Summary
이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.
Abstract
Acellular 기질 준비 세포-매트릭스 상호 작용을 공부 하는 데 유용 하 고 재생 세포 치료 응용 프로그램을 용이 하 게. 여러 상업 기질 제품 hydrogels 또는 막, 사용할 수 있지만 이러한 조직 관련 생물 활성을가지고 있지 않습니다. 불가능 하기 때문에 관류 decellularization 일반적으로 인간의 심장 조직으로, 우리는 3 단계 집중 decellularization 프로세스를 개발 했다. 인간의 심근 조각 수술 중 조달 먼저 세제 무료 hyperosmolar 세포의 용 해 버퍼, 이온 세제, 나트륨 라우릴 황산 염와 부 화 다음으로 취급 되 고 과정의 본질적인 DNase 활동을 이용 하 여 완료 되 면 태아 둔감 한 혈 청입니다. 이 기술은 결과 심장 세포 외 매트릭스의 셀 무료 시트에 주로 섬유 조직 아키텍처 biopolymer 구성 유지는 심장 세포 인구를 pluripotent 줄기 특정 환경 단서를 제공 하기 위해 표시 했다 셀입니다. 심장 세포 외 기질 시트 다음 추가 추가 화학 수정 없이 microparticle 분말으로 처리 하거나 수, 단기 펩 신 소화를 통해와 자가 조립 심장 세포 외 기질 히드로로 보존 bioactivity입니다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM) 뿐만 아니라 구조 지원 하지만 생물 학적 세포에 대 한 중요 및 조직 기능1을 제공 합니다. 에, ECM 등 섬유 증, 염증, 신생, cardiomyocyte 수축 기능 및 생존 능력, 주민 조상 세포 운명 pathophysiologic 응답의 규칙에 참여합니다. 그것의 기본 구성 요소-섬유 glycoproteins, 있다, proteoglycans-분 비 성장 인자, cytokines, 및 포함 하는 핵 산 및 단백질2,3막 소포를 포함 합니다.
그것은 최근에 분명 acellular ECM 준비 하지만 공부 뿐만 아니라 잠재적인 치료 셀 기반 응용 프로그램에 대 한 세포-매트릭스 상호 작용에 대 한 귀중 한 되고있다. 치료 셀 제품 또는 설계 조직에 적절 한 환경을 제공의 중요성은 이제 널리 인정 했다. 정의 된 biopolymeric hydrogels4,,56 또는 단백질 칵테일 murine 육 종 세포 (즉, Matrigel, Geltrex)에 의해 분 비 세포 현 탁 액 또는 활성 화합물을 결합 하려는 시도가 되었습니다. 그러나 7., 전 bioactivity 제한, 후자는 GMP 급 프로세스에 문제가 및 둘 다 부족 심장 ECM (cECM)8,,910, 의 조직-특정 bioactivity 11,,1213.
심근의 decellularization 이전 관상 맥 관 구조14,15통해 전체 심장의 관류에 의해 수행 되었습니다. 그러나이 동물 마음에 가능한, 그대로 인간 심 혼 거의 사용할 수 있습니다. 따라서, 수술 실에서 얻은 조직 샘플 처리에 대 한 허용 하는 집중 과정 선호 했다. 우리의 "3 단계" 프로토콜 포함 되어 있습니다 3 별도 인큐베이션 단계 즉 세포, 가용 화, 및 DNA 제거. 그것은 크게 보존된 단백질과 glycosaminoglycan 구성16,17와 인간 심근 ECM을 생성합니다. 이러한 cECM 슬라이스 체 외에서 세포-매트릭스 상호 작용의 연구에 대 한 허용 하지만 제대로 잠재적인 인간 규모 치료 응용 프로그램에 적합. 제조 프로세스는 동결 건조 된 cECM 미 또는 cECM 하이드로 겔18다음 확장 되었다.
이 프로토콜은 심근 세포 외 기질 (ECM) 및 그들의 생물 학적 활동의 주요 구성 요소를 보존 하는 수술 샘플에서 얻은 인간 심근의 decellularization에 대 한 수 있습니다. 보존된 조직-특정 bioactivity와 인간의 심장 ECM는 세포-매트릭스 상호 작용의 실험 연구에 필요한 또는 심근 재생 세포 기반 접근 방법에 대 한 적합 한 환경이 필요한 경우,이 프로토콜에 것이 좋습니다. 원칙적으로, 그것은 또한이 프로토콜 GMP 급 조건에 적응할 수 있도록 처리 된 cECM의 사용 가능한 미래에 치료 응용 해야.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
연구 프로토콜은 헬싱키의 선언에 명시 된 윤리 원칙을 준수 하 고 Charité 의과대학의 제도적 검토 보드 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 제공 하는 모든 환자, 실험 연구에 대 한 심 혼 직물의 사용에 대 한 동의 작성.
1입니다. 단면에 대 한 인간의 심근의 준비
- 왼쪽된 심 실 심근을 얻기 (크기는 수술의 종류에 따라 다릅니다) 수술 실 무 균 용기에 차가운 PBS의 교통에서 직접.
- 무 균 조건 하에서 10 번 블레이드와 살 균 메스와 모든 지방 조직을 제거 합니다.
- 약 1 x 1 x 1 cm의 메스를 사용 하 여 큐브에서 심근을 잘라.
- 살 균 50 mL 튜브에 큐브를 놓습니다.
참고: 일시 중지, 수행 단계 1.5, 그렇지 않으면 계속 단계 2.2. 단백질 저하와 조직 품질 저하를 방지 하기 위해 반복된 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오. - -80 ° c.에 큐브를 포함 하는 튜브를 저장 조직 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
2. 조각으로 심근 큐브의 단면
- 냉동 실에서 준비 큐브를 포함 하는 tube(s)를 가져가 라.
- cryostat 얼음에 전송 합니다.
- 개체와 챔버 온도-15 ° c.를 설정
참고: 적당 한 온도 완벽 한 단면을 보장 하기 위해 중요 한. - 진정 빈 50 mL 튜브와 우표 챔버 또는 드라이 아이스.
- 레이어를 추가 (약 0.5-1.0 mL) 차가운 스탬프 및 하자에 cryosection 매체의 그것 백색 이며 단단한 때까지 동결.
- Cryosection 매체의 두 번째 레이어를 추가 하 고이 계층에 심근 큐브를 놓습니다.
- Cryosection 매체와 심근 계속 하기 전에 완전 하 게 고정 되어 있는지 확인 합니다.
참고: 샘플 및 cryosection 매체 동결 되지는 구분 될 것입니다 장애인. 완전히 언된 cryosection 매체에서으로 바뀝니다 유연 하 고 투명 한 고체, 백색, 그리고 불투명. 심근 큐브 완전히 동결 단계 1.4에서에서 즉시 계속 하는 경우 h 1까지 적어도 30 분 필요 합니다. 조직 고정 면 핀셋으로 감동/처리 하지 변형 한다. - 홀더에 냉동된 심근으로 스탬프를 삽입 하 고 모든 나사를 조입니다.
- 심지어 단면 표면 얻을 때까지 조직의 표면 손질.
- 300 µ m 두께 단면 설정 합니다.
- 자동 구분 된 섹션 냉동된 심근입니다. 이 유니폼 컷된 섹션을 보장합니다. 약 30-40 섹션 한 큐브의 슬라이스 수 있다.
- Precooled 50 mL 튜브에 느슨하게 단면 후 각 슬라이스를 놓습니다.
참고: 누르지 마십시오 조각 또는 팩 단단히. 약 40 조각 1 개의 관에 들어갈 수 있습니다. - 채워진된 튜브를 닫고 얼음에.
참고: 단계에 서 일시 중지 단계 3.2 계속 2.14, 그렇지 않으면. - -80 ° c.에 게 심근 조각 슬라이스는 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
3입니다. 인간의 심근 조각 decellularization
- -80 ° C 냉장고와 얼음에 전송 심근 섹션을 포함 하는 50 mL 튜브의 필요한 수를 가져가 라.
- 한 메 마른 비 커에 단계 3.1에서에서 모든 50 mL 튜브의 냉동된 섹션을 전송. 약 40 조각은 비 커 50ml 튜브 당에 추가 됩니다. 비 커 세 번 50 mL 튜브;의 볼륨 해야 합니다. 예를 들어, decellularization 한 50 mL 튜브에 대 한 150 mL 비 커를 사용 합니다.
- 50 mL 50 mL 튜브 심근 조각 당 세포 솔루션 (10 mM Tris, 0.1 w/v %EDTA, pH 7.4 H2O)를 추가 합니다.
- 실 온에서 2 h에 대 한 지속적으로 100-150 rpm에서 메 마른 비 커에 흔들어 심근 조각.
- 거친 스 트레이너를 통해 조직의 조각으로 액체를 스트레인. 새로운 살 균 비 커에 무딘 족집게와 조직 조각을 전송 합니다. PBS에서 심근 조각 (예를 들어, 사용 100 mL SDS 솔루션 두 50 mL 튜브 심근 섹션의 decellularized 되는 때)의 초기 50 mL 튜브 당 0.5 %SDS 50 mL를 추가 합니다.
- 실 온에서 100-150 rpm에서 6 h에 대 한 지속적으로 흔들.
- 거친 스 트레이너를 통해 조직의 조각으로 액체를 스트레인. 새로운 살 균 비 커에 무딘 족집게와 조직 조각을 전송 하 고 150 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 각 50 mL PBS로 3 회 세척. 다음, 1% 페니실린/스와 1 %PBS 하룻밤 씻어 Nystatin (PBS-P/S-N) 100-150 rpm, 4 ° C 동요 하는 동안에.
참고: 철저 한 세척은 완전히 제거 하는 어떤 잔여 SDS 중요 합니다. SDS의 남은 흔적 ECM 셀과 함께에서 사용 될 때 독성이 있다. - 세척 솔루션 제거 및 추가 25 mL 1% 페니실린/스와 1 %FBS (37 ° C)를 미리 데워 Nystatin 심근 조각의 초기 50 mL 튜브 당 decellularized 조각에.
- 37 ° c.에 3 h에 대 한 품 어 이 단계에서는 모든 나머지 DNA는 FBS의 본질적인 DNase 활동으로 인해 매트릭스에서 제거 됩니다.
- 새로운 살 균 비 커에 슬라이스를 전송 하 고 150 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 각 50 mL PBS로 3 회 세척.
참고: ECM 조각은 저장할 수 있습니다 PBS-P/S-n에서 4 ° C에서 몇 일 동안. 그러나, 즉시 진행 하는 것이 좋습니다.
4. 처리 한 분말 Decellularized cECM
- 새로운 살 균 6 잘 플레이트에 느슨하게 ECM 슬라이스를 놓습니다. -80 ° C에 ECM을 고정 하 고는 lyophilizer에서 2 일 동안 lyophilize.
참고: 둘 이상의 슬라이스는 잘 당 놓일 수 있다. 우물의 표면 표지에 분할 영역을 정렬 합니다. 겹치는 슬라이스 후속 분쇄 성공에는 영향이 없습니다. - ECM 조각 분쇄에 대 한 사용 하 여 특정 밀링 ( 재료의 표참조) 포함 1.4 m m 세라믹 구슬 튜브합니다. 무딘 멸 균 핀셋을 사용 하 여 동결 건조 된 ECM으로 느슨하게 튜브를 채우십시오. 최적의 결과 대 한 10-20 밀리 그램 사이 ECM의 총 무게는 것이 좋습니다.
참고: ECM 밀링 튜브에 너무 밀접 하 게 포장 하는 경우 분쇄 과정은 부정적인 영향을. - 스냅-동결 튜브에 액체 질소.
주의:: 액체 질소는 매우 낮은 온도, 적절 한 개인 보호를 착용. -
밀링 기계에 냉동된 튜브를 삽입 하 고 ECM을 격파.
- 30의 기간 설정 s와 최대 속도 장치 시작.
- 마친 후, 튜브를 꺼내와 스냅-동결 다시 액체 질소.
- 5 회 반복 한다.
- 1 mL ddH2O 당 관 및 쉐이크 또는 완전 한 solubilizing 대 한 소용돌이 추가 하 여 튜브에서 미를 씻어. 50 mL 튜브에 200 µ m 메쉬를 통해 이기종 솔루션을 필터링 합니다.
- -80 ° C 또는 액체 질소에 튜브를 고정 합니다.
- 튜브의 표준 뚜껑을 0.22 μ m 필터 바꿉니다. 이 필터 뚜껑 튜브에서 흐르는 분말을 방지 하지만 물 증발에 대 한 공기 순환을 허용 한다.
- lyophilizer에 튜브를 삽입 하 고 다시 단계 (단계 4.5)에서 물을 제거 하 lyophilize
참고:이 단계에서 동결은 최대 3 일 걸릴 수 있습니다. - 추가 처리까지-80 ° C에서 분말을 저장 하거나 단계 5.1 계속.
5. 효소 기반 Homogenizing cECM 마이크로 입자의
- 1 mg/mL의 농도를 0.01 M HCl (pH 2.0)에 돼지 펩 신을 디졸브. 완전히 용 해 될 때까지 실 온에서 회전 통에 놓습니다.
- 10 mg/mL의 최종 농도에 펩 신 솔루션에서 동결 건조 된 인간의 ECM 분말 (단계 4.8)을 분해. Pipetting 통해 철저 하 게 혼합. 총 볼륨 필요한 ECM 솔루션의 금액에 따라 달라 집니다. 예를 들어 10mg 1 mL 펩 신 솔루션에서 ECM 분말의 분해.
참고: 입자를 녹이는 부드러운 vortexing (1000-1500 RPM)를 통해 지원 수 있습니다. 미의 덩어리를 나머지 소화에 부정적인 영향을 줍니다. - 솔루션 2 mL 튜브 튜브 당 1 mL의 볼륨을 전송.
- 48 h 27 ° C에서와 1200 rpm에 대 한 튜브 통에 튜브를 놓습니다.
- 뿌리에서 튜브를가지고 고 얼음 또는 사전 냉각된 튜브 홀더에 놓습니다.
- 믹스 1/9 ECM 솔루션의 볼륨의 콜드 10 x PBS (pH 7.4) 감기 0.1 m M의 ECM 솔루션의 볼륨의 1/10의 NaOH는 precooled와 얼음에 장소. 이 혼합 소화 ECM 솔루션을 무력화 하 고 irreversibly는 펩 신을 비활성화 합니다.
- 중립화 혼합물 및 pipetting 또는 vortexing를 통해 철저 하 게 혼합에 ECM 솔루션을 추가 합니다.
- 1 x PBS (pH 7.4)와 원하는 농도에 ECM을 설정 합니다. 솔루션의 산도 pH 종이 함께 확인할 수 있습니다.
참고: 10 mL에 대 한 예제 계산 소화 ECM 솔루션:
10 ml HCl (pH 2.0) 10mg 돼지 펩 신을 추가 합니다.
펩 신 솔루션 100 mg ECM 파우더를 추가 합니다.
참고: 10 mL를 중화에 대 한 예제 계산 소화 ECM 솔루션 및 8 mg/ml 농도 설정:
집최종 c시작 x Vol시작 = / c최종 10 mg/mL x 10 mL/8 mg/mL = = 12.5 mL
권10xPBS 권시작 = / 9 = 1/9 10 mL = 1.11 10 x PBS에서
집NaOH = 집시작 / 10 = 1/10 10 mL = 1 mL에서
권1xPBS 권최종 -집시작 -집10xPBS -집NaOH = = 12.5 mL-10 mL-.11 1 mL = 0.39 mL
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
인간의 심근의 decellularization에 대 한 3 단계 프로토콜 여기 키 ECM 구성 요소와 ECM의 원 구조를 유지 하면서 세포 소재의 가까운 완전 한 제거 결과 제시. Decellularization, 후 조직에서 세포의 총 제거 색깔 (그림 1A)에 있는 변화에 의해 분명 하다. H & E와 Masson Trichrome 얼룩으로 조직학 분석 잔여 그대로 셀 (그림 1B)의 완전 한 부재를 공개 했다. ECM의 개별 구성 요소에 대 한 양적 분석 SDS 혼자 (그림 2A)에 의해 decellularization에 비해 서 더 완전 한 DNA 제거 및 총 콜라겐, 엘라 스 틴, 및 있다의 더 나은 보존을 공개 했다. CECM의 생물 학적 활동의 기능 증거는 그림 2B에 표시 됩니다. 여기, RT-PCR 구조 cardiomyocyte 단백질 (Myh6, Tnnt2)의 식을 일찍 계량 하는 데 사용 되었다 (Mef2c, Nkx2.5)과 후반 (Gata4) cardiomyogenic 녹음 방송 요인, 그리고 내 피 세포 표면 마커 유전자 (폰 Willibrand 인자 (vWF), VE-cadherin) 자발적인 차별화를 겪고 murine ESC에. Uncoated 문화 요리 표면 및 Matrigel ECM 코팅에 비해, 그것은 분명 cECM와 접촉 pluripotent 줄기 세포 cardiomyocyte 같은 표현 형으로 선호 드라이브.
동결 건조 된 ECM 조각 효소 또는 화학 시 약을 사용 하지 않고 미에 추가 처리 수 있습니다. 기계 연 삭 또는 균일 한 크기 (그림 3A)와 미의 생산을 위해 허용 하는 적합 한 키트를 사용 하 여 분쇄. 질량 분석 cECM에 모든 인식할 수 있는 단백질에 대 한 개요를 제공합니다. 세포질 구성 요소에 집중 하는 유전자 온톨로지 분석 ECM 단백질의 대부분은 실제로 몇 헤모글로빈 잔류물 및 주로 세포내 단백질 (그림 4)의 수와 세포 외 공간에서 파생 된 밝혔다. 이 패턴의 cECM, 조직의 특정 생물 학적 기능을 결정할 수 있지만이 가설 추가 연구 필요. CECM 단백질 구성의 요약에 표시 됩니다 표 1. 미에 ECM을 처리의 생물 학적 활동을 유지 합니다. HL-1 셀 시뮬레이션된 "허 혈 성" 조건 (산소, 포도 당 및 혈 청 부족)에 노출 셀 신진 대사 (그림 3B)와 cECM (그림 3C)에 배양 할 때 세포 죽음에 있는 감소에 있는 증가 표시.
CECM 분말, 콜라겐 정화19, 개발 하는 수정 된 프로토콜에 따라 제한 된 펩 신-기반 소화 무 균된 ECM 솔루션에 발생 합니다. 단계 대조 조명 현미경 사진 (그림 5A)와 48 h 후 소화 과정을 보여 줍니다. 이 균질 화 단계 재생 의학10응용 프로그램을 지원합니다. 결과 처리 된 cECM는 그림 5B에서 표시 됩니다. 실내 온도 아래 남아 있다 액체 (그림 5B, 왼쪽) 37 ° C에서 그것 형성 자가 조립 히드로 오버레이 대 한 적당 한 안정성과 세포 정지 수 있도록 3D 문화 (대표 그림, 그림 5B 오른쪽, 히드로와 하지만 문화 매체와 계층). 라이브/죽은 인간의 심장 섬유 아 세포의 얼룩 또한 cECM (그림 5C)에 경작의 유익한 효과 보여줍니다. CECM 미와 cECM 히드로 셀 표준 문화 (그림 5C, 하단 오른쪽 패널)에 비해 허 혈 성 조건에서 수축 HL1 세포의 대사 활동을 강화.
그림 1: 인간의 심장 심근의 Decellularization. (A) cECM 스테레오 현미경 검사 법에 의해의 거시적인 분석 결과 3 단계 decellularization 프로토콜 세포질 물자의 제거. 이것은 투명도 증가 의해 분명 하다입니다. (B) 조직학 얼룩이 지 심근 조각의 그-(왼쪽; decellularization 전후 눈금 막대 = 50 µ m)과 Masson Trichrome 얼룩 (오른쪽; 눈금 막대 = 200 µ m)는 조직에서 세포의 성공적인 제거를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 콘텐츠 및 cECM 조각의 효과. (A) 선택한 ECM 구성 요소와 0.5 %SDS 혼자 decellularization 3 단계 decellularization 프로토콜을 비교 하는 DNA의 양적 생 화 확 적인 분석. 데이터는 네이티브 심근에 콘텐츠의 백분율로 표현 됩니다. 3 단계 프로토콜 잔여 DNA 콘텐츠 거의 제로 고는 SDS/세포의 용 해 버퍼 조합과 FBS (SDS 9 h + FBS) 후 표준 9 h 인큐베이션 결합 0.5% 보다 크게 낮은. 각 생 화 확 적인 분석 실험 시연는 가까운 완전 한 보존 콜라겐, glycosaminoglycan 콘텐츠의 약 20% 보존의 기본 조직, 그리고 엘라 스 틴 콘텐츠, 모두 현저 하 게 더 높은 보다 거의 30% 보존에 비해 표준 SDS 참조 프로토콜 (바 대표 평균 ± SEM). (B) cECM에서 분화 유도 만능 줄기 세포에서 선택 된 유전자의 mRNA 표현 uncoated 문화 요리와 Matrigel 코팅 표면에 비교 했다. cECM 데이터는 각각 제어 자료에서 얻은 그 정규화 (제어 = 1, 점선 라인). 심장 유전자의 대다수는 cECM (바 대표 평균 ± SEM)에 경작 하는 때 더 높게 표현 크게. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 모양 및 cECM 미의 생물 학적 활동. (A) cECM microparticle 분말 동결은 후. (B) 대사 (MTS)와 (C) 세포 죽음 (LDH 자료) 분석 cECM 또는 젤라틴 교양된 HL-1 셀의. cECM는 크게 세포 죽음을 감소 시키고 신진 대사를 증가. 바 평균 ±를 SEM, 일방통행 ANOVA와 Bonferroni 테스트 통계 중요성을 나타냅니다. 그림 3B -C Kappler 외 에서 수정 된 18 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: cECM 미의 단백질 구성. 질량 분석, 다음 문자열 DB 분석 묘사 주로 세포 외 공간에 연관 된 cECM의 주요 구성 요소 (이동: 0005615; 빨간 분야 p > 0.05). 줄에 공동 식 데이터 (검정), 공동 식 (녹색) 및 데이터베이스 상호 작용 (파란색)에 (보라색), 생화학 실험 데이터를 기반으로 하는 단백질 상호 작용을 나타냅니다. 문자열 DB 필요한 자신감: 점수 > 0.4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 처리는 히드로에 cECM의 보존 생물 학적 유효성. 단계 대조 조명 현미경 사진을 보여 더 무 균 ECM 솔루션; 48 h 결과 대 한 cECM의 효소는 소화 눈금 막대 = 500 µ m. (A)는 ECM 솔루션 남아 액체 실내 온도 (B, 왼쪽)까지 하 고 37 ° C (B, 오른쪽)에서 알을 품을 때 히드로 향해 각자 소집을 포함. 라이브/죽은 심장 인간의 섬유 아 세포와 cECM 없이 경작의 얼룩 얼룩 살아있는 세포;의 강도 높은 calcein 보여 눈금 막대 50 µ m (C)=. CECM 히드로 (C, Kappler 외 에서 수정 하단 오른쪽 패널, 마이크로 입자와 같은 방식으로 허 혈 성 조건에서 HL1 세포의 대사 활동 증가 18) 바 평균 ±를 SEM, 일방통행 ANOVA와 Bonferroni 테스트 통계 중요성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단백질 설명 |
| 5-hydroxytryptamine 수용 체 7 OS 호모 사피엔스 GN = HTR7 PE = 1 SV = = 2 |
| 말라와 같은 단백질 6B OS 호모 사피엔스 GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1 = |
| 말라, 대동맥 평활 근 OS 호모 사피엔스 GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1 = |
| 혈 청 알 부 민 OS 호모 사피엔스 GN = ALB PE = 1 SV = = 2 |
| Antithrombin III OS 호모 사피엔스 GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1 = |
| Apolipoprotein C-III에 운영 체제로 호모 사피엔스 GN = APOC3 PE = 1 SV = 1 = |
| Apolipoprotein E OS 호모 사피엔스 GN = APOE PE = 1 SV = 1 = |
| 코일 코일 도메인에 포함 된 단백질 47 OS 호모 사피엔스 GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1 = |
| C 형 lectin 도메인 11 가족 A OS 호모 사피엔스 GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1 = |
| 염화 물 채널 세포내 단백질 1 OS 호모 사피엔스 GN = CLIC1 PE = 1 SV = = 4 |
| 콜라겐 alpha-2(I) 체인 운영 체제 = 호모 사피엔스 GN COL1A2 PE = 1 SV = = 7 |
| C3 OS 보완 호모 사피엔스 GN = C3 PE = 1 SV = = 2 |
| 콜라겐 alpha-2(IV) 체인 운영 체제 호모 사피엔스 GN = COL4A2 PE = 1 SV = = 4 |
| 순환 암페어 응답 요소 바인딩 단백질 3-같은 단백질 4 OS 호모 사피엔스 GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1 = |
| Dermatopontin OS 호모 사피엔스 GN = = DPT PE 2 SV = = 2 |
| Fibronectin OS 호모 사피엔스 GN = FN1 PE = 1 SV = = 4 |
| 티 과산화 효소 3 OS 호모 사피엔스 GN = GPX3 PE = 1 SV = = 2 |
| 헤모글로빈 소 단위 알파 OS 호모 사피엔스 GN = HBA1 PE = 1 SV = = 2 |
| 헤모글로빈 소 단위 베타 OS 호모 사피엔스 GN = HBB PE = 1 SV = = 2 |
| Ig 카파 체인 C 지역 OS 호모 사피엔스 GN = IGKC PE = 1 SV = 1 = |
| Lumican OS 호모 사피엔스 GN = LUM PE = 1 SV = = 2 |
| Mimecan OS 호모 사피엔스 GN = OGN PE = 1 SV = 1 = |
| Nidogen-1 OS 호모 사피엔스 GN = NID1 PE = 1 SV = = 3 |
| Pseudopodium 농축 비정형 키 1 OS 호모 사피엔스 GN = PEAK1 PE = 1 SV = = 4 |
| 안료 상피 파생 요소 OS 호모 사피엔스 GN = SERPINF1 PE = 1 SV = = 4 |
| 미토 콘 드 리아 보 효소 A 운송업 자 SLC25A42 OS 호모 사피엔스 GN = = SLC25A42 PE 2 SV = = 2 |
| 혈 청 아 밀 로이드 P 구성 요소 운영 체제 = 호모 사피엔스 GN APCS PE = 1 SV = = 2 |
| 녹음 방송 개시 인자 TFIID 소 단위 5 OS 호모 사피엔스 GN = TAF5 PE = 1 SV = = 3 |
| 튜더 도메인에 포함 된 단백질 3 OS 호모 사피엔스 GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1 = |
| 아연 손가락 matrin 형 단백질 4 OS 호모 사피엔스 GN = = ZMAT4 PE 2 SV = 1 = |
| 아연 손가락 단백질 101 OS 호모 사피엔스 GN = = ZNF101 PE 2 SV = 1 = |
표 1: 질량 분석에 의해 결정 된 cECM 분말의 단백질 구성.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
다음을 달성 하는 목표는 인간의 심근 ECM를 준비할 때: 관련 된 면역성 세포 소재, ECM 무결성 및 bioactivity, 불 임, GMP 공정 호환성, 최종 제품의 비 독성의 보존의 제거 및 처리 측면에서 특정된 응용 프로그램에 대 한 제품의 적합성. 미 또는 자가 조립 히드로 처리 된 우리의 3 단계 decellularization 프로토콜을 결합 하 여 인간의 심장 ECM 소재 얻은 특정 생물 학적 활동을 보유 하 고, 처리 하 고, 쉽게에 대 한 가능성이 있다 여러 응용 프로그램에서 체 외에서 고 vivo에서, 무슨 보였다 ECM 제품에 대 한 여러 동물 종11,13,,2021에서 비슷합니다.
심근 직물의 초기 처리 중 화합물 농도 치료 기간 300 µ m 조각에 대 한 적정 되는 때문에 동일한 두께의 섹션 심근 조각에 중요 하다. 두꺼운 조각 decellularized 불완전 하 게 되며 얇은 조각 bioactivity의 손실 ECM 구성 요소의 원치 않는 붕괴를 겪게 될 것 이다. 이것은 어디 독성 수 있습니다 부정적인 영향을 미칠 ECM 속성 및 세포 분석16SDS 처리에 관하여 특히 중요 하다. 또한, 장기간된 SDS 처리 Godier Fournement 외에 의해 연구에서 보듯이 fibronectin의 부재를 완료 하는 데 발생할 수 있습니다. 22, 우리의 방법17에 보존 하는 동안. CECM 단면도 추가 처리 (즉, 3D 문화 모델 분석 세포 분화 하거나 세포-ECM 상호 작용, 또는 "조직 공학" 셀룰러 repopulation 접근에 대 한) 없이 실험에 사용 하기 적합 이다. DNA 제거 FBS 사용 하 여 매우 효율적 이지만 ECM 섹션에 일부 잔여 FBS 단백질 유도. 이 모든 FBS 민감한 분석 실험에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 적응 규정에 따라 필요할 수 있습니다 임상 등급 GMP 프로토콜을 번역 인증된 세라 사용 가능 해야 합니다. 이 중 하나는 ECM에서 FBS 잔류물의 부재를 확인 수 또는 프로토콜 변경 DNase 치료는 FBS를 대체할 필요가 있을 것입니다. 마지막으로, 조직 및 ECM 섹션의 반복된 freeze-thaw 주기는 매트릭스의 저하를 방지 하기 위해 피할 수 있습니다.
CECM 히드로 생산 때 펩 신 소화 과정에서 가장 중요 한 단계입니다. 우리의 초기 실험에서 pH 1 37 ° C에서 48 h에 펩 신 소화 이끌어 냈다 bioactivity, pH 2 27 oc.에서 48 h에 부 화를 수정 하 여 막힐 수의 손실 또한, 곰 염두에 두고는 히드로 갓 decellularized 젖은 cECM 조각에서 동결 건조 된 cECM microparticle 정지에서 생산 됩니다. CECM 조각에 비해 하이드로 겔의 향상 된 일반적인 처리 이외에 히드로 장점이 다른 농도에서 예를 들어 다른 재료와 함께에서 높은 농도에 사용 하기 위해 또는 3D에 대 한 그것은 희석 될 수 있습니다. 문화, 또는 세포 문화 요리 또는 문화 매체에 첨가물으로 코팅에 대 한 더 낮은 농도에서.
이 프로토콜 Saldin 그 외 여러분 에 의해 최근에 설명 했다 변환 재생 의료에서 격차를 채우기 위해 인간 cECM 준비를 위해 실험실 급 SOP로 설립 되었습니다. 10 는 하이드로 겔으로 처리 하는 동안 decellularized cECM 조각 시트 Sarig 외.,23, 심근 경색 쥐 모델에서 돼지 cECM와에 의해 설명된대로 최근 병 마음의 epicardial 표면에 적용 될 수 있습니다. 더 다양 한 비보에 응용 프로그램을 가능, 심근에 cECM의 주입 등 Singelyn 그 외 여러분 에 의해 표시 된 대로 13 , 24 임상 변환 활동으로 진행 하기 위해서는 현재 프로토콜이 해야한다 GMP 급 절차로 변환할. 원칙적으로, 이용 된 모든 물자는 또한 승인 된 의료 장치/ATMP 생산 프로세스 (즉, decellularized 심장 밸브 또는 혈관)의 일부 하 고 아무 주요 장애물은 예상 될 것 이다. 그러나, 안전한 저장 기간 및 병원 체의 부재에 대 한 정보 확실히 하셔야 합니다. 궁극적으로, 더 큰 양의 심장 질환 없이 기증자 로부터 신선 하 고 메 마른 심장 조직의 신뢰할 수 있는 원본 필요 합니다. 여기, 마음 고 인된 장기 기증자 이식에 적합 하지 않은에서 가능성이 가장 높은 시나리오입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
연구 프로토콜 헬싱키의 선언에 명시 된 윤리 원칙을 준수 합니다. 환자는 연구 목적, 조직의 사용에 대 한 동의 제공 하 고 조직의 컬렉션 과정 기관 검토 위원회의 Charité-Universitätsmedizin 베를린 (EA4/028/12)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
