Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von zentrifugalen Sammelnetzwerk primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen.
Abstract
Die Fähigkeit, Zellen zu synchronisieren ist zentraler Bedeutung für unser Verständnis des Zellzyklus Verordnung gewesen. Gemeinsame Techniken umfassen Serum Entbehrung; Chemikalien, die Zellen in verschiedene Zellzyklus Phasen zu verhaften; oder die Verwendung der mitotischen Shake-off die Einhaltung der reduzierten nutzt. Jedoch haben alle diese Nachteile. Zum Beispiel arbeitet Serum Hunger gut für normale Zellen aber weniger gut für Tumorzellen mit kompromittierten Zellzyklus Checkpoints aufgrund Onkogen-Aktivierung oder Tumor-Suppressor-Verlust. Ebenso können chemisch behandelte Zellpopulationen Hafen Medikamenten-induzierten Schäden und stressbedingten Veränderungen zeigen. Eine Technik, die diese Probleme umgeht ist Gegenstrom zentrifugale Sammelnetzwerk (CCE), wo Zellen ausgesetzt sind zwei gegensätzliche Kräfte, Fliehkraft und Fluidgeschwindigkeit, wodurch die Trennung der Zellen auf der Grundlage von Größe und Dichte. Da Zellen, die Förderung durch den Zyklus in der Regel vergrößern, einsetzbar CCE Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen. Hier wenden wir diese Technik auf primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen. Unter optimalen Bedingungen erhalten Sie eine im wesentlichen reine Bevölkerung der Zellen in der G1-Phase und eine hoch angereicherten Population von Zellen in der G2/M-Phasen hervorragende Ausbeute. Dieser Zellpopulationen eignen sich ideal für Studium Zellzyklus-abhängige Mechanismen der Wirkung von Krebsmedikamenten und für andere Anwendungen. Wir zeigen, wie Änderungen an der standard-Verfahren kann in suboptimalen Leistung führen und die Grenzen der Technik zu diskutieren. Die detaillierte Methodik vorgestellt sollte Anwendung und Erforschung der Technik auf andere Arten von Zellen erleichtern.
Introduction
Kultivierte Zellen wachsen in der Regel asynchron und Einzelzellen sind in verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Einige Organismen weisen natürlich synchronen Zelle Zyklen oder durch bestimmte physiologische Reize synchronisiert werden können. Zum Beispiel teilen Kerne in riesigen Plasmodien von Slime Mold Physarum Polycephalum in einem sehr synchron Mode1und Zellen der grünen Algen, die Desmodesmus Quadricauda synchronisiert werden kann, durch den Wechsel von hellen und dunklen Perioden2. Während solche Organismen einzigartige experimentelle Attribute bieten, modellieren sie unzureichend die Komplexität von Säugerzellen. Die Möglichkeit, künstlich Säugetier-Zellenbevölkerungen synchronisieren wurde zentraler Bedeutung für unser Verständnis der Zellzyklus-Verordnung und die molekulare Basis der Zellzyklus Checkpoints voranzutreiben. Gängige Methoden gehören Serum Entbehrung, chemische Block- und Veröffentlichung oder Nutzung von physikalischen Eigenschaften3,4. Rücknahme von Serum führt oft Zellen geben Sie Ruhe, und die erneute Zugabe von Serum fördert Wiedereintritt der Zellzyklus in der G1-Phase5. Chemische Inhibitoren gehören Stoffe wie überschüssige Thymidin oder Hydroxyurea die Zellen an der G1/S-Grenze zu blockieren oder Mikrotubuli-Inhibitoren die Zellen in der M Phase3,4in der Regel zu verhaften. Ansätze, die physikalische Eigenschaften ausnutzen gehören mitotischen Shake-off die bereichern für mitotischen Zellen verwendet werden kann, da sie weniger Anhänger als Interphase Zellen6sind. Alle diese Techniken haben jedoch mögliche Nachteile. Zum Beispiel pflegen nicht alle Zelltypen Lebensfähigkeit in der Abwesenheit von Serum oder das Vorhandensein von chemischen Inhibitoren und die Ausbeute an Zellen nach mitotischen Shake-off ohne vorherige Synchronisation mit mitotischen Inhibitoren beschränkt.
Mit Ausnahme der frühen embryonalen Zelle Zyklen, wo Zellen nach und nach in der Größe zurückgehen, da sie7teilen, die meisten Zellen durch den Zyklus Wachstumsphasen zu unterziehen und größer geworden. Diese Eigenschaft wird in der Technik der Gegenstrom zentrifugale Sammelnetzwerk (CCE) ausgenutzt, die kann verwendet werden, um Zellen unterschiedlicher Größe zu trennen und somit im Zellzyklus phase8,9. Während der CCE, Zellen werden unter dem Einfluss der beiden gegensätzlichen Kräfte: Zentrifugalkraft, die die Zellen von der Drehachse antreibt, und Fluidgeschwindigkeit (Gegenstrom), die die Zellen in Richtung der Drehachse (Abbildung 1) antreibt. Zellen in der Sammelnetzwerk Kammer erreichen eine Gleichgewichtslage, wo diese Kräfte gleich sind. Die wichtigsten Faktoren diktiert die Gleichgewichtslage sind Zelle Durchmesser und Dichte. Als der Fluss der Pufferlösung erhöht und die Widerstandskraft der Gegenstrom überwiegt die Fliehkraft, ein neues Gleichgewicht entsteht, verursacht eine Änderung in der Position der Zellen im Inneren der Kammer. Alle Zellen sind die Kammer-Ausgang, was zu kleineren verlassen die Kammer zunächst, während die größeren Zellen innerhalb der Kammer bleiben, bis die Gegenstrom-Rate ausreichend erhöht wird, um die Ausfahrt zu fördern verschoben. Die Flucht der Sammelnetzwerk Kammer mit aufeinander folgenden Erhöhungen Gegenstrom Zellen können in bestimmten Fraktionen gesammelt und jede Fraktion enthält Zellen nacheinander Größen zu erhöhen. Statt Sammelnetzwerk mit inkrementellen Erhöhungen Gegenstrom, werden fortlaufende Rückgang der Zentrifugalkraft durch Zentrifugation Geschwindigkeit verringern das gleiche Ergebnis erreichen. Der Prozess der Sammelnetzwerk erfordert Optimierung je nach Zelltyp, Sammelnetzwerk Puffer eingesetzt und das spezifische Gerät verwendet. Die Rate der Sedimentation der Zellen unter diesen Bedingungen wird am besten durch Stokes Gesetz beschrieben: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2R, wo SV = Sedimentation Geschwindigkeit; d = Durchmesser des Teilchens; Ρp = Dichte des Teilchens; Ρm = Dichte des Puffers; Η = Viskosität des Puffers; Ω = Winkelgeschwindigkeit des Rotors; und R = radiale Position des Partikels. So, SV ist proportional zur Zelle Durchmesser und Dichte, und da Durchmesser auf die zweite Kraft angehoben, es leistet mehr als Dichte, die in der Regel konstant durch den Zellzyklus ist.
Ein wichtiger Vorteil der CCE ist, dass Zellen nicht einer rauen chemische Behandlung oder ernährungsphysiologischen Entbehrung unterliegen und hervorragende Ausbeute im wesentlichen unbeirrt zurückgewonnen werden. Voraussetzung ist, dass die fraglichen Zellen eine deutliche Zunahme der Durchmesser von mindestens 30 % zu unterziehen, wie sie den Zellzyklus durchqueren. Der größte Nachteil sind die Kosten der spezialisierten Zentrifuge, Rotor und Zubehör. Dennoch hat die Fähigkeit, Zellen in bestimmten Zellzyklus Phasen von CCE bereichert bereiten Zellzyklus Forschung in Organismen aus Hefe auf Säugerzellen9,10erheblich erleichtert. Darüber hinaus sind die jüngsten Fortschritte verwendet zur Trennung von Zellen von gesunden versus Krebsgewebe, die Trennung der verschiedenen Zelltypen in heterogenen Gemischen und zur Produktion von bestimmten Zelltypen für Immuntherapie9erweitert.
Unser Hauptinteresse ist für das Verständnis des Wirkmechanismus von Mikrotubuli targeting Agents (MTAs) wie Vinca Alkaloide und Taxane gewesen. Diese Medikamente wurden gedacht, um ausschließlich in Mitose, blockieren Spindel Mikrotubuli Funktion11,12, handeln, aber den letzten Beweis schlägt vor, dass sie auch Interphase Microtubules13,14Zielen können. Wir berichteten kürzlich, dass primäre akute lymphoblastische Leukämie (ALL) Zellen Tod entweder der G1-Phase unterziehen oder in der M phase, wenn mit Vincristin und anderen MTAs im Zellzyklus-abhängigen Weise15behandelt. Die Fähigkeit, alle Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen von CCE zu trennen war maßgeblich an dieser Schlussfolgerung. In diesem Artikel wir beschreiben die technischen Details und bieten praktische Tipps für die Anwendung des CCE zur Vorbereitung des primären alle Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen.
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Protocol
Hinweis: dieses Protokoll wurde optimiert für primäre B-ALL die reichen im Durchmesser von ca. 8 µm (G1-Phase) bis 13 µm (G2/M-Phase) Zellen. Somit können die spezifische Zentrifuge Geschwindigkeiten und Pumpe Flussraten nicht auf Zellen mit verschiedenen Größenbereiche anwendbar. Allerdings können entsprechende Sammelnetzwerk Parameter unter Verwendung der Sedimentation Rate Gleichung geschätzt werden. Zellen sind wie beschrieben 16 auf eine optimale Dichte von 1-3 x 10 6 Zellen/mL in einem definierten serumfreien Medium kultiviert. Mit Ausnahme der Sammlung von Brüchen, bei 4 ° C mit Eis gekühlt Röhren durchgeführt wird, werden alle Schritte durchgeführt, bei Raumtemperatur und die Zentrifuge gesetzt bei 20 ° C mit maximal 24 ° c
1. Vorbereitung der Sammelnetzwerk Puffer und Materialien
- zur Verklumpung der Zellen zu verringern, bereiten Sie einen Sammelnetzwerk Puffer von Hank ' s mit Phenol rot ergänzt mit 2 % fötalen Rinderserum (Kochsalzlösung (HBSS) ausgeglichen FBS), zum Schutz der Zellen vor mechanischer Belastung während der Sammelnetzwerk Prozess und 1,6 g/L 2-Naphthol-6,8-Disulfonic Säure Dipotassium Salz (NDA), das macht die Zelle außen negativ geladen und reduziert die Verklumpung.
- Eine 50 mL konische Rohr 1,6 g der NDA hinzufügen.
- 35 mL HBSS aus eine 1 L Flasche, die 50 mL konische Röhrchen mit NDA unter sterilen Bedingungen hinzufügen. Das Rohr zu schwenken, bis die NDA aufgelöst hat.
- Mit einem 0,2 µm-Filter, die gelöste NDA in eine neue sterile 50 mL konische Rohr übertragen. Fügen Sie dann die NDA zu den verbleibenden 1 L HBSS.
- Schließlich 21 mL FBS hinzufügen HBSS, eine Endkonzentration von 2 % (V/V) zu erhalten.
Hinweis: Die Sammelnetzwerk Puffer kann vorbereitet und bei 4 ° C gelagert werden, bis zum Ablaufdatum auf der HBSS oder bis gibt es eine große Veränderung in der pH-Wert durch eine Gelbfärbung der Indikatorfarbstoff.
- Label 50 mL konische Rohre für die Sammlung der Fraktionen, so dass gibt es Röhren mit der Bezeichnung 1 und 2 (W1 und W2), Brüche 1-20 (F1 - F20) zu waschen und zu stoppen.
- Pre-chill diese Rohre auf dem Eis vor der Erhebung Brüche.
2. Montage des Systems Elutriation
- zuerst installieren die Strobe-Versammlung in der Zentrifuge, so, dass das Netzkabel aus der Kammer durch den Hafen auf der linken Seite zugeführt wird. Sicherstellen Sie, dass die Strobe-Blitzlampe an der Vorderseite der Kammer, ist so es mit Sichtfenster Line-up wird geschlossenem Zentrifuge.
- Die Versammlung im Ort zu sichern, indem Sie zuerst anziehen 2 Kreuzschlitz Schrauben in die zwei Löcher am oberen Rand jeder Bügel und dann durch Anziehen der Rändelschrauben am unteren Rand jeder Bügel.
- Stecken Sie das Netzkabel in die Strobe-Netzanschluss auf der Rückseite der Zentrifuge.
- Als nächstes absetzen den Rotor direkt auf der Zentrifuge Antrieb Nabe und sichern Sie mit einem T-Griff Inbusschlüssel.
Hinweis: Wenn die Zentrifuge nicht Sammelnetzwerk Zwecken nicht erforderlich ist, die Strobe-Versammlung und der Rotor können gehalten werden in der Zentrifuge zwischen Läufen. - Sobald der Rotor gesichert ist, legen Sie die Quick-Release-Baugruppe mit der Sammelnetzwerk Kammer, Gegengewicht, Dichtungs-Baugruppe und Montageplatte in den Rotor drehen.
- Drücken Sie gleichmäßig mit einer Hand am Sammelnetzwerk und andererseits an das Gegengewicht bis der Bolzen in den Rotor in die Löcher auf der Montageplatte einrasten.
- Schließen Sie abschließend das verankern Kabel indem die Pin auf der einen Seite des Kabels in das Loch in der rotierenden Dichtungs-Baugruppe und Sicherung der Türspion auf der anderen Seite des Kabels mit einem Kreuzschlitz Schrauben (erwähnt in 2.1.1) an der Halterung an der linken Seite die Kammer f.
- Als nächstes montieren die Flow-System mit einem drehzahlgeregelten Pumpe und Schlauch zu Pumpe Puffer in der Sammelnetzwerk Kammer und Puffer zu sammeln, wie es aus der Sammelnetzwerk Kammer fließt.
- Einsatz der Größe 16 Eingang Schlauch aus der drehzahlgeregelten Pumpe über den Anschluss an die Spitze der Zentrifuge Kammer, links so dass es in die Kammer eintritt.
- Legen eine passende auf das freie Ende der Eingabe Schlauch und Armatur in der Eingabe Loch an der Seite der rotierenden Dichtungs-Baugruppe einfügen. Legen Sie die Größe 16 Ausgang Schlauch durch den Hafen und hängen Sie es an das Übertragungsrohr an der Spitze des rotierenden
- Dichtung Montage.
Hinweis: Die Flow-System kann auch montiert zwischen Sammelnetzwerk Läufe bleiben.
- Zu guter Letzt Einschalten die Zentrifuge und die Spezifikationen für das Experiment.
- Änderung der Rotor ID.
- Wenn die Zentrifuge ein Zeitaufwand erfordert, festgelegt für 2 h, was mehr als ausreichend, um eine Sammelnetzwerk laufen zu vervollständigen ist.
- Stellen Sie die Temperatur auf 20 ° C mit einer max. Temp von 24 ° c
- Legen Sie die Beschleunigung für Max und die Verzögerung für langsam.
- Schließlich stellen Sie die Geschwindigkeit bis 867 X g.
3. Grundierung der Sammelnetzwerk System
- zuerst um das Sammelnetzwerk System zu sterilisieren, legen die Reservoir-Schlauch in einer 500 mL Kunststoff-Flasche mit 5 % Bleichmittel und den Ausgang Schlauch in eine leere 1 L-Kunststoff-Abfall-Flasche.
- Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 25 mL/min und ermöglichen das 5 % Bleichmittel zu ganzen Weg durch das Sammelnetzwerk System fließen, bis es aus dem Ausgabe-Rohr in die Abfallflasche gepumpt wird.
- Die Zentrifuge einschalten und warten sie, um die maximale Geschwindigkeit (867 X g) bezeichnet, um Luftblasen und Gegendruck freizusetzen.
- Stoppen die Zentrifuge. Wenn der Rotor nicht rotiert mehr, den Deckel öffnen und inspizieren die Kammer für alle undichten Stellen.
- Gibt es keine Lecks, lassen Sie das Bleichmittel-Lösung fließen durch das System für mindestens 5 min.
- Als nächstes das Spülsystem mit autoklaviert Wasser als Bleichmittel zu Bildung von Ausscheidungen aus dem Puffer Sammelnetzwerk, die kann zur Verklumpung der Zellen führen führen kann, sowie Schäden an den Zellen verursachen.
- Ort der Reservoir-Schlauch in eine 1 L Flasche autoklaviert Wasser und lassen Sie es für mindestens 10 Minuten durch Spülen
- Nach dem Spülen mit Wasser, Sammelnetzwerk Puffer in das System einführen. Verwenden Sie eine 150 mL Glasflasche autoklaviert erstelle ich ein Reservoir für die Sammelnetzwerk Puffer und Zellen wurde.
- Die Flasche 100 mL Sammelnetzwerk Puffer hinzu und verschieben Sie das Reservoir Schlauch zur Glasflasche, so dass die Röhren an der Unterseite.
- Die Zentrifuge starten und lassen Sie den Puffer durch das System zu spülen, das Wasser fließen.
- Sobald die Vorratsflasche fast leer ist und das Wasser wird vollständig aus dem System heraus gespült, bewegen die Ausgabe Schläuche aus der Abfallflasche zum Stausee, dass der Puffer durch das System wiederverwertet wird.
- Schließlich das Sichtfenster so einstellen, dass die aktuelle Geschwindigkeit die Sammelnetzwerk Kammer eingesehen werden kann.
- Presse die Strobe Lampe / aus-Taste an der Außenseite der Zentrifuge so dass die Lampe einschaltet. Drehen Sie die Sammelnetzwerk kNob auch auf der Außenseite der Zentrifuge ganz nach links.
- Während langsam durch das Sichtfenster auf der Suche Drehen der Regler nach rechts, bis die Sammelnetzwerk Kammer in Sicht und das Blitzlicht kommt rechtzeitig mit der Drehung des Rotors ist.
Hinweis: Das Sammelnetzwerk System kann gelassen werden in diesem Zustand bis die Zellen desinfiziert werden.
4. Vorbereitung der die Zellprobe
- Anzahl Zellen und aliquoten 300 bis 400 Millionen im Wachstumsmedium in mehreren 50 mL konische Röhrchen. Spin-down der Zellen bei 1210 X g für 3 min.
- Aspirat aus Wachstum Medien und Aufschwemmen Zellen in 25 mL Sammelnetzwerk Puffer durch sanft auf und ab pipettieren.
- Verringerung des Zell-Verklumpung, Pass Zellen zweimal durch eine 25 gauge Nadel.
- Mit einer 10 mL Spritze zeichnen die Zellen und dann 25 Gauge-Nadel befestigen und die Zellen durch auf der Innenseite Wand einer sterilen 50 mL konische Röhre. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle 25 mL die Nadel durchlaufen haben.
- Erhalten eine neue Nadel und Spritze und wiederholen Sie den Vorgang oben einmal.
Achtung: Spritze Nadeln sollten in Sharps Container platziert werden.
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zellen durch die Nadel geschoben, sind unmittelbar vor der Einführung in das Sammelnetzwerk System um Zelle Verklumpung auf ein Minimum.
5. Einführung der Zellprobe in das Elutriation System und Sammlung der Fraktionen
- Einführung in das Sammelnetzwerk System durch Gießen die Zellprobe in dem Behälter mit den restlichen Sammelnetzwerk Puffer recycling durch die Zellprobe .
- Lassen Sie die Zellen in das System eingeben und erreichen Gleichgewicht innerhalb der Kammer Sammelnetzwerk.
Hinweis: Dieser Vorgang dauert ca. 5 min. und Fortschritt kann durch die Beobachtung der Zellen beim Eintritt in der Kammers über das Sichtfenster verfolgt werden. Um sicherzustellen, dass alle Zellen in der Kammer, nimm einen Tropfen des Elutionsmittels, legen Sie auf einen Objektträger und unter dem Mikroskop betrachten. Wenn die Probe frei von intakten Zellen, dies bestätigt ihre Aufbewahrung in der Kammer.
- Lassen Sie die Zellen in das System eingeben und erreichen Gleichgewicht innerhalb der Kammer Sammelnetzwerk.
- Fraktionen sammeln, sobald alle Zellen in die Kammer getreten und es eine deutliche Grenze an der breitesten Stelle der Kammer gibt, in dem die Zellen im Gleichgewicht sind.
- Beginnen indem das Ausgabe-Rohr auf die 50 mL konische Röhrchen beschriftet W1. Sammeln Sie 50 mL Sammelnetzwerk Puffer für dieser Bruch, achten Sie darauf, halten ein Auge auf den Vorratsbehälter und mit Sammelnetzwerk Puffer bei Bedarf auffüllen.
Hinweis: Um sicherzustellen, dass alle Zellen in das System eingegeben haben, können Sie der Behälter fast leer werden vor dem Nachfüllen des Stausees zum ersten Mal. Nach dem ersten Nachfüllen werden nicht nötig zu warten, bis der Behälter fast leer zu. Auch nicht immer erlauben den Tank leer werden, da diese Bläschen und Gegendruck im System anlegen wird. - Sobald 50 mL für W1 gesammelt worden, gleichzeitig ändern Sie die Geschwindigkeit auf 821 X g und bewegen das Ausgabe-Rohr mit dem konischen Rohr beschriftet W2 und sammeln Sie mehr im selben Tempo 50 mL.
- Weiter Änderung der Geschwindigkeit und Brüche zu sammeln, wie in Tabelle 1 angegeben. Stellen Sie sicher, es gibt Medien in das Reservoir tank und behalten Sie stets die konischen Rohren auf Eis. Schließlich stellen Sie das Sichtfenster durch langsames Drehen der Regler nach rechts, da die Geschwindigkeit abnimmt.
- Einmal alle 20 Fraktionen gesammelt worden, die Zentrifuge zu stoppen und sammeln Sie 50 mL in der konischen Röhre mit der Aufschrift STOP.
- Beginnen indem das Ausgabe-Rohr auf die 50 mL konische Röhrchen beschriftet W1. Sammeln Sie 50 mL Sammelnetzwerk Puffer für dieser Bruch, achten Sie darauf, halten ein Auge auf den Vorratsbehälter und mit Sammelnetzwerk Puffer bei Bedarf auffüllen.
6. Spülen der Elutriation System
- , nachdem die Zentrifuge das System vollständig bündig aufgehört hat, indem man die Reservoir-Schlauch in der 1 L Wasserflasche autoklaviert und den Ausgang Schlauch zurück in die Abfallflasche.
- Die Pumpendrehzahl bis 50 mL/min drehen und lassen Sie das Wasser durch das System laufen lassen, bis dieses aufgebraucht ist.
- Schalten Sie die Pumpe den Eingangs- und Schlauch vom Schnellspanner Montage entfernen, und ziehen Sie den Stift aus der Verankerung Kabel.
- Schnellverschluss-Versammlung vom Rotor entfernen.
Hinweis: Je nachdem, was die Zentrifuge für verwendet, kann das Sammelnetzwerk-System nun so belassen werden. Andernfalls kann die ganze Versammlung in umgekehrter Reihenfolge abgebaut werden wie oben beschrieben. Die Sammelnetzwerk Kammer kann aus der Schnellspanner Montage entfernt und zwischen den Läufen mit einem Ultraschall Wasserbad gereinigt. Dies entfernt Schmutz und Verunreinigungen aus der Kammerwand die späteren Auflagen negativ beeinflussen kann.
- Schnellverschluss-Versammlung vom Rotor entfernen.
7. Analyse der Fraktionen und Sammlung der G1 oder G2/M Pools.
Hinweis: um die Wirksamkeit des Sammelnetzwerk zu demonstrieren, wird jede Fraktion für Zellzahl, Zelle Durchmesser und DNA-Gehalt analysiert und Pools sind Zellen in G1 oder G2/M Phasen für Immunoblot Analysen erstellt, wie in beschrieben Vertreter Ergebnisse. Dieses Protokoll Abschnitt wird beschrieben, wie Sie erstellen diese Pools und bereiten sie für Versuchszwecke.
- Spin jede Fraktion bei 2000 X g für 5 min bei 4 ° C und Aspirat aus Sammelnetzwerk Puffer.
- Mähdrescher Fraktionen zusammen, um ein G1-Phase-Pool und einen G2/M-Phasen-Pool zu erhalten.
- Für G1 phase Pool, Brüche, die im Drehzahlbereich von 788 X g 661 X g (F1 - F5) gesammelt wurden insgesamt 1 mL der Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) und Übertragung auf eine 15 mL konische Rohr Aufschwemmen. Für die G2/M-Phasen-Pool Aufschwemmen Brüche die im Drehzahlbereich von 387 x g und 333 X g (F17 - F20) gesammelt wurden.
- Spin-down Zellen 2000 X g für 5 min bei 4 ° C und Absaugen von PBS.
- Zellen in 10 mL Wachstumsmedien Aufschwemmen und nehmen eine Zellzahl.
- Eine Aliquote aus jedem Pool für DNA analysiert werden Inhalte über Propidium Jodid Färbung nehmen und fließen durchflusszytometrischen Analyse 15.
Hinweis: Der Rest der einzelnen Pools kann für weitere Experimente verwendet werden.
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Representative Results
Primäre alle Zellen (3-4 x 108) gesammelt in zwei Fraktionen waschen und zwanzig Hauptfraktionen, wie im Protokoll beschrieben und zentrifugale Sammelnetzwerk ausgesetzt waren. Tabelle 1 zeigt repräsentative Daten wo die Gesamtzahl der Zellen in jeder Fraktion sowie die entsprechenden Rotordrehzahl vorgestellt werden. Alles in allem war die Ausbeute in der Regel über 80 %. Messung des Durchmessers der Zelle in einzelne Fraktionen bestätigt die Zelle Durchmesser erhöht sich mit zunehmendem Sammelnetzwerk (Abbildung 2). Diese Ergebnisse stellen Mittelwerte aus zwei unabhängigen Bestimmungen und spiegeln das hohe Maß an Reproduzierbarkeit der Daten. Brüche wurden als nächstes Opfer Propidium Jodid Färbung und flow Cytometry ermitteln DNA-Gehalt (Abbildung 3). Frühe Brüche (F1 - F5) enthalten fast ausschließlich Zellen mit 2N DNA-Gehalt, G1-Phase darstellt. Eine Mischung aus Zellen in der G1-Phase und S-Phase wurde im Zwischenfraktionen (F6 - F9) beobachtet und Zellen mit 4N DNA-Gehalt wurden beobachtet, F10 ab. Späteren Fraktionen hatten vor allem Zellen mit 4N DNA-Gehalt, G2/M-Phasen darstellt. Diese Daten zusammen mit den Ergebnissen der Abbildung 2 bestätigt eine Beziehung zwischen Zellengröße und Zellzyklus-Phase.
Basierend auf diesen Ergebnissen, Brüche F1 - F5 wurden kombiniert, um einen Pool von Zellen in der G1-Phase zu erstellen, und Brüche F17 - F20 wurden kombiniert, um einen Pool von Zellen in der G2/M-Phase zu erstellen. Der Anteil der Zellen mit 2N DNA-Gehalt in der G1-Phase-Pool war in der Regel 99 % und der Anteil der Zellen mit 4N DNA-Gehalt in der G2/M Pool war in der Regel 85 %, wie von Propidium Jodid Färbung bestimmt und flow Cytometry. Asynchrone Bedingungen sind 60-70 % der primären sind alle Zellen in der G1-Phase und 15-20 % in der G2/M Phasen15, damit die Werte, die nach Sammelnetzwerk reflektieren hohe Anreicherung. Um die beiden Pools in Bezug auf Zellzyklus-Phase weiter zu authentifizieren, wurden Auszüge aus jedem Immunoblotting mit Markern der G1 oder G2/M Phasen unterzogen. Erstens haben wir verwendet einen Phospho-spezifische Antikörper erkennt Retinoblastom (Rb) Protein phosphoryliert auf Ser-807 oder Ser-811, da nun feststeht, dass Rb zunehmend phosphoryliert wird als Zellen Fortschritt durch den Zellzyklus17 . Wie in Abbildung 4dargestellt, waren die Ebenen des Phospho-Rb in Zellen in der G2/M Pool gegenüber der G1-Phase-Pool, Erwartungen viel höher. Wir sondiert auch für cyclin B1, die höchst in G2/M-Phase-Zellen exprimiert wird, und cyclin D1, die höchst in G1 Phase Zellen18 (Abbildung 4) zum Ausdruck kommt. Der G2/M Pool hatte viel höhere Niveaus von cyclin B1 im Vergleich zu den G1-Pool, Erwartungen. Cyclin D1 gab nur ein schwaches Signal bei diesen Vorbereitungen, aber dennoch war in der G1-Pool nachweisbar und in der G2/M-Pool nicht nachweisbar. GAPDH diente ein Steuerelement, das gleiche Protein laden zu bestätigen.
Änderungen an den standard-Protokoll wurden zur Beurteilung ihrer Auswirkungen und Voraussetzungen für eine optimale Leistung durchgeführt. Zunächst wurde die Anzahl der Fraktionen gesammelt, von der standard 20, verringert nur drei, mit Geschwindigkeiten ermittelt aus Tabelle 1 um die Klemmstellen für Ansammlung von Zellen in den Phasen G1, S und G2/M darzustellen, wie in Tabelle 2 dargestellt. Analyse der DNA-Gehalt der Fraktionen F1 und F3 sind in Abbildung 5Adargestellt. Teil 1 enthaltenen Zellen hochangereichertes in G1-Phase (95 %) und war damit ähnlich Reinheit zu denen, die unter Normbedingungen (Abbildung 3). Jedoch, Teil 3, angeblich Zellen hochangereichertes in G2/M-Phase, gab eine gemischte Bevölkerung, mit Zellen in G1 und S Phasen ebenfalls anwesend. G2/M-Zellen vertreten nur 51 % der gesamten, im Vergleich zu 85 % unter Standardbedingungen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die versucht wird, das Verfahren zu vereinfachen, indem die Anzahl der Fraktionen Kompromisse Probenqualität. Als nächstes haben wir die Wirkung der Bruchteil Abfallbeseitigungssystem, als ein Mittel zur Reduzierung von Reagenzienverbrauch getestet. Ein standard Sammelnetzwerk wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 40 mL statt 50 mL Fraktionen wurden gesammelt. Brüche-F1 und F20 wurden für DNA-Gehalt untersucht. Wie in Abbildung 5 bgezeigt, wurde Bruchteil F1 in G1 Phase Zellen (98 %), ähnlich zu denen, die unter normalen Bedingungen sehr bereichert. Bruchteil F20 enthaltenen Zellen in allen drei Phasen, mit Zellen in der G2/M-Phase nur 64 % der Gesamtmenge, Vertretung gegenüber jedoch 85 % unter Standardbedingungen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Bruchteil Abfallbeseitigungssystem auch Probenqualität beeinträchtigt.
Abbildung 1 . Prinzip der zentrifugalen Sammelnetzwerk Gegenstrom.
Beachten Sie, dass Sammelnetzwerk Zellen erreicht werden, entweder durch Erhöhung der Gegenstrom wie hier angegeben oder durch eine Verringerung der Rotordrehzahl. Adaptiert mit Erlaubnis von Macmillan Publishers Ltd: [Natur Protokolle] (Ref 8.), copyright (2008)8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Durchmesser des primären alle Zellen steigt mit Sammelnetzwerk Bruchteil.
Der mittlere Durchmesser wurde für jede Fraktion, die mit einer Zelle-Analyzer, der Datensätze von 500-4.500 Einzelzellen pro Probe bestimmt. Die angezeigten Daten sind Mittelwert ± S.D. aus zwei unabhängigen Experimenten. Beachten Sie, dass Fehlerindikatoren für viele Punkte kleiner als das Symbol sind und wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Analyse der DNA-Gehalt bestätigt erfolgreiche Trennung des primären alle Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen.
10 mL der einzelnen Fraktionen wurde behoben, bei 70 % EtOH, gebeizt in Propidium Jodid und analysiert durch Durchflusszytometrie,15beschrieben. Propidium Jodid integriert Intensität (x-Achse) war im Vergleich zu Zellzahl (y-Achse), den Teil der Zellen in jeder Phase zu bestimmen, wo 2N DNA-Gehalt gibt G1-Phase und 4N DNA-Gehalt gibt Zellen in G2 oder M Phasen aufgetragen. Die angezeigten Daten sind von einem repräsentativen Experiment und wesentlichen identische Ergebnisse wurden in vier Wiederholungen erzielt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Immunoblot Analyse der Zellzyklus-Proteine in gebündeltBrüche.
Nach einem standard Sammelnetzwerk der Grundschule, die alle Zellen, Brüche F1 - F5 kombiniert wurden, um einen G1-Phase-Pool und Brüche F17 - erstellen F20 wurden kombiniert, um eine G2/M-Phase-Pool zu erstellen. Auszüge wurden vorbereitet und 40 µg/Bahn Immunoblot Analyse unterzogen, wie zuvor15, mit Antikörpern gegen Phospho-Rb (Ser807/811) beschrieben cyclin B1 oder cyclin D1, alle in 1:2,000 Verdünnung verwendet. GAPDH (01:10, 000) diente als ein Steuerelement laden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Anschauliche Daten aus suboptimalen Elutriations.
(A) Wirkung der Verringerung der Anzahl der Fraktionen gesammelt. Nur drei Hauptfraktionen (F1 - F3), statt der üblichen 20, jeweils 100 mL, sammelten bei Geschwindigkeiten wie in Tabelle 2 angegeben. Brüche-F1 und F3 wurden für DNA-Gehalt wie in Abbildung 3analysiert. (B) Auswirkungen der Bruchteil Lautstärke zu reduzieren. Zwanzig Fraktionen gesammelt wurden, unter den gleichen Bedingungen wie in Tabelle 1, aber nur 40 mL Sammelnetzwerk Puffer anstelle der standard 50 mL für jede verwendet wurde. Brüche-F1 und F20 wurden für DNA-Gehalt wie in Abbildung 3analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Bruchteil | Drehzahl (u/min) | G-Force | Insgesamt Zellen (X 10 ^ 6) |
| W1 | 3000 | 867 X g | 17,75 |
| W2 | 2920 | 821 X g | 7,00 |
| FORMEL 1 | 2860 | 788 X g | 4.60 |
| F2 | 2800 | 755 X g | 10,75 |
| F3 | 2740 | 723 X g | 15.25 |
| F4 | 2680 | 692 X g | 22.50 Uhr |
| F5 | 2620 | 661 X g | 26,75 |
| F6 | 2560 | 631 X g | 25,00 |
| F7 | 2500 | 602 X g | 22,75 |
| F8 | 2440 | 573 X g | 18: 00 Uhr |
| F9 | 2380 | 546 X g | 14: 00 Uhr |
| F10 | 2320 | 518 X g | 10,75 |
| F11 | 2260 | 492 X g | 7.43 |
| F12 | 2200 | 466 X g | 8,63 |
| F13 | 2140 | 441 X g | 6,63 |
| F14 | 2100 | 425 X g | 4.98 |
| F15 | 2060 | 409 X g | 3.46 |
| F16 | 2020 | 393 X g | 3.43 |
| F17 | 1980 | 378 X g | 2,63 |
| F18 | 1940 | 363 X g | 3.17 |
| F19 | 1900 | 248 X g | 2.78 |
| F20 | 1860 | 333 X g | 1.66 |
| STOP | 0 | 0 X g | 5.19 |
| Gesamtertrag | 245.06 | ||
| Prozent Ertrag | 81,69 | ||
Tabelle 1. Zellausbeute und entsprechenden Rotordrehzahl für jede Fraktion.
Zellzahl wurde über einen automatisierten Zelle Zähler ermittelt. Gesamtausbeute war bestimmt durch die Summe der einzelnen Fraktionen gegenüber Eingang (3 x 10-8 -Zellen). Daten sind durchschnittlich zwei repräsentative Experimente. Zentrifugalkraft und entsprechenden Rotordrehzahl gegeben werden.
| Bruchteil | Drehzahl (u/min) | G-Force |
| W1 | 3000 | 867 X g |
| W2 | 2920 | 821 X g |
| FORMEL 1 | 2620 | 661 X g |
| F2 | 2020 | 393 X g |
| F3 | 1860 | 333 X g |
| Stop | 0 | 0 X g |
Tabelle 2. Geschwindigkeitsparameter für suboptimale Sammelnetzwerk.
Gezeigt werden Fliehkräfte und entsprechenden Rotordrehzahlen für Waschungen und drei Fraktionen in eine komprimierte suboptimalen Sammelnetzwerk gesammelt. Siehe Abbildung 5A für entsprechende DNA-Gehalt und Text für Details.
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Discussion
Wir haben einer Methode für den Erhalt der primären alle Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus mit CCE beschrieben. Unter optimalen Bedingungen eine im wesentlichen reine Bevölkerung der Zellen in der G1-Phase und eine hoch angereicherten Population von Zellen in der G2/M-Phasen könnte ohne weiteres eingeholt werden hervorragende Ausbeute und Zellen hochangereichertes in S-Phase können auch erhalten werden, wenn gewünscht. Die hier präsentierten Ergebnisse wurden mit eine eigenständige Kultur, ALL-215eine primäre, die alle Kultur (insbesondere ALL-5) und im Wesentlichen identische Ergebnisse vorliegen. Darüber hinaus führen alle anderen primären aller Kulturen bis heute untersucht haben ähnliche Dichte Bereiche während des asynchronen Wachstums, und werden wahrscheinlich ähnlich wie bei CCE. Unsere früheren Studien haben auch gezeigt, dass anderen Leukämie-Zell-Linien, einschließlich HL60 und K562, in verschiedenen Zellzyklus Phasen mit CCE19,20getrennt werden können. Kritischen Schritte des Verfahrens umfassen die Gewährleistung, dass die Zellen Mono zerstreut und nicht aufgehäuften zu Beginn des Laufs; Optimierung der Bedingungen des Gegenstrom-Rate und Rotor-Geschwindigkeit; die Komponenten des Systems zu gewährleisten, sind sauber und frei von Fremdkörpern; und die Einführung von Luftblasen in der Flow-Linien zu vermeiden. CCE funktioniert am besten mit Zellen, die in Zellengröße deutlich, wie sie durch den Zellzyklus vorher. Für einen gegebenen Population von Zellen in Suspension kann dies zunächst und einfach festgestellt werden durch die Untersuchung der Beziehung zwischen DNA-Gehalt und Side Scatter, der letztere je nach Zellengröße. Beide Parameter können gleichzeitig nach Propidium Jodid Färbung, durch Durchflusszytometrie gemessen werden, wie wir15beschrieben haben. Eine lineare Beziehung zwischen Side Scatter und DNA-Gehalt schafft Vertrauen, dass Zellengröße mit dem Zellzyklus voraus steigt und so, dass CCE das Potenzial hat, die Zellen trennen auf Zellzyklus-Phase basieren.
Wie wir (Abbildung 5) gezeigt haben, führen zu Abweichungen von der optimierten Verfahren kompromittierten Sample-Qualität, vor allem für Zellen in der G2/M-Phasen. Verringerung der Zahl der Brüche oder Bruchteil Volumen nicht merklich die Reinheit der Zellen in der G1-Phase (Abbildung 5) betroffen war davon allerdings. So können Verknüpfungen zu dem Verfahren toleriert werden, wenn nur gereinigte G1 Phase Zellen benötigt werden. Obwohl CCE Suspensionskulturen Zelle ohne weiteres zugänglich ist, kann es auch auf subzellularen Brüchen angewendet werden. Z. B. wurden Kerne aus murinen Pre-B Zellen erfolgreich Größe mit CCE8getrennt. Adhärente Zelltypen stellen potenzielle Probleme aufgrund ihrer Neigung für die Aufhäufung und mögliche Einhaltung der Oberflächen der Rohre und Sammelnetzwerk Kammer und sollte daher mit Vorsicht untersucht werden.
Die wichtigste Einschränkung der CCE sind die Kosten der Ausrüstung; eine mögliche Lösung ist es, mit einem Labor zusammenarbeiten, die das notwendige Gerät hat. Beachten Sie jedoch, dass während der Rotor eines speziellen Instruments ist, die Zentrifuge allgemeine Zentrifugation Zwecken verwendet werden kann, wodurch die Kosten investiert ausschließlich in CCE. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Planung von Experimenten noch problematischer verglichen mit der Flexibilität von anderen Methoden wie z. B. Serum verhungern oder chemische Synchronisierung ist. Sammelnetzwerk läuft in der Regel 5-6 Stunden dauern, und wenn die Zellen anschließend für kurzfristige oder Multi-Zeit Punkt Experimente benötigt werden, können dadurch Unannehmlichkeiten planen. Der größte Vorteil ist, dass Zellen, die durch diese Methode erhalten gelassen werden und können für viele Tage ohne irgendwelche Anzeichen von Stress, kultivierten wie wir15gezeigt haben. Dies kontrastiert mit Zellen synchronisiert mit chemischen Mitteln die Medikamenten-induzierten Schäden beherbergen können. Eine aktuelle Studie mit SB4 Zellen aus akuter myeloischer Leukämie Blasten, CCE und andere Methoden, einschließlich der Verhaftung mit Serum Hunger, Hydroxyurea oder Behandlung mit einem Inhibitor cyclin-abhängige Kinase 1, RO-330621direkt verglichen. Elutriated Zellen und Zellen, die in vergleichbaren Phasen erschien in Bezug auf DNA-Gehalt und cyclin Ausdruck ähnlich verhaftet. Jedoch wenn das Proteom untersucht wurde, große Veränderungen in Protein Fülle, besonders betonen-in Verbindung stehende und Verhaftung-spezifische Proteine, beobachtet in den Verhafteten Zellen und nicht in den elutriated Zellen an entsprechende Zelle Größe stellen. Diese Ergebnisse das CCE-Dienstprogramm für die Herstellung von unbeirrt Zellen hervorheben und betonen, dass Vorsicht sollte verwendet werden, bei der Interpretation der Daten aus Zellen mit anderen Mitteln synchronisiert.
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Disclosures
Anisha Kothari liegt derzeit bei der Abteilung für Zell- und Molekularbiologie an der St. Jude Children Research Hospital.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH CA109821 (, TCC) unterstützt. Wir danken Beckman Coulter für die großzügige Bereitstellung von Mitteln zur Deckung der Veröffentlichungskosten und für technische Unterstützung bei der Einrichtung und Bedienung des Sammelnetzwerk Systems. Wir danken Dr. Fred Falkenburg für die Bereitstellung von ursprünglichen primären aller Kulturen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
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