 분) 후. 예: 561 nm, Em: 610/75 nm. 눈금 막대: 10 µ m. (C) 양적 FCM 분석의 세포질 캘리포니아2 + 다른 빛 복용량 조명 (평균 ± SD)로 정규화 된 형광 강렬의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 문서는 휴대 전화 응용 프로그램에 대 한 기능 moieties 란타넘족 실수로 업 코어-쉘 나노 (UCNs)의 합성 및 그들의 표면 개 질에 대 한 메서드를 제시 했다. 이 소설을 접한 자외선과 NIR 빛 여기 다중 광자 업 과정에 따라 보이는 빛을 방출할 수 있다 뛰어난 광학 특성을 소유한 다. 이 프로토콜, 코어-쉘 UCNs nanostructures (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %))는 준비 올레산 및 1 octadecene의 혼합물에서 높은 온도 공동 강 수 방법으로. 가장 이미지 보여 이러한 코어의 형태 및 코어-쉘 나노는 직경 20의 형태로 구형 및 30 nm 각각 암시 하는 쉘 두께 약 5 nm (그림 1). 코어-쉘 구조 또한 높은 해상도 가장 이미지 그림 1, 보여주는 핵심 UCNs nanostructures의 저것과 유사한 격자 변두리의 삽입에 의해 드러났습니다. 또한, 일반적인 d-0.52 nm β-NaYF4의 (100) 면의 간격 잘 동의 주위 간격, 모든에 코어 및 코어-쉘 UCNs nanostructures 높은 결정 하 고 동일한 결정 구조를 유지. 또한, 업 발광 스펙트럼 보여 코어-쉘 나노 480에 훨씬 더 높은 강도 가진 강한 블루 방출 방출 다이오드 레이저는 연속파 808에서 달성 하기 위해 여기에 코어 입자 보다 nm nm ( 그림 4C). 코어-쉘 UCNs의 향상 된 방출 억제 표면 냉각 하는 Yb3 +, Nd3 +, 그리고 코어-쉘 나노21의 내부 계층에 포함 된 Tm3 + 이온의 효과에 기인 된다. 이러한 결과 강력 하 게이 제안에 코어-쉘 UCNs 접한 란타넘족 첨가의 성공적인 준비를 확인합니다.
이러한 나노의 높은 온도 공동 강수량 합성에서 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 란타넘족 이온 재고 솔루션 코어 및 코어-쉘 UCNs의 합성 과정에서의 추가 볼륨 엄격 하 게 통제 한다 (단계 1.1.2.2). 높은 수준의 이온도 핑 농도 관련 크로스-휴식 또는 냉각 효과21나노에서 이온-이온 상호 작용 때문에 발생 합니다. NaOH와 NH4F 결정 성장 오 스 트 발트에 따라 홍보 하 여 균일 한 형태를 위해 중요 하다 (단계 1.1.2.9와 단계 1.2.9), 술병에 추가 된 후 완전 한 nucleation 되도록 미만 50 ° C에 온도 유지 한다 둘째, 숙성 효과22. 셋째, 크기 및 코어-쉘 나노 입자의 광학 속성은 셸 (Y3 + 와 Nd3 +)으로 준비 하는 코어 입자 (1.2.1 단계)의 선구자에서 란타넘족 이온의 양을 조정 하 여 주로 제어 수 있습니다. 그것은 또한 중요 한 코어-쉘 나노의 형태는 NIR 빛 조명23시 UCNs의 다른 광학 배출량을 조절 하는 데 유용 코어 입자의 다양 한 종류의 이방성 셸 성장에 기반으로 것입니다.
또한, 소수 UCNs 추가 생물 학적 응용에 대 한 친수성 UCNs 나노 효과적으로 변환할 상당한 도전 이기도 합니다. 버퍼 솔루션에 UCNs의 생체 적합성을 향상 시키기 위해 몇 가지 방법을 보고 되었습니다 비록 ligand 교환, 실리 카 코팅, ligand 산화 oleate 상한, 등, 등 그들은 시간이 걸리고, 예기치 않은 집계에서 고통 그리고 복잡 한 절차24,,2526. 여기, 우리 산 물 솔루션에서 oleate 출장 UCNs의 표면에 올레산을 제거 하 여 물 분산 ligand 무료 UCNs nanostructures를 간단한 방법 개발 (pH = 4). HCl에 의해 조정 하는 pH 값이 oleate ligand의 릴리스를 제어 하 고 UCNs의 발광에 영향을 미칠 중요 합니다. 더 중요 한 것은, 한 생체 고분자 (polyacrylic 산, PAA) carboxyl 그룹 추가 화학에 대 한 더 많은 기능 그룹을 제공할 것입니다 조정 상호 작용에 의해 UCNs의 표면에 란타넘족 이온와 연결할 수 있다의 많은 수 수정입니다. 따라서, 우리는 더 특정 N3를 위한 UCNs의 표면에 DBCO-NH2 moieties functionalize-세포 막 지역화 태그. Ligand 무료 UCNs, PAA UCNs 및 DBCO-UCNs 그림 2에서 편 이미지는 표면 처리 후 큰 dispersity 및 버퍼 솔루션에 이러한 nanostructures의 가용성을 보여 줍니다. 또한, 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 분광학 특성 UCNs nanoplatform에 DBCO 그룹의 표면 수정 수행 되었다. 그림 3에서 보듯이 3,430 cm-1 주위에 강한 밴드 carboxyl 그룹의 H O 스트레칭 진동 때문 이며 가운데 1550 c m-1 과 1458 cm-1 에 2 개의 악대는 비대칭와 연결 하 고 UCNP 표면에 COOH 그룹 포함 된 고분자 (PAA)의 성공적인 코팅을 나타내는 카복실산 음이온의 대칭 스트레칭 진동 모드. DBCO-NH2 moieties, 반응 후 1,635 cm-1 에 분명 한 밴드는 C = C는 DBCO-NH2 moieties 동시의 FTIR 스펙트럼과 일치 DBCO 그룹의 향기로운 반지에 진동 기지개에 따라 wavenumber입니다. 또한, 동적 산란 (DL) 결과 수성 해결책에서 DBCO UCNs의 유체역학 직경 증가 나타냅니다 (96.4±10.4 nm) (그림 4A). 제타 잠재적인 결과 또한 PAA UCNs의 부정적인 면을 나타냅니다 (-26.1±4.4 mV) 및 DBCO UCNs (-11.9±5.6 mV) 각각 (그림 4B), 좋은 가용성 및 버퍼 솔루션에 이러한 nanostructures의 안정성을 보여주는. 또한, PAA UCNs 및 DBCO UCNs의 UCL 스펙트럼 그들이 480에서 비슷한 upconverted 방출 방출 수 있습니다 입증 nm 808 nm 빛 조사 (그림 4C), 추가 NIR 빛 중재 photoactivation 생물에 대 한 이용 될 수 있는 시 시스템입니다.
또한,-의 증거-개념, 살아있는 세포에서 기능성된 UCNs의 bioapplication를 설명 하기 위하여 빛-문이 채널 단백질 (ChR2)은 양이온 이온의 유입을 중재 하 여 세포 기능을 조절 하는 세포 표면에 설계 (예를 들어, 캘리포니아2 +) 세포질27,,2829에. HEK293 세포 라인의 막에 ChR2의 성공적인 식 confocal 현미경 검사 법 (그림 5A)를 사용 하 여 녹색 형광 단백질 (GFP) 마커 (금성)의 존재에 의해 확인 된다. 또한, N3에 UCNs의 지역화-태그 세포 막의 세포 표면에 (파란색) 2 h 부 화 후 UCNs nanostructures의 표면에 잔여 DBCO 그룹으로 얼룩이 사실에 기인 수 있습니다 분명히 시각 이다 포함 하는 아 지 드 형광 염료 (5-carboxytetramethylrhodamine-아 지 드, 로드-N3) 구리 무료 bioorthogonal 통해 클릭 반응 합니다. 또한, NIR 빛 (808 nm) 지역화 UCNs nanotransducer 활성화할 수 있는 세포 표면에 비추는 활용빛 문이 ChR2 단백질 채널 고 막에 걸쳐 캘리포니아2 + 이온 유입 촉진. cytosol에 빨간색 형광의 상당한 증가 관찰은 그림 5B같이 표준 형광 Ca2 + 표시기, 로드-3 오전, 동안 아무 명백한 형광 증가 빛 조명의 부재에 기록 됩니다. 그림 5C 에 양적 흐름 cytometry (FCM) 분석 또한 함을 보여 줍니다 이러한 NIR 빛 응답 형광 향상 빛-복용량-의존, biocompatible DBCO UCNs 효과적으로 통제할 수 있다 명확 하 게 제안 합니다 NIR 빛 조사 시 세포 막에 채널 단백질.
요약 하자면, 상기 결과에 따라, 우리가 기대 하 고 현재 프로토콜 뿐만 아니라 코어-쉘 UCNs nanostructures의 높은 온도 공동 강수량 합성에 대 한 자세한 실험 절차를 제공 하지만 간단한 개발 추가 NIR 빛 중재 photoactivation 생물 학적 응용에 대 한 UCNs의 생체 표면 개 질에 대 한 기술. 더 중요 한 것은,이 방법은 뒤에 있는 근거에 따라 UCNs의 광학 속성 추가 조정 될 수 있다 다른 종류 란타넘족 이온의도 핑에 의해 (예를 들면,에 르 븀 (III), Holmium (III), 등) UV, 녹색, 빨강, 방출 결정에 고 NIR 빛 808 nm 빛 조사30에. 또한, UCNs 표면 수정할 수 있습니다 또한 다양 한 기능 그룹 (예:펩타이드, 단백질, 지질, 리간드, 등을 대상으로) 더 생명 의학 어플리케이션31,32. 이러한 장점을 생체 UCNs 접한 생리 적 프로세스 시험관 및 비보에, 연구에 대 한 적합 한 후보 만들고 따라서 역할을 수 있습니다 맞춤된 nanomedicine 임상 theranostics에 대 한 미래에.
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Disclosures
공개 하는 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NTU-AIT-MUV 남/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13)에 의해 부분적으로 지원 하 고 (RG 35/15) 난 양 기술 대학교, 싱가포르, 국립 자연 과학 재단의 중국 (NSFC) (No. 51628201) 수상.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Octadecene | Sigma Aldrich | O806 | Technical grade |
oleic acid | Sigma Aldrich | 364525 | Technical grade |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | Technical grade |
Ethanol | Fisher Scientific | A405 | Technical grade |
Acetone | Fisher Scientific | A18 | Technical grade |
Hexane | Sigma Aldrich | H292 | Technical grade |
Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 367702 | 99.9% trace metals basis |
Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 325805 | 99.9% trace metals basis |
Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326011 | 99.9% trace metals basis |
Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) | Sigma Aldrich | 326046 | 99.9% trace metals basis |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | reagent grade |
Ammonium fluoride (NH4F) | Sigma Aldrich | 338869 | ACS reagent |
Hydrogen chloride (HCl) | Fisher Scientific | A144 | reagent grade |
polyacrylic acid (PAA) | Sigma Aldrich | 323667 | average Mw 1800 |
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma Aldrich | 54802 | ACS reagent |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E7750 | commercial grade |
Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) | Sigma Aldrich | 761540 | ACS reagent |
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma Aldrich | D125806 | ACS reagent |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231 | Technical grade |
HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | human embryonic kidney |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | ACS reagent |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) | Addgene | 15753 | Plasmid sent as bacteria in agar stab |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11965092 | High glucose |
opti-Modified Eagle Medium (MEM) | Thermo Fisher | 51985034 | Reduced Serum Media |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000015 | Lipid-Based Transfection |
N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) | Sigma Aldrich | A7605 | ACS reagent |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | Phenol red |
Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | R10145 | Fluorescence dye |
5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) | Sigma Aldrich | 760757 | Azide-fluor 545 |
Confical dish | ibidi GmbH | 81158 | Glass Bottom, 35 mm |
50 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | Polypropylene |
15 ml conical centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Polypropylene |
1.5 ml conical microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | Polypropylene |
Phenylmethyl silicone oil | Clearco Products | 63148-52-7 | Less than 320 degrees Celsius |
Glass thermometer | GH Zeal | L0111/10 | From -10 to 360 degrees Celsius |
12-well plate | Sigma Aldrich | Z707775 | Polystyrene |
References
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