Summary
Этот протокол описывает полный decellularization человека миокарда при сохранении его компонентов внеклеточного матрикса. Дальнейшая обработка внеклеточная матрица результатов в производстве микрочастиц и цитопротективного самостоятельной сборки гидрогеля.
Abstract
Бесклеточной внеклеточного матрикса препараты являются полезными для изучения взаимодействия клеток матрица и облегчения применения терапии регенерации клеток. Ряд коммерческих внеклеточного матрикса продукты доступны как гидрогели или мембраны, но они не обладают биологической активности тканей конкретных. Потому что decellularization перфузии обычно не возможно с человеческой ткани сердца, мы разработали процесс погружения 3-шаг decellularization. Человека миокарда ломтиками, приобретенных во время операции сначала лечатся буфера lysis бесплатный стиральный порошок hyperosmolar, следуют инкубации с ионной стиральный порошок, лаурилсульфат натрия, и процесс завершится, используя встроенные DNase деятельность плода бычьим сывороточным. Этот метод приводит к листы клеток сердечной внеклеточной матрицы с во многом сохранились фиброзной ткани архитектуры и биополимерные состав, были продемонстрированы предоставлять конкретные экологические сигналы сердца клеточных популяций и плюрипотентных стволовых клетки. Сердца внеклеточного матрикса листов может затем быть далее перерабатывается в тонкодисперсный порошок без дальнейшей химической модификации, или, через краткосрочные пепсин пищеварение, в самостоятельной сборки сердца внеклеточного матрикса гидрогеля с консервированные биологическую.
Introduction
Внеклеточная матрица (ECM) обеспечивает не только структурной поддержки, но также имеет важное значение для биологических клеток и тканей функции1. В самом сердце ECM участвует в регуляции патофизиологические реакции например фиброз, воспаление, ангиогенез, cardiomyocyte сократительной функции и жизнеспособности и резидентов прогениторных клеток судьбы. В дополнение к его основных компонентов - волокнистые гликопротеинов, гликозаминогликанов и протеогликаны - он содержит целый ряд секретируемые факторов роста и цитокинов, мембранные везикулы, содержащие нуклеиновых кислот и белков2,3.
Недавно стало ясно, что бесклеточной ECM препараты не только бесценным для изучения взаимодействия клеток матрицы, но и для потенциальных терапевтических клеток-приложений на основе. В настоящее время широко признается важность обеспечения надлежащих условий для терапевтического клеточных продуктов или инженерии тканей. Были предприняты попытки объединить клеточных суспензий или активных соединений с определенными Биополимерное гидрогели4,5,6 или коктейлей белка выделяется клетками мышиных саркома (т.е. Matrigel, Geltrex) 7. Однако, бывший имеют ограниченные биологическую, последние являются проблематичными в процессах GMP-сорт, и оба не хватает биологическую ткань конкретных сердца ECM (СКВ)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization миокарда ранее выполнялись перфузии всего сердца через коронарные сосудистую14,15. Хотя это возможно в сердцах животных, нетронутым человеческие сердца редко доступны. Таким образом процесс погружения, который позволяет для обработки образцов тканей, полученных в операционной комнате было оказано. Наши «3-шаг» протокол содержит 3 отдельных инкубации шаги, а именно лизиса, солюбилизация и удаления ДНК. Он дает человека миокарда ECM с во многом сохранились белка и Глюкозаминогликан состав16,17. Эти фрагменты СКВ позволяют в vitro исследования взаимодействий клеток матрица, но плохо подходят для потенциальных человека масштабе терапевтического применения. Производственный процесс был затем продлен до производства лиофилизированный СКВ микрочастицы или СКВ гидрогеля18.
Этот протокол позволяет для decellularization человека миокарда, полученные из хирургической образцов, сохраняя основные компоненты и их биологическая активность миокарда внеклеточного матрикса (ECM). Этот протокол рекомендуется, когда человеческие сердца ECM с сохранившихся биологическую ткань конкретных требуется для экспериментальных исследований взаимодействия клеток матрицы, или когда подходящей среды необходима для подходов, основанных на клетки миокарда регенерации. В принципе возможна также адаптировать этот протокол в условиях GMP-класса, так что использование обработанных СКВ должно быть возможным в будущем терапевтического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол исследования соответствует этические принципы, изложенные в Хельсинкской декларации и был одобрен Комитетом Совета и этики институциональный обзор Charité медицинского университета. Все пациенты условии написано, информированное согласие на использование ткани сердца для экспериментальных исследований.
1. Подготовка человека миокарда для разрезания
- Получения миокарда левого желудочка (размер варьируется в зависимости от вида операции) непосредственно из операционной комнате и транспорт в холодной PBS в стерильный контейнер.
- Удалите все жировой ткани с стерильным скальпель с лезвием № 10 в стерильных условиях.
- Нарезать кубиками примерно 1 x 1 x 1 см с помощью скальпеля миокарда.
- Поместите кубики в стерильных 50 мл трубки.
Примечание: Чтобы приостановить, выполните шаг 1.5, в противном случае продолжите с шага 2.2. Избегайте повторного замораживания оттаивания циклов для предотвращения деградации белков и снижение качества ткани. - Хранить пробирки, содержащие кубов в-80 ° C. Ткани могут храниться в течение нескольких месяцев.
2. Вырезание из кубов, миокарде ломтиками
- Возьмите трубки, содержащий подготовленный кубов из морозильника.
- Транспорт на льду для криостата.
- Выберите объект и камеры температуру до-15 ° C.
Примечание: Нужной температуры имеет решающее значение для обеспечения идеальной секционирование. - Холод пустой 50 мл трубки и марок в камере или на сухой лед.
- Добавьте слой (примерно 0,5 - 1,0 мл) cryosection среды на холодной штамп и пусть он заморозить до тех пор, пока это белые и твердые.
- Добавить второй слой cryosection среды и место в миокарде куб на этот слой.
- Убедитесь, что средство cryosection и миокарде полностью заморожены, прежде чем продолжить.
Примечание: Когда среднего образца и cryosection не заморожен секционирование будет нарушением. Полностью заморожены cryosection среднего превращается из жидкости и прозрачной твердых, белый и непрозрачные. Миокарда кубики нужно по крайней мере 30 минут до 1 h полностью заморозить, если продолжение сразу от шага 1.4. Когда ткань заморожен должен не деформируются, когда коснулся/обрабатываются с помощью пинцета. - Вставьте штамп с замороженных миокарда в держатель и затяните все винты.
- Отделка поверхности ткани, пока не получается даже секущей поверхности.
- Задайте, секционирование толщиной до 300 мкм.
- Раздел замороженных миокарда с автоматическое секционирование. Это гарантирует равномерное сократить разделы. Приблизительно 30-40 секций можно нарезанные из одного куба.
- Поместите каждый ломтик после разрезания слабо в помощи 50 мл трубки.
Примечание: Не нажимайте ломтиками или пакет плотно. Около 40 фрагментов может поместиться в одну трубу. - Закройте заполненных трубок и место на льду.
Примечание: Чтобы приостановить идти на шаг 2.14, в противном случае продолжите с шага 3.2. - Хранить фрагменты миокарда при температуре-80 ° C. Фрагменты могут храниться в течение нескольких месяцев.
3. decellularization кусочков миокарда человека
- Возьмите необходимое количество 50 мл пробирки, содержащие разделы миокарда из морозильника-80 ° C и транспорта на льду.
- Передача замороженных секции всех 50 мл трубки от шаг 3.1 в один стакан стерильные. Около 40 фрагментов добавляются в стакан за Тюбик 50 мл. Стакан должно быть три раза объем 50 мл пробирок; например, для decellularization один тюбик 50 мл используйте 150 мл стакан.
- Добавьте 50 мл раствора лизис (10 мм трис, 0.1% w/v ЭДТА, рН 7,4 в H2O) за 50 мл трубки с ломтиками миокарда.
- Встряхните миокарда ломтики в стерильных стакан на 100-150 об/мин, непрерывно в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Процедите жидкость с кусочками ткани через стрейнер грубый. Передать новым стерильным стакан ткани кусочки с тупыми пинцет. Добавьте 50 мл 0,5% SDS в PBS на первоначальный 50 мл трубки кусочков миокарда (например, использование 100 мл SDS решение, когда два 50 мл трубки разделы миокарда в настоящее время decellularized).
- Встряхните непрерывно в течение 6 часов при 100-150 об/мин при комнатной температуре.
- Процедите жидкость с кусочками ткани через стрейнер грубый. Передать новым стерильным стакан ткани кусочки с тупыми пинцет и мыть 3 раза с 50 мл PBS 10 мин при встряхивании в 150 об/мин. Далее, мыть на ночь в PBS с 1% пенициллина/стрептомицина и 1% Нистатин (PBS-P/S-N) в 100-150 об/мин и 4 ° C при встряхивании.
Примечание: Тщательного мытья важно, чтобы полностью удалить любые остаточные SDS. Оставшиеся следы SDS являются токсичными, когда ECM используется в сочетании с ячейками. - Удаление моющий раствор и добавить 25 мл разогретую FBS (37 ° C) с 1% пенициллина/стрептомицина и 1% Нистатин decellularized ломтики на первоначальный 50 мл трубки кусочков миокарда.
- Инкубируйте 3 ч при 37 ° C. В этом шаге любые оставшиеся ДНК удаляется из матрицы благодаря внутренней DNase деятельности FBS.
- Ломтики передать новым стерильным стакан и мыть 3 раза с 50 мл PBS 10 мин при встряхивании в 150 об/мин.
Примечание: ECM фрагменты могут храниться в PBS-P/S-N на 4 ° C на несколько дней. Однако рекомендуется приступить немедленно.
4. обработка Decellularized СКВ в порошок
- Место ECM Ломтики слабо в новой пластинкой стерильным 6-хорошо. Заморозить ECM-80 ° c и lyophilize за 2 дня в лиофилизатор.
Примечание: более чем один срез могут быть размещены в колодец. Устройте ломтики для полностью покрывают поверхность хорошо. Перекрывающиеся фрагменты не влияет на последующие пульверизация успех. - Для измельчения фрагментов ECM использование конкретных фрезерования трубки (см. Таблицу материалы) содержащих 1,4 мм керамический бисер. Свободно заполните трубы с лиофилизированные ECM с помощью стерильных тупым пинцета. Для получения оптимальных результатов рекомендуется общий вес ECM между 10-20 мг.
Примечание: Если ECM слишком плотно упакованы в трубки фрезы пульверизация процесс будет отрицательно сказываться. - Трубы оснастки замораживание в жидком азоте.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: жидкого азота является крайне низкая температура, носить соответствующую личной защиты. -
Вставьте замороженные трубы в фрезерный станок и распылить ECM.
- Установить продолжительность 30 s и максимальная скорость и запустить устройство.
- После окончания, взять трубы и оснастки заморозить снова в жидком азоте.
- Повторите пять раз.
- Вымойте микрочастицы из трубок, добавив 1 мл ddH2O на трубу и поколебать или вихревые для полного растворяющие. Фильтр гетерогенных раствора через сетку 200 мкм в 50 мл трубки.
- Замораживание труб в-80 ° C или жидкого азота.
- Замените крышку стандартной трубки 0,22 мкм фильтром. Этот фильтр крышки предотвращает течет из трубки порошок, но позволяет циркуляции воздуха для испарения воды.
- Вставьте трубки в лиофилизатор и lyophilize снова, чтобы удалить воду из шаг (шаг 4.5)
Примечание: Лиофилизации на этот шаг может занять до 3 дней. - Хранить порошок-80 ° c до дальнейшей обработки или продолжить с шага 5.1.
5. фермент основе гомогенизаторы СКВ микро-частицы
- Растворите свинину пепсин в 0,01 М HCl (рН 2.0) до концентрации 1 мг/мл. Место на роторный шейкер при комнатной температуре до тех пор, пока он полностью не растворится.
- Растворите лиофилизированный порошок человека ECM (шаг 4.8) в решении пепсин в конечной концентрации 10 мг/мл. Тщательно перемешать через закупорить. Общий объем зависит от суммы необходимо решение ECM. Например Растворите 10 мг порошка ECM в 1 мл раствора пепсина.
Примечание: Растворение частиц может поддерживаться через нежный vortexing (1000-1500 об/мин). Оставшиеся куски микрочастиц негативно повлияет на пищеварение. - Решение передать 2 мл пробирок с объемом 1 мл на трубу.
- Место труб в шейкере трубки для 48 ч при 27 ° C и 1200 об/мин.
- Возьмите трубы из шейкер и место на льду или предварительно охлажденным трубодержатель.
- Смесь 1/9 объема решение ECM холодной 10 x PBS (рН 7,4) с 1/10 объема решение ECM холода 0,1 М NaOH в помощи трубки и место на льду. Эта смесь будет нейтрализовать переваривается решение ECM и необратимо Инактивирует пепсин.
- Добавьте решение ECM для нейтрализации смеси и перемешать тщательно через закупорить или vortexing.
- Установите ECM желаемой концентрации с ПБС (рН 7,4). РН раствора может быть проверена с рН бумагой.
Примечание: Пример расчета для 10 мл переваривается решение ECM:
Добавьте свинину пепсин 10 мг в 10 мл HCl (рН 2.0).
Добавьте порошок 100 мг ECM пепсин решение.
Примечание: Пример расчета для нейтрализации 10 мл переваривается решение ECM и установка с концентрацией до 8 мг/мл:
Volокончательный = cначать x Vol,Начало / cокончательный = 10 мг / мл х 10 мл / 8 мг/мл = 12,5 мл
Том10xPBS = Volначать / 9 = 1/9 от PBS 10 x 10 = 1,11 мл
VolNaOH = Volначать / 10 = 1/10 от 10 мл = 1 мл
Том1xPBS = Volокончательный - Volстарт - Vol10xPBS - VolNaOH = 12,5 мл - 10 мл-.11-1 мл = 0.39 мл
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол 3-шаг для decellularization миокарда человека здесь представлены результаты в почти полное удаление клеточным материалом, сохраняя основные компоненты ECM и фибриллярного структуры ECM. После decellularization брутто удаление клеток из ткани свидетельствует изменение цвета (рис. 1A). Гистологический анализ с H & E и Masson Trichrome пятна показали полное отсутствие остаточного нетронутым клеток (рис. 1B). Количественных анализов для отдельных компонентов ECM показало более полного удаления ДНК и лучшей сохранности всего коллагена, эластина и гликозаминогликанов, как по сравнению с decellularization SDS только (рисунок 2A). Функциональные доказательств биологической активности СКВ показано на рисунке 2B. Здесь, RT-PCR был использован для количественного определения выражения cardiomyocyte структурных белков (Myh6, Tnnt2), рано (Mef2c, Nkx2.5) и поздний (Gata4) cardiomyogenic транскрипционных факторов и эндотелиальных клеток поверхности маркерных генов (фон Willibrand фактор (vWF), VE-cadherin) в мышиных ESC, происходят спонтанные дифференциации. По сравнению с немелованной культуры блюдо поверхности и покрытия Matrigel-ECM, очевидно, что контакт с СКВ диски плюрипотентных стволовых клеток предпочтительно к cardiomyocyte как фенотип.
Лиофилизированные ломтики ECM может быть дополнительно обработаны в микрочастиц без использования ферментативной или химические реагенты. Механическая шлифовка или распыление с помощью подходящих комплектов для производства микрочастиц с одинакового размера (рис. 3A). Масс-спектрометрия обзор всех узнаваемых белков, присутствующих в СКВ. Анализ онтология гена сосредоточиться на клетчатых компонентов показал, что большинство белков ECM действительно являются производными от внеклеточного пространства, с несколько остатков гемоглобина и количество преимущественно внутриклеточных белков (рис. 4). Этот шаблон может определить ткани специфические биологические функции СКВ, но эта гипотеза требует дальнейшего исследования. Краткое описание состава белков СКВ показано в Таблица 1. Обработки ECM в микрочастиц сохраняет свою биологическую активность. HL-1 клеток воздействию имитируемых «ишемическая» условий (гипоксии, глюкозы и сыворотки лишение) отображается увеличение в метаболизм клеток (рис. 3B) и уменьшение гибели клеток при культивированный на СКВ (рис. 3 c).
Ограничено на основе пепсин пищеварение СКВ порошка, основанный на измененный Протокол, разработанный для очистки коллаген19, приводит к усредненной решения ECM. Фаза контраст световой микроскопии (Рисунок 5A) снимках процесс пищеварения после 0 h и 48 ч. Этот шаг гомогенизации способствует приложений в регенеративной медицине10. Результате обработанные СКВ показано на рисунке 5B. Ниже комнатной температуре он остается жидким (Рисунок 5B, слева), но при 37 ° C он образует самостоятельной сборки гидрогеля с стабильности для наложения с клеточных суспензий, позволяя 3D культуры (представитель фотография, Рисунок 5B право, Гидрогель слоистых с питательной среды). Live/мертвые окрашивания фибробластов сердца также показывает благотворное влияние культивирования на СКВ (рис. 5 c). СКВ микрочастиц и СКВ гидрогеля Улучшено метаболической активности клеток сократительной HL1 в ишемичных условиях по сравнению с клеток в культуре стандартных (рис. 5 c, нижней правой панели).
Рисунок 1: Decellularization человеческого сердца миокарда. (A) макроскопический анализ СКВ, стерео микроскопии показывает удаление клеточного материала с протоколом 3-шаг decellularization. Это проявляется увеличением прозрачности. (B) гистология пятнать миокарда срезов до и после decellularization с он-(слева; Шкалы бар = 50 мкм) и Masson Trichrome окрашивание (справа; Шкалы бар = 200 µm) показывает успешное удаление клеток из ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: содержание и эффект фрагментов СКВ. (A) количественный биохимический анализ отдельных компонентов ECM и ДНК, сравнивая протокол 3-шаг decellularization 0,5% SDS-только decellularization. Данные выражаются как процент содержания в родной миокарда. С протоколом 3-шаг остаточное содержание ДНК была практически нулевой и значительно ниже, чем, что после того, как 9 ч инкубации с стандартный комбинированный 0,5% SDS/лизис буфера комбинации и FBS (SDS 9 h + FBS). Соответствующие биохимические анализы показали почти полное сохранение коллагена, около 20% сохранение Глюкозаминогликан контента по сравнению с родной ткани и почти 30% сохранение содержания эластина, все значительно выше, чем с Стандартный протокол ведения SDS (бары представляют среднее ± SEM). (B) выражение mRNA отдельных генов в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток дифференциации на СКВ, по сравнению с немелованной культуры блюда и Matrigel покрытием поверхности. СКВ данные нормализованы с полученными на материалы соответствующих управления (управления = 1, пунктирная линия). Большинство сердечной генов выражены значительно более высоко когда культивированный на СКВ (бары представляют среднее ± SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: внешний вид и биологическая активность микрочастиц СКВ. (A) СКВ тонкодисперсный порошок после лиофилизации. (B) метаболизм (МТС) и (C) клеток смерти (ЛДГ релиз) анализ клеток HL-1, культивируемых с СКВ или желатин. СКВ значительно снижает гибель клеток и увеличивает метаболизм. Бары представляют собой среднее ± SEM, статистической значимости, проверены односторонний дисперсионный анализ и Бонферрони. Рисунок 3B -C были изменены из Kappler и др. 18 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: состав белков микрочастиц СКВ. После масс-спектрометрии, DB строка анализа изображает ключевых компонентов СКВ, которые в основном связаны с внеклеточного пространства (GO: 0005615; красный сфер p > 0,05). Линии показывают взаимодействия протеина на основе экспериментальные биохимический данных (фиолетовый), Сопредседатель выражение данных (черный), на базе данных взаимодействий (синий) и совместно выражения (зеленый). Строка DB требует доверия: Оценка > 0,4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: обработка СКВ гидрогеля сохранить биологическая эффективность. Фаза контраст световой микроскопии снимках что ферментативного пищеварения СКВ для 48 h результаты в более гомогенизированные решения ECM; Шкалы бар = 500 мкм. ECM (A) раствор остается жидкость до комнатной температуры (B, слева) и содержит потенциал для самостоятельной сборки к гидрогеля, когда инкубировали при 37 ° C (B, право). Live/мертвые пятна сердечной фибробластов, культивируемых с и без СКВ показывает высокий Флуорексон пятнать интенсивности живых клеток; Шкалы бар = 50 мкм (C). СКВ гидрогеля увеличивает метаболической активности клеток HL1 в ишемичных условиях так же, как микрочастиц (C, нижней правой панели, изменение от Kappler и др. 18) полосы представляют собой среднее ± SEM, статистической значимости, проверены односторонний дисперсионный анализ и Бонферрони. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Описание белка |
| 5-гидрокситриптамин рецептор 7 OS = Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 Зв = 2 |
| Актин подобных белков 6B OS = Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 Зв = 1 |
| Актина, аортальный гладких мышц OS = Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 Зв = 1 |
| Сывороточного альбумина OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 Зв = 2 |
| Антитромбина-III OS = Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 Зв = 1 |
| Аполипопротеин C-III OS = Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 Зв = 1 |
| Аполипопротеин E OS = Homo sapiens GN = АРОЕ PE = 1 Зв = 1 |
| Биспиральных домена содержащих белков 47 OS = Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 Зв = 1 |
| C-типа Лектин домена член семьи 11 OS = Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 Зв = 1 |
| Хлорид внутриклеточных канал протеин 1 OS = Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 Зв = 4 |
| Коллаген alpha-2(I) цепь OS = Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 Зв = 7 |
| Дополняют C3 OS = Homo sapiens GN = C3 PE = 1 Зв = 2 |
| Коллаген alpha-2(IV) цепь OS = Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 Зв = 4 |
| ЦАМФ отзывчивым 3-как элемент привязки протеин 4 OS = Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 Зв = 1 |
| Dermatopontin OS = Homo sapiens GN = DPT PE = 2 SV = 2 |
| Фибронектин OS = Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 Зв = 4 |
| Глутатионпероксидазы 3 OS = Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 Зв = 2 |
| Гемоглобин Субблок альфа OS = Homo sapiens GN = HBA1 PE = 1 Зв = 2 |
| Гемоглобин Субблок бета OS = Homo sapiens GN = ГБД PE = 1 Зв = 2 |
| Иг Каппа цепи C регион OS = Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 Зв = 1 |
| Lumican OS = Homo sapiens GN = LUM PE = 1 Зв = 2 |
| Mimecan OS = Homo sapiens GN = OGN PE = 1 Зв = 1 |
| Nidogen-1 OS = Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 Зв = 3 |
| Pseudopodium обогащенный нетипичных киназы 1 OS = Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 Зв = 4 |
| Пигментный эпителий производный фактор OS = Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 Зв = 4 |
| Митохондриальной коэнзима A транспортер SLC25A42 OS = Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = 2 SV = 2 |
| Сыворотка амилоид P-компонент ОС = Homo sapiens GN = БТР PE = 1 Зв = 2 |
| Транскрипция инициации фактор TFIID Субблок 5 OS = Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 Зв = 3 |
| Тудор домена содержащих протеин 3 OS = Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 Зв = 1 |
| Цинковый палец Матрин тип протеина 4 OS = Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1 |
| Цинк-пальцевый белок 101 OS = Homo sapiens GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1 |
Таблица 1: Состав белков СКВ порошка определяемые масс-спектрометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При подготовке человека миокарда ECM, цель – добиться следующее: удаление соответствующих иммуногенность клеточного материала, сохранение целостности ECM и биологическую, бесплодие, нетоксичность конечного продукта, GMP-процесса совместимости, и пригодность продукта для данного приложения с точки зрения обработки. Объединив наши 3-шаг decellularization протокол с дальнейшей обработкой на микрочастицы или самостоятельной сборки гидрогеля, человеческого сердца ECM материала получается что обладает конкретным биологической активности, прост в обращении, и имеет потенциал для несколько приложений в пробирке и в естественных условиях, похож на то, что было показано для продуктов ECM от нескольких животных видов11,13,,2021.
Во время начальной обработки ткани миокарда, важно для миокарда сечения одинаковой толщины, потому что соединения продолжительность концентрации и лечения были титруют 300 мкм фрагментов. Толстые ломтики будет неполно decellularized и тонкие срезы будут страдать нежелательные разбивка компоненты ECM с потерей биологическую. Это особенно важно в отношении обращения с SDS, где токсичность может негативно сказаться на ECM свойства и клеточного анализа16. Кроме того длительное лечение ИКБ может привести к полное отсутствие фибронектин, как показано в исследовании Godier-Fournement и др. 22, хотя он сохраняется с нашими метод17. СКВ секции подходят для использования в экспериментах без дальнейшей обработки (то есть, в 3D культуры модели анализа дифференцировки клеток и клеток ECM взаимодействия, или «тканевая инженерия» сотовой заселение подходов). Использование FBS для удаления ДНК очень эффективна, но потенциально может привести к некоторых остаточных белков FBS в разделах ECM. Это может повлиять на любые FBS чувствительные анализы. Перевод в протокол клинического класса GMP должно быть возможным с использованием сертифицированных сера, однако адаптация может быть необходимым в зависимости от правил. Это может либо об отсутствии FBS остатков в ECM или модификации протокола будет необходимо заменить FBS DNase лечения. И наконец циклы повторного замораживания оттаивания тканей и ECM секции должны избегать, чтобы не допустить деградации матрицы.
При производстве СКВ гидрогеля, пепсин пищеварения является наиболее важным шагом в этом процессе. В наших первоначальных экспериментов пепсин пищеварение при pH 1 за 48 ч при 37 ° C привели к потере биологическую, который можно было бы предотвратить путем изменения инкубации до pH 2 для 48 ч при 27 oC. Кроме того Имейте в виду, что гидрогелевые производится из подвеска микрочастица лиофилизированные СКВ, не из кусочков свежей decellularized мокрой СКВ. Помимо улучшения обработки гидрогеля по сравнению с СКВ ломтиками, гидрогеля имеет то преимущество, что она может быть разбавлен, для использования в различных концентрациях, например в более высокой концентрации в сочетании с другими материалами или 3D культуры, или в более низкой концентрации для покрытия блюд культуры клеток или как добавка к питательной среды.
Этот протокол был создан как Лаборатория класс СОП для подготовки человека СКВ помочь заполнить пробелы в трансляционной регенеративной медицины, которые недавно были описаны систематические et al. 10 хотя decellularized СКВ фрагменты могут быть применены как листы на эпикардиальной поверхности больные сердца, как недавно описан Сариг et al., с свинину СКВ в мышиной модели инфаркт миокарда23, обработка в Гидрогель позволяет для более разнообразными в vivo приложений, таких как инъекции СКВ в миокарде, как показано, Singelyn и др. 13 , 24 для того, чтобы приступить к клинической переводческая деятельность, текущий протокол должны быть преобразованы в процедуры GMP-сорт. В принципе все материалы, используемые, также являются частью утвержденной медицинской устройство/ATMP производственных процессов (т.е., decellularized клапанов сердца или кровеносных сосудов), и никаких крупных препятствий должны быть предположенным. Однако информация о продолжительности безопасного хранения и отсутствие патогенов, безусловно, будет необходимо. В конечном счете необходим надежный источник большего количества свежих и стерильные сердечной ткани от доноров без сердечных заболеваний. Сердца из умерших органа доноров, которые не подходят для трансплантации здесь наиболее вероятный сценарий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Протокол исследования соответствует этические принципы, изложенные в Хельсинкской декларации. Обоснованного согласия пациентов предусмотрено использование ткани для исследовательских целей, а процесс сбора ткани был одобрен институциональных Наблюдательный Совет и Комитет по этике Шарите - этот Berlin (ΕΑ4/028/12).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
