Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van centrifugaal elutriation te scheiden van primaire acute lymfatische leukemie cellen in verschillende celcyclus fasen.
Abstract
De mogelijkheid om te synchroniseren van cellen heeft bevorderen van ons begrip van de celcyclus verordening centraal gestaan. Gemeenschappelijk gebruikte technieken omvatten serum ontbering; chemische stoffen die cellen te in verschillende celcyclus fasen arresteren; of het gebruik van de mitotische shake-off die gebruik maakt van de naleving van hun verminderde. Echter, al deze nadelen hebben. Serum honger werkt bijvoorbeeld goed voor normale cellen, maar minder goed voor tumorcellen met gecompromitteerde celcyclus controlepunten oncogen activering of tumor suppressor verlies. Ook kunnen chemisch behandeld cel populaties haven drug-geïnduceerde schade en stressgerelateerde wijzigingen weergeven. Een techniek die deze problemen omzeilt is tegenstroom centrifugaal elutriation (CCE), waar cellen worden onderworpen aan twee tegengestelde krachten, middelpuntvliedende kracht en vloeiende snelheid, wat in de scheiding van cellen op basis van grootte en bevolkingsdichtheid resulteert. Aangezien cellen bevorderen door de cyclus meestal vergroten, kan CCE worden gebruikt om te scheiden van cellen in verschillende celcyclus fasen. Hier toepassen wij deze techniek op primaire acute lymfatische leukemie cellen. Onder optimale omstandigheden, kunnen een in wezen puur bevolking van cellen in de G1-fase en een hoogverrijkt bevolking van cellen in G2/M fasen worden verkregen in uitstekende rendement. Deze cel populaties zijn bij uitstek geschikt voor studeren celcyclus-afhankelijke mechanismen voor actie van antikanker geneesmiddelen en voor andere toepassingen. We ook laten zien hoe wijzigingen in de standaard procedure kan leiden tot suboptimaal prestaties en bespreken van de beperkingen van de techniek. De voorgestelde gedetailleerde methodologie moet vergemakkelijken toepassing en verkenning van de techniek naar andere soorten cellen.
Introduction
Gekweekte cellen groeien meestal asynchroon en afzonderlijke cellen zijn aanwezig in de verschillende fasen van de celcyclus. Sommige organismen vertonen natuurlijk synchrone cel cycli of kunnen worden gesynchroniseerd met behulp van specifieke fysiologische prikkels. Bijvoorbeeld, verdelen kernen binnen giant plasmodia van de slime schimmel Physarum polycephalum in een zeer synchrone mode1, en de cellen van de groene algen die desmodesmus quadricauda kan worden gesynchroniseerd door afwisselend licht en donker perioden2. Hoewel dergelijke organismen unieke experimentele kenmerken bieden, model zij onvoldoende de complexiteit van zoogdiercellen. De mogelijkheid om te synchroniseren kunstmatig zoogdiercellen populaties is centraal in het bevorderen van ons begrip van de celcyclus verordening en de moleculaire basis van de controlepunten van de celcyclus. Veel gebruikte methoden zijn serum ontbering, chemische blokkeren en vrijgeven, of exploitatie van de fysieke kenmerken3,4. Terugtrekking van het serum worden vaak cellen invoeren van onbeweeglijkheid en de nieuwe toevoeging van serum promoot celcyclus reentry in de G1-fase5. Chemische inhibitoren zijn agenten zoals overtollige thymidine hydroxyurea die blokkeren van cellen op de grens van de G1/S of microtubulus-remmers die meestal het arresteren van cellen in de M fase3,4. Benaderingen die misbruik maken van fysieke kenmerken omvatten mitotische shake-off die kan worden gebruikt om te verrijken voor mitotische cellen omdat ze minder aanhangend dan interfase cellen6. Al deze technieken wel mogelijke nadelen. Bijvoorbeeld, onderhouden niet alle celtypes levensvatbaarheid in de afwezigheid van serum of de aanwezigheid van chemische inhibitoren, en de opbrengst van cellen nadat mitotische shake-af beperkt zonder voorafgaande synchronisatie met mitotische remmers is.
Met uitzondering van vroege embryonale cel cycli, waar cellen geleidelijk in grootte afnemen als ze7 verdelen, de meeste cellen bevorderen door de cyclus ondergaan groeifases en groter worden. Deze eigenschap wordt benut in de techniek van tegenstroom centrifugaal elutriation (CCE), die kan worden gebruikt voor het scheiden van cellen die verschillen in grootte en vandaar in celcyclus fase8,9. Tijdens het CCE, cellen zijn onder invloed van twee tegengestelde krachten: middelpuntvliedende kracht, die drijft de cellen uit de buurt van de rotatie-as, en vloeiende snelheid (tegenstroom), die drijft de cellen naar de as van draaiing (Figuur 1). Cellen in de elutriation zaal bereiken een evenwicht positie waar deze krachten gelijk zijn. De belangrijkste factoren dicteren de positie van het evenwicht zijn cel diameter en dichtheid. Als de stroom tarief bufferoplossing wordt verhoogd en de tegenstroom slepen force opweegt tegen de middelpuntvliedende kracht, een nieuw evenwicht is gebracht, veroorzaakt een verandering in de positie van de cellen in de kamer. Alle cellen worden verschoven naar de uitgang van de kamer, wat resulteert in kleinere wegloopt eerst, terwijl de grotere cellen binnen de kamer blijven, totdat het tegenstroom tarief is voldoende verhoogd ter bevordering van hun uitgang. De cellen ontsnappen aan de elutriation kamer met opeenvolgende verhogingen in tegenstroom tarief op specifieke breuken kunnen worden verzameld en elk deel bevat cellen maten opeenvolgend te verhogen. In plaats van het uitvoeren van elutriation met een incrementele toename tegenstroom tarief, zal sequentiële afname van de middelpuntvliedende kracht door het verlagen van de snelheid van centrifugeren bereiken hetzelfde resultaat. Het proces van elutriation vereist optimalisatie afhankelijk van het celtype, elutriation buffer werkzaam en de specifieke apparatuur wordt gebruikt. De snelheid van sedimentatie van cellen onder deze omstandigheden is het best omschreven door de wet van Stokes: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2r, waar SV = snelheid sedimentatie; d = diameter van het deeltje; Ρp = dichtheid van de deeltjes; Ρm = dichtheid van de buffer; Η = viscositeit van de buffer; Ω = hoeksnelheid van de rotor; en r = radiale positie van de particle. Dus, SV is evenredig met de diameter van de cel en dichtheid, en aangezien diameter is verheven tot de tweede macht, het levert belangrijker dan dichtheid die over het algemeen door middel van de celcyclus constant.
Een belangrijk voordeel van CCE is dat cellen niet aan de barre omstandigheden van chemische behandeling of nutritionele ontbering onderworpen zijn en in uitstekende rendement in wezen onverstoorbaar kunnen worden hersteld. Een vereiste is dat de cellen in kwestie ondergaan een aanzienlijke toename van de diameter, van ten minste 30%, als ze de celcyclus doorkruisen. Het grootste nadeel is de kostprijs van de gespecialiseerde centrifuge, rotor en accessoires. Toch heeft de mogelijkheid om voor te bereiden van cellen die zijn verrijkt met specifieke celcyclus fasen door CCE sterk vergemakkelijkt celcyclus onderzoek in organismen uit gist zoogdiercellen9,10. Recente vooruitgang, zijn bovendien toepassingen uitbreiden naar de scheiding van de cellen van gezonde versus kanker weefsel, de scheiding van verschillende celtypes in heterogene mengsels, en tot de productie van specifieke celtypes voor immunotherapie9.
Onze groot belang is geweest in het begrip van het werkingsmechanisme van microtubulus gericht op agenten (MTA) zoals vinca-alkaloïden en taxine. Deze drugs werden verondersteld om op te treden uitsluitend in de mitose, blokkeren spindel microtubulus functie11,12, maar recent bewijs suggereert dat zij mogen ook worden getarget op interfase microtubuli13,14. We hebben onlangs gemeld dat primaire acute lymfatische leukemie (ALL) cellen ondergaan dood in hetzij de G1-fase of in de M fase wanneer vincristine en andere MTAs in een celcyclus-afhankelijke manier15behandeld. De mogelijkheid om te scheiden van alle cellen in verschillende celcyclus fasen door CCE was behulpzaam bij het bereiken van deze conclusie. In dit artikel, wij beschrijven de technische details en bieden praktische tips voor de toepassing van CCE aan de voorbereiding van primaire alle cellen in verschillende celcyclus fasen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: dit protocol is geoptimaliseerd voor primaire B-ALL die variëren in diameter van ongeveer 8 µm (G1-fase) tot 13 µm (G2/M fasen cellen). Dus, de specifieke centrifuge snelheden en het debiet van de pomp kunnen niet toepasbaar op cellen met verschillende grootte varieert. Niettemin, passende elutriation parameters kunnen worden geschat met behulp van de vergelijking van de snelheid sedimentatie. Cellen worden gekweekt in een gedefinieerde serumvrij medium als beschreven 16 bij een optimale dichtheid van 1-3 x 10 6 cellen/mL. Met uitzondering van de inzameling van breuken die wordt uitgevoerd bij 4 ° C met behulp van ijs-gekoelde buizen, alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur en de centrifuge ingesteld bij 20 ° C met een maximum van 24 ° C.
1. voorbereiding van de Buffer van de Elutriation en materialen
- om te verminderen samendoen van cellen, het bereiden van een buffer van de elutriation van Hank ' s evenwichtig zoutoplossing (HBSS) met fenol rood aangevuld met 2% foetale runderserum () FBS), om de cellen te beschermen tegen mechanische belasting tijdens het proces van de elutriation, en de 1,6 g/L van 2-naftol-6,8-disulfonic zuur dikaliumhexafluorozirkonaat zout (NGK), die maakt de buitenkant van de cel negatief geladen en vermindert samendoen.
- 1,6 g NDA toevoegen aan een conische tube van 50 mL.
- Onder steriele condities, 35 mL HBSS uit een 1 L-fles toevoegen aan de conische tube van 50 mL met NDA. Swirl van de buis totdat de NDA heeft opgelost.
- De opgeloste NDA met behulp van een 0,2 µm filter, breng kwantitatief over in een nieuwe steriele 50 mL conische buis. Voeg vervolgens de NDA aan de resterende 1 L van HBSS.
- Ten slotte 21 mL FBS toevoegen aan de HBSS te verkrijgen van een eindconcentratie van 2% (v/v).
Opmerking: De buffer van de elutriation kan worden voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C tot de vervaldatum op de HBSS of totdat er een belangrijke verandering in de pH zoals aangegeven door een geelverkleuring van de indicator kleurstof.
- Label 50 mL conische buizen voor collectie van breuken zodat er buizen label 1 en 2 (W1 en W2), breuken 1-20 (F1 - F20) wassen, en stoppen.
- Chill vooraf deze buizen op ijs vóór het verzamelen van breuken.
2. Vergadering van het systeem van de Elutriation
- Installeer eerst de strobe-vergadering in de centrifuge zodat het netsnoer wordt gevoed uit de zaal via de poort aan de linkerkant. Zorg ervoor dat de flitslamp stroboscoop aan de voorkant van de kamer zodat het wordt uitgelijnd met het kijkvenster wanneer de centrifuge wordt gesloten.
- De vergadering in plaats veilig door de eerste twee Phillips-head schroeven aanscherping in de twee gaten aan de bovenkant van de de beugels en vervolgens door de aanscherping van de duimschroeven onderin de beugels.
- Sluit het netsnoer op de flitser macht poort aan de achterkant van de centrifuge.
- Next, instellen van de rotor recht naar beneden op de centrifuge station hub en veilig met een T-hendel hex moersleutel.
Opmerking: Als de centrifuge is niet nodig voor de doeleinden van de niet-elutriation, de vergadering van de flitser en de rotor kunnen worden gehouden in de centrifuge tussen runs. - Zodra de rotor is beveiligd, plaatst u de vergadering van de quick-release met de elutriation kamer, de teller evenwicht, roteerbare zegel vergadering en een montageplaat in de rotor.
- Duw gelijkmatig met één hand op de kamer van de elutriation en de andere hand op de teller evenwicht totdat de bouten in de rotor worden uitgelijnd in de gaten op de montageplaat.
- Tot slot hecht de verankerende kabel door het plaatsen van de pin aan de ene kant van de kabel in het gat in de vergadering van de roterende zegel en het veiligstellen van de eyehole aan de andere kant van de kabel met één van de Phillips-head schroeven (vermeld in 2.1.1) op de beugel op de linkerzijde-o f de zaal.
- Vervolgens monteren van het gebruik van een pomp met variabele snelheid-stroomsysteem en buizen aan pomp buffer in de elutriation kamer en buffer te verzamelen, zoals het stroomt uit de elutriation-zaal.
- Invoegen de grootte 16 input slang afkomstig van de pomp met variabele snelheid via de poort aan de bovenkant van de kamer van de centrifuge verlaten zodat het in de kamer treedt.
- Een montage hechten aan het vrije uiteinde van de input-buis en steek de montage in de input opening aan de zijkant van de vergadering van de roterende zegel.
- Invoegen de grootte 16 uitgang buizen via de poort en deze koppelen aan de verbindingsleiding aan de bovenkant van de roterende zegel vergadering.
Opmerking: De stroomsysteem ook kan blijven gemonteerd tussen elutriation runs.
- Ten slotte, zet de centrifuge en de specificaties die nodig zijn voor het experiment worden ingesteld.
- Wijziging van de rotor ID.
- Als de centrifuge een inbreng van de tijd vereist, voor 2 h, die meer dan voldoende om te voltooien een elutriation uitvoeren instellen.
- De temperatuur instellen tot 20 ° C met een max temp van 24 ° C.
- Stelt u de versnelling voor max en de vertraging voor langzaam.
- Ten slotte stelt de snelheid tot 867 x g.
3. Priming van het systeem van de Elutriation
- eerst om te steriliseren van het elutriation systeem, plaats de buis reservoir in een 500 mL plastic fles met 5% bleekwater en de slang van de uitvoer in een lege 1 L kunststof afval fles te plaatsen.
- De pomp inschakelt en zet de snelheid naar 25 mL/min en toestaan dat het 5%-bleekmiddel te stromen al manier door het systeem van de elutriation totdat het wordt in de afgewerkte fles uit de output buis gepompt.
- De centrifuge inschakelen en laat ze komen tot de maximum snelheid (867 x g) aangemerkte release bubbels en tegendruk.
- Stoppen de centrifuge. Zodra de rotor heeft gestopt draaien, open het deksel en inspecteren van de kamer voor eventuele lekken.
- Als er geen lekken, laat de bleekwater oplossing stroom in het systeem voor ten minste 5 min.
- Vervolgens het spoelen van het systeem met gesteriliseerde met autoclaaf water als bleekmiddel tot de vorming van precipitaten uit de buffer van de elutriation die kan leiden leiden kan tot het samendoen van de cellen, evenals schade toebrengen aan de cellen.
- Plaats de buis reservoir in een 1 L-fles van gesteriliseerde met autoclaaf water en laat ze door middel van ten minste 10 min. spoelen
- Na spoelen met water, elutriation buffer te introduceren in het systeem. Gebruik een 150 mL glazen fles die een gesteriliseerde met autoclaaf is maken een reservoir voor de elutriation buffer en cellen.
- 100 mL elutriation buffer toevoegen aan de fles en verplaatsen de reservoir buizen aan de glazen fles zodat de buis helemaal onderaan is.
- Start van de centrifuge en toestaan dat de buffer te stromen via het systeem te spoelen van de water.
- Zodra het reservoir fles bijna leeg is en het water is volledig uit het systeem gespoeld, verplaatsen de uitvoer buizen uit de fles afval naar het reservoir zodat de buffer wordt door het systeem wordt gerecycleerd.
- Ten slotte het kijkvenster zodanig aanpassen dat de kamer van de elutriation kan worden gezien op de huidige snelheid.
- Press de stroboscoop lamp power knop op de buitenkant van de centrifuge zodat de lamp ingeschakeld. Draai de elutriation kNOB ook aan de buitenkant van de centrifuge helemaal naar links.
- Terwijl op zoek door het kijkvenster, langzaam draai de knop naar rechts totdat de elutriation kamer in zicht en de stroboscoop komt in de tijd met de rotatie van de rotor is.
Opmerking: Het elutriation-systeem kan worden overgelaten in deze toestand totdat de cellen worden klaargestoomd.
4. Bereiding van het monster van de cel
- graaf cellen en aliquoot 300 tot 400 miljoen in groeimedium in verschillende 50 mL conische buizen. Spin down de cellen bij 1210 x g gedurende 3 min.
- Aspirate uit groei media en resuspendeer de cellen in 25 mL elutriation buffer door zachtjes op en neer pipetteren.
- Teneinde cel samendoen, pass cellen tweemaal door middel van een 25-meter naald.
- Met behulp van een spuit van 10 mL de cellen en opstellen dan 25 meter naald bijvoegen en doorgeven van de cellen door op de binnenkant muur van een steriele 50 mL conische buis. Herhaal dit totdat alle 25 mL zijn gepasseerd via de naald.
- Verkrijgen van een nieuwe naalden en spuiten en herhaal het proces hierboven eens.
Let op: Spuit naalden in sharps containers moeten worden geplaatst.
Opmerking: Het is cruciaal dat de cellen worden geduwd door de naald onmiddellijk vóór de invoering van hen aan het elutriation-systeem te houden het samendoen van cel tot een minimum.
5. Binnenbrengen van cel monster het Elutriation systeem en een collectie van breuken
- introduceren het monster van de cel in het systeem van de elutriation door het gieten van het monster van de cel in de reservoir tank heeft de resterende elutriation buffer recycling via .
- Laat de cellen in het systeem worden ingevoerd en het bereiken van evenwicht binnen de zaal elutriation.
Opmerking: Dit proces duurt ongeveer 5 minuten en voortgang kan worden bijgehouden door te kijken naar de cellen als ze de zaal via het kijkvenster betreden. Nemen om ervoor te zorgen alle cellen in de zaal, een daling van de elutievloeistof, plaats op een glasplaatje en bekijken onder een microscoop. Als het monster gratis intact cellen is, dit bevestigt hun retentie in de zaal.
- Laat de cellen in het systeem worden ingevoerd en het bereiken van evenwicht binnen de zaal elutriation.
- Beginnen met het verzamelen van breuken, zodra alle cellen zijn aangegaan in de vergaderzaal en er is een duidelijke grens op het breedste deel van de kamer waarin de cellen in evenwicht zijn.
- Begin door de uitvoer buis te verplaatsen naar de conische tube van 50 mL label W1. Verzamelen van 50 mL elutriation buffer voor deze fractie, ervoor zorgend om een oogje houden op de tank reservoir en vullen met elutriation buffer wanneer dat nodig is.
Nota: Om ervoor te zorgen dat alle cellen in het systeem hebben ingevoerd, toestaan de reservoir tank tot bijna leeg voordat de eerste keer het bijvullen van het reservoir. Na de eerste bijvullen zal het niet nodig te wachten tot het reservoir tot bijna leeg zijn. Ook, DO NOT ooit toestaan de tank te worden leeg als dit tot bubbels en tegendruk in het systeem leiden zal. - Zodra 50 mL zijn verzameld voor W1, gelijktijdig de snelheid tot 821 x g wijzigen en verplaatsen van de output buis aan de conische buis label W2 en verzamelen van 50 mL meer bij deze snelheid.
- Blijven wijzigen van de snelheid en het verzamelen van breuken, zoals aangegeven in tabel 1. Zorg ervoor dat er media in het reservoir tank en houd de conische buisjes op ijs te allen tijde. Tot slot, het aanpassen van het kijkvenster door langzaam verandert de knop naar rechts zoals de snelheid afneemt.
- Zodra alle 20 breuken verzameld zijn, de centrifuge stoppen en verzamelen van 50 mL in de conische buis label STOP.
- Begin door de uitvoer buis te verplaatsen naar de conische tube van 50 mL label W1. Verzamelen van 50 mL elutriation buffer voor deze fractie, ervoor zorgend om een oogje houden op de tank reservoir en vullen met elutriation buffer wanneer dat nodig is.
6. Flushing van het systeem van de Elutriation
- na de centrifuge volledig flush het systeem gestopt is doordat het reservoir buis in de 1 L-fles van gesteriliseerde met autoclaaf water en de buis van de output terug in de afval fles.
- Zet van het toerental van de pomp tot 50 mL/min. en laat het water om het systeem te doorlopen totdat het uitgeput.
- Schakelen uit de pomp, de ingangs- en uitgangssignaal slang verwijderen uit de vergadering van de quick-release, en trek de pin uit de verankerende kabel.
- Verwijderen de quick-release-vergadering van de rotor.
Opmerking: Afhankelijk van wat de centrifuge zal worden gebruikt voor, het elutriation-systeem kan nu worden gelaten zoals is. Anders, de hele vergadering kan worden afgebroken in de omgekeerde volgorde zoals hierboven beschreven. De elutriation kamer kan worden verwijderd uit de vergadering van de quick-release en schoongemaakt tussen runs met behulp van een ultrasoon waterbad. Hiermee verwijdert u vuil en verontreinigingen uit de kamer muur die negatief van invloed kan zijn op de latere loopt.
- Verwijderen de quick-release-vergadering van de rotor.
7. Analyse van breuken en verzameling van de G1 of G2/M zwembaden.
Opmerking: om aan te tonen de effectiviteit van elutriation, elke fractie wordt geanalyseerd voor cellen, de diameter van de cel en DNA inhoud en zwembaden zijn gemaakt van cellen in de G1 of G2/M fasen voor immunoblot analyses, zoals beschreven in Vertegenwoordiger resultaten. Dit protocol sectie beschrijft hoe bereiden hen voor experimenteel gebruik te maken van deze poelen.
- Spin elke breuk bij 2000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en aspirate uit elutriation buffer.
- Combineren breuken samen om te verkrijgen van zowel een pool van de fase G1 en G2/M fasen zwembad.
- Voor de G1 fase zwembad, resuspendeer breuken die werden verzameld in het snelheidsbereik van 788 x g tot 661 x g (F1 - F5) in een totaal 1 mL van fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) en transfer naar een conische tube van 15 mL. Voor de groep van de fasen G2/M resuspendeer breuken die werden verzameld in het snelheidsbereik van 387 x g en 333 x g (F17 - F20).
- Spin down cellen bij 2000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en aspirate uit PBS.
- Resuspendeer de cellen in 10 mL van de media van de groei en het nemen van een cel tellen.
- Nemen een aliquoot gedeelte van elke pool te worden geanalyseerd voor DNA inhoud via propidium jodide kleuring en stromen van cytometrische analyse 15.
Opmerking: De rest van elke groep kan worden gebruikt voor verdere experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primaire alle cellen (3-4 x 108) waren onderworpen aan centrifugaal elutriation en verzameld in twee wassen breuken en twintig belangrijkste fracties, zoals beschreven in het protocol. Tabel 1 toont representatieve gegevens waar het totale aantal cellen in elke fractie, alsmede de overeenkomstige snelheid van de rotor worden gepresenteerd. Totale was opbrengst doorgaans meer dan 80%. Meting van de diameter van de cel in afzonderlijke fracties bevestigd dat cel diameter verhoogd met het bevorderen van de elutriation (Figuur 2). Deze resultaten vormen de gemiddelden van twee onafhankelijke bepalingen en weerspiegelen de hoge graad van reproduceerbaarheid van de gegevens. Breuken werden vervolgens onderworpen aan propidium jodide kleuring en stroom cytometry om te bepalen van de DNA-inhoud (Figuur 3). Vroege breuken (F1 - F5) bevatte bijna uitsluitend cellen met 2N DNA inhoud die van de G1-fase. Een mengsel van cellen in de G1-fase en de S-fase werd waargenomen in intermediaire breuken (F6 - F9) en cellen met 4N DNA inhoud werden waargenomen vanaf F10. Later breuken had voornamelijk cellen met 4N DNA inhoud vertegenwoordigt G2/M fasen. Deze gegevens samen met de resultaten van Figuur 2 bevestigd een relatie tussen Celgrootte en de fase van de celcyclus.
Op basis van deze resultaten, breuken F1 - F5 werden samengevoegd tot een pool van cellen in de G1-fase, en breuken F17 - F20 werden samengevoegd tot een pool van cellen in G2/M fase. Het aantal cellen met 2N DNA inhoud in de G1-fase pool was meestal 99%, en het percentage cellen met 4N DNA inhoud in de G2/M zwembad was doorgaans 85%, zoals bepaald door propidium jodide kleuring en stroom cytometry. Asynchrone omstandigheden zijn 60-70% van alle cellen in de G1-fase en 15-20 zijn % primaire in G2/M fasen15, dus de waarden verkregen na elutriation weerspiegelen hoge niveaus van verrijking. Voor de verdere verificatie van de twee zwembaden met betrekking tot de fase van de celcyclus, werden extracten uit elk onderworpen aan immunoblotting met markers van G1 of G2/M fasen. Ten eerste, we gebruikt een phospho-specifieke antilichaam dat Retinoblastoom (Rb) eiwit phosphorylated op Ser-807 of Ser-811, herkent aangezien het is reeds lang gevestigd dat de Rb wordt steeds phosphorylated als cellen opmars door de celcyclus17 . Zoals blijkt uit Figuur 4, waren niveaus van phospho-Rb veel hoger in cellen in het zwembad van de G2/M ten opzichte van de G1-fase pool, stroken met de verwachtingen. We peilden ook voor cycline B1, die wordt uitgedrukt hoogst in G2/M fase cellen, en cycline D1, die hoogst wordt uitgedrukt in G1 fase cellen18 (Figuur 4). De G2/M zwembad hadden veel hogere niveaus van cycline B1 ten opzichte van de G1 pool, stroken met de verwachtingen. Cycline D1 gaf slechts een zwak signaal in deze voorbereidingen, maar toch was aantoonbaar in het zwembad van de G1 en kan niet worden getraceerd in de G2/M zwembad. GAPDH werd gebruikt een besturingselement te bevestigen van gelijke eiwit laden.
Wijzigingen in het standaard protocol werden uitgevoerd voor de beoordeling van hun effecten en voorwaarden te scheppen voor optimale prestaties. Eerst, het aantal breuken verzameld werd verlaagd, van de standaard twintig tot slechts drie, met behulp van snelheden bepaald op basis van tabel 1 te vertegenwoordigen de terminal punten voor verzameling cellen in de G1, S of G2/M fasen, zoals weergegeven in tabel 2. Analyse van de DNA-inhoud van breuken, F1 en F3 staan in figuur 5A. Breuk 1 bevatte cellen hoogverrijkt in de G1-fase (95%) en dus conductometrisch daartoe verkregen onder standaardomstandigheden (Figuur 3). Echter, deel 3, ogenschijnlijk cellen hoogverrijkt in G2/M fase, gaf een gemengde bevolking, met cellen in G1 en S fasen ook aanwezig. G2/M cellen vertegenwoordigd slechts 51% van de totale, in vergelijking met 85% onder standaardomstandigheden. Deze resultaten wijzen erop dat pogingen tot vereenvoudiging van de procedure door het verminderen van het aantal breuken compromissen monster kwaliteit. Vervolgens testten wij het effect van de vermindering van de breuk volume, als een middel om reagens energieverbruik te verminderen. Een standaard elutriation werd uitgevoerd behalve dat 40 mL in plaats van 50 mL breuken werden verzameld. Breuken F1 en F20 werden geanalyseerd voor DNA-inhoud. Zoals blijkt uit figuur 5B, was breuk F1 hoogverrijkt in G1 fase cellen (98%), vergelijkbaar met die verkregen onder normale omstandigheden. Echter, breuk F20 opgenomen cellen in alle drie fasen, met cellen in G2/M fase vertegenwoordigt slechts 64% van de totale, vergeleken met 85% onder standaardomstandigheden. Deze resultaten wijzen erop dat vermindering van de omvang van de breuk ook monster kwaliteit compromissen.
Figuur 1 . Beginsel van tegenstroom centrifugaal elutriation.
Opmerking dat elutriation van cellen kan worden bereikt door het optrekken van het steunpercentage van tegenstroom, zoals hier aangegeven of door het verlagen van de snelheid van de rotor. Aangepast door toestemming van Macmillan Publishers Ltd: [natuur protocollen] (Ref 8.), copyright (2008)8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Diameter van primaire ALL cellen toeneemt met elutriation breuk.
De gemiddelde diameter werd bepaald voor elke fractie met behulp van een cel analyzer die gegevens van de afzonderlijke cellen 500-4.500 per monster registreert. De gegevens zijn gemiddelde ± S.D. van twee onafhankelijke experimenten. Merk op dat de foutbalken voor vele punten kleiner dan het symbool zijn en voor de duidelijkheid werden weggelaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Analyse van DNA inhoud bevestigt succesvolle scheiding van primaire alle cellen in verschillende celcyclus fasen.
10 mL van elke breuk werd bevestigd in 70% EtOH, gekleurd in propidium jodide en geanalyseerd door stroom cytometry, als beschreven15. Propidium jodide geïntegreerd intensiteit (x-as) was uitgezet tegen de cel graaf (y-as) tot het bepalen van het gedeelte van de cellen in elke fase, waar 2N DNA inhoud duidt op G1-fase en 4N DNA inhoud geeft aan cellen in G2 of M fasen. De gegevens die worden weergegeven zijn van een representatieve experiment en essentiële identieke resultaten zijn verkregen in vier herhalingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Immunoblot analyse van celcyclus-gerelateerde eiwitten in gebundeldbreuken.
Naar aanleiding van een standaard elutriation van primaire alle cellen, breuken F1 - F5 werden samengevoegd tot een G1 fase pool en breuken F17 - F20 werden samengevoegd tot een G2/M fase adresgroep maken. Extracten werden voorbereid en 40 µg/lane onderworpen aan immunoblot analyse, zoals eerder15, met antilichamen tegen phospho-Rb (Ser807/811), B1 cycline en cycline D1, alle gebruikte bij 1:2,000 verdunning. GAPDH (1:10, 000) werd gebruikt als een besturingselement laden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Illustratieve gegevens uit suboptimaal elutriations.
A) effect van de vermindering van het aantal breuken verzameld. Slechts drie belangrijkste breuken (F1 - F3), in plaats van de standaard twintig, elk van 100 mL, werden verzameld, bij snelheden zoals aangegeven in tabel 2. Breuken F1 en F3 werden geanalyseerd voor DNA inhoud zoals in Figuur 3. B) effect van de vermindering van de omvang van de breuk. Twintig breuken werden verzameld, onder dezelfde voorwaarden zoals in tabel 1, maar slechts 40 mL elutriation buffer in plaats van de standaard 50 mL werd gebruikt voor elk. Breuken F1 en F20 werden geanalyseerd voor DNA inhoud zoals in Figuur 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Breuk | Snelheid (rpm) | G-Force | Total cellen (x 10 ^ 6) |
| W1 | 3000 | 867 x g | 17,75 |
| W2 | 2920 | 821 x g | 7,00 |
| F1 | 2860 | 788 x g | 4,60 |
| F2 | 2800 | 755 x g | 10,75 |
| F3 | 2740 | 723 x g | 15.25 |
| F4 | 2680 | 692 x g | 22,50 |
| F5 | 2620 | 661 x g | 26,75 |
| F6 | 2560 | 631 x g | 25,00 |
| F7 | 2500 | 602 x g | 22,75 |
| F8 | 2440 | 573 x g | 18.00 uur |
| F9 | 2380 | 546 x g | 14,00 |
| F10 | 2320 | 518 x g | 10,75 |
| F11 | 2260 | 492 x g | 7.43 |
| F12 | 2200 | 466 x g | 8,63 |
| F13 | 2140 | 441 x g | 6.63 |
| F14 | 2100 | 425 x g | 4,98 |
| F15 | 2060 | 409 x g | 3,46 |
| F16 | 2020 | 393 x g | 3.43 |
| F17 | 1980 | 378 x g | 2,63 |
| F18 | 1940 | 363 x g | 3.17 |
| F19 | 1900 | 248 x g | 2,78 |
| F20 | 1860 | 333 x g | 1,66 |
| STOP | 0 | 0 x g | 5.19 |
| Totale opbrengst | 245.06 | ||
| Percentage opbrengst | 81.69 | ||
Tabel 1. Opbrengst van de cel en bijbehorende rotor snelheid voor elke fractie.
Cellen werd bepaald met behulp van een geautomatiseerde cel teller. Totale opbrengst werd bepaald door de som van de individuele fracties versus input (3 x 108 cellen). Gegevens zijn een gemiddelde van twee representatieve experimenten. Centrifugale kracht en bijbehorende rotor snelheid krijgen.
| Breuk | Snelheid (rpm) | G-Force |
| W1 | 3000 | 867 x g |
| W2 | 2920 | 821 x g |
| F1 | 2620 | 661 x g |
| F2 | 2020 | 393 x g |
| F3 | 1860 | 333 x g |
| Stop | 0 | 0 x g |
Tabel 2. Snelheid parameters voor suboptimaal elutriation.
Weergegeven zijn de centrifugale krachten en bijbehorende rotor snelheden voor de wasbeurten en drie fracties verzameld in een gecomprimeerde suboptimaal elutriation. Zie figuur 5A voor het corresponderende DNA inhoud en tekst voor meer informatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben beschreven een methode voor het verkrijgen van primaire alle cellen in de verschillende fasen van de celcyclus CCE gebruiken. Onder optimale omstandigheden een in wezen puur bevolking van cellen in de G1-fase en een hoogverrijkt bevolking van cellen in G2/M fasen kunnen gemakkelijk worden verkregen in uitstekende rendement en cellen in de S-fase hoogverrijkt kunnen ook verkregen worden indien gewenst. De hier gepresenteerde resultaten werden verkregen met behulp van een primaire die alle cultuur (in het bijzonder ALL-5), en in wezen identieke resultaten zijn verkregen met een onafhankelijke cultuur, ALL-2-15. Daarnaast alle andere primaire alle culturen onderzocht tot nu toe hebben dezelfde dichtheid bereiken tijdens asynchrone groei, en zal waarschijnlijk voeren ook wanneer onderworpen aan CCE. Onze voorafgaande studies hebben ook aangetoond dat andere cellijnen van leukemie, waaronder HL60 en K562, kunnen worden gescheiden in verschillende celcyclus fasen met behulp van CCE19,20. Kritische stappen in de procedure zijn ervoor te zorgen dat de cellen mono verspreide en niet klonterende aan het begin van de termijn; optimalisatie van de voorwaarden van tegenstroom tarief en de rotor snelheid; waarborgen van de componenten van het systeem zijn schoon en vrij van vuil; en het vermijden van de invoering van luchtbellen in de lijnen van de stroom. CCE werkt het beste met cellen die aanzienlijk toename celgrootte als ze verder door de cyclus van de cel. Voor een bepaalde bevolking van cellen in suspensie, kan dit worden vastgesteld in eerste instantie en gemakkelijk door het onderzoek van de relatie tussen DNA inhoud en kant-scatter, de laatste afhankelijk van de celgrootte. Beide parameters kunnen worden afgemeten aan gelijktijdig stroom cytometry na propidium jodide kleuring, zoals we hebben15beschreven. Een lineaire relatie tussen kant-scatter en DNA inhoud biedt vertrouwen dat celgrootte met de celcyclus voorschot toeneemt en dus dat CCE heeft het potentieel om te scheiden van cellen op basis van de fase van de celcyclus.
Zoals we hebben aangetoond (Figuur 5), afwijkingen van de geoptimaliseerde procedure leiden tot gecompromitteerde monster kwaliteit, met name voor cellen in G2/M fasen. Echter, vermindering van het aantal breuken of breuk volume aanmerkelijk beïnvloedde niet de zuiverheid van de cellen in de G1-fase (Figuur 5). Snelkoppelingen naar de procedure kunnen dus worden getolereerd als alleen gezuiverde G1 fase cellen nodig zijn. Hoewel het CCE is gemakkelijk vatbaar voor schorsing celculturen, kan het ook worden toegepast op subcellular breuken. Bijvoorbeeld, kernen uit lymfkliertest pre-B cellen geweest met succes grootte-gescheiden met behulp van CCE8. Aanhangend celtypes potentiële problemen als gevolg van hun neiging voor het samendoen en mogelijke naleving van de oppervlakken van de buis en elutriation kamer en dus moeten worden onderzocht met de nodige voorzichtigheid.
De belangrijkste beperking van CCE is de kosten van de apparatuur; een mogelijke oplossing is om samen te werken met een lab die de nodige apparatuur heeft. Merk echter op dat terwijl de rotor is een speciaal instrument, de centrifuge voor algemene centrifugeren doeleinden kan worden gebruikt, waardoor de kosten geïnvesteerd uitsluitend in CCE. Een andere beperking is dat de planning van experimenten problematischer in vergelijking met de flexibiliteit van andere methoden zoals serum honger of chemische synchronisatie is. Elutriation loopt meestal 5-6 uur duren, en desgewenst de cellen verkregen zijn vervolgens voor de korte termijn of multi time punt experimenten, dit kan resulteren in het plannen van ongemakken. Het grootste voordeel is dat de volgens deze methode verkregen cellen onverstoorbaar zijn en gekweekt voor vele dagen zonder tekenen van nood, worden kunnen zoals we hebben van15. Dit in tegenstelling tot cellen gesynchroniseerd met chemische middelen die drug-geïnduceerde schade kan haven. Een recente studie, NB4 cuvetten afgeleid van acute myeloïde leukemie ontploffing, rechtstreeks met elkaar vergeleken CCE en andere methoden, met inbegrip van arrestatie in serum honger, hydroxyurea of behandeling met een cycline-afhankelijk kinase 1-remmer, RO-330621. Elutriated cellen en cellen gearresteerd op vergelijkbare fasen verscheen vergelijkbaar met betrekking tot de inhoud van het DNA en cycline expressie. Echter, wanneer de Proteoom werd onderzocht, grote veranderingen in eiwit overvloed, met name stressgerelateerde en arrestatie-specifieke eiwitten, werden waargenomen in de gearresteerde cellen en niet in de elutriated cellen op equivalente cel grootte posities. Deze resultaten wijzen op het nut van CCE voor de productie van onverstoorbaar cellen en benadrukken dat voorzichtigheid moet worden gebruikt wanneer het interpreteren van de gegevens uit de cellen gesynchroniseerd met behulp van andere middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anisha Kothari is momenteel bij de afdeling van de cel- en moleculaire biologie van St. Jude Children's Research Hospital.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH CA109821 (aan TCC). Wij danken Beckman Coulter royaal voorzien van fondsen ter dekking van de publicatiekosten en voor technische bijstand in de opzet en werking van het elutriation-systeem. Wij danken Dr. Fred Falkenburg voor het verstrekken van de eerste primaire alle culturen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
