Summary
该协议描述了人类心肌的完整细胞, 同时保留了其胞外基质成分。细胞外基质的进一步处理导致微粒和细胞自组装水凝胶的生产。
Abstract
脱细胞细胞外基质制剂对研究细胞基质相互作用和促进再生细胞治疗的应用非常有用。一些商业胞外基质产品可作为水凝胶或膜, 但这些不具有组织特异性的生物活性。由于灌注细胞通常是不可能与人类心脏组织, 我们开发了3步浸泡细胞过程。在手术过程中获得的人心肌切片首先采用无洗涤剂高裂解缓冲液, 然后用离子洗涤剂、十二烷基硫酸钠进行孵化, 并利用其内在 dnasei 活性来完成。胎儿牛血清。这项技术的结果是在心脏细胞外基质的无细胞板, 主要保存纤维组织结构和生物成分, 这表明, 提供了具体的环境线索, 以心电池群体和多能干细胞细胞.心脏胞外基质片可进一步加工成微粒粉, 无需进一步化学修饰, 或者, 通过短期胃蛋白酶消化, 保存成自组装的心脏细胞外基质水凝胶。活性.
Introduction
细胞外基质 (ECM) 不仅提供结构支持, 而且对生物细胞和组织功能1也很重要。在心脏, ECM 参与调节病理反应, 如纤维化, 炎症, 血管生成, 心肌收缩功能和生存能力, 和居民祖细胞的命运。除了其主要成分-纤维糖蛋白, 多糖, 和蛋白-它包含了一系列分泌生长因子, 细胞因子, 和膜囊泡含有核酸和蛋白质2,3。
最近已经清楚的是, 脱细胞 ECM 制剂不仅对研究细胞基质相互作用, 而且对潜在的治疗细胞基础的应用是非常宝贵的。为治疗性细胞产品或工程组织提供适当环境的重要性现已得到广泛承认。试图结合细胞悬浮液或活性化合物与定义的 biopolymeric 凝胶4,5,6或与小鼠肉瘤细胞分泌的蛋白鸡尾酒 (即,基质, Geltrex)7. 然而, 前者的生物活性有限, 后者在 GMP 级别的过程中存在问题, 且缺乏心脏 ECM (cECM)8、9、10、的组织特异性生物活性.11,12,13。
心肌的细胞先前是通过冠状动脉血管灌注的整个心脏,14,15。虽然这是可能的在动物的心脏, 完整的人的心脏是很少可利用的。因此, 一个浸泡过程, 允许处理在手术室获得的组织样本受到青睐。我们的 "3 步" 协议包含3单独的孵化步骤, 即溶解, 增溶, 和 DNA 去除。它产生人心肌 ECM 与主要保存蛋白质和多糖构成16,17。这些 cECM 切片允许体外研究细胞-基质相互作用, 但不适合潜在的人类规模的治疗应用。然后, 制造过程被扩展到生产冻干 cECM 微粒或 cECM 水凝胶18。
该协议允许从外科标本中获得的人心肌细胞, 保留心肌细胞外基质 (ECM) 的主要成分及其生物活性。在细胞基质相互作用的实验研究中, 或在细胞基心肌再生方法需要合适的环境时, 推荐使用具有组织特异性生物活性的人心脏 ECM。原则上, 也可以将此协议与 GMP 级别的条件相适应, 以便在将来的治疗应用中使用经过处理的 cECM 是可行的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
《研究议定书》符合《赫尔辛基宣言》所述的道德原则, 并得到了 charit 医科大学机构审查委员会和道德问题小组的批准。所有患者都提供了书面的、知情的同意, 以供实验研究使用心脏组织。
1. 人心肌切片的制备
- 获得左心室心肌 (大小取决于手术类型) 直接从手术室和运输在冷 PBS 在一个无菌容器。
- 在无菌条件下, 用无菌手术刀将所有脂肪组织取出10刀片。
- 用手术刀切割大约 1 x 1 x 1 cm 的立方体的心肌。
- 将立方体置于无菌50毫升管中。
注意: 要暂停, 请执行步骤 1.5, 否则继续步骤2.2。避免重复的冻融循环, 以防止蛋白质退化和组织质量下降。 - 在-80 ° c 下储存含有立方体的管子。这些组织可以储存几个月。
2. 将心肌立方体切片
- 把装有准备好的立方体的管子从冰箱里拿出来。
- 在冰上运送到低温。
- 将物体和燃烧室温度设置为-15 ° c。
注意: 正确的温度是保证完美切片的关键。 - 冷却空50毫升管和邮票在房间里或在干冰。
- 在冰冷的邮票上加入一层 (约 0.5-1.0 毫升) 的 cryosection 介质, 并让它冻结, 直到它是白色和固体。
- 加入第二层 cryosection 培养基, 并将心肌立方体放置在这层上。
- 请确保 cryosection 培养基和心肌完全冻结, 然后再继续。
注意: 当样品和 cryosection 培养基不结冰时, 切片将会受损。完全冷冻的 cryosection 介质由液体和透明变为固态、白色和非透明。如果立即从步骤1.4 继续, 心肌立方需要至少30分钟至1小时才能完全冻结。当组织被冻结, 它不应该变形, 当触摸/处理与镊子。 - 将冰冻心肌的印记插入支架, 拧紧所有螺钉。
- 修剪组织的表面直到获得均匀的切片表面。
- 将切片厚度设置为300µm。
- 冰冻心肌切片自动切片。这保证了一致的切口部分。大约 30-40 部分可以从一个立方体切片。
- 在冷50毫升管中松散切片后放置每片。
注意: 请勿按下切片或紧密包装。大约40片可以装在一个管。 - 关闭填充管和放置在冰上。
注意: 要暂停使用步骤 2.14, 否则请继续执行步骤3.2。 - 在-80 ° c 贮存心肌切片。切片可以存储几个月。
3. 人心肌切片的细胞
- 采取必要数量的50毫升管包含心肌部分出-80 ° c 冰箱和运输冰。
- 将所有50毫升管子的冰冻切片从步骤3.1 转移到一个无菌烧杯中。大约40片被添加到烧杯每50毫升管。烧杯应为50毫升管体积的三倍;例如,对于一个50毫升管的细胞使用150毫升的烧杯。
- 添加50毫升溶解液 (10 毫米三, 0.1% 瓦特/五 EDTA, pH 7.4 在 H2O) 每50毫升的心肌切片管。
- 在室温下连续 100-150 rpm, 在无菌烧杯中摇动心肌切片, 持续2小时。
- 用粗糙的过滤器将液体与组织切片进行应变。用钝镊子将组织切片转移到新的无菌烧杯中。增加50毫升的 0.5% sds 在 PBS 每初始50毫升心肌切片管 (例如,使用100毫升的 sds 溶液时, 两个50毫升的心肌部分的管正在细胞)。
- 在室温下连续摇动6小时, 在 100-150 rpm。
- 用粗糙的过滤器将液体与组织切片进行应变。用钝镊子将组织切片转移到一个新的无菌烧杯中, 用50毫升 PBS 清洗3次, 每次10分钟, 同时晃动 150 rpm。接下来, 在 pbs 中用1% 青霉素/链霉素和1% 制 (pbs-P/S-N) 在 100-150 rpm 和4° c 的同时进行夜间清洗。
注: 彻底清洗是至关重要的完全清除任何残留 SDS。当 ECM 与细胞结合使用时, SDS 的残留痕迹是有毒的。 - 取出洗涤液, 并添加25毫升预热 FBS (37 ° c) 与1% 青霉素/链霉素和1% 制的细胞切片每初始50毫升管心肌切片。
- 在37° c 孵育3小时。在这一步, 任何剩余的 DNA 从母体中移除, 由于 FBS 的内在 dnasei 活动。
- 将切片转移到新的无菌烧杯中, 用50毫升 PBS 清洗3次, 每次10分钟, 同时晃动 150 rpm。
注: ECM 切片可在4° c 下贮存数天。但是, 建议立即进行。
4. 加工细胞 cECM 粉末
- 将 ECM 切片松散地放在一个新的无菌6井板上。在-80 ° c 和 lyophilize 中冻结 ECM, 在冻中2天。
注意: 每个切片可以放置一个以上。安排切片, 完全覆盖井面。重叠的切片不会影响随后的粉碎成功。 - 对于 ECM 切片的粉碎, 请使用特定的铣管 (参见材料表), 其中包含 1.4 mm 陶瓷珠。用无菌钝镊子将管子松散地用冻干的 ECM 填满。为了获得最佳结果, 建议在 10-20 毫克之间进行 ECM 的总重量。
注: 如果 ECM 在铣管中太紧, 粉碎过程将受到负面影响。 - 用液氮把管子冻住。
警告:液氮的温度极低, 佩戴适当的个人防护。 -
将冷冻管插入铣床并粉碎 ECM。
- 设置三十年代和最大速度的持续时间并启动设备。
- 完成后, 取出试管, 再在液氮中再次凝固。
- 重复五次。
- 通过添加1毫升 ddH2O 每管和震动或漩涡, 为完整的磷清洗微粒从管。通过一个200µm 网格过滤到50毫升管的异构解决方案。
- 将管在-80 ° c 或液氮中冷冻。
- 用0.22 µm 过滤器更换管的标准盖子。这种过滤器盖子防止粉末流出管, 但允许空气循环为水蒸发。
- 插入冻和 lyophilize 中的管子, 将水从步骤中取出 (步骤 4.5)
注: 冻干在这一步可能需要长达3天。 - 将粉末贮存在-80 ° c, 直至进一步处理或继续执行步骤5.1。
5. 基于酶的 cECM 微粒子的均匀化
- 将猪胃蛋白酶溶于 0.01M HCl (pH 值 2.0), 浓缩1毫克/毫升。在旋转振动筛上放置室温, 直到完全溶解。
- 溶解在胃蛋白酶溶液中的冻干人 ECM 粉末 (步骤 4.8), 最终浓度为10毫克/毫升。通过移彻底混合。总容量取决于所需的 ECM 解决方案的数量。例如, 在1毫升胃蛋白酶溶液中溶解10毫克 ECM 粉末。
注: 溶解颗粒可通过温和的涡流 (1000-1500 RPM) 来支持。剩余的微粒会对消化产生负面影响。 - 将溶液转移至2毫升管, 每管1毫升。
- 把管子放在一个48小时27° c 和 1200 rpm 的管子振动器中。
- 把管子从振动筛中取出, 放在冰上或预冷管架上。
- 将冷 10x PBS (pH 7.4) 的 ecm 溶液体积的1/9 与1/10 的冷管中的冷0.1M 氢氧化钠的 ecm 溶液体积和冰的位置混合。这种混合物将抵消消化的 ECM 溶液和不可逆转地钝化胃蛋白酶。
- 将 ECM 解决方案添加到中和混合物中, 并通过移或涡流进行彻底混合。
- 使用 1x PBS (pH 值 7.4) 将 ECM 设置为所需浓度。溶液的 ph 值可以用 ph 值纸检查。
注:10 毫升消化 ECM 解决方案的示例计算:
添加10毫克猪胃蛋白酶到10毫升 HCl (pH 2.0)。
加入100毫克 ECM 粉末到胃蛋白酶溶液。
注: 中和10毫升消化 ECM 溶液的实例计算, 并将浓度设置为8毫克/毫升:
最终= c开始x 卷开始/c最终= 10 毫克/毫升 x 10 毫升/8 毫克/毫升 = 12.5 毫升
10xPBS = 卷开始/9 = 1/9 从10毫升 = 1.11 毫升 10x PBS
氢氧化钠= 卷开始/10 = 1/10 从10毫升 = 1 毫升
卷1xPBS = 卷最终-卷开始-卷10xPBS卷氢氧化钠= 12.5 毫升-10 毫升-11 毫升-1 毫升 = 0.39 毫升
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3步的人心肌细胞的协议, 导致了近完全去除细胞材料, 同时保留了关键的 ecm 成分和纤维结构的 ecm。细胞后, 通过颜色的变化 (图 1A), 明显去除组织中的细胞。组织学分析与 H & E 和马尾松三污渍显示完全没有剩余完整的细胞 (图 1B)。单个 ECM 成分的定量分析显示, 单独的 DNA 清除和更好地保存总胶原蛋白、弹力蛋白和多糖, 与 SDS (图 2A) 相比更完整。cECM 生物活性的功能性证据如图 2B所示。在这里, rt-pcr 用于定量表达结构心肌蛋白 (Myh6, Tnnt2), 早期 (Mef2c, Nkx2.5) 和晚期 (Gata4) 心肌转录因子, 和内皮细胞表面标记基因 (冯 Willibrand 因子 (vWF),VE-钙黏蛋白) 在小鼠 ESC 发生自发分化。与非涂层培养皿表面和基质-ECM 涂层相比, 很明显的是, 接触 cECM 驱动多能干细胞, 优选为心肌样的表型。
在不使用酶或化学试剂的情况下, 冻干 ECM 切片可以进一步加工成微粒。机械研磨或粉碎使用适当的试剂盒, 允许生产具有统一尺寸的微粒 (图 3A)。质谱法提供了 cECM 中所有可识别蛋白质的概述。专注于细胞成分的基因本体分析显示, 大多数 ECM 蛋白确实来源于细胞外空间, 很少有血红蛋白残留物和大量的胞内蛋白 (图 4)。这种模式可以确定 cECM 的组织特异生物学功能, 但这一假说需要进一步研究。cECM 蛋白组成的摘要见表 1.将 ECM 加工成微粒可保持其生物活性。HL-1 细胞暴露于模拟的 "缺血" 条件 (缺氧、葡萄糖和血清剥夺) 显示细胞新陈代谢的增加 (图 3B) 和细胞死亡减少时, 培养 cECM (图 3C)。
以胃蛋白酶为基础的 cECM 粉的有限消化, 基于为胶原纯化而开发的修改后的协议19, 产生了均匀化 ECM 解决方案。相衬光学显微镜图片 (图 5A) 演示0小时和48小时后的消化过程。这一均质化步骤便于在再生医学中的应用10。所得到的经过处理的 cECM 显示在图 5B中。在室温下它保持液体 (图 5B, 左), 但在37° c, 它形成了一个自组装水凝胶与稳定适用于一个覆盖的细胞悬浮允许3D 文化 (代表性图片,图 5B右, 水凝胶用培养基分层)。人心脏成纤维细胞的活/死染色也显示了培养对 cECM 的有益作用 (图 5C)。与标准培养细胞相比, cECM 微粒和 cECM 凝胶增强了缺血性 HL1 细胞的代谢活性 (图 5C, 右下面板)。
图 1: 人心肌细胞。(A)用立体显微镜对 cECM 的宏观分析揭示了细胞材料与3步细胞协议的去除。透明度的增加明显地表明了这一点。(B)细胞前后心肌切片的组织学染色-(左;刻度杆 = 50 µm) 和马尾松三染色 (右;刻度条 = 200 µm) 显示成功地从组织中去除细胞。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: cECM 切片的内容和效果(A)对所选的 ECM 组件和 DNA 进行定量生物化学分析, 将3步细胞协议与 0.5% SDS 单细胞进行比较。数据以原生心肌中含量的百分比表示。与3步协议, 残余 DNA 含量几乎为零, 并显着低于 9 h 孵化后的标准组合 0.5% sds/裂解缓冲组合和 FBS (sds 9 h + FBS)。各自的生化化验显示, 几乎完全保存的胶原蛋白, 约20% 保存多糖含量与本机组织, 和近30% 保存的弹性蛋白含量, 所有显着高于标准 SDS 参考协议 (条形代表平均± SEM)。(B)与非涂层培养皿和基质涂层表面相比, 诱导多能干细胞中的选择基因的 mRNA 表达与 cECM 的区别。cECM 数据被规范化对那些获得在各自控制材料 (控制 = 1, 虚线)。大多数心脏基因是显着更高的表达时, 培养 cECM (酒吧代表平均± SEM)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: cECM 微粒的外观和生物活性.(A)冷冻干燥后的 cECM 微粒粉末。(B)代谢 (MTS) 和(C)细胞死亡 (LDH 释放) 对 cECM 或明胶培养的 HL-1 细胞的分析。cECM 显著减少细胞死亡, 增加新陈代谢。条形代表平均± SEM, 经单向方差分析和 Bonferroni 检验的统计学意义。图 3B-c已从 Kappler et al.中修改18请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: cECM 微粒的蛋白质组成.在质谱学之后, 弦 DB 分析描述了 cECM 的关键成分, 主要与细胞外间隙 (GO:0005615; 红色球体 p > 0.05) 相关。线表示蛋白质相互作用基于实验生化数据 (紫色), 在 co 表达数据 (黑色), 在数据库互作用 (蓝色) 和在 co 表达 (绿色)。字符串 DB 需要的信心: 得分 > 0.4。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: cECM 对水凝胶的处理保存了生物有效性.相对比光显微镜图片表明, 酶消化的 cECM 48 h 结果在一个更均匀的 ECM 溶液;缩放条 = 500 µm. (A) ECM 解决方案仍然保持液态, 直至室温 (b,左), 并包含在37° c (b, 右) 孵育时对水凝胶进行自组装的潜能。无 cECM 培养的心脏成纤维细胞活/死染色显示活细胞的素染色强度较高;缩放条形图 = 50 µm (C)。cECM 水凝胶与微颗粒 (C, 右下面板, 从 Kappler et al.中修改的相同方式增加了缺血条件下 HL1 细胞的代谢活性18) 条表示平均± SEM, 由单向方差分析和 Bonferroni 检验的统计学意义。请单击此处查看此图的较大版本.
| 蛋白质描述 |
| 5-色受体 7 OS = 智人 GN=HTR7 PE=1 SV=2 |
| 肌动蛋白样蛋白质 6B OS = 智人 GN=ACTL6B PE=1 SV=1 |
| 肌动蛋白, 主动脉平滑肌系统 = 智人 GN=ACTA2 PE=1 SV=1 |
| 血清白蛋白 OS = 智人 PE=1 SV=2 |
| 抗凝血酶 III OS = 智人 GN=SERPINC1 PE=1 SV=1 |
| 载脂蛋白 C III OS = 智人 GN=APOC3 PE=1 SV=1 |
| 载脂蛋白 E OS = 智人 GN = 载脂蛋白 PE=1 SV=1 |
| 盘绕线圈域含蛋白质 47 OS = 智人 GN=CCDC47 PE=1 SV=1 |
| C 型凝集素域家族11成员 A OS = 智人 GN=CLEC11A PE=1 SV=1 |
| 氯化物胞内通道蛋白 1 OS = 智人 GN=CLIC1 PE=1 SV=4 |
| 胶原蛋白α-2 (I) 链 OS = 智人 GN=COL1A2 PE=1 SV=7 |
| 补充 C3 OS = 智人 GN=C3 PE=1 SV=2 |
| 胶原蛋白α-2 (IV) 链 OS = 智人 GN=COL4A2 PE=1 SV=4 |
| 循环放大反应元素结合蛋白3样蛋白 4 OS = 智人 GN=CREB3L4 PE=1 SV=1 |
| Dermatopontin OS = 智人 PE=2 SV=2 |
| 纤维连接蛋白 OS = 智人 GN=FN1 PE=1 SV=4 |
| 谷胱甘肽过氧化物酶 3 OS = 智人 GN=GPX3 PE=1 SV=2 |
| 血红蛋白亚基α OS = 智人 GN=HBA1 PE=1 SV=2 |
| 血红蛋白亚基β OS = 智人 GN = HBB PE=1 SV=2 |
| 链 C 区域 OS = 智人 GN = IGKC PE=1 SV=1 |
| Lumican OS = 智人 GN = 亮度 PE=1 SV=2 |
| Mimecan OS = 智人 GN = OGN PE=1 SV=1 |
| Nidogen-1 OS = 智人 GN=NID1 PE=1 SV=3 |
| 伪足丰富的非典型激酶 1 OS = 智人 GN=PEAK1 PE=1 SV=4 |
| 色素上皮衍生因子 OS = 智人 GN=SERPINF1 PE=1 SV=4 |
| 线粒体辅酶 A 转运 SLC25A42 OS = 智人 GN=SLC25A42 PE=2 SV=2 |
| 血清淀粉样蛋白 P 组分 OS = 智人 GN = apc PE=1 SV=2 |
| 转录起始因子 TFIID 亚基 5 OS = 智人 GN=TAF5 PE=1 SV=3 |
| 都铎域含蛋白质 3 OS = 智人 GN=TDRD3 PE=1 SV=1 |
| 锌指交互型蛋白 4 OS = 智人 GN=ZMAT4 PE=2 SV=1 |
| 锌指蛋白 101 OS = 智人 GN=ZNF101 PE=2 SV=1 |
表 1: 质谱法测定 cECM 粉的蛋白质组成。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在制备人体心肌 ECM 时, 其目的是实现以下目标: 去除相关的免疫细胞材料, 保护 ecm 的完整性和生物活性, 不育, 最终产品的非毒性, GMP-过程相容性, 以及产品在处理方面的适用性。将我们的3步细胞协议与进一步加工成微粒或自组装水凝胶结合, 获得了具有特定生物活性的人体心脏 ECM 材料, 易于处理, 并具有多个应用程序在体外和在体内, 类似于从几个动物种类中显示的 ECM 产品11、13、20、21。
在心肌组织的初始处理过程中, 由于300µm 切片的复合浓度和处理时间的滴定, 对相同厚度的断面心肌切片很重要。较厚的切片将是不完全细胞和薄切片将遭受不必要的故障 ECM 组件的生物活性损失。这对于 SDS 的治疗尤为重要, 因为毒性会对 ECM 的性质和细胞分析产生负面影响16。此外, 长期 SDS 治疗可导致完全没有纤维连接蛋白的研究中看到的 Godier-Fournement et al.22, 而用我们的方法17保留它。cECM 节适合于在没有进一步处理的实验中使用 (即,在分析细胞分化或细胞 ECM 相互作用的3D 培养模型中, 或用于 "组织工程" 细胞重新方法)。使用 FBS 的 DNA 去除是非常有效的, 但可能导致一些残留的 FBS 蛋白的 ECM 部分。这可能影响任何 FBS 敏感的化验。翻译到临床等级 GMP 协议应该是可能的与使用被证明的血清, 然而适应可能是必要的根据章程。这既可以证实在 ECM 中没有 FBS 残留物, 也不需要修改议定书, 以取代 FBS 的 dnasei 处理。最后, 应避免组织和 ECM 切片的重复冻融循环, 以防止基质的降解。
在生产 cECM 水凝胶时, 胃蛋白酶消化是这一过程中最关键的一步。在我们的最初的实验中, 胃蛋白酶消化在 ph 值1为 48 h 在37° c 导致了生物活性的损失, 可以通过修改孵育到 ph 2 为 48 h 在 27 oc 防止。同时, 请记住, 水凝胶是由冻干 cECM 微粒悬浮, 而不是从新鲜细胞湿 cECM 片。除了与 cECM 切片相比, 水凝胶的一般处理有所改进外, 水凝胶的优点是可以在不同浓度下稀释, 例如在更高浓度下与其他材料结合使用或用于3D培养, 或在较低浓度的细胞培养皿涂层或作为一种添加剂的培养基。
本议定书是为人类 cECM 准备的实验室级 SOP, 以帮助填补 Saldin et al.最近描述的平移再生医学中的空白。10而细胞 cECM 切片可作为在病变心脏的心外膜表面上的表片, 如最近所描述的 Sarig et al., 与猪 cECM 在大鼠心肌梗死模型23, 处理成一个水凝胶允许更多样的体内应用, 如 Singelyn et al.所示的 cECM 注入心肌13,24为了进行临床转化活动, 当前的协议将必须转换为 GMP 级别的程序。原则上, 所使用的所有材料也是经批准的医疗器械/ATMP 生产过程的一部分 (即,细胞心脏瓣膜或血管), 没有任何重大障碍可预期。然而, 关于安全储存时间和病原体的缺乏的信息肯定是必需的。最终, 一个可靠的来源, 大量的新鲜和无菌的心脏组织的捐助者没有心脏病是需要的。在这里, 死亡器官捐献者的心脏不适合移植是最有可能的情况。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
《研究议定书》符合《赫尔辛基宣言》中概述的道德原则。患者提供了知情同意的使用组织的研究目的, 和组织收集的过程是批准的机构审查委员会和伦理委员会 charit-Universitätsmedizin 柏林 (EA4/028/12)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
