Summary
Questo protocollo descrive l'uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per separare le cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria in fasi del ciclo cellulare diverso.
Abstract
La possibilità di sincronizzare le cellule è stata fondamentale per far avanzare la nostra comprensione della regolazione del ciclo cellulare. Tecniche comuni impiegate includono privazione del siero; sostanze chimiche che arrestano le cellule alle fasi del ciclo cellulare diverso; o l'uso di shake-off mitotic che sfrutta la loro aderenza ridotta. Tuttavia, tutti questi hanno svantaggi. Ad esempio, inedia del siero funziona bene per le cellule normali ma meno bene per le cellule del tumore con i checkpoint del ciclo cellulare compromessa a causa della perdita di soppressore del tumore o l'attivazione dell'oncogene. Allo stesso modo, popolazioni cellulari trattati chimicamente possono harbor danno farmaco-indotto e mostrano le alterazioni legate allo stress. Una tecnica che aggira questi problemi è elutriazione centrifugo controcorrente (CCE), dove le cellule sono soggetti a due forze opposte, la forza centrifuga e la velocità del fluido, che provoca la separazione delle cellule in base a dimensione e densità. Poiché le cellule avanzando attraverso il ciclo in genere ingrandicono, CCE può essere utilizzato per separare le cellule in fasi del ciclo cellulare diverso. Qui applichiamo questa tecnica alle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria. In condizioni ottimali, una popolazione essenzialmente pura di cellule in fase G1 e una popolazione altamente arricchita di cellule in fase G2/M è ottenibile in ottima resa. Queste popolazioni cellulari sono ideali per studi ciclo cellulare-dipendente meccanismi d'azione dei farmaci anticancro e per altre applicazioni. Abbiamo anche mostrare come modifiche alla procedura standard può comportare prestazioni non ottimali e discutere le limitazioni della tecnica. La metodologia dettagliata presentata dovrebbe agevolare applicazione ed esplorazione della tecnica ad altri tipi di cellule.
Introduction
Le cellule coltivate in genere crescono in modo asincrono e singole celle sono presenti nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Alcuni organismi presentano cicli cellulari naturalmente sincroni o possono essere sincronizzati da specifici stimoli fisiologici. Ad esempio, nuclei all'interno di giganti plasmodi della muffa di melma Physarum polycephalum dividono in un modo altamente sincrono1e le cellule delle alghe verde che Desmodesmus quadricauda possono essere sincronizzati da un'alternanza di luce e buio periodi2. Mentre tali organismi offrono unici attributi sperimentali, modellano non adeguatamente la complessità delle cellule di mammiferi. La possibilità di sincronizzare artificialmente popolazioni di cellule di mammifero è stata fondamentale per far avanzare la nostra comprensione della regolazione del ciclo cellulare e le basi molecolari dei checkpoint del ciclo cellulare. Metodi comuni includono la privazione del siero, chimica blocco e rilascio o sfruttando le caratteristiche fisiche3,4. Prelievo di siero spesso induce le cellule a entrare in quiescenza, e tale aggiunta di siero promuove il rientro del ciclo cellulare in fase G15. Inibitori chimici includono gli agenti quali timidina eccedente hydroxyurea che bloccano le cellule al contorno di G1/S o inibitori del microtubulo che tipicamente arrestano le cellule in fase3,M4. Approcci che sfruttano le caratteristiche fisiche includono shake-off mitotic che può essere utilizzato per arricchire per cellule mitotiche poiché sono meno aderenti di interfase celle6. Tuttavia, tutte queste tecniche hanno svantaggi potenziali. Ad esempio, non tutti i tipi di cellule mantengono vitalità in assenza di siero o la presenza di inibitori chimici e la resa delle cellule dopo shake-off mitotica è limitato senza preventiva sincronizzazione con inibitori mitotici.
Ad eccezione dei primi cicli cellulari embrionali, dove le cellule diminuiscono progressivamente di dimensioni come dividono7, maggior parte delle cellule avanzando attraverso il ciclo di subire le fasi di crescita e diventano più grande. Questa proprietà viene sfruttata nella tecnica della elutriazione centrifugo controcorrente (CCE), che può essere utilizzato per separare le cellule differiscono per dimensioni e quindi nel ciclo cellulare fase8,9. Durante CCE, le cellule sono sotto l'influenza di due forze opposte: la forza centrifuga, che spinge le cellule dall'asse di rotazione e la velocità del fluido (controcorrente), che spinge le cellule verso l'asse di rotazione (Figura 1). Le cellule nella camera di elutriazione raggiungere una posizione di equilibrio dove queste forze sono uguali. Densità e diametro delle cellule sono i fattori chiave che dettano la posizione di equilibrio. Come il flusso del tasso della soluzione tampone è aumentato e la forza di trascinamento controcorrente supera la forza centrifuga, è stabilito un nuovo equilibrio, causando un cambiamento nella posizione delle cellule all'interno della camera. Tutte le celle vengono spostate verso l'uscita della camera, con conseguente più piccoli lasciando l'aula in primo luogo, considerando che le più grandi cellule rimanere all'interno della camera fino a quando il tasso di controcorrente è aumentato sufficientemente per promuovere la loro uscita. Le cellule fuggire la camera di elutriazione con aumenti consecutivi nel tasso di controcorrente possono essere raccolti in frazioni specifiche e ciascuna frazione contiene cellule in sequenza crescente di dimensioni. Invece di condurre elutriazione con aumenti incrementali nel tasso di controcorrente, sequenziale diminuisce in forza centrifuga diminuendo la velocità di centrifugazione compirà lo stesso risultato. Il processo di elutriazione richiede l'ottimizzazione a seconda del tipo di cellula, buffer elutriazione impiegate e le specifiche dell'apparecchio utilizzato. Il tasso di sedimentazione delle cellule in queste condizioni è meglio descritto dalla legge di Stokes: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2r, dove SV = velocità di sedimentazione; d = diametro della particella; Ρp = densità della particella; Ρm = densità del buffer; Η = viscosità del buffer; Ω = Velocità angolare del rotore; e r = radiale posizione della particella. Così, SV è proporzionale alla densità e diametro delle cellule, e dal momento che il diametro è elevato alla seconda potenza, contribuisce più significativamente densità che è generalmente costante durante il ciclo cellulare.
Un importante vantaggio di CCE è che le cellule non sono sottoposti a dure condizioni di trattamento chimico o privazione nutrizionale e possono essere recuperate in ottima resa essenzialmente senza scomporsi. Un requisito è che le cellule in questione subiscono un significativo aumento di diametro, di almeno il 30%, mentre attraversano il ciclo cellulare. Lo svantaggio principale è il costo della centrifuga specializzata, rotore e accessori. Tuttavia, la capacità di preparare cellule arricchite in fasi del ciclo cellulare specifico da CCE ha notevolmente facilitato ricerca ciclo cellulare negli organismi da lievito per cellule di mammifero9,10. Inoltre, i recenti progressi stanno espandendo usi alla separazione delle cellule da sano rispetto al tessuto cancerogeno, la separazione dei diversi tipi di cellule in miscugli eterogenei e per la produzione di tipi cellulari specifici per immunoterapia9.
Il nostro interesse principale è stato la comprensione del meccanismo d'azione del microtubule targeting agenti (MTA) come alcaloidi della vinca e taxani. Queste droghe sono state pensate per agire esclusivamente in mitosi, blocco mandrino microtubule funzione11,12, ma la prova recente suggerisce che possono anche rivolgersi a interfase i microtubuli13,14. Recentemente abbiamo riferito che le cellule primarie leucemia linfoblastica acuta (tutta) subiscono la morte in una fase G1 o in M di fase quando trattati con vincristina e altri MTA in un modo dipendente dal ciclo cellulare15. La capacità di separare tutte le cellule in ciclo cellulare diverse fasi di CCE è stato determinante per giungere a questa conclusione. In questo articolo, descriviamo i dettagli tecnici e offrire consigli pratici per l'applicazione di CCE per la preparazione delle primarie tutte le cellule nel ciclo cellulare diverse fasi.
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Protocol
Nota: questo protocollo è stato ottimizzato per primaria B-tutte le cellule che vanno in diametro da circa 8 µm (fase G1) a 13 µm (fasi di G2/M). Così, la velocità di centrifuga specifico e tassi di flusso della pompa non siano applicabili alle celle con intervalli di dimensioni diverse. Tuttavia, del caso elutriazione parametri possono essere stimati utilizzando l'equazione di tasso di sedimentazione. Le cellule sono coltivate in un medium privo di siero definito come descritto 16 ad una densità ottima di 1-3 x 10 6 cellule/mL. Fatta eccezione per la raccolta delle frazioni che si svolge a 4 ° C, utilizzando tubi di raffreddamento a ghiaccio, tutte le operazioni sono condotte a temperatura ambiente e la centrifuga impostata a 20 ° C con un massimo di 24 ° C.
1. preparazione di elutriazione Buffer e materiali
- al fine di ridurre l'aggregazione delle cellule, preparare un tampone di elutriazione di Hank ' s equilibrata soluzione salina (HBSS) con rosso fenolo completato con 2% di siero bovino fetale ( FBS), per proteggere le cellule dallo stress meccanico durante il processo di elutriazione e 1,6 g/L di sale 2-naphthol-6,8-disolfonico acido dipotassico (NDA), che rende l'esterno cella carico negativamente e riduce l'agglutinamento.
- Aggiungere 1,6 g di NDA una provetta conica da 50 mL.
- In condizioni sterili, aggiungere 35 mL di HBSS da una bottiglia da 1 litro per la provetta conica da 50 mL contenente NDA. Agitare la provetta fino a sciolta la NDA.
- Usando un filtro di 0,2 µm, trasferire la NDA disciolta in una nuova provetta conica sterile 50 mL. Quindi aggiungere la NDA per il restante 1 L di HBSS.
- Infine, aggiungere mL 21 FBS HBSS per ottenere una concentrazione finale del 2% (v/v).
Nota: Il buffer di elutriazione può essere preparato e conservato a 4 ° C fino alla data di scadenza sull'HBSS, o fino a quando c'è un grande cambiamento del pH, come indicato da un ingiallimento del colorante indicatore.
- Etichetta 50 mL provette coniche per la raccolta delle frazioni affinché ci sono tubi etichettati lavare le frazioni di (W1 e W2), 1-20 (F1 - F20) 1 e 2 e STOP.
- Pre-chill questi tubi sul ghiaccio prima di raccogliere le frazioni.
2. Assemblaggio del sistema di classificazione mediante veicolo fluido
- in primo luogo, installare l'assembly di strobo nella centrifuga in modo che il cavo di alimentazione è alimentato dalla camera attraverso la porta sul lato sinistro. Assicurarsi che la lampada flash strobo sia nella parte anteriore della camera di modo che si allinei con la finestra di visualizzazione quando la centrifuga viene chiuso.
- Fissare il gruppo al posto di prima due viti Phillips a testa nei due fori nella parte superiore di ogni staffa e poi stringendo le viti nella parte inferiore di ogni staffa.
- Collegare il cavo di alimentazione alla porta di alimentazione dello stroboscopio sul retro della centrifuga.
- Successivamente, impostare il rotore verso il basso sul mozzo disco centrifuga e fissare con una chiave esagonale da impugnatura a T.
Nota: Se la centrifuga non è necessario per gli scopi non-elutriazione, l'Assemblea di strobo e il rotore può essere conservati in centrifuga tra le esecuzioni. - Dopo aver fissato il rotore, è collocare il gruppo di sgancio rapido contenente elutriazione sezione, contrappeso, rotanti assieme tenuta e una piastra di montaggio nel rotore.
- Spingere verso il basso in modo uniforme con una mano sulla camera elutriazione e l'altra mano sul contrappeso fino a quando i bulloni nel rotore a scatto nei fori sulla piastra di montaggio.
- Infine, collegare il cavo di ancoraggio posizionando il pin su un lato del cavo nel foro il gruppo rotante della tenuta e protezione eyehole su altro lato del cavo con una delle viti Phillips a testa (menzionate al punto 2.1.1) sulla staffa sul lato sinistro o Camera di f.
- Successivamente, montare il sistema di flusso utilizzando una pompa a velocità variabile e tubazione al buffer di pompa nella classificazione mediante veicolo fluido dell'alloggiamento e raccogliere buffer come fluisce nella camera di classificazione mediante veicolo fluido.
- Inserire il tubo di ingresso taglia 16 provenienti dalla pompa a velocità variabile tramite la porta nella parte superiore sinistra della camera della centrifuga in modo che entra nella camera.
- Collegare un raccordo all'estremità libera del tubo di ingresso e inserire il raccordo nel foro di ingresso sul lato di assieme della tenuta rotante.
- Inserisci la dimensione 16 tubi attraverso la porta di uscita e collegarlo al tubo di trasferimento nella parte superiore della parte rotante assieme della tenuta.
Nota: Il sistema di flusso può anche rimanere montato tra le esecuzioni di elutriazione.
- Infine, attivare la centrifuga e impostare le specifiche necessarie per l'esperimento.
- Cambia il rotore ID.
- Se la centrifuga richiede un input di tempo, impostare per 2 h, che è più che sufficiente per completare un elutriazione eseguire.
- Impostare la temperatura a 20 ° C con una temperatura max di 24 ° C.
- Impostare l'accelerazione per max e la decelerazione per lento.
- Infine, impostare la velocità a 867 x g.
3. Innesco del sistema elutriazione
- in primo luogo al fine di sterilizzare il sistema di classificazione mediante veicolo fluido, inserire il tubo serbatoio in una bottiglia di plastica da 500 mL contenente candeggina al 5% e inserire il tubo di uscita in una bottiglia di rifiuti in plastica vuota di 1 L.
- Accendere la pompa e impostare la velocità di 25 mL/min e lasciare che la candeggina 5% a scorrere tutto il modo attraverso il sistema di classificazione mediante veicolo fluido fino a quando non viene pompato fuori dal tubo di uscita nella bottiglia degli scarti.
- Attivare la centrifuga e lasciare che entri al massimo indicato velocità (867 x g) al fine di liberare le bolle e contropressione.
- Blocca la centrifuga. Una volta che il rotore ha smesso di ruotare, aprire il coperchio e ispezionare la camera non vi siano perdite.
- Se non vi siano perdite, lasciate che la soluzione di candeggina flusso attraverso il sistema per almeno 5 min
- Successivamente, lavare il sistema con acqua in autoclave come candeggina può portare alla formazione di precipitati dal buffer elutriazione che può portare a agglutinamento delle cellule, come pure causare danni alle cellule.
- Posto il tubo serbatoio in una bottiglia da 1 litro di sterilizzato nell'autoclave acqua e permettono di irrigare attraverso per almeno 10 min.
- Dopo il lavaggio con acqua, introdurre il tampone elutriazione nel sistema. Utilizzare una bottiglia di vetro di 150 mL che è stato sterilizzato nell'autoclave per creare un serbatoio per il buffer di elutriazione e cellule.
- Aggiungere 100 mL di tampone di elutriazione alla bottiglia e spostare il serbatoio della tubazione per la bottiglia di vetro modo che il tubo sia nella parte inferiore.
- Avviare la centrifuga e permettere al tampone di fluire attraverso il sistema per svuotare l'acqua.
- Una volta la bottiglia serbatoio è quasi vuota, e l'acqua viene scaricata completamente fuori dal sistema, spostare l'uscita della tubazione dalla bottiglia degli scarti al serbatoio affinché il buffer viene riciclato attraverso il sistema.
- Infine, regolare la finestra di visualizzazione in modo che la camera di elutriazione può essere visto alla velocità corrente.
- Stampa la strobo lampada pulsante all'esterno della centrifuga di alimentazione così che la lampada si accende. Girare il k elutriazioneNob anche sul lato esterno della centrifuga tutta la strada a sinistra.
- Mentre guardando attraverso la finestra di visualizzazione, lentamente girare la manopola verso destra fino a quando la camera di elutriazione entra in vista e la luce stroboscopica è nel tempo con la rotazione del rotore.
Nota: Il sistema di classificazione mediante veicolo fluido può essere lasciato in questo stato fino a quando le cellule sono prepped.
4. Preparazione del campione delle cellule
- conteggio celle e aliquota 300 a 400 milioni in crescita medio in diverse provette coniche da 50 mL. Rotazione verso il basso le cellule a 1210 x g per 3 min.
- Aspirato fuori crescita media e risospendere le cellule in 25 mL di tampone di elutriazione pipettando su e giù delicatamente.
- Al fine di ridurre la cella che ragruppa, cellule passa due volte attraverso un 25 ago del manometro.
- Usando una siringa da 10 mL redigere le celle e quindi allegare 25 ago di calibro e passare le cellule attraverso l'interno muro di una provetta conica sterile 50 mL. Ripetere l'operazione finché tutti i 25 mL sono passati attraverso l'ago.
- Ottenere un nuovo ago e siringa e ripetere il processo sopra una volta.
Attenzione: Aghi siringhe devono essere posti in contenitori di sharps.
Nota: È fondamentale che le cellule sono spinto attraverso l'ago immediatamente prima di introdurli al sistema di classificazione mediante veicolo fluido a tenere il cellulare agglutinamento al minimo.
5. Introduzione del campione di cellule nel sistema di classificazione mediante veicolo fluido e raccolta delle frazioni
- introdurre il campione di cellule nel sistema elutriazione versando il campione di cellule nel serbatoio che ha il restante buffer elutriazione riciclaggio attraverso .
- Lasciare che le celle entrare nel sistema e raggiungere l'equilibrio all'interno della camera di elutriazione.
Nota: Questo processo richiederà circa 5 minuti e progresso può essere rintracciato guardando le cellule come essi entrano nella camera attraverso la finestra di visualizzazione. Per garantire che tutte le celle sono in aula, prendere una goccia di eluente, posto su un vetrino e mostra sotto un microscopio. Se il campione è libero di cellule intatte, questo conferma la loro conservazione nella camera.
- Lasciare che le celle entrare nel sistema e raggiungere l'equilibrio all'interno della camera di elutriazione.
- Iniziare la raccolta delle frazioni una volta tutte le celle siano entrati in camera e c'è un confine distinto nella parte più larga della camera in cui le cellule sono in equilibrio.
- Begin spostando il tubo di uscita per la provetta conica da 50 mL con l'etichetta W1. Raccogliere 50 mL di tampone di elutriazione per questa frazione, assicurandosi di tenere d'occhio il serbatoio e riempire con buffer elutriazione quando necessario.
Nota: Al fine di assicurarsi che tutte le celle sono entrati nel sistema, lasciare che il serbatoio di serbatoio di diventare quasi vuoto prima di riempimento del serbatoio la prima volta. Dopo la prima ricarica non sarà necessario attendere il serbatoio a diventare quasi vuoto. Inoltre, non si deve mai lasciare il serbatoio diventano vuote come questo creerà bolle e contropressione nel sistema. - Una volta 50 mL sono stati raccolti per W1, contemporaneamente modificare la velocità a 821 x g e spostare il tubo di uscita a tubo conico etichettato W2 e raccogliere 50 mL più a questa velocità.
- Continuare a cambiare la velocità e raccogliendo le frazioni come indicato nella tabella 1. Assicurarsi che vi sia media nel serbatoio serbatoio e mantenere le provette coniche su ghiaccio a tutti i tempi. Infine, regolare la finestra di visualizzazione girando lentamente la manopola verso destra man mano che la velocità diminuisce.
- Una volta 20 tutte le frazioni sono stati raccolte, blocca la centrifuga e raccogliere 50 mL in tubo conico etichettato STOP.
- Begin spostando il tubo di uscita per la provetta conica da 50 mL con l'etichetta W1. Raccogliere 50 mL di tampone di elutriazione per questa frazione, assicurandosi di tenere d'occhio il serbatoio e riempire con buffer elutriazione quando necessario.
6. Flushing del sistema elutriazione
- dopo la centrifuga ha smesso completamente a filo il sistema inserendo il tubo serbatoio in bottiglia 1L di acqua in autoclave e il tubo di uscita nella bottiglia dei rifiuti.
- Girare la velocità della pompa fino a 50 mL/min e permettere all'acqua di fluire attraverso il sistema fino a quando non si è esaurita.
- Girare la pompa, rimuovere il tubo di ingresso e di uscita dall'assemblaggio rapido e sfilare la spina del cavo di ancoraggio.
- Rimuovere l'assembly di sgancio rapido dal rotore.
Nota: A seconda di ciò che la centrifuga verrà utilizzata per, il sistema di classificazione mediante veicolo fluido può ora essere lasciato come è. In caso contrario, tutta l'Assemblea può essere preso giù nell'ordine opposto come descritto sopra. La camera di classificazione mediante veicolo fluido possa essere rimossi dall'assemblaggio rapido e pulita tra esecuzioni utilizzando un bagno d'acqua ad ultrasuoni. Questo rimuove residui e contaminanti dalla parete della camera che può influire negativamente sulle successive esecuzioni.
- Rimuovere l'assembly di sgancio rapido dal rotore.
7. Analisi delle frazioni e raccolta del G1 o G2/M piscine.
Nota: al fine di dimostrare l'efficacia di elutriazione, ogni frazione è analizzata per il conteggio delle cellule, diametro delle cellule e del DNA contenuto, e vengono creati pool di cellule in fase G1 o G2/M per le analisi di immunoblot, come descritto Risultati di rappresentante. Questa sezione del protocollo descriverà come creare queste piscine e prepararli per uso sperimentale.
- Spin ogni frazione a 2000 x g per 5 min a 4 ° C e aspirato tampone elutriazione.
- Frazioni di combinare insieme per ottenere una piscina di fasi di G2/M e una piscina di fase G1.
- Per il G1 fase piscina, risospendere le frazioni che sono stati raccolti nella gamma di velocità di 788 x g-661 x g (F1 - F5) in un totale di 1 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) e trasferirlo in una provetta conica da 15 mL. Per il pool di fasi di G2/M, risospendere le frazioni che sono stati raccolti nella gamma di velocità di 387 x g e 333 x g (F17 - F20).
- Rotazione verso il basso le cellule a 2000 x g per 5 min a 4 ° C e aspirato di PBS.
- Risospendere le cellule in 10 mL di coltura e prendere un conteggio delle cellule.
- Prendere un'aliquota da ogni girone da analizzare per il DNA contenuto tramite ioduro di propidio e flusso cytometric analisi 15.
Nota: Il resto di ogni pool può essere utilizzato per ulteriori esperimenti.
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Representative Results
Primaria tutte le celle (3-4 x 108) sono stati sottoposti a classificazione mediante veicolo fluido centrifuga e raccolti in due frazioni di lavaggio e venti frazioni principali, come descritto nel protocollo. La tabella 1 Mostra dati rappresentativi dove vengono presentato il numero totale di cellule in ogni frazione, nonché la corrispondente velocità del rotore. Nel complesso il rendimento era tipicamente oltre 80%. Misura del diametro delle cellule in singole frazioni ha confermato tale diametro cellulare aumentato con l'avanzare dell'elutriazione (Figura 2). Questi risultati rappresentano medie delle due determinazioni indipendenti e riflettono l'alto grado di riproducibilità dei dati. Le frazioni sono stati successivamente sottoposti a ioduro di propidio e flusso cytometry per determinare il contenuto di DNA (Figura 3). Prime frazioni (F1 - F5) conteneva quasi esclusivamente di cellule con contenuto di DNA di 2N che rappresenta la fase G1. Una miscela delle cellule in fase G1 e fase S è stata osservata in frazioni intermedie (F6 - F9) e cellule con contenuto di DNA 4N sono stati osservati a partire in F10. Le frazioni successive ha avuto principalmente cellule con contenuto di DNA 4N che rappresentano fasi di G2/M. Questi dati insieme ai risultati della Figura 2 hanno confermato una relazione tra dimensioni della cella e fase del ciclo cellulare.
Basato su questi risultati, frazioni F1 - F5 sono state combinate per creare un pool di cellule in fase G1 e frazioni F17 - F20 sono state combinate per creare un pool di cellule in fase G2/M. La proporzione di cellule con contenuto di DNA di 2N in piscina fase G1 era tipicamente 99%, e la proporzione di cellule con contenuto di DNA 4N in G2/M piscina era tipicamente 85%, come determinato da ioduro di propidio e citometria a flusso. Condizioni asincrona, 60-70% di primario di tutte le cellule sono in fase G1 e 15-20% sono in G2/M fasi15, quindi i valori ottenuti dopo elutriazione riflettono elevati livelli di arricchimento. Per autenticare ulteriormente le due piscine rispetto alla fase del ciclo cellulare, estratti da ciascuno sono stati sottoposti a immunoblotting con indicatori delle fasi G1 o G2/M. In primo luogo, abbiamo utilizzato un anticorpo di fosfo-specifici che riconosce la proteina del retinoblastoma (Rb) fosforilata su Ser-807 o Ser-811, poiché è ormai assodato che Rb diventa sempre più fosforilata come cellule avanzare attraverso il ciclo cellulare17 . Come illustrato nella Figura 4, livelli di phospho-Rb erano molto più alti nelle cellule in G2/M piscina contro la piscina di fase G1, coerenza con le aspettative. Abbiamo sondato anche per cyclin B1, che è più altamente espresso in cellule di fase G2/M, e per la ciclina D1, che è più altamente espressa in G1 fase cellule18 (Figura 4). La piscina di G2/M aveva livelli elevati molto di cyclin B1 rispetto al pool di G1, coerente con le aspettative. Ciclina D1 ha dato solo un segnale debole in queste preparazioni, ma ciononostante era rilevabile in piscina G1 e non rilevabile nel pool di G2/M. GAPDH è stato utilizzato un controllo per confermare il caricamento di proteina uguale.
Modifiche al protocollo standard sono state effettuate per valutare i loro effetti e per stabilire le condizioni per ottenere prestazioni ottimali. In primo luogo, il numero delle frazioni raccolte è stato diminuito, da una ventina standard di solo tre, utilizzando la velocità determinata dalla tabella 1 per rappresentare i punti terminali per la raccolta delle cellule nelle fasi G1, S e G2/M, come mostrato nella tabella 2. Analisi del contenuto del DNA delle frazioni F1 e F3 sono mostrati in Figura 5A. Frazione 1 ha contenuto le cellule altamente arricchite in fase G1 (95%) ed era così di purezza simile a quella ottenuta in condizioni standard (Figura 3). Tuttavia, la frazione 3, apparentemente cellule altamente arricchito in fase G2/M, ha dato una popolazione mista, con le cellule in fase G1 e S anche presenti. Cellule in G2/M rappresentano solo il 51% del totale, rispetto all'85% in condizioni standard. Questi risultati indicano che i tentativi di semplificare la procedura di riduzione del numero di frazioni compromessi campione di qualità. Successivamente, abbiamo testato l'effetto di ridurre la frazione volume, come un mezzo per ridurre il consumo di reagente. Un elutriazione standard è stato effettuato ad eccezione del fatto che sono stati raccolti 40 mL invece di frazioni di 50 mL. Le frazioni F1 e F20 sono stati analizzati per il contenuto di DNA. Come mostrato in figura 5B, frazione F1 era altamente arricchito in cellule in fase G1 (98%), simile a quella ottenuta in condizioni standard. Tuttavia, le cellule di frazione F20 contenute in tutte le tre fasi, con le cellule in fase G2/M solo che rappresentano il 64% del totale, rispetto all'85% in condizioni standard. Questi risultati indicano che anche riducendo il volume di frazione compromette la qualità del campione.
Figura 1 . Principio di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga di controcorrente.
Nota che elutriazione delle cellule può essere raggiunto aumentando il tasso di controcorrente come indicato qui o facendo diminuire la velocità del rotore. Adattato da permesso da Macmillan Publishers Ltd: [natura protocolli] (Ref 8.), copyright (2008)8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Diametro del primario tutti cellule aumenta con la frazione di elutriazione.
Il diametro medio è stato determinato per ciascuna frazione utilizzando un analizzatore di cella che registra dati da 500-4.500 singole celle per campione. I dati riportati sono media ± S.D. da due esperimenti indipendenti. Nota che le barre di errore per molti punti sono più piccoli del simbolo e sono stati omessi per chiarezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Analisi del contenuto di DNA conferma riuscita separazione primaria tutte le cellule nel ciclo cellulare diverse fasi.
10 mL di ciascuna frazione è stato risolto in 70% EtOH, macchiato in ioduro di propidio e analizzati mediante citometria a flusso, come descritto15. Propidio ioduro integrato intensità (asse x) era tramato contro il conteggio delle cellule (asse y) per determinare la parte delle cellule in ogni fase, dove il contenuto di DNA 2N indica fase G1 e 4N DNA contenuto indica cellule in fase G2 o M. I dati riportati sono da un esperimento rappresentativo ed essenziali risultati identici sono stati ottenuti in quattro ripetizioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . L'analisi di immunoblot di proteine correlate a ciclo cellulare nel poolfrazioni.
A seguito di una standard elutriazione del primario di tutte le cellule, frazioni F1 - F5 sono state combinate per creare un pool di fase G1 e frazioni F17 - F20 sono stati combinati per creare un pool di fase G2/M. Gli estratti sono stato preparato e 40 µ g/corsia sottoposto ad analisi di immunoblot, come descritto in precedenza15, con anticorpi fosfo-Rb (Ser807/811), cyclin B1, o ciclina D1, tutti utilizzati alla diluizione di 1:2,000. GAPDH (01:10, 000) è stato usato come un controllo di carico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Dati illustrativi da elutriations non ottimali.
A) effetto di diminuire il numero delle frazioni raccolte. Solo tre frazioni principali (da F1 a F3), anziché lo standard di vent'anni, ciascuna da 100 mL, sono stati raccolti, a velocità come indicato nella tabella 2. Frazioni F1 e F3 sono stati analizzati per il contenuto di DNA come in Figura 3. B) effetto di ridurre la frazione volume. Venti frazioni sono stati raccolti, alle stesse condizioni come in tabella 1, ma solo 40 mL di buffer di elutriazione anziché standard 50 mL è stato utilizzato per ciascuno. Le frazioni F1 e F20 sono stati analizzati per il contenuto di DNA come in Figura 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Frazione | Velocità (rpm) | G-Force | Totale di cellule (x 10 ^ 6) |
| W1 | 3000 | 867 x g | 17.75 |
| W2 | 2920 | 821 x g | 7.00 |
| F1 | 2860 | 788 x g | 4.60 |
| F2 | 2800 | 755 x g | 10.75 |
| F3 | 2740 | 723 x g | 15,25 |
| F4 | 2680 | 692 x g | 22.50 |
| F5 | 2620 | 661 x g | 26,75 |
| F6 | 2560 | 631 x g | 25.00 |
| F7 | 2500 | 602 x g | 22,75 |
| F8 | 2440 | 573 x g | ore 18.00 |
| F9 | 2380 | 546 x g | ore 14.00 |
| F10 | 2320 | 518 x g | 10.75 |
| F11 | 2260 | 492 x g | 7,43 |
| F12 | 2200 | 466 x g | 8,63 |
| F13 | 2140 | 441 x g | 6,63 |
| F14 | 2100 | 425 x g | 4,98 |
| F15 | 2060 | 409 x g | 3.46 |
| F16 | 2020 | 393 x g | 3.43 |
| F17 | 1980 | 378 x g | 2.63 |
| F18 | 1940 | 363 x g | 3.17 |
| F19 | 1900 | 248 x g | 2,78 |
| F20 | 1860 | 333 x g | 1.66 |
| FERMATA | 0 | 0 x g | 5,19 |
| Rendimento totale | 245.06 | ||
| Resa percentuale | 81,69 | ||
Tabella 1. Rendimento delle celle e la corrispondente velocità del rotore per ogni frazione.
Conteggio delle cellule è stato determinato utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Rendimento totale è stata determinata dalla somma delle singole frazioni contro ingresso (3 x 108 cellule). I dati sono una media dei due esperimenti rappresentante. Forza centrifuga e la corrispondente velocità del rotore sono date.
| Frazione | Velocità (rpm) | G Force |
| W1 | 3000 | 867 x g |
| W2 | 2920 | 821 x g |
| F1 | 2620 | 661 x g |
| F2 | 2020 | 393 x g |
| F3 | 1860 | 333 x g |
| Fermata | 0 | 0 x g |
Tabella 2. Parametri di velocità per elutriazione suboptimali.
Vengono mostrati le forze centrifughe e corrispondenti velocità di rotore per i lavaggi e tre frazioni raccolte in una compressa elutriazione suboptimali. Per contenuto di DNA corrispondente e testo per i dettagli, vedere Figura 5A .
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Discussion
Abbiamo descritto un metodo per ottenere primaria tutte le celle in diverse fasi del ciclo cellulare utilizzando CCE. In condizioni ottimali una popolazione essenzialmente pura di cellule in fase G1 e una popolazione altamente arricchita di cellule in fase G2/M potrebbe essere ottenuti prontamente in ottima resa, e cellule altamente arricchite in fase S possono essere ottenute anche se lo si desidera. I risultati qui presentati sono stati ottenuti utilizzando uno primario che tutta cultura (in particolare, ALL-5) ed essenzialmente identici risultati sono stati ottenuti con una coltura indipendente, tutti-215. Inoltre, tutte le altre primarie tutte le culture esaminate fino ad oggi hanno gamme di densità simili durante la crescita asincrona e saranno probabilmente eseguire allo stesso modo quando sottoposti a CCE. Nostri studi precedenti hanno dimostrato anche che altre linee cellulari di leucemia, tra cui HL60 e K562, possono essere suddiviso in fasi di ciclo cellulare diverso utilizzando CCE19,20. Fasi critiche nella procedura anche assicurare che le cellule sono mono-disperse e non ragruppata all'inizio della corsa; ottimizzazione delle condizioni di tasso e rotore velocità di controcorrente; garantire i componenti del sistema siano puliti e privi di detriti; ed evitando l'introduzione di bolle d'aria nelle linee di flusso. CCE funziona meglio con le cellule che aumentano significativamente nel formato delle cellule mentre avanzano attraverso il ciclo cellulare. Per una data popolazione di cellule in sospensione, questo può essere stabilito inizialmente e facilmente esaminando il rapporto tra il contenuto di DNA e lato a dispersione, il quest'ultimo dipende dalla dimensione della cella. Entrambi i parametri possono essere misurati simultaneamente tramite flusso cytometry dopo ioduro di propidio macchiatura, come abbiamo descritto15. Una relazione lineare tra lato a dispersione e contenuto di DNA fornisce fiducia che aumenta la dimensione delle celle con anticipo del ciclo cellulare e quindi che CCE ha il potenziale per separare le cellule basati sulla fase del ciclo cellulare.
Come abbiamo mostrato (Figura 5), deviazioni dalla procedura ottimizzata si tradurrà in qualità di campionamento compromessa, soprattutto per le cellule in fase G2/M. Tuttavia, riduzione del numero di frazioni o frazione volume non ha sensibilmente influenzato la purezza delle cellule nella fase G1 (Figura 5). Così, scorciatoie per la procedura possono essere tollerati se solo le cellule di fase G1 purificate sono necessari. Anche se CCE è prontamente assoggettabile a colture cellulari in sospensione, può anche essere applicato per le frazioni subcellulari. Ad esempio, i nuclei da cellule pre-B murino sono state con successo separati usando CCE8-size. Tipi di cellule aderenti rappresentano potenziali problemi per la loro propensione per agglutinamento e possibile adesione alle superfici della camera della tubazione e classificazione mediante veicolo fluido e così dovrebbero essere studiati con attenzione.
La limitazione principale di CCE è il costo delle attrezzature; una possibile soluzione è quello di collaborare con un laboratorio che ha l'apparecchiatura necessaria. Si noti tuttavia che, mentre il rotore è uno strumento dedicato, la centrifuga può essere utilizzata per scopi generali di centrifugazione, riducendo così i costi investiti esclusivamente in CCE. Un'altra limitazione è che la pianificazione di esperimenti è più problematica rispetto alla flessibilità di altri metodi come la sincronizzazione di inedia o chimico del siero. Elutriazione corre in genere impiega 5-6 ore, e se le cellule ottenute successivamente sono necessari per gli esperimenti a breve termine o multi-time point, questo può comportare inconvenienti di pianificazione. Il più grande vantaggio è che cellule ottenute da questo metodo sono imperturbabile e possono essere coltivate per molti giorni senza alcun segno di sofferenza, come abbiamo mostrato15. Questo contrasta con le cellule sincronizzate con mezzi chimici che possono harbor danno farmaco-indotto. Un recente studio, usando le cellule NB4 derivate dalla leucemia mieloide acuta blasti, confrontati direttamente CCE e altri metodi, compreso l'arresto con inedia del siero, hydroxyurea o il trattamento con un inibitore cyclin-dipendente della chinasi 1, RO-330621. Elutriated cellule e cellule arrestate alle fasi comparabili è sembrati simile per quanto riguarda il contenuto di DNA e l'espressione di cyclin. Tuttavia, quando è stato esaminato il proteoma, grandi cambiamenti in abbondanza di proteine, in particolare legati allo stress e arresto specifiche proteine, sono stati osservati nelle cellule arrestate e non nelle cellule elutriated alle posizioni di dimensione equivalente cella. Questi risultati evidenziare l'utilità di CCE per la produzione di cellule senza scomporsi e sottolineare che deve essere usata cautela quando interpretando i dati dalle celle sincronizzati con altri mezzi.
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Disclosures
Anisha Kothari è attualmente presso il dipartimento di biologia cellulare e molecolare presso St. Jude Children Research Hospital.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH CA109821 (per TCC). Ringraziamo Beckman Coulter per generosamente fornendo fondi per coprire le spese di pubblicazione e per l'assistenza tecnica nella messa a punto e funzionamento del sistema di classificazione mediante veicolo fluido. Ringraziamo il Dr. Fred Falkenburg per la fornitura iniziale primario di tutte le culture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
