Summary
Ce protocole décrit l’utilisation d’élutriation centrifuge pour séparer les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en phases de cycle de cellules différentes.
Abstract
La possibilité de synchroniser les cellules a été essentiel pour faire progresser notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire. Les techniques courantes utilisées incluent la privation de sérum ; produits chimiques qui arrêtent les cellules lors des phases d’un cycle cellulaire différent ; ou l’utilisation de mitotique shake-off qui exploite leur adhérence réduite. Cependant, tous ces ont des inconvénients. Par exemple, la privation de sérum fonctionne bien pour les cellules normales, mais moins bien pour les cellules de la tumeur avec compromis cell cycle points de contrôle en raison de l’oncogène activation ou tumor suppressor perte. De même, populations cellulaires traité chimiquement peuvent abriter des dommages causés par les drogues et montrent des altérations liées au stress. Une technique qui contourne ces problèmes est élutriation centrifuge contre-courant (CCE), où les cellules sont soumis à deux forces opposées, la force centrifuge et vitesse du fluide, qui se traduit par la séparation des cellules sur la base de la taille et la densité. Étant donné que les cellules avançant à travers le cycle typiquement agrandir, CCE peut être utilisé pour séparer les cellules en phases de cycle de cellules différentes. Ici, nous appliquons cette technique à des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë primaire. Dans des conditions optimales, une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M peuvent être obtenus avec un excellent rendement. Ces populations de cellules sont idéales pour étudier des mécanismes dépendants du cycle cellulaire d’action des médicaments anticancéreux et pour d’autres applications. Aussi, nous montrent comment les modifications à la procédure standard peut provoquer des performances sous-optimales et discuter les limites de la technique. La méthodologie détaillée présentée devrait faciliter l’application et à l’exploration de la technique à d’autres types de cellules.
Introduction
Les cellules cultivées généralement croissent de façon asynchrone et des cellules individuelles sont présents dans les différentes phases du cycle cellulaire. Certains organismes présentent naturellement synchrone des cycles cellulaires ou peuvent être synchronisées par des stimuli physiologiques spécifiques. Par exemple, les noyaux dans les plasmodes géants du myxomycète Physarum polycephalum divisent dans un mode très synchrone1et les cellules de l’algue que Desmodesmus quadricauda peuvent être synchronisés par une alternance de lumière et l’obscurité périodes2. Tandis que ces organismes offrent des particularités expérimentales, ils modèle insuffisamment les complexités des cellules de mammifères. La possibilité de synchroniser artificiellement les populations cellulaires de mammifères a été essentiel pour faire progresser notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire et la base moléculaire du cycle cellulaire points de contrôle. Méthodes courantes sont la privation de sérum, bloc chimique et libération ou d’exploiter les caractéristiques physiques3,4. Retrait du sérum entraîne souvent des cellules entrer dans le repos, et le rajout du sérum favorise rentrée cycle cellulaire en phase G15. Des inhibiteurs chimiques comprennent des agents tels que la thymidine excessive ou hydroxyurée qui bloquent les cellules à la limite de G1/S ou inhibiteurs de microtubules qui arrêtent généralement les cellules en phase M3,4. Les approches qui exploitent les caractéristiques physiques comprennent mitotique shake-off qui peut être utilisé pour enrichir des cellules mitotiques, car ils sont moins adhérents que de cellules interphasiques6. Cependant, toutes ces techniques présentent des inconvénients potentiels. Par exemple, pas tous les types de cellules maintiennent la viabilité en l’absence de sérum ou de la présence d’inhibiteurs chimiques et le rendement des cellules après que shake arrêt mitotique est limité sans synchronisation préalable avec inhibiteurs mitotiques.
À l’exception des premiers cycles cellulaires embryonnaires, où cellules diminuent progressivement en taille comme ils divisent7, avançant à travers le cycle de la plupart des cellules subissent des phases de croissance et de plus en plus. Cette propriété est exploitée en technique d’élutriation centrifuge contre-courant (CCE), qui peut être utilisée pour séparer les cellules différant par taille et par conséquent au cycle cellulaire phase8,9. Au cours de la CCE, les cellules sont sous l’influence de deux forces opposées : la force centrifuge, qui entraîne les cellules de l’axe de rotation et la vitesse du fluide (contre-courant), qui entraîne les cellules vers l’axe de rotation (Figure 1). Les cellules dans la chambre d’élutriation atteint une position d’équilibre où ces forces sont égales. Les principaux facteurs dictant la position d’équilibre sont la densité et le diamètre de la cellule. Comme l’écoulement de la solution tampon est augmenté et la force de traînée de contre-courant l’emporte sur la force centrifuge, un nouvel équilibre est établi, provoquant un changement dans la position des cellules à l’intérieur de la chambre. Toutes les cellules sont décalés vers la sortie de la chambre, ayant pour résultat plus petits laissant la chambre tout d’abord, alors que les plus grosses cellules restent dans la chambre jusqu'à ce que le taux de contre-courant est augmenté suffisamment pour promouvoir leur sortie. Les cellules s’échappant de la chambre d’élutriation avec hausses consécutives des taux de contre-courant peuvent être collectées dans les fractions spécifiques et chaque fraction contient des cellules de croissance séquentielle de tailles. Au lieu de mener élutriation avec des augmentations des taux de contre-courant, séquentiel diminue en force centrifuge en diminuant la vitesse de centrifugation permettra d’atteindre le même résultat. Le processus d’élutriation nécessite optimisation selon le type de cellule, élutriation tampon employées et l’appareillage spécifique utilisé. Le taux de sédimentation des cellules dans ces conditions est mieux décrit par la Loi de Stokes : SV = [d2ρp- ρ (m) / 18η] .ω2r, où SV = vitesse de sédimentation ; d = diamètre de la particule ; Ρ,p = masse volumique de la particule ; Ρm = masse volumique de la mémoire tampon. Η = viscosité de la mémoire tampon. Ω = vitesse angulaire du rotor ; et r = position radiale de la particule. Ainsi, la SV est proportionnelle à la densité et le diamètre de la cellule, et diamètre étant déclenché à la seconde puissance, elle contribue d’une manière plus significative que la densité qui est généralement constante au cours du cycle cellulaire.
Un avantage important du CCE est que les cellules ne sont pas soumises à des conditions difficiles de traitement chimique ou de la privation alimentaire et peuvent être récupérés avec un excellent rendement essentiellement non perturbée. Une exigence est que les cellules en question subissent une augmentation significative de diamètre, d’au moins 30 %, car ils parcourent le cycle cellulaire. Le principal inconvénient est le coût de la centrifugeuse spécialisée, rotor et accessoires. Néanmoins, la possibilité de préparer les cellules enrichies en phases de cycle de cellules spécifiques par le CCE a grandement facilité les recherche sur le cycle cellulaire chez les organismes de levure en cellules mammifères9,10. Par ailleurs, les avancées récentes élargissent utilisations à la séparation des cellules de sain par rapport aux tissus cancéreux, la séparation des différents types de cellules dans les mélanges hétérogènes et à la production de types spécifiques de cellules pour immunothérapie9.
Notre intérêt majeur a été pour comprendre le mécanisme d’action du microtubule ciblant les agents (MTA) tels que les alcaloïdes de la Pervenche et taxanes. Ces médicaments étaient censés agir exclusivement lors de la mitose, bloquant la fonction de microtubules du fuseau11,12, mais des données récentes suggèrent qu’ils peuvent viser aussi interphase microtubules13,14. Nous avons récemment rapporté que les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë (tous) subissent la mort en soit la phase G1 ou au m phase que traités par vincristine et d’autres MTA dans un cycle cellulaire-dépendant15. La capacité de séparer toutes les cellules en phases de cycle de cellules différentes par le CCE a contribué pour parvenir à cette conclusion. Dans cet article, nous décrire les détails techniques et offrent des conseils pratiques pour l’application du CCE à la préparation des primaires toutes les cellules en phases de cycle de cellules différentes.
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Protocol
Remarque : ce protocole a été optimisé pour primaire B-toutes les cellules qui vont de diamètre d’environ 8 µm (phase G1) à 13 µm (phases G2/M). Ainsi, la centrifugeuse spécifique des vitesses et les débits pompe peut-être pas applicables aux cellules avec des gammes de tailles différentes. Néanmoins, les paramètres appropriés d’élutriation peuvent être estimées à l’aide de l’équation de vitesse de sédimentation. Les cellules sont cultivées dans un milieu sans sérum défini comme décrit 16 à une densité optimale de 1-3 x 10 6 cellules/mL. À l’exception de la collection des fractions qui est réalisée à 4 ° C, en utilisant des tubes de refroidissement glace, toutes les mesures sont effectuées à température ambiante et la centrifugeuse réglé à 20 ° C avec un maximum de 24 ° C.
1. préparation du tampon de l’élutriation et matériaux
- afin de réduire l’agglutination des cellules, de préparer un tampon d’élutriation de Hank ' s équilibré de solution saline (HBSS) avec le rouge de phénol additionné de 2 % sérum de veau fœtal ( FBS), pour protéger les cellules contre les contraintes mécaniques pendant le processus de l’élutriation et 1,6 g/L de sel dipotassique acide 2-naphtol-6,8-disulfonique (NDA), qui rend l’extérieur de la cellule chargée négativement et réduit l’agglutination.
- Ajouter 1,6 g de NDA dans un tube conique de 50 mL.
- Dans des conditions stériles, ajouter 35 mL de HBSS provenant d’une bouteille de 1 L dans le tube conique de 50 mL contenant NDA. Agiter le tube jusqu'à ce que l’EDN a dissous.
- à l’aide d’un filtre de 0,2 µm, transférer la LDN dissoute dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL. Puis ajoutez l’EDN à la L 1 restante du HBSS.
- Ajouter enfin, 21 mL FBS à la HBSS pour obtenir une concentration finale de 2 % (v/v).
Remarque : La mémoire tampon d’élutriation peut être préparée et stockée à 4 ° C jusqu'à la date d’expiration du HBSS ou jusqu'à ce qu’il y a un changement majeur dans le pH comme il est indiqué par un jaunissement du colorant indicateur.
- Label 50 mL tubes coniques pour la collecte des fractions afin qu’il y a laver les fractions (W1 et W2), 1-20 (F1 - F20) 1 et 2 tubes étiquetés et arrêter.
- Refroidir préalablement ces tubes sur la glace avant de recueillir des fractions.
2. Assemblage du système élutriation
- installer tout d’abord, l’Assemblée de stroboscope dans la centrifugeuse pour que le cordon d’alimentation est introduit dans la chambre via le port sur le côté gauche. Veiller à ce que la lampe flash stroboscopique est à l’avant de la chambre, donc il s’alignera avec la fenêtre de visualisation quand la centrifugeuse est fermée.
- Fixer l’ensemble en place en serrant tout d’abord deux vis à tête Phillips dans les deux trous en haut de la chaque support et ensuite en serrant les vis de serrage au bas de chaque support.
- Brancher le cordon d’alimentation dans la prise d’alimentation de lampe stroboscopique à l’arrière de la centrifugeuse.
- Ensuite, mettre le rotor vers le bas sur le moyeu d’entraînement de centrifugeuse et sécuriser avec une clé hexagonale de poignée en T.
Remarque : Si la centrifugeuse n’est pas nécessaire à des fins non-élutriation, l’Assemblée de stroboscope et le rotor peuvent être conservés dans la centrifugeuse entre pistes. - Une fois que le rotor est sécurisé, placez l’assembly de dégagement rapide contenant la chambre élutriation, contrepoids, rotation d’ensemble et une plaque de montage dans le rotor.
- Appuyez uniformément avec une main sur la chambre d’élutriation et l’autre main sur le contrepoids jusqu'à ce que les boulons dans le rotor s’enclenchent dans les trous sur la plaque de montage.
- Enfin, fixer l’ancrage de câble en plaçant la broche sur un côté du câble dans le trou de la garniture rotative et fixant l’eyehole de l’autre côté du câble avec une des vis à tête Phillips (mentionnés à la section 2.1.1) sur le support sur le côté gauche de o la chambre de f.
- Ensuite assembler le système d’écoulement à l’aide d’une pompe à vitesse variable et chambre de tuyau au tampon de pompe dans l’élutriation et recueillir tampon telle qu’elle circule dans la chambre de l’élutriation.
- Insérer le tuyau d’entrée de taille 16 venant de la pompe à vitesse variable par l’orifice en haut à gauche de la chambre de centrifugeuse afin qu’elle pénètre dans la chambre.
- Fixer un raccord à l’extrémité libre du tuyau d’entrée et insérez le raccord dans le trou d’entrée sur le côté de la garniture rotative. Ensemble d’étanchéité
- Insérez la taille 16 tubes via le port de sortie et fixez-le au tube de transfert en haut de la rotation.
Remarque : Le système d’écoulement peut rester aussi assemblé entre les exécutions d’élutriation.
- Enfin, allumez la centrifugeuse et définir les spécifications nécessaires pour l’expérience.
- Changement du rotor ID.
- Si la centrifugeuse requiert une contribution de temps, définissez pendant 2 h, ce qui est plus que suffisante pour effectuer une élutriation exécute.
- Régler la température à 20 ° C avec une température maximum de 24 ° C.
- Set max l’accélération et la décélération pour lent.
- Enfin, réglez la vitesse à 867 x g.
3. D’amorçage du système élutriation
- préalable pour stériliser le système élutriation, placez le tuyau de réservoir dans une bouteille en plastique de 500 mL, contenant 5 % eau de Javel et placer le tube de sortie dans une bouteille en plastique vide de déchets du 1 L.
- Allumer la pompe et de régler la vitesse à 25 mL/min et de permettre à l’eau de Javel 5 % s’écouler complètement par le système d’élutriation jusqu'à ce qu’il est pompé hors du tube de sortie dans la bouteille pour eaux usées.
- Allumez la centrifugeuse et lui permettre de venir au maximum désignée vitesse (867 x g) afin de libérer les bulles et contre-pression.
- Arrêter la centrifugeuse. Une fois que le rotor a arrêté de tourner, ouvrez le couvercle et inspecter la chambre de fuites.
- Si il n’y a aucune fuite, laisser la solution d’eau de Javel débit dans le système pendant au moins 5 min.
- Ensuite, rincez le système avec autoclave eau comme eau de Javel peut conduire à la formation de précipités de la mémoire tampon d’élutriation qui peut conduire à l’agglutination des cellules, ainsi que d’effets nocifs pour les cellules.
- Place le tuyau de réservoir dans une bouteille de 1 L de stérilisés à l’autoclave de l’eau et lui permettre de circuler dans pour au moins 10 min.
- Après le rinçage avec de l’eau, introduire le tampon élutriation dans le système. Utiliser une bouteille de verre de 150 mL qui a été stérilisés à l’autoclave pour créer un réservoir pour les cellules et le tampon d’élutriation.
- Ajouter 100 mL de tampon d’élutriation dans le flacon et déplacer le tuyau de réservoir à la bouteille en verre afin que le tube est tout en bas.
- Commencer la centrifugeuse et laisser le tampon de circuler à travers le système pour évacuer l’eau.
- Une fois la bouteille réservoir est presque vide et l’eau est complètement évacué hors du système, déplacez la sortie tuyau de la bouteille pour eaux usées vers le réservoir afin que la mémoire tampon est être recyclé via le système de.
- Enfin, ajuster la fenêtre de visualisation afin que la chambre d’élutriation peut être vu à la vitesse actuelle.
Lampe
- presse le stroboscope alimentation touche à l’extérieur de la centrifugeuse pour que la lampe s’allume. Tourner l’élutriation kNob également à l’extérieur de la centrifugeuse complètement vers la gauche.
- Tout en regardant par le hublot, lentement tourner le bouton vers la droite jusqu'à ce que la chambre d’élutriation entrera en vue et la lumière stroboscopique est dans le temps avec la rotation du rotor.
Remarque : Le système d’élutriation peut être laissé dans cet état jusqu'à ce que les cellules sont préparés.
4. Préparation de l’échantillon de cellules
les cellules- comte et aliquote moyen de 300 à 400 millions en croissance dans plusieurs tubes conique de 50 mL. Tournez en bas des cellules à 1210 x g pendant 3 min.
- Aspirer les cellules de médias et remettre de la croissance dans 25 mL de tampon d’élutriation en pipettant également monter et descendre doucement.
- Afin de réduire la cellule agglomérante, cellules de passe deux fois à un 25 aiguille de calibre.
- à l’aide d’une seringue de 10 mL dresser les cellules puis fixer l’aiguille de calibre 25 et passer les cellules grâce à l’intérieur sur la paroi d’un tube conique stérile de 50 mL. Répétez cette opération jusqu'à ce que tous les 25 mL ont transité par l’aiguille.
- Obtenir une nouvelle aiguille et la seringue et répéter le processus ci-dessus une fois.
ATTENTION : Aiguilles de seringue doivent être placés dans des conteneurs pour objets acérés.
Remarque : Il est essentiel que les cellules sont poussés à travers l’aiguille immédiatement avant de leur présenter le système d’élutriation pour garder la cellule s’agglutiner au minimum.
5. Introduction de l’échantillon cellulaire dans le système de l’élutriation et la Collection des Fractions
- introduire l’échantillon cellulaire dans le système d’élutriation en versant l’échantillon cellulaire dans le réservoir de stockage qui a de la mémoire tampon d’élutriation restants recyclage par le biais .
- Laisse les cellules entrent dans le système et atteindre l’équilibre au sein de la chambre d’élutriation.
Remarque : Ce processus prendra environ 5 min et progrès peuvent être suivis en regardant les cellules lorsqu’ils entrent dans la chambre par l’intermédiaire de la fenêtre de visualisation. Pour s’assurer que toutes les cellules sont dans la chambre, prendre une goutte de l’éluant, déposer sur une lame de verre et Découvre sous un microscope. Si l’échantillon est libre de cellules intactes, cela confirme leur maintien dans la chambre de.
- Laisse les cellules entrent dans le système et atteindre l’équilibre au sein de la chambre d’élutriation.
- Commencer à accumuler des fractions dès que toutes les cellules sont entrés dans la chambre et il y a une limite distincte à la partie la plus large de la chambre dans laquelle les cellules sont en équilibre.
- Begin en déplaçant le tube de sortie vers le tube à fond conique 50 mL étiqueté W1. Recueillir 50 mL de tampon d’élutriation pour cette fraction, en veillant à garder un oeil sur le réservoir de stockage et de reconstituer avec le tampon d’élutriation lorsque cela est nécessaire.
Remarque : Afin de s’assurer que toutes les cellules sont entrés dans le système, laisser le réservoir de stockage devenir presque vide avant chaque remplissage du réservoir, la première fois. Après la première recharge, il ne sera pas nécessaire d’attendre que le réservoir de devenir presque vide. Aussi, ne jamais laisser la cuve se vide car cela va créer des bulles et la contre-pression dans le système. - Une fois 50 mL ont été recueillis pour W1, simultanément changer la vitesse à 821 g x et déplacer le tube de sortie pour le tube à fond conique étiqueté W2 et recueillir 50 mL plus à cette vitesse.
- Continuer à changer la vitesse et recueillant des fractions comme il est indiqué dans le tableau 1. Assurez-vous qu’il y a des médias dans le réservoir du réservoir et garder les tubes coniques sur la glace à tout moment. Enfin, ajuster la fenêtre de visualisation en tournant lentement le bouton vers la droite à mesure que la vitesse diminue.
- Une fois que toutes les fractions de 20 ont été prélevées, arrêter la centrifugeuse et recueillir 50 mL dans le tube à fond conique marqué STOP.
- Begin en déplaçant le tube de sortie vers le tube à fond conique 50 mL étiqueté W1. Recueillir 50 mL de tampon d’élutriation pour cette fraction, en veillant à garder un oeil sur le réservoir de stockage et de reconstituer avec le tampon d’élutriation lorsque cela est nécessaire.
6. Flushing du système élutriation
- après la centrifugeuse a cessé complètement rincer le système en plaçant le tube réservoir dans la bouteille de 1 L d’eau stérilisés à l’autoclave et le tube de sortie dans la bouteille des déchets.
- Mettre la vitesse de la pompe jusqu'à 50 mL/min et laisser l’eau couler à travers le système jusqu'à ce qu’elle est déchargée.
- Tourner la pompe, retirer le tuyau d’entrée et de sortie de l’Assemblée de dégagement rapide et tirez sur la broche du câble d’ancrage.
- Supprimer l’assembly de dégagement rapide du rotor.
NOTE : Selon ce que la centrifugeuse sera utilisée pour, le système d’élutriation peut être laissé maintenant comme c’est. Dans le cas contraire, l’ensemble peut être pris vers le bas dans l’ordre inverse comme décrit ci-dessus. La chambre d’élutriation peut être retirée de l’Assemblée de dégagement rapide et nettoyée entre s’exécute à l’aide d’un bain à ultrasons. Cela supprime les débris et les contaminants de la paroi de la chambre qui peut affecter négativement les pistes plus tard.
- Supprimer l’assembly de dégagement rapide du rotor.
7. L’analyse des Fractions et Collection du G1 ou G2/M piscines.
Remarque : pour démontrer l’efficacité d’élutriation, chaque fraction est analysée pour globules, le diamètre de la cellule et la teneur en ADN, et piscines sont créés des cellules dans les phases G1 ou G2/M pour les analyses immunoblot, comme décrit dans Représentant des résultats. Cette section de protocole décrit comment faire pour créer ces pools et les préparer à usage expérimental.
- Spin chaque fraction à 2000 x g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer hors tampon élutriation.
- Fractions de combiner ensemble afin d’obtenir une piscine de phase G1 et un pool de phases G2/M.
- Pour le G1 phase piscine, remettre en suspension les fractions qui ont été recueillies dans la gamme de vitesse de 788 x g à 661 x g (F1 - F5) dans 1 mL de solution saline de tampon phosphate (PBS) et transférez dans un tube conique de 15 mL au total. Pour le pool de phases G2/M, remettre en suspension les fractions qui ont été recueillies dans la gamme de vitesse de 387 x 333 x g (F17 - F20) et de g.
- Spin down cellules à 2000 x g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer hors PBS.
- Remettre en suspension des cellules dans 10 mL de milieu de culture et d’effectuer un comptage cellulaire. Prélever une partie aliquote de chaque poule à analyser l’ADN contenu via l’iodure de propidium et flux de l’analyse cytométrique 15 de
- .
NOTE : Le reste de chaque pool peut être utilisé pour d’autres expériences.
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Representative Results
Primaire toutes les cellules (3-4 x 108) ont été soumis à élutriation centrifuge et recueilli dans deux fractions de lavage et vingt principales fractions, comme décrit dans le protocole. Le tableau 1 montre les données représentatives où le nombre total de cellules dans chacune des fractions ainsi que la vitesse du rotor correspondantes est présenté. Dans l’ensemble rendement dépassait généralement 80 %. Mesure du diamètre des cellules dans les différentes fractions a confirmé ce diamètre cellulaire a augmenté avec l’élutriation (Figure 2). Ces résultats représentent des moyennes des deux déterminations indépendantes et reflètent le haut degré de reproductibilité de données. Fractions ont été ensuite soumises à l’iodure de propidium et cytométrie en flux pour déterminer le contenu en ADN (Figure 3). Premières fractions (F1 - F5) contiennent presque exclusivement de cellules contenant 2N ADN représentant la phase G1. Un mélange de cellules en phase G1 et phase S a été observé dans les fractions intermédiaires (F6 - F9) et des cellules avec la teneur en ADN 4N ont été observées à partir de F10. Les fractions plus tard ont principalement de cellules avec la teneur en ADN 4N représentant les phases G2/M. Ces données ainsi que les résultats de la Figure 2 ont confirmé une relation entre la taille des cellules et la phase du cycle cellulaire.
Selon ces résultats, les fractions F1 - F5 ont été combinées pour créer un pool de cellules en phase G1 et fractions F17 - F20 ont été combinées pour créer un pool de cellules en phase G2/M. La proportion de cellules contenant 2N ADN dans la piscine de phase G1 était généralement 99 % et la proportion de cellules avec la teneur en ADN 4N dans la piscine G2/M a été typiquement 85 %, tel que déterminé par l’iodure de propidium et cytométrie en flux. Asynchrone, 60 à 70 % de l’enseignement primaire sont de toutes les cellules en phase G1 et 15 à 20 % sont en G2/M phases15, donc les valeurs obtenues après élutriation apparaître des taux élevés d’enrichissement. Pour plus amples authentifier les deux piscines en ce qui concerne la phase du cycle cellulaire, des extraits de chacun ont été soumis à immunoblotting avec marqueurs des phases G1 ou G2/M. Tout d’abord, nous avons utilisé un anticorps phospho-spécifiques, qui reconnaît la protéine du rétinoblastome (Rb) phosphorylée sur Ser-807 ou Ser-811, puisqu’il est bien établi que Rb devient phosphorylée de plus en plus comme des cellules avance à travers le cycle cellulaire17 . Comme illustré à la Figure 4, niveaux de phospho-Rb étaient beaucoup plus élevés dans les cellules dans la piscine G2/M par rapport à la piscine de phase G1, conforme aux attentes. Aussi, nous avons sondé cyclin B1, qui s’exprime plus fortement dans les cellules en phase G2/M, et de la cycline D1, qui est plus fortement exprimé en G1 phase cellules18 (Figure 4). La piscine G2/M avait des niveaux beaucoup plus élevés de la cycline B1 par rapport à la piscine de G1, conforme aux attentes. Cycline D1 a donné seulement un signal faible dans ces préparations, mais néanmoins était détectable dans la piscine de G1 et indétectable dans la piscine G2/M. GAPDH a été utilisé un contrôle pour confirmer le chargement de protéines égale.
Modifications au protocole standard ont été réalisées pour évaluer leurs effets et de définir des conditions pour des performances optimales. Tout d’abord, le nombre de fractions collectées a diminué, depuis les vingt standards à seulement trois, en utilisant des vitesses déterminées du tableau 1 pour représenter les points terminaux de collecte de cellules dans les phases G1, S et G2/M, comme illustré dans le tableau 2. Analyse de la teneur en ADN des fractions F1 et F3 sont indiquées dans la Figure 5 a. Fraction 1 contenait des cellules fortement enrichis en phase G1 (95 %) et était donc de pureté semblable à celle obtenue dans des conditions normales (Figure 3). Cependant, la fraction 3, cellules ostensiblement fortement enrichi en phase G2/M, a donné une population mixte, avec des cellules en phases G1 et S également présents. Cellules G2/M représentent seulement 51 % du total, contre 85 % dans des conditions normales. Ces résultats indiquent que les tentatives de simplifier la procédure en réduisant le nombre de qualité d’échantillon de fractions des compromis. Ensuite, nous avons testé l’effet de réduire le volume de la fraction, comme un moyen de réduire la consommation de réactif. Une élutriation standard a été effectuée sauf que 40 mL au lieu de fractions 50 mL ont été recueillis. Fractions F1 et F20 ont analysé la teneur en ADN. Comme le montre la Figure 5 b, fraction F1 a été hautement enrichie dans les cellules en phase G1 (98 %), similaires à celle obtenue dans des conditions normales. Cependant, les cellules F20 contenu fraction, dans les trois phases, avec des cellules en phase G2/M seulement, ce qui représente 64 % du total, contre 85 % dans des conditions normales. Ces résultats indiquent que réduire le volume de la fraction compromet aussi de qualité de l’échantillon.
Figure 1 . Principe d’élutriation centrifuge de contre-courant.
Remarque Cette élutriation des cellules peut être réalisée soit en augmentant le taux de contre-courant comme indiqué ici, soit en diminuant la vitesse du rotor. Adapté avec la permission de Macmillan Publishers Ltd : [Nature protocoles] (Ref 8.), droit d’auteur (2008)8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Diamètre du primaire tous les cellules augmente avec la fraction d’élutriation.
Le diamètre moyen a été déterminé pour chaque fraction à l’aide d’un analyseur portable qui enregistre les données des cellules individuelles de 500-4 500 par exemple. Les données présentées sont moyenne ± S.D. de deux expériences indépendantes. Notez que les barres d’erreur de nombreux points sont plus petits que le symbole et ont été omis par souci de clarté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Analyse du contenu en ADN confirme séparation réussie de l’enseignement primaire, toutes les cellules en phases de cycle de cellules différentes.
10 mL de chacune des fractions a été fixée à 70 % EtOH, colorés à l’iodure de propidium et analysés par cytométrie en flux, comme décrit à15. Intensité d’intégré l’iodure de propidium (axe x) a été tracée par rapport aux globules (axe y) pour déterminer la partie des cellules dans chaque phase, où la teneur en ADN 2N indique phase G1 et 4N ADN contenu indique les cellules en phases G2 ou M. Les données présentées proviennent d’une expérience représentative et principaux résultats identiques ont été obtenus dans quatre répétitions. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Immunobuvardage de protéines cycle cellulaire en communfractions.
Suite à une standard élutriation primaire toutes les cellules, fractions F1 - F5 ont été combinés pour créer un pool de phase G1 et fractions F17 - F20 ont été combinés pour créer un pool de phase G2/M. Des extraits ont été préparé et 40 µg/lane soumis à l’analyse par immunotransfert, tel que décrit précédemment15, avec des anticorps phospho-Rb (Ser807/811), cycline B1 ou cycline D1, tous utilisés à dilution de 1:2,000. GAPDH (01:10, 000) a été utilisé comme un contrôle de chargement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Données illustratives d’elutriations sous-optimale.
A) effet de la diminution du nombre de fractions collectées. Seulement trois principales fractions (F1 - F3), au lieu de la norme vingt, chacun de 100 mL, ont été recueillies, à des vitesses comme il est indiqué dans le tableau 2. On a analysé la teneur en ADN comme sur la Figure 3fractions F1 et F3. B) effet de réduire le volume de la fraction. Fractions de vingt ont été recueillies, dans les mêmes conditions que dans le tableau 1, mais seulement 40 mL de tampon d’élutriation au lieu du standard de 50 mL est utilisée pour chacun. Fractions F1 et F20 ont analysé la teneur en ADN comme sur la Figure 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Fraction | Vitesse (tr/min) | G-Force | Total des cellules (x 10 ^ 6) |
| W1 | 3000 | 867 x g | 17.75 |
| W2 | 2920 | 821 g x | 7,00 |
| F1 | 2860 | 788 x g | 4.60 |
| F2 | 2800 | 755 x g | 10.75 |
| F3 | 2740 | 723 x g | 15,25 |
| F4 | 2680 | 692 x g | 22.50 |
| F5 | 2620 | 661 x g | 26,75 |
| F6 | 2560 | 631 x g | 25,00 |
| F7 | 2500 | 602 x g | 22,75 |
| F8 | 2440 | 573 x g | 18 h 00 |
| F9 | 2380 | 546 x g | 14 h 00 |
| F10 | 2320 | 518 x g | 10.75 |
| F11 | 2260 | 492 x g | 7.43 |
| F12 | 2200 | 466 x g | 8,63 |
| F13 | 2140 | 441 x g | 6.63 |
| F14 | 2100 | 425 x g | 4.98 |
| F15 | 2060 | 409 x g | 3.46 |
| F16 | 2020 | 393 x g | 3.43 |
| F17 | 1980 | 378 x g | 2.63 |
| F18 | 1940 | 363 x g | 3.17 |
| F19 | 1900 | 248 x g | 2.78 |
| F20 | 1860 | 333 x g | 1.66 |
| ARRÊTER | 0 | 0 x g | 5.19 |
| Rendement total | 245.06 | ||
| Pourcentage de rendement | 81,69 | ||
Le tableau 1. Rendement des cellules et la vitesse de rotor correspondante pour chaque fraction.
Nombre de cellules a été déterminé à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Rendement total a été déterminé par la somme des fractions individuelles par rapport aux entrées (3 x 108 cellules). Les données sont une moyenne de deux expériences représentatives. La force centrifuge et correspondante du rotor sont donnés.
| Fraction | Vitesse (tr/min) | G Force |
| W1 | 3000 | 867 x g |
| W2 | 2920 | 821 g x |
| F1 | 2620 | 661 x g |
| F2 | 2020 | 393 x g |
| F3 | 1860 | 333 x g |
| Arrêter | 0 | 0 x g |
Le tableau 2. Paramètres de vitesse d’élutriation sous-optimale.
Sont des forces centrifuges et vitesses correspondantes de rotor pour les lavages et trois fractions collectées dans une comprimé élutriation sous-optimale. Voir Figure 5 a pour la teneur en ADN correspondante et le texte pour plus de détails.
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Discussion
Nous avons décrit une méthode pour l’obtention de primaire toutes les cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire à l’aide de la CCE. Dans des conditions optimales une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M pourraient être facilement obtenus avec d’excellents rendements et cellules fortement enrichis en phase S peuvent également être obtenus si vous le souhaitez. Les résultats présentés ici ont été obtenus à l’aide d’un primaire que tous les culture (plus précisément, ALL-5) et essentiellement des résultats identiques ont été obtenus avec une culture indépendante, ALL-215. En outre, tous les autres primaires toutes les cultures étudiées jusqu’ici ont des gammes de densité semblable pendant la croissance asynchrone et seront sans doute effectuer de même lorsqu’ils sont soumis au CCE. Nos études antérieures ont montré également que les autres lignées de cellules de leucémie, dont HL60 et K562, peuvent être séparées en phases de cycle de cellules différentes à l’aide de CCE19,20. Des étapes critiques de la procédure notamment veiller à ce que les cellules sont dispersées par le mono et pas contagieuse au début de la course ; optimisation des conditions du régime rotor et taux de contre-courant ; assurer les composants du système sont propres et exempts de débris ; et en évitant l’introduction de bulles d’air dans les conduites d’écoulement. CCE fonctionne mieux avec les cellules qui augmentent considérablement dans la taille de la cellule pendant qu’ils avancent à travers le cycle cellulaire. Pour une population de cellules en suspension, ceci peut être établie au départ et facilement en examinant la relation entre la teneur en ADN et diffusion latérale, le dernier selon la taille de la cellule. Ces deux paramètres peuvent être mesurés simultanément par cytométrie en flux après coloration, l’iodure de propidium comme nous l’avons décrit15. Une relation linéaire entre la diffusion latérale et la teneur en ADN donne confiance que la taille des cellules augmente avec l’avancée du cycle cellulaire et ainsi que le CCE a le potentiel pour séparer les cellules basées sur la phase du cycle cellulaire.
Comme nous l’avons montré (Figure 5), qualité de l’échantillon de compromis, en particulier pour les cellules en phases G2/M entraîner déviations par rapport à la procédure optimisée. Toutefois, la réduction du nombre de fractions ou de la fraction volume n’affecte pas sensiblement de la pureté des cellules en phase G1 (Figure 5). Ainsi, des raccourcis vers la procédure peuvent être tolérées si seulement les cellules en phase G1 purifiées sont requises. Que CCE est facilement propices aux cultures de cellules de suspension, il peut également s’appliquer aux fractions subcellulaires. Par exemple, les noyaux des cellules pré-B murins ont été avec succès taille-séparés à l’aide de CCE8. Types de cellules adhérentes posent des problèmes potentiels en raison de leur propension agglomérante et possible l’adhérence sur les surfaces de la chambre de tubes et d’élutriation et doivent donc être examinées avec prudence.
La principale limitation du CCE est le coût de l’équipement ; une solution possible est de collaborer avec un laboratoire qui a l’appareil nécessaire. Notez toutefois que si le rotor est un instrument dédié, la centrifugeuse peut être utilisée à des fins générales de centrifugation, réduisant ainsi le coût investi exclusivement en CCE. Une autre limitation est que la planification d’expériences est plus problématique par rapport à la souplesse d’autres méthodes telles que la synchronisation de famine ou de produit chimique sérum. Élutriation s’exécute généralement prendre 5 à 6 heures, et si les cellules sont ensuite nécessaires pour des expériences de courte durée ou plusieurs fois un point, il peut en résulter dans l’ordonnancement des inconvénients. Le plus grand avantage est que les cellules obtenues par cette méthode sont non perturbés et peuvent être mis en cultures pendant plusieurs jours sans aucun signe de détresse, comme nous l’avons montré15. Cela contraste avec les cellules synchronisées par des moyens chimiques qui pourraient contenir de lésion induite par le médicament. Une étude récente, à l’aide de Bn4 cellules dérivées de la leucémie myéloïde aiguë coups, directement comparés CCE et autres méthodes, y compris l’arrestation avec privation de sérum, hydroxyurée ou un traitement avec un inhibiteur de la kinase cycline-dépendante 1, RO-330621. Décanté cellules et arrêté à phases comparables semblent comparables en ce qui concerne la teneur en ADN et expression de cycline. Cependant, lorsqu’on a examiné le protéome, des changements majeurs dans l’abondance des protéines, en particulier liés au stress et des protéines spécifiques aux arrestations, ont été observées dans les cellules arrêtées et pas dans les cellules de décanté aux positions de taille de cellule équivalente. Ces résultats soulignent l’utilité de la CCE pour la production de cellules non perturbés et souligner que soyez prudent lors de l’interprétation des données de cellules synchronisés par d’autres moyens.
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Disclosures
Anisha Kothari est actuellement dans le département de biologie cellulaire et moléculaire à l’hôpital St. Jude Children Research.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les NIH CA109821 (à la STC). Nous remercions Beckman-Coulter pour fournir généreusement des fonds pour couvrir les frais de publication et d’assistance technique à l’installation et le fonctionnement du système élutriation. Nous remercions le Dr Fred Falkenburg fournissant primaire initiale toutes les cultures.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
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