Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש elutriation צנטריפוגלי כדי להפריד בין תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרי לשלבים שונים של מחזור התא.
Abstract
היכולת לסנכרן את התאים כבר מרכזי לקידום ההבנה שלנו של מחזור התא רגולציה. טכניקות נפוצות המועסקים כוללים קיפוח סרום; כימיקלים אשר לעצור תאים בכל שלבי מחזור התא שונים; או השימוש mitotic לנער-off המנצלת שדבקו מופחת. אולם, כל אלה יש חסרונות. לדוגמה, סרום הרעבה עובד היטב עבור תאים נורמליים, אבל פחות טוב של תאים סרטניים עם מחזור התא פרוץ המחסומים בשל אובדן משתיק קול ההפעלה או גידול אונקוגן. באופן דומה, אוכלוסיות תאים טיפול כימי יכול הנמל נזק שיכרון ולהראות שינויים הקשורות במתח. טכניקה אשר עוקף בעיות אלה הוא counterflow elutriation צנטריפוגליות (להרדים), שבו תאים נחשפים שני הכוחות המנוגדים, כוח צנטריפוגלי, מהירות נוזלים, כשהתוצאה היא ההפרדה של תאים על בסיס גודל וצפיפות. מאז תאים לקדם באמצעות המחזור בדרך כלל להגדיל, להרדים יכול לשמש כדי להפריד בין תאים לשלבים שונים של מחזור התא. כאן אנו מיישמים את הטכניקה הזו לתאים העיקרי לוקמיה לימפובלסטית חריפה. בתנאים אופטימליים, אוכלוסיה בעיקרו של דבר טהור של תאים בשלב G1 ואת אוכלוסיה מועשר של תאים בשלבים G2/M ניתן להשיג תשואה מעולה. אוכלוסיות תאים אלה מתאימים באופן אידיאלי עבור לימוד תלויי-מחזור התא מנגנוני הפעולה של תרופות נגד סרטן, יישומים אחרים. אנחנו גם להראות כיצד שינויים הליך סטנדרטי יכול לגרום בביצועים שיוצרת ולדון את המגבלות של הטכניקה. המתודולוגיה מפורט שהוצג צריך לאפשר יישום וחקירה של הטכניקה סוגים אחרים של תאים.
Introduction
תאים בתרבית בדרך כלל לגדול באופן אסינכרוני, תאים בודדים נמצאים בשלבים שונים של מחזור התא. אורגניזמים מסוימים ייתקלו מחזורי תאים סינכרונית באופן טבעי או ניתן לסנכרן באמצעות ספציפית לגירויים פיזיולוגיים. לדוגמה, גרעינים בתוך plasmodia ענק התבנית רפש Physarum polycephalum לחלק אופנה מאוד סינכרונית1, וכן תאים של האצות הירוק שניתן לסנכרן Desmodesmus quadricauda , לסירוגין כהה תקופות2. בעוד אורגניזמים כגון מציעים תכונות ניסויית ייחודית, הם מודל כראוי המורכבות של תאי יונקים. היכולת לסנכרן באופן מלאכותי בתרבית של תאים אוכלוסיות כבר מרכזי לקידום ההבנה שלנו של מחזור התא רגולציה, הבסיס המולקולרי של מחזור התא מחסומים. שיטות נפוצות כוללות מניעת סרום, בלוק כימי, שחרור, או ניצול מאפיינים פיזיים3,4. נסיגה של סרום גורם לעתים קרובות תאים להזין תרדמה ולאחר התוספת מחדש של סרום מקדם החזרה מחזור התא לתוך שלב G15. מעכבי כימי כוללות סוכני כגון עודף תימידין הידרוקסיוראה החוסמות תאים על הגבול G1/S, או מעכבי microtubule אשר בדרך כלל לעצור התאים ב-3,שלב4מ'. גישות לנצל תכונות פיזיות כוללות mitotic לנער את אשר יכול לשמש כדי להעשיר תאים mitotic מכיוון שהן פחות חסיד מאשר לאטמוספרה תאים6. אולם, כל הטכניקות הללו יש החסרונות פוטנציאל. לדוגמה, לא כל סוגי תאים לשמור על הכדאיות העדר של סרום או הנוכחות של מעכבי כימי, וכן את התשואה של התאים לאחר mitotic לנער-לא מוגבל ללא סינכרון מוקדמת עם מעכבי mitotic.
למעט בתחילת מחזורי תאים עובריים, שבו תאים בהדרגה להקטנת גודל כפי הם מחלקים7, רוב התאים לקדם באמצעות המחזור עוברים שלבי גידול ולהיות גדול יותר. מאפיין זה הוא לנצל את הטכניקה של counterflow צנטריפוגלי elutriation (להרדים), אשר יכול לשמש כדי להפריד בין תאים שונות בגודל, ומכאן במחזור התא שלב8,9. במהלך. להרדים, התאים נמצאים תחת ההשפעה של שני כוחות מנוגדים: כוח צנטריפוגלי, אשר כוננים התאים מחוץ לציר הסיבוב, והמהירות נוזל (counterflow), אשר מניע את התאים לכיוון לציר הסיבוב (איור 1). תאים במחסנית elutriation להגיע למשרת שיווי משקל שבו כוחות אלה הם שווים. גורמי מפתח מכתיב את מיקום שיווי משקל הם התא קוטר וצפיפות. כמו הזרם גדל קצב של הפתרון מאגר כוח גרירה counterflow עולה הדיסקה, נוצר שיווי משקל חדש, גרימת שינוי בעמדה של תאים בתוך החדר. כל התאים יוזזו לכיוון היציאה קאמרית, וכתוצאה מכך הקטנים עוזב את החדר קודם, ואילו התאים גדול יותר להישאר בתוך החדר עד שער counterflow הוא גדל מספיק כדי לקדם את היציאה שלהם. ניתן לאסוף תאי בריחה תא elutriation עם עליות רצופות קצב counterflow בחלקים ספציפיים ומכיל כל השבר תאים ברצף הולך וגובר גדלים. במקום ניצוח elutriation עם עליות מצטבר counterflow קצב, ירידות רציפים כוח צנטריפוגלי על ידי הפחתת מהירות צנטריפוגה תוכלו להשיג את אותה תוצאה. התהליך של elutriation דורש אופטימיזציה בהתאם סוג התא, מאגר elutriation המועסקים מנגנון ספציפי משמש. הקצב של שיקוע של תאים בתנאים אלה מתואר על ידי חוק סטוקס מיטב: SV = [d2(ρp- ρמ') / 18η] .ω2r, איפה SV = מהירות שיקוע; d = קוטר של החלקיק; Ρp = צפיפות של החלקיק; Ρm = צפיפות של המאגר; Η = צמיגות של המאגר; Ω = מהירות זוויתית של הרוטור; ו- r = רדיאלי המיקום של החלקיק. לפיכך, SV הוא יחסי התא קוטר וצפיפות, מאז קוטר הוא בחזקת השני, תורם יותר משמעותית מאשר צפיפות אשר הוא בדרך כלל קבוע דרך מחזור התא.
יתרון חשוב של להרדים הוא תאים לא נתון את התנאים הקשים של טיפול כימי או מחסור תזונתי, ניתן לשחזר בעיקרו בשלוות נפש מעולה כממוצע. דרישה הוא בתאים עוברים עלייה משמעותית בקוטר לפחות 30%, כפי שהם חוצים את מחזור התא. החיסרון העיקרי הוא העלות של צנטריפוגה מיוחדים, רוטור, אביזרים. למרות זאת, היכולת להכין תאים מועשר בשלבים מסוימים מחזור התא על-ידי. להרדים במידה רבה הנחתה את מחזור התא במחקר האורגניזמים שמרים בתרבית של תאים9,10. יתר על כן, ההתקדמות מתרחבים שימושים הפרדת תאים מן בריא לעומת רקמה סרטנית, ההפרדה של סוגי תאים שונים בתערובות הטרוגניות ולאחר לייצור של סוגי תאים ספציפיים חיסוני9.
האינטרס העיקרי שלנו כבר בהבנת מנגנון הפעולה של microtubule מיקוד סוכנים (MTAs) כגון וינקה אלקלואידים, taxanes. תרופות אלו נחשבו לפעול באופן בלעדי מיטוזה, חסימת צירים microtubule פונקציה11,12, אך לאחרונה העדויות שהם גם עשויים למקד לאטמוספרה microtubules13,14. לאחרונה דיווחנו כי ראשי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) תאים עוברים מוות בכל שלב G1 או ב- M שלב כאשר שטופלו vincristine ו MTAs אחרים באופן תלוי-מחזור התא15. היכולת להפריד בין כל התאים לשלבים שונים מחזור התא על ידי להרדים היה אינסטרומנטלי להגיע מסקנה זו. במאמר זה, אנו מתארים את הפרטים הטכניים, מציעים טיפים מעשיים עבור היישום של. להרדים הכנת ראשי כל התאים בשלבים שונים של מחזור התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה הותאם עבור ראשי B-כל התאים אשר נע בקוטר של 8 מיקרומטר (שלב G1) 13 מיקרומטר (שלבים G2/M). לפיכך, מהירויות צנטריפוגה ספציפיים, משאבת זרימה המחירים לא ייתכן החלים על תאים בעלי גודל שונה טווחים. ובכל זאת, הפרמטרים elutriation המתאים יכול להיות מוערך באמצעות המשוואה קצב שקיעת. תאים מתורבתים במדיום מוגדר ללא סרום כפי שמתואר 16 ב צפיפות מיטבית של 1-3 x 10 6 תאים למ"ל. פרט לאוסף של שברים מתנהל ב 4 ° C באמצעות צינורות מקורר קרח, נערכים כל השלבים בטמפרטורת החדר, לצנטריפוגה להגדיר ב- 20 ° C עם מקסימום של 24 מעלות צלזיוס
1. הכנה של מאגר Elutriation וחומרים
- על מנת להפחית את הצליעה של תאים, להכין מאגר elutriation של האנק ' s מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) עם פנול אדום בתוספת 2% סרום שור עוברית ( FBS), כדי להגן על התאים מלחץ מכני במהלך תהליך elutriation, ו 1.6 g/L 2-naphthol-6,8-דיסולפו dipotassium חומצת מלח (NDA), אשר הופך את הסביבה החיצונית תא אניון ומפחיתה את הצליעה.
- להוסיף 1.6 גר' NDA צינור חרוטי 50 מ ל.
- בתנאים סטריליים, להוסיף 35 מ של HBSS מתוך בקבוק 1 ליטר ל 50 מ ל צינור חרוטי המכיל NDA. מערבולת הצינור עד NDA יש התפרקה.
- באמצעות מסנן 0.2 µm, להעביר את NDA המומס לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל. לאחר מכן להוסיף את NDA הנותרים 1 ליטר של HBSS.
- לבסוף, להוסיף 21 מ FBS HBSS הסופית בריכוז של 2% (v/v).
הערה: המאגר elutriation יכול להיות מוכן ומאוחסנים ב 4 ° C עד תאריך התפוגה של HBSS או עד שלא יהיה שינוי גדול ב- pH כמצוין על-ידי הצהבה של אינדקטור.
- תווית 50 מ ל צינורות חרוט עבור אוסף של שברים כך שיהיו צינורות בתווית לשטוף 1 ו-2 (W1, W2), שברים 1-20 (F1 - F20), ולהפסיק.
- מראש להירגע הצינורות האלה על הקרח לפני איסוף השברים.
2. הרכבה של מערכת Elutriation
- ראשון, התקן את מכלול strobe לתוך לצנטריפוגה כך כבל החשמל מוזנים אל מחוץ לתא באמצעות היציאה בצד שמאל. ודא המנורה פלאש strobe בחלקו הקדמי של החדר אז זה יעמדו בתור עם חלון צפייה לצנטריפוגה נסגר.
- המאבטחים את מכלול במקום קודם הידוק ברגי פיליפס שני לתוך החורים שני בחלק העליון של הסוגריים כל, ואז על ידי הידוק את מכשיר העינויים בתחתית הכן לכל.
- חברו את כבל החשמל ליציאת כוח strobe בחלק האחורי לצנטריפוגה.
- הבא, הגדר הרוטור ישר למטה על גבי ה-hub נסיעה צנטריפוגה ולאבטח עם מפתח ברגים hex ידית T.
הערה: אם לצנטריפוגה נחוצה למטרות הלא-elutriation, את מכלול strobe ו הרוטור יכול להישמר בין פועל בצנטריפוגה. - ברגע הרוטור מאובטחת, הנח את מכלול שחרור מהיר המכיל את elutriation קאמרית, מונה איזון, סיבוב חותם האסיפה, צלחת הרכבה לתוך הרוטור.
- לדחוף למטה באופן שווה עם יד אחת על תא elutriation, היד השנייה על האיזון מונה עד המנעולים של הרוטור הצמד לתוך החורים על הצלחת הרכבה.
- לבסוף, חבר את כבל עגינת על-ידי הצבת את הסיכה על צד אחד של הכבל לתוך החור בהרכבה חותם מסתובב ואבטחת את eyehole בצד השני של הכבל עם אחד הברגים פיליפס (מוזכר 2.1.1) שבכן-o בצד שמאל נ התא.
- הבא, להרכיב מערכת הזרימה באמצעות משאבה מהירות משתנה, אבובים למאגר משאבת לתוך elutriation קאמרית ולאסוף מאגר זורם החוצה מהחדר elutriation.
- הוספה הצנרת קלט בגודל 16 מגיע המשאבה מהירות משתנה באמצעות היציאה בחלק העליון השמאלי של החדר צנטריפוגה כך הוא נכנס אל החדר.
- לצרף מתאים לסוף חינם של הצנרת קלט ולהוסיף ההתאמה לתוך החור קלט בצד מכלול חותם מסתובב.
- הוספה בגודל 16 פלט אבובים דרך היציאה ולחבר אותו צינור העברה בחלק העליון של סיבוב חותם האסיפה.
הערה: מערכת הזרימה יכולה גם להישאר התאספו בין פועל elutriation.
- לבסוף, להפעיל לצנטריפוגה ולהגדיר את המפרט הדרוש לניסוי.
- שינוי הרוטור מזהה
- אם לצנטריפוגה דורש קלט הזמן, להגדיר עבור 2 h, וזה די והותר להשלים elutriation לרוץ.
- מוגדר בטמפרטורה של 20 ° C עם זמני מקסימום 24 ° C.
- להגדיר את ההאצה על מקס והאטה עבור לאט.
- לבסוף, הגדר את המהירות לג'י x 867
3. הטרמה של מערכת Elutriation
- קודם כדי לחטא את מערכת elutriation, למקם את הצנרור מאגר מים לתוך בקבוק 500 מ"ל פלסטיק המכילה 5% מלבין ולמקם את צינורות פלט לתוך 1 ליטר פלסטיק פסולת בקבוק ריק.
- להפעיל את המשאבה להגדיר את המהירות עד 25 mL/min ומאפשרים לזרום לאורך כל הדרך מערכת elutriation עד זה נשאבים מתוך הצינור פלט לתוך הבקבוק פסולת המלבין 5%-
- תפעיל לצנטריפוגה ולא לאפשר לו לבוא המרבי שנקבע מהירות (867 x g) כדי לשחרר בועות, backpressure.
- עוצרים לצנטריפוגה. ברגע הרוטור הפסיק סיבוב, פותחים את המכסה ולבדוק את התא עבור הדלפות.
- אם אין דליפות, לתת את הפתרון אקונומיקה זרימה דרך המערכת לפחות 5 דק
- הבא, לרוקן את המערכת עם מים בלוק כמו אקונומיקה יכול להוביל להיווצרות פוחת משקעים מתוך המאגר elutriation אשר עשויים להוביל הצליעה של התאים, כמו גם לגרום נזק לתאים.
- המקום הצנרת מאגר מים לתוך בקבוק 1 ליטר של בלוק מים ולאפשר את המים דרך במשך לפחות 10 דקות
- לאחר שטיפה עם מים, להציג את מאגר elutriation לתוך המערכת. להשתמש בבקבוק זכוכית 150 מ אשר היה בלוק ליצירת מאגר עבור מאגר elutriation ותאים.
- להוסיף 100 מ של elutriation מאגר של הבקבוק ולהזיז את המאגר אבובים על בקבוק הזכוכית כך ברכבת התחתית נמצאת בתחתית מאוד.
- לאפשר את המאגר לזרום דרך המערכת כדי. להוריד את המים ומתחילים לצנטריפוגה.
- פעם בקבוק לאגירת כמעט ריקה המים התרוקן לגמרי מחוץ למערכת, להעביר את הפלט אבובים מהבקבוק פסולת למאגר המים כך המאגר להיות ממוחזר דרך המערכת.
- לבסוף, להתאים את חלון צפייה כך תא elutriation ניתן לראות את המהירות הנוכחית.
- העיתונות strobe מנורת חשמל כפתור בצד החיצוני של צנטריפוגה כך מדליק המנורה. להפוך את k elutriationנוב גם בצד החיצוני של צנטריפוגה עד הסוף שמאלה.
- בזמן מביט מבעד לחלון הצפייה, לאט סיבוב הידית שמאלה עד תא elutriation מגיע לתוך נוף ואור strobe הוא בזמן עם הסיבוב של הרוטור.
הערה: מערכת elutriation יכול להיות שמאל במצב זה עד התאים הם מוכנה.
4. הכנת המדגם תא
- ספירת תאים, מדיום הגידול בתוך 300 עד 400 מיליון aliquot לתוך צינורות חרוט מספר 50 מ ל. ספין למטה התאים ב g ואורך 1210 x עבור מינימלית 3
- לשאוב את צמיחת תאים resuspend ומדיה 25 מ של מאגר elutriation על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות.
- על מנת להפחית תא clumping, מסירה תאים פעמיים דרך 25 להעריך את המחט.
- באמצעות מזרק 10 מ"ל לצייר את התאים ואז לצרף מחט בקוטר 25, תעביר את התאים דרך אל תוך קיר של צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל. חזור על פעולה זו עד 25 מ ל כל עברו דרך המחט.
- לקבל מזרק עם מחט חדשה וחזור על התהליך לעיל פעם.
התראה: מחטי מזרקים להניחה במיכלים שרפ.
הערה: זה קריטי התאים יידחפו דרך המחט מיד לפני להם היכרות עם מערכת elutriation לשמור על התא clumping למינימום.
5. הקדמה של דגימות התאים לתוך המערכת Elutriation ואת אוסף של שברים
- להציג דגימת תאים לתוך המערכת elutriation על ידי מזיגת המדגם תא לתוך הטנק מאגר הכולל מאגר elutriation הנותרים מיחזור באמצעות .
- לתת את התאים נכנסים למערכת ולהגיע שיווי משקל בתוך תא elutriation.
הערה: תהליך זה ייקח בערך 5 דקות, ניתן לעקוב אחר התקדמות על-ידי צפייה התאים כפי שהם להיכנס לתא באמצעות חלון הצפייה. כדי להבטיח שכל התאים בבית הבליעה, קח טיפה של eluent, מניחים על משטח זכוכית, ולהציג תחת מיקרוסקופ. אם המדגם הוא חינם של תאים שלמים, זה מאשר את השמירה שלהם בתא.
- לתת את התאים נכנסים למערכת ולהגיע שיווי משקל בתוך תא elutriation.
- להתחיל באיסוף שברים ברגע כל התאים נכנסו אל החדר ואין גבול שונות בחלק הרחב ביותר של התא שבו התאים נמצאים בשיווי משקל.
- בגין על-ידי העברת הצינור פלט הצינור חרוט 50 מ ל תווית W1. לאסוף 50 מ של elutriation למאגר הזה שבר, מקפיד לשמור על מיכל אגירה, לחדש באמצעות מאגר elutriation בעת הצורך.
הערה: על מנת לוודא כי כל התאים נכנסו לתוך המערכת, לאפשר את טנק המאגר להפוך כמעט ריק לפני מילוי המאגר בפעם הראשונה. אחרי רעיון הראשון לא יהיה צורך לחכות המאגר להפוך כמעט ריק. גם, לא פעם לאפשר לטנק להיות ריק כמו פעולה זו תיצור בועות ולחץ בגב במערכת. - לאחר 50 מ ל שנגבה עבור W1, בו זמנית לשנות את המהירות ל 821 x g, להעביר צינור פלט כדי הצינור חרוט עם התווית W2, לאסוף 50 מ ל יותר במהירות הזאת.
- ממשיכים לשנות את המהירות ואיסוף השברים כמצוין בטבלה 1. ודא כי יש מדיה במאגר המים טנק ולשמור את צינורות חרוט על קרח בכל עת. לבסוף, להתאים את חלון צפייה על ידי לאט הופכים את הידית ימינה כפי מקטין המהירות.
- לאחר שברים 20 כל נאספו, תפסיק לצנטריפוגה ולאסוף 50 מ ל צינור חרוט עם התווית להפסיק.
- בגין על-ידי העברת הצינור פלט הצינור חרוט 50 מ ל תווית W1. לאסוף 50 מ של elutriation למאגר הזה שבר, מקפיד לשמור על מיכל אגירה, לחדש באמצעות מאגר elutriation בעת הצורך.
6. שטיפה של מערכת Elutriation
- לאחר לצנטריפוגה הפסיק לחלוטין מיושרות המערכת על ידי מכניס את הצינור מאגר מים 1 ליטר בקבוק מים בלוק ולתחנת רכבת התחתית בקווינסוואי פלט לבקבוק פסולת.
- להפעיל את המשאבה מהירות עד 50 mL/min ולאפשר את המים לרוץ דרך המערכת עד זה תיגמר.
- להפעיל את המשאבה, הסר את הצינור קלט ופלט של מכלול שחרור מהיר, להוציא את ה-pin של הכבל עגינת.
- הסר מכלול שחרור מהיר של הרוטור.
הערה: תלוי מה לצנטריפוגה ישמש עבור, מערכת elutriation יכול עכשיו להיות יושארו כפי. אחרת, מכלול שלם ניתן לקחת לפי סדר מול כמתואר לעיל. תא elutriation יכול להיות הסרת מכלול שחרור מהיר וניקה בין פועל באמצעות אמבט מים אולטרה סאונד. פעולה זו מסירה את הלכלוך ואת מזהמים מהקיר קאמרית אשר עלול להשפיע לרעה פועל מאוחר יותר.
- הסר מכלול שחרור מהיר של הרוטור.
7. ניתוח של שברים ואוסף של G1 או בריכות G2/M.
הערה: כדי להדגים את היעילות של elutriation, ניתוח שבר כל ספירת תאים, תא בקוטר של תוכן ה-DNA, בריכות נוצרים תאים בשלבים G1 או G2/M עבור ניתוחים immunoblot, כפי שמתואר נציג תוצאות. סעיף פרוטוקול זה יתאר כיצד ליצור בשלוליות להכין אותם לשימוש ניסיוני.
- לסובב כל שבר ב g x 2000 דקות 5-4 ° C ו לשאוב את מאגר elutriation.
- שברים לשלב ביחד על מנת לקבל בריכה שלב G1 וגם בריכה שלבים G2/M.
- עבור G1 שלב הבריכה, resuspend שברים אשר נאספו בטווח מהירות של 788 x g 661 x גרם (F1 - F5) סך 1 מ"ל של פוספט תמיסת מלח מאגר (PBS), העברת צינור חרוטי 15 מ"ל. עבור מאגר שלבים G2/M, resuspend שברים אשר נאספו בטווח מהירות של 387-g ו- g x 333 (F17 - F20).
- ספין למטה תאים ב g x 2000 דקות 5-4 ° C ו לשאוב את PBS.
- Resuspend בתאים 10 מ"ל של צמיחה מדיה ולקחת ספירה תא.
- סעו aliquot של תוכן באמצעות propidium יודיד מכתים בכל בריכה שינותח לדנ א, לזרום cytometric ניתוח 15.
הערה: השארית בכל בריכה יכול לשמש לניסויים נוספים-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ראשית כל התאים (3-4 x 108) היו נתון elutriation צנטריפוגלי ונאספים שני שברים שטיפת ושברים הראשי עשרים, כמפורט בפרוטוקול. טבלה 1 מציגה את הנתונים נציג איפה המספר הכולל של תאים כל שבר, כמו גם את מהירות הרוטור המתאימים מוצגים. בסך הכל התשואה היה בדרך כלל מעל 80%. מדידה של התא קוטר בחלקים בודדים אישר את קוטר תא גדל עם קידום elutriation (איור 2). תוצאות אלו מייצגים ממוצעים של שני האישושים עצמאית ומשקפים רמה גבוהה של נתונים הפארמצבטית. שברים הבא היו נתונים propidium יודיד מכתים, לזרום cytometry לקביעת תוכן דנ א (איור 3). שברים מוקדם (F1 - F5) הכיל כמעט אך ורק תאים עם תוכן ה-DNA 2N המייצגת שלב G1. תערובת של תאים ב- G1 שלב ושלב S נצפתה בחלקים ביניים (F6 - F9) והיו תאים עם תוכן ה-DNA 4N נצפתה החל ב F10. שברים מאוחר יותר היו בעיקר תאים עם תוכן ה-DNA 4N המייצגים שלבים G2/M. נתונים אלה יחד עם התוצאות של איור 2 אישר גומלין בין גודל תא, שלב מחזור התא.
בהתבסס על תוצאות אלו, שברים F1 - F5, חברו יחד כדי ליצור מאגר של תאים בשלב G1, שברים F17 - F20 חברו יחד כדי ליצור מאגר של תאים בשלב G2/M. היחס של תאים עם תוכן ה-DNA 2N בבריכה שלב G1 הייתה בדרך כלל 99%, חלקם של תאים עם תוכן ה-DNA 4N בבריכה G2/M היה בדרך כלל 85%, כפי שנקבע על ידי צביעת יודיד propidium, לזרום cytometry. בתנאים אסינכרוני, 60-70% של ראשי כל התאים הם שלב G1 ו- 15-20% הם שלבים G2/ז15, ובכך הערכים שהתקבלו לאחר elutriation לשקף רמות גבוהות של העשרה. לאימות עוד שתי הבריכות לגבי שלב מחזור התא, תמציות מכל היו נענשים immunoblotting עם סמנים של שלבים G1 או G2/M. ראשית, אנחנו מנוצל של נוגדנים ספציפיים פוספו אשר מזהה את החלבון רטינובלסטומה (Rb) phosphorylated Ser-807 או Ser-811, שכן היא מבוססת היטב כי Rb הופכת phosphorylated יותר ויותר כמו תאים להתקדם דרך מחזור התא17 . כפי שמוצג באיור4, רמות של פוספו-Rb היו גבוהים יותר בתאים בבריכה G2/M מול הבריכה שלב G1, בקנה אחד עם הציפיות. אנחנו גם נחקר B1 cyclin, הבאה לידי ביטוי ביותר בתאים שלב G2/M, ועבור D1 cyclin, הבאה לידי ביטוי ביותר תאים שלב G118 (איור 4). הבריכה G2/M היו רמות גבוהות יותר של B1 cyclin בהשוואה הבריכה G1, בקנה אחד עם הציפיות. Cyclin D1 נתן רק אות חלש ההכנות האלה, אבל בכל זאת היה לזיהוי בבריכה G1 ו לגילוי בבריכה G2/M. GAPDH שימש פקד כדי לאשר טעינת חלבון שווה.
בוצעו שינויים הפרוטוקול הסטנדרטי כדי להעריך את ההשפעות שלהם וכדי לקבוע תנאים לקבלת ביצועים מיטביים. ראשית, מספר שברים שנאספו היה ירד, מ פה רגיל כדי רק שלוש, באמצעות מהירויות מחילופי טבלה 1 כדי לייצג את הנקודות מסוף עבור אוסף של תאים בשלבים G1, S או G2/M, כפי שמוצג בטבלה מס ' 2. ניתוח של התוכן הדנ א של שברים F1 ו- F3 מוצגים באיור 5A. שבר 1 הכיל התאים מועשרים מאוד בשלב G1 (95%) והיה ובכך טוהר דומה לזה שהושג בתנאים סטנדרטיים (איור 3). עם זאת, חלק 3, לכאורה תאים מועשר מאוד בשלב G2/M, נתן אוכלוסייה מעורבת, עם תאים בשלבים G1 ו- S גם בהווה. G2/M תאים ייצג רק 51% מכלל, לעומת 85% בתנאים רגילים. תוצאות אלו מצביעות על זה מנסה לפשט את ההליך על-ידי הפחתת מספר שברים פשרות מדגם איכות. בשלב הבא, בדקנו את השפעת צמצום נפח שבר, כאמצעי להפחתת צריכת מגיב. Elutriation סטנדרטי בוצעה חוץ מזה 40 מ"ל במקום 50 מ ל שברים שנאספו. שברים F1 ו- F20 נותחו עבור תוכן ה-DNA. כפי שמוצג באיור 5B, היה שבר F1 מאוד מועשר ב- G1 לשלב תאים (98%), דומה לזה שהושג בתנאים סטנדרטיים. עם זאת, שבר F20 המוכלים בתאים כל שלושת השלבים, עם תאים בשלב G2/M מייצג רק 64% מכלל, לעומת 85% בתנאים רגילים. תוצאות אלה מציינים כי צמצום נפח שבר גם פוגעת באיכות הדגימה.
איור 1 . עקרון elutriation צנטריפוגלי counterflow.
הערה ניתן להשיג את elutriation של תאים על-ידי הגדלת שיעור של counterflow כפי שצוין כאן, או על ידי הפחתת מהירות הרוטור. על-ידי רשות מן מקמילן מוציאים לאור בע מ: [הטבע פרוטוקולים] (Ref 8.), זכויות יוצרים (2008)8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . בקוטר של כל ראשי תאים גדל עם שבר elutriation.
הקוטר הממוצע נקבע עבור כל שבר באמצעות מנתח תא אשר רשומות נתונים מ 500-4,500 תאים בודדים עבור דגימה. הנתונים המוצגים הם זאת אומרת ± ש מ שני ניסויים עצמאית. שימו לב כי קווי שגיאה עבור נקודות רבות הם קטנים יותר מאשר הסמל, הושמטו עבור בהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . ניתוח של ה-DNA תוכן מאשר הפרדה מוצלחת בין ראשי כל התאים בשלבים שונים של מחזור התא.
10 מ של כל שבר תוקנה ב- 70% EtOH, צבעונית ב- propidium יודיד, נותחו על ידי cytometry זרימה, כפי שמתואר15. עוצמת יודיד משולב Propidium (ציר x) הייתה להתוות נגד ספירת התאים (ציר y) כדי לקבוע את החלק של תאים בלכל שלב, איפה 2N DNA תוכן מציין שלב G1 ומציין 4N DNA תוכן תאים בשלבים G2 או M. הנתונים המוצגים של ניסוי נציג, הושגו תוצאות זהות חיוניות ב 4 חזרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . ניתוח Immunoblot של חלבונים הקשורים מחזור התא, איחדושברים.
בעקבות elutriation סטנדרטי של ראשי כל התאים, שברים F1 - F5, חברו יחד כדי ליצור בריכה שלב G1 ושברים F17 - F20 משולב כדי ליצור מאגר שלב G2/M. תמציות היו מוכנים ל-40 µg/ליין נתון immunoblot ניתוח, כפי שתואר קודם לכן15, עם נוגדנים פוספו-Rb (Ser807/811), cyclin B1, או cyclin D1, כל שימוש ב 1:2,000 דילול. GAPDH (1:10, 000) שימש פקד הטעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . המחשה נתונים שיוצרת elutriations.
א) אסף השפעת הפחתת מספר שברים. רק שלושה שברים הראשי (F1 - F3), במקום תקן עשרים, כל אחד 100 מל ', נאספו, במהירויות כמצוין בטבלה מס ' 2. שברים F1 ו- F3 נותחו עבור ה-DNA תוכן כמו באיור 3. B) השפעת צמצום נפח שבר. שברים עשרים נאספו, תחת באותם התנאים כמו טבלה 1, אבל רק 40 מ"ל elutriation מאגר במקום רגיל 50 מ ל שימש עבור כל אחד. שברים F1 ו- F20 נותחו עבור ה-DNA תוכן כמו באיור 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שבר | מהירות (rpm) | G-Force | סה כ תאי (x 10 ^ 6) |
| W1 | 3000 | 867 x g | 17.75 |
| W2 | 2920 | 821 x g | 7.00 |
| F1 | 2860 | 788 x g | 4.60 |
| F2 | 2800 | 755 x g | 10.75 |
| F3 | 2740 | 723 x g | 15.25 |
| F4 | 2680 | 692 x g | 22.50 |
| F5 | . המטומטמת | 661 x g | 26.75 |
| F6 | 2560 | 631 x g | 25.00 |
| F7 | 2500 | 602 x g | 22.75 |
| F8 | 2440 | 573 x g | 18.00 |
| F9 | 2380 | 546 x g | 14.00 |
| F10 | 2320 | 518 x g | 10.75 |
| F11 | 2260 | 492 x g | 7.43 |
| F12 | 2200 | 466 x g | 8.63 |
| F13 | 2140 | 441 x g | 6.63 |
| F14 | 2100 | 425 x g | 4.98 |
| F15 | 2060 | 409 x g | 3.46 |
| F16 | 2020 | 393 x g | 3.43 |
| F17 | 1980 | 378 x g | 2.63 |
| F18 | 1940 | 363 x g | 3.17 |
| F19 | 1900 | 248 x g | 2.78 |
| F20 | 1860 | 333 x g | 1.66 |
| . תפסיק | 0 | 0 x g | 5.19 |
| התשואה הכוללת | 245.06 | ||
| אחוז התשואה | 81.69 | ||
טבלה 1. התא התשואה מהירות הרוטור המתאימים עבור כל שבר.
ספירת התאים נקבע באמצעות מונה תא אוטומטית. התשואה הכוללת נקבע על ידי הסכום של שברים בודדים לעומת קלט (3 x 108 תאים). הנתונים הם ממוצע של שני ניסויים נציג. כוח צנטריפוגלי ומהירות הרוטור המתאימים מקבלים.
| שבר | מהירות (rpm) | כוח ג'י |
| W1 | 3000 | 867 x g |
| W2 | 2920 | 821 x g |
| F1 | . המטומטמת | 661 x g |
| F2 | 2020 | 393 x g |
| F3 | 1860 | 333 x g |
| . תפסיק | 0 | 0 x g |
בטבלה 2. מהירות פרמטרים עבור שיוצרת elutriation.
מוצגות צנטריפוגלי כוחות ואת מהירויות הרוטור המתאים עבור שוטף שלושה שברים שליקט elutriation שיוצרת דחוס. לקבלת התוכן הדנ א שלהם וטקסט לפרטים, ראה איור 5A .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תארנו שיטה להשגת ראשי כל התאים בשלבים שונים של מחזור התא באמצעות להרדים. בתנאים אופטימליים אוכלוסיה בעיקרו של דבר טהור של תאים בשלב G1 ואת אוכלוסיה מועשר של תאים בשלבים G2/M יכול בקלות להשיג תשואה מעולה, התאים מועשרים מאוד בשלב זה גם ניתן להשיג אם רצונך בכך. התוצאות המובאות כאן התקבלו באמצעות ראשי אחד שכל תרבות (ליתר דיוק, כל-5) ותוצאות במהותה זהה הושגו עם תרבות עצמאית, כל-215. בנוסף, כל שאר ראשי בכל התרבויות בדק את תאריך יש טווחים צפיפות דומה במהלך צמיחה אסינכרוני, צפויה לבצע באופן דומה כאשר נתון להרדים. מחקרים קודמים שלנו הראו גם כי ניתן להפריד שורות תאים לוקמיה אחרים, כולל HL60, K562, לשלבים שונים מחזור התא באמצעות להרדים19,20. שלבים קריטיים בהליך כוללים להבטיח כי התאים הם התפזרו מונו לא גושית בתחילת המרוץ; אופטימיזציה של תנאי counterflow קצב מהירות הרוטור; להבטיח את הרכיבים של המערכת הם נקיים, ללא פסולת; והימנעות המבוא של בועות אוויר לקווי הזרימה. . להרדים פועלת באופן מיטבי עם תאים המגבירים באופן משמעותי בגודל תא בשעת התקדמותם דרך מחזור התא. עבור אוכלוסיה נתון של תאים ההשעיה, זה ניתן להקים בתחילה ובקלות על ידי בחינת הקשר בין DNA תוכן צד-פיזור, הנתמך האחרון על גודל התא. שני הפרמטרים ניתן למדוד בו זמנית על ידי cytometry זרימה לאחר יודיד propidium מכתים, כפי שתיארנו15. הקשר הליניארי בין הצד-פיזור ותוכן DNA מספק ביטחון כי גודל תא עולה עם התקדמות מחזור התא, ובכך שיש להרדים את הפוטנציאל בתאים נפרדים המבוסס על שלב מחזור התא.
כפי שהראתי (איור 5), סטיות מההליך ממוטבת התוצאה איכות מדגם פרוץ, במיוחד עבור תאים בשלבים G2/M. עם זאת, צמצום מספר שברים או שבר נפח לא ניכרת השפיע על הטוהר של תאים בשלב G1 (איור 5). לפיכך, ניתן לסבול קיצורי דרך ההליך אם רק תאים שלב G1 מטוהרים נדרשים. להרדים אמנם נוטה בקלות ההשעיה תרביות תאים, באפשרותך להחיל אותה גם על שברים subcellular. לדוגמה, גרעינים מתאי מאתר טרום-B כבר בהצלחה גודל-מופרדים באמצעות להרדים8. סוגי תאים חסיד להוות בעיות פוטנציאליות בגלל הנטייה שלהם לכיוון קיבוץ ואפשרי ההקפדה משטחים לשכת צנור ו- elutriation, לפיכך צריך להיחקר בזהירות.
המגבלה העיקרית של להרדים עלותו של הציוד; פתרון אפשרי הוא לשתף פעולה עם מעבדה אשר יש מנגנון הכרחי. עם זאת שימו לב כי בעוד הרוטור הוא מכשיר ייעודי, לצנטריפוגה יכול לשמש למטרות כלליות צנטריפוגה, ובכך להקטין את העלות להשקיע אך ורק להרדים. מגבלה נוספת היא כי התזמון של ניסויים בעייתי יותר לעומת הגמישות של שיטות אחרות כגון סינכרון סרום הרעבה או כימית. Elutriation פועל בדרך כלל לקחת 5-6 שעות, אם התאים שהושג לאחר מכן נדרשים לניסויים לטווח קצר או זמן רב נקודת, התוצאה יכולה להיות תזמון אי הנוחות. היתרון הגדול הוא כי תאים המתקבלות בשיטה זו בשלוות נפש, יכולים להיות בתרבית במשך ימים רבים ללא כל סימנים של מצוקה, כפי שהראתי15. זה מנוגד תאים מסונכרנים באמצעים כימיים אשר ייתכן הנמל נזק תחת השפעת סמים. מחקר שנערך לאחרונה, באמצעות תאים NB4 נגזר לוקמיה מיאלואידית חריפה תקיעות, ישירות בהשוואה להרדים ושיטות אחרות, לרבות מעצר עם סרום הרעבה, הידרוקסיוראה או טיפול עם מעכב קינאז תלוי-cyclin 1, רו-330621. Elutriated תאים ותאים נעצר ב שלבים דומים הופיעו דומה ביחס DNA תוכן וביטוי cyclin. אולם, כאשר פרוטאום נבחנה, רס ן משנה בשפע חלבון, בעיקר הקשורות במתח, חלבונים ספציפיים מעצר, נצפו התאים נעצר ולא התאים elutriated תא המקביל גודל ומעמדות. תוצאות אלו להאיר את התועלת של להרדים לייצור תאים בשלוות נפש, להדגיש כי זהירות אמור לשמש לפרש נתונים מתאי מסונכרנת באמצעים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יעקב לוי Kothari נמצאת כרגע המחלקה של התא וביולוגיה מולקולרית בבית החולים סנט ג'וד לילדים מחקר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH CA109821 (כדי TCC). אנו מודים Beckman Coulter בנדיבות תקציבים כדי לכסות את עלויות הפרסום, לקבלת סיוע טכני בארצות ותפעול של מערכת elutriation. אנו מודים ד ר פרד Falkenburg למתן הראשית הראשונית בכל התרבויות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
