Summary
Questo protocollo descrive la completa decellularizzazione di miocardio umano pur conservando le sue componenti della matrice extracellulare. Ulteriore elaborazione dei risultati nella produzione di microparticelle e un idrogel autoassemblanti cytoprotective matrice extracellulare.
Abstract
Matrice extracellulare acellulare preparazioni sono utili nello studio delle interazioni cellula-matrice e agevolare le domande di terapia rigenerativa delle cellule. Diversi prodotti commerciali di matrice extracellulare sono disponibili come idrogel o membrane, ma questi non possiedono attività biologica tessuto-specifica. Perché decellularizzazione di aspersione non è solitamente possibile con tessuto cardiaco umano, abbiamo sviluppato un processo di decellularizzazione immersione 3-passo. Fette del miocardio umani procurati durante la chirurgia vengono prima trattati con buffer di lisi di hyperosmolar privo di detergente, seguita da incubazione con il solfato dodecilico di sodio di detersivo, ionico, e il processo è completato, sfruttando l'attività intrinseca della dnasi di siero bovino fetale. Questa tecnica si traduce in fogli senza cellula di matrice extracellulare cardiaca con in gran parte conservata composizione architettura e biopolimero di tessuto fibroso, che sono stati indicati per fornire stimoli ambientali specifici per le popolazioni delle cellule cardiache e staminali pluripotenti indotte cellule. Matrice extracellulare cardiaco possono quindi essere ulteriormente trasformati in una polvere di microparticelle senza ulteriore modificazione chimica, o, attraverso la digestione pepsina a breve termine, in un auto-assemblanti idrogel di matrice extracellulare cardiaca con conservato bioattività.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) fornisce non solo il supporto strutturale, ma è importante anche per cellula biologica e tessuto funzione1. Nel cuore, l'ECM interviene nella regolazione delle risposte patofisiologiche come fibrosi, infiammazione, l'angiogenesi, la funzione contrattile del cardiomyocyte e attuabilità e destino delle cellule staminali e progenitori residenti. Oltre ai suoi componenti primari - fibrosi glicoproteine, glicosaminoglicani e proteoglicani - contiene una serie di fattori di crescita secreti, citochine e membranose vescicole contenenti acidi nucleici e proteine2,3.
Recentemente è diventato chiaro che acellulare preparazioni di ECM non sono solo inestimabile per lo studio delle interazioni cellula-matrice, ma anche per le potenziali applicazioni terapeutiche basate sulle cellule. L'importanza di fornire un ambiente adeguato per prodotti terapeutici delle cellule o tessuti ingegnerizzati è ormai ampiamente riconosciuta. Tentativi sono stati fatti per combinare sospensioni cellulari o composti attivi definiti idrogeli biopolymeric4,5,6 o con cocktail di proteina secreta dalle cellule di sarcoma murino (cioè, Matrigel, Geltrex) 7. Tuttavia, l'ex hanno limitato la bioattività, quest'ultimo è problematico nei processi di GMP-grado ed entrambi mancano la bioattività di tessuto-specifica di cardiaco ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularizzazione del miocardio è stata eseguita in precedenza da aspersione di tutto il cuore tramite le vene coronarie14,15. Mentre questo è possibile nei cuori degli animali, cuori umani intatti sono raramente disponibili. Di conseguenza, è stato favorito un processo di immersione che permette una gestione di campioni di tessuto ottenuti in sala operatoria. Il nostro protocollo "3-step" contiene 3 separato incubazione passi cioè Lisi, solubilizzazione e rimozione del DNA. Produce del miocardio umano ECM con16,in gran parte conservata della proteina e glicosaminoglicani composizione17. Queste fette cECM permettono per studi in vitro delle interazioni cellula-matrice, ma sono poco adatte per le potenziali applicazioni terapeutiche su scala umana. Il processo di fabbricazione è stato poi esteso per produrre microparticelle cECM liofilizzato o un cECM idrogel18.
Questo protocollo consente il decellularizzazione di miocardio umano ottenuto da campioni chirurgici, preservando i componenti principali del miocardio della matrice extracellulare (ECM) e la loro attività biologica. Questo protocollo è consigliato quando cardiaco umano ECM con conservato bioattività di tessuto-specifici è necessario per gli studi sperimentali delle interazioni cellula-matrice, o quando è necessario un ambiente adatto per gli approcci basati su cellule di rigenerazione miocardica. In linea di principio, è anche possibile adattare questo protocollo alle condizioni GMP-grado, così che l'uso di elaborati cECM dovrebbe essere fattibile applicazioni terapeutiche in futuro.
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Protocol
Il protocollo di studio è conforme ai principi etici delineati nella dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal comitato del Consiglio e l'etica di revisione istituzionale della Charité Medical University. Tutti i pazienti di cui scritto, il consenso informato per l'uso del tessuto del cuore per studi sperimentali.
1. preparazione del miocardio umano per il sezionamento
- Ottenere il miocardio ventricolare di sinistra (la dimensione varia a seconda del tipo di intervento chirurgico) direttamente dalla sala operatoria e trasporto in PBS freddo in un recipiente sterile.
- Rimuovere tutto il tessuto grasso con un bisturi sterile con una lama n. 10 in condizioni sterili.
- Tagliare il miocardio in cubetti di circa 1 x 1 x 1 cm usando un bisturi.
- Posizionare i cubi nelle provette sterili da 50 mL.
Nota: Per mettere in pausa, eseguire passo 1.5, altrimenti passare al punto 2.2. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento per impedire la degradazione proteica e una diminuzione nella qualità del tessuto. - Conservare le provette contenenti i cubi a-80 ° C. Il tessuto può essere conservato per diversi mesi.
2. taglio dei cubi miocardio a fette
- Prendere le provette contenenti i cubi preparati fuori dal freezer.
- Trasporto su ghiaccio al criostato.
- Impostare la temperatura dell'oggetto e camera a-15 ° C.
Nota: La temperatura giusta è fondamentale per garantire perfetta di sezionamento. - Provette da 50 mL freddo vuoto e timbri in aula o il ghiaccio secco.
- Aggiungere uno strato (circa 0,5 - 1,0 mL) di donatrici medio sul timbro freddo e lasciate che si congelare fino a quando è bianco e solido.
- Aggiungere un secondo strato di mezzo di donatrici e inserire un cubo di miocardio su questo strato.
- Assicurarsi che il mezzo di donatrici e miocardio sono completamente congelato prima di continuare.
Nota: Quando il mezzo campione e donatrici non sono congelati il sezionamento sarà compromessa. Donatrici completamente congelati medio si trasforma da liquido e trasparente solido, bianco e non trasparente. I cubi del miocardio bisogno almeno 30 min fino a 1 h di congelare completamente se continuando direttamente dal punto 1.4. Quando il tessuto viene congelato non dovrebbero deformare quando toccato/gestito con le pinzette. - Inserire il timbro con il miocardio congelato nel supporto e serrare tutte le viti.
- Tagliare la superficie del tessuto fino ad ottenuta una superficie anche sezionamento.
- Impostare lo spessore di 300 µm di sezionamento.
- Sezione del miocardio congelato con sezionamento automatico. Questo garantisce sezioni di taglio uniforme. Circa 30-40 sezioni possono essere affettati da un cubo.
- Mettete ogni fetta dopo il sezionamento senza bloccare in un tubo da 50ml preraffreddato.
Nota: Non premere saldamente le fette o pack. Circa 40 fette possono andare bene in una provetta. - Chiudere le provette riempite e metterli su ghiaccio.
Nota: Per mettere in pausa vai su con passo 2.14, altrimenti continuare con il passaggio 3.2. - Archivio miocardio fette a-80 ° C. Le fette possono essere conservate per diversi mesi.
3. decellularizzazione di miocardio umano fette
- Prendere il numero necessario di provette da 50 mL contenente sezioni di miocardio fuori dal congelatore a-80 ° C e il trasporto sul ghiaccio.
- Trasferire le sezioni congelate di tutte le provette da 50 mL dal punto 3.1 in un becher sterile. Circa 40 fette vengono aggiunti il becher per tubo da 50 mL. Il bicchiere deve essere tre volte il volume dei tubi 50 mL; ad esempio, per decellularizzazione di un tubo da 50 mL utilizzare un becher da 150 mL.
- Aggiungere 50 mL di soluzione lisi (10 mM Tris, 0.1% w/v EDTA, pH 7.4 in H2O) al tubo da 50 mL con le fette del miocardio.
- Agitare le fette del miocardio in un becher sterile a 100-150 giri continuamente per 2 h a temperatura ambiente.
- Filtrare il liquido con le fette di tessuto attraverso un colino grossolano. Trasferire le fettine di tessuto con una pinzetta smussata in un recipiente sterile di nuovo. Aggiungere 50 mL di SDS di 0,5% in PBS per tubo 50ml iniziale delle fette di miocardio (ad es., uso 100 mL SDS soluzione quando due provette da 50 mL di sezioni del miocardio sono essere decellularized).
- Agitare continuamente per 6 h a 100-150 giri/min a temperatura ambiente.
- Filtrare il liquido con le fette di tessuto attraverso un colino grossolano. Trasferire le fettine di tessuto con una pinzetta smussata in un nuovo recipiente sterile e lavare 3 volte con 50 mL di PBS per 10 minuti ciascuno, mentre si stringono a 150 giri/min. Successivamente, lavare una notte in PBS con 1% di penicillina/streptomicina e l'1% nistatina (PBS-P/S-N) a 100-150 giri/min e 4 ° C agitando.
Nota: Lavaggio accurato è fondamentale per rimuovere completamente qualsiasi residuo SDS. Residuo di SDS è tossici quando l'ECM è usato in combinazione con le cellule. - Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 25 mL preriscaldato FBS (37 ° C) con 1% di penicillina/streptomicina e l'1% nistatina le fette decellularizzate per tubo da 50 mL iniziale delle fette del miocardio.
- Incubare per 3 ore a 37 ° C. In questo passaggio, qualsiasi DNA rimanente viene rimosso dalla matrice a causa della intrinseca attività dnasi degli FB.
- Trasferire le fettine in un recipiente sterile nuovo e lavare 3 volte con 50 mL di PBS per 10 minuti ciascuno, mentre si stringono a 150 giri/min.
Nota: Le fette di ECM possono essere memorizzate in PBS-P/S-N a 4 ° C per diversi giorni. Tuttavia, si consiglia di procedere immediatamente.
4. elaborazione del cECM Decellularized in polvere
- Sistemare le fettine di ECM senza bloccare in una nuova piastra 6 pozzetti sterile. Congelare il ECM a-80 ° C e lyophilize per 2 giorni in un liofilizzatori.
Nota: più di una fetta può essere posizionata per pozzetto. Disporre le fette in modo da coprire completamente la superficie del pozzo. Sovrapponendo le fette non influisce il successo di polverizzazione successive. - Per la polverizzazione della fetta ECM, uso specifico fresatura tubi contenenti perline di ceramica 1,4 mm (Vedi Tabella materiali). Riempire le provette senza bloccare con ECM liofilizzato con una pinzetta smussata sterile. Per risultati ottimali, si raccomanda un peso totale di ECM tra 10-20 mg.
Nota: Se l'ECM è troppo compattamente nei tubi fresatura il processo di polverizzazione sarà influenzato negativamente. - Snap-congelare i tubi in azoto liquido.
ATTENZIONE: azoto liquido è estremamente bassa temperatura, usura di protezione personale appropriate. -
Inserire i tubi congelati la fresatrice e polverizzare l'ECM.
- Impostare una durata di 30 s e un massimo di velocità e avviare il dispositivo.
- Dopo aver terminato, estrarre i tubi e snap-congelare nuovamente in azoto liquido.
- Ripetere cinque volte.
- Lavare le microparticelle dai tubi aggiungendo 1 mL ddH2O al tubo e agitare o vortice per solubilizzare completa. Filtrare la soluzione eterogenea attraverso una maglia di 200 µm in una provetta da 50 mL.
- Congelare il tubo a-80 ° C o azoto liquido.
- Sostituire il coperchio standard del tubo con un filtro da 0,22 µm. Questo coperchio filtro impedisce alla polvere di fluire fuori dal tubo ma permette la circolazione dell'aria per evaporazione dell'acqua.
- Inserire le provette nei liofilizzatori e lyophilize nuovamente per rimuovere l'acqua dal passaggio (punto 4.5)
Nota: Liofilizzazione in questa fase può richiedere fino a 3 giorni. - Conservare la polvere a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione o continuare con il passaggio 5.1.
5. enzima base omogeneizzazione di cECM Micro-particelle
- Sciogliere la pepsina suina in 0,01 M HCl (pH 2.0) ad una concentrazione di 1 mg/mL. Posizionare su un agitatore rotante a temperatura ambiente finché non è completamente dissolto.
- Sciogliere la polvere liofilizzata di ECM umana (passo 4,8) della soluzione di pepsina a una concentrazione finale di 10 mg/mL. Mescolare accuratamente attraverso il pipettaggio. Il volume totale dipende dalla quantità di soluzione di ECM necessaria. Ad esempio, sciogliere 10 mg di polvere di ECM in 1 mL di soluzione di pepsina.
Nota: Particelle di dissoluzione può essere supportato tramite delicato nel Vortex (1.000-1.500 giri/min). Restanti grumi di microparticelle influenzerà negativamente la digestione. - Trasferire la soluzione in provette da 2 mL con un volume di 1 mL per tubo.
- Mettere i tubi in uno shaker di tubo per 48 h a 27 ° C e a 1.200 giri/min.
- Prendete i tubi fuori lo shaker e posto su ghiaccio o un supporto del tubo pre-raffreddata.
- Mix 1/9 del volume della soluzione ECM di freddo 10X PBS (pH 7,4) con 1/10 del volume della soluzione ECM di freddo 0,1 M NaOH in un tubo preraffreddato e posto sul ghiaccio. Questa miscela sarà neutralizzare la soluzione ECM digerita e inattivare irreversibilmente la pepsina.
- Aggiungere la soluzione di ECM per la miscela di neutralizzazione e mescolare accuratamente attraverso il pipettaggio o tramite vortex.
- Impostare l'ECM fino alla concentrazione desiderata con 1x PBS (pH 7.4). Il pH della soluzione può essere controllato con carta pH.
Nota: Esempio di calcolo per 10ml digerito soluzione ECM:
Aggiungere 10 mL di HCl (pH 2.0) pepsina suina 10mg.
Aggiungere 100 mg ECM polvere soluzione di pepsina.
Nota: Esempio di calcolo per neutralizzare 10ml digerito soluzione ECM e impostando la concentrazione di 8 mg/mL:
Volfinale = cavviare x Volavviare / cfinale = 10 mg / mL x 10ml / 8 mg/mL = 12.5 mL
Vol10xPBS = Volavviare / 9 = 1/9 da 10 mL = 1,11 mL 10X PBS
VolNaOH = Volavviare / 10 = 1/10 da 10 mL = 1 mL
Vol1xPBS = Vol Volfinale - Volavviare -10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL
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Representative Results
Il protocollo di 3 fasi per decellularizzazione di miocardio umano ha presentato qui risultati in quasi completa rimozione del materiale cellulare, mantenendo i componenti chiave di ECM e la struttura fibrillare del ECM. Dopo decellularizzazione, la rimozione lorda delle cellule dal tessuto è evidente il cambiamento di colore (Figura 1A). L'analisi istologica con macchie di H & E e Masson Trichrome ha rivelato l'assenza completa di cellule intatte residuale (Figura 1B). Analisi quantitative per singoli componenti della MEC ha rivelato una rimozione più completa del DNA e la migliore conservazione del totale del collagene, elastina e glicosaminoglicani rispetto a decellularizzazione di SDS da solo (Figura 2A). Prova funzionale dell'attività biologica di cECM è mostrata nella Figura 2B. Qui, RT-PCR è stato usato per quantificare l'espressione di proteine strutturali del cardiomyocyte (Myh6, Tnnt2), presto (Mef2c, NKX 2.5) e fine (Gata4) cardiomiogenici fattori di trascrizione e geni di indicatore della superficie delle cellule endoteliali (von Willibrand Factor (vWF), VE-cadherin) in murino ESC in fase di differenziazione spontanea. Rispetto ad entrambi non patinata cultura piatto superficie e rivestimento di Matrigel-ECM, è evidente che il contatto con cECM unità cellule staminali pluripotenti preferibilmente verso un fenotipo simile a cardiomiociti.
Fette di ECM liofilizzati possono essere ulteriormente elaborati in microparticelle senza l'utilizzo di reagenti chimici o enzimatici. Meccanica di rettifica o polverizzazione utilizzando kit adatto ammessi per la produzione di microparticelle con una dimensione uniforme (Figura 3A). Spettrometria di massa viene fornita una panoramica di tutte le proteine riconoscibile presente in cECM. Analisi di ontology del gene concentrandosi su componenti cellulari hanno rivelato che la maggior parte delle proteine ECM è infatti derivata dallo spazio extracellulare, con pochi residui di emoglobina e un numero di proteine prevalentemente intracellulari (Figura 4). Questo modello può determinare la funzione biologica di tessuto-specifica di cECM, ma questa ipotesi ha bisogno di ulteriore ricerca. Viene visualizzato un riepilogo della composizione proteica cECM in tabella 1. Trasformazione di ECM in microparticelle conserva la sua attività biologica. HL-1 cellule esposte a condizioni simulate "ischemico" (deprivazione di siero, glucosio e ipossia) ha visualizzato un aumento nel metabolismo delle cellule (Figura 3B) e una diminuzione nella morte delle cellule quando coltivate su cECM (Figura 3).
Limitata digestione pepsina-basato della polvere cECM, basato su un protocollo modificato sviluppato per collagene purificazione19, si traduce in una soluzione di ECM omogeneizzata. Immagini di microscopia chiara contrasto fase (Figura 5A) illustrano il processo di digestione dopo 0 e 48 h. Questo passaggio omogeneizzazione facilita le applicazioni in medicina rigenerativa10. Il cECM trasformati risultante è mostrato in figura 5B. Sotto della temperatura rimane liquida (figura 5B, sinistra) ma a 37 ° C forma un idrogel autoassemblanti con stabilità adatto per un overlay con sospensioni cellulari 3D delle culture (immagine rappresentativa, destra figura 5B , idrogel a strati con terreno di coltura). Live/dead macchiatura dei fibroblasti cardiaci umani Mostra anche gli effetti benefici della coltura su cECM (Figura 5). CECM microparticelle sia cECM idrogel migliorato l'attività metabolica delle cellule contrattili HL1 in condizioni ischemiche rispetto alle cellule in coltura (Figura 5, pannello inferiore di destra).
Figura 1: decellularizzazione di miocardio cardiaco umano. (A) analisi macroscopiche di cECM da stereo microscopia rivela la rimozione del materiale cellulare con il protocollo di decellularizzazione 3-passo. Questo risulta evidente per l'aumento della trasparenza. (B) istologia macchiatura delle fette del miocardio del prima e dopo decellularizzati con lui-(a sinistra; Barra della scala = 50 µm) e Masson Trichrome macchiatura (a destra; Barra della scala = 200 µm) dimostra la riuscita rimozione di cellule dal tessuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: contenuto ed effetti cECM fette. (A) analisi biochimica Quantitative di selezionati componenti della MEC e DNA, confrontando il protocollo 3-passo decellularizzazione di decellularizzazione SDS-solo dello 0,5%. I dati sono espressi come percentuale di contenuto nel miocardio nativo. Con il protocollo 3-step, il contenuto di DNA residuo era quasi pari a zero e significativamente inferiore che dopo un'incubazione di 9 h con standard combinato 0,5% SDS/Lisi tampone combinazione e FBS (SDS 9 h + FBS). Rispettivi saggi biochimici hanno dimostrato una conservazione vicino-completa di collagene, circa il 20% conservazione dei glicosaminoglicani contenuti rispetto al tessuto nativo e una conservazione quasi 30% di contenuto di elastina, significativamente superiore con il protocollo di riferimento SDS standard (barre rappresentano la media ± SEM). (B) l'espressione del mRNA di geni selezionati in cellule staminali pluripotenti indotte differenziando il cECM, rispetto alle piastre di coltura non patinata e alla superficie di Matrigel-rivestite. cECM dati vengono normalizzati a quelli ottenuti sui materiali rispettivo controllo (controllo = 1, linea tratteggiata). La maggior parte dei geni cardiaci è significativamente più altamente espressi quando coltivate su cECM (barre rappresentano la media ± SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: aspetto e attività biologica di microparticelle cECM. (A) cECM microparticella polvere dopo liofilizzazione. (B) metabolismo (MTS) e (C) cella analisi di (rilascio di LDH) morte delle cellule HL-1 coltivate con cECM o gelatina. cECM significativamente riduce la morte delle cellule e aumenta il metabolismo. Barre rappresentano la media ± SEM, significatività statistica testata da One-way ANOVA e Bonferroni. Figura 3B -C sono stati modificati da Kappler et al. 18 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: composizione proteica della cECM microparticelle. A seguito di spettrometria di massa, String DB analisi raffigura i componenti chiave di cECM, che sono principalmente associati con lo spazio extracellulare (GO: 0005615; sfere rosse p > 0.05). Le linee indicano interazioni proteina basano su dati sperimentali-biochimici (viola), il co-espressione dati (neri), sulle interazioni del database (blu) e il co-espressione (verde). DB di stringa necessaria fiducia: Punteggio > 0,4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: elaborazione di cECM di un idrogel preservare l'effettività biologica. Contrasto di fase microscopia immagini dimostrano che digestione enzimatica di cECM per risultati di 48 h in una soluzione di ECM più omogeneizzata; Barra della scala = 500 µm. (A) The ECM soluzione rimane liquido fino a temperatura ambiente (B, a sinistra) e contiene il potenziale di auto-assemblarsi verso un idrogel quando incubati a 37 ° C (B, destra). Live/dead macchia dei fibroblasti umani cardiaci coltivate con e senza cECM rivela una superiore calceina macchiatura intensità delle cellule viventi; Barra della scala = 50 µm (C). L'idrogel di cECM aumenta l'attività metabolica delle cellule di HL1 in condizioni ischemiche nello stesso modo come le particelle (C, il pannello di destra inferiore, per l'ultima volta da Kappler et al. 18) barre rappresentano la media ± SEM, significatività statistica testata da One-way ANOVA e Bonferroni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Descrizione della proteina |
| recettore 5-idrossitriptamina 7 OS = Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2 |
| Actina-come proteina 6B OS = Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1 |
| Actina, muscolo liscio aortiche OS = Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1 |
| Albumina di siero OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2 |
| OS di antitrombina-III = Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1 |
| Apolipoproteina C-III OS = Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1 |
| Apolipoprotein E OS = Homo sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1 |
| Arrotolato-arrotola dominio contenenti proteine 47 OS = Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1 |
| Membro di famiglia 11 dominio di lectine di tipo C A OS = Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1 |
| Proteina di cloruro intracellulare canale 1 OS = Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4 |
| Catena di collagene alpha-2(I) OS = Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7 |
| Complemento C3 OS = Homo sapiens GN = C3 PE = 1 SV = 2 |
| Catena di collagene alpha-2(IV) OS = Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4 |
| AMP ciclico-responsive element-3-come della proteina 4 OS = Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1 |
| Dermatopontin OS = Homo sapiens GN = DPT PE = SV 2 = 2 |
| Fibronectina OS = Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4 |
| Glutatione perossidasi 3 OS = Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2 |
| Alfa subunità dell'emoglobina OS = Homo sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = 2 |
| Emoglobina beta unità secondaria OS = Homo sapiens GN = HBB PE = 1 SV = 2 |
| Regione di IG kappa catena C OS = Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1 |
| Lumican OS = Homo sapiens GN = LUM PE = 1 SV = 2 |
| Mimecan OS = Homo sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1 |
| Nidogeno-1 OS = Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3 |
| Arricchita di pseudopodo atipica chinasi 1 OS = Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4 |
| Il fattore epitelio-derivato pigmento OS = Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4 |
| Trasportatore mitocondriale del coenzima A SLC25A42 OS = Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = SV 2 = 2 |
| Amiloide a siero P-componente OS = Homo sapiens GN = APCS PE = 1 SV = 2 |
| Secondaria di trascrizione iniziazione fattore TFIID 5 OS = Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3 |
| Tudor dominio contenenti proteine 3 OS = Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1 |
| Zinco dito matrina-tipo proteina 4 OS = Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = SV 2 = 1 |
| Zinco proteina dito 101 OS = Homo sapiens GN = ZNF101 PE = SV 2 = 1 |
Tabella 1: Composizione proteica della polvere cECM come determinato mediante spettrometria di massa.
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Discussion
Durante la preparazione del miocardio umano ECM, l'obiettivo è quello di conseguire i seguenti obiettivi: rimozione di materiale cellulare immunogeno pertinente, conservazione dell'integrità di ECM e bioattività, sterilità, non-tossicità del prodotto finale, compatibilità GMP-processo, e idoneità del prodotto per una determinata applicazione in termini di gestione. Combinando il nostro protocollo di decellularizzazione 3-passaggio con ulteriore trasformazione in microparticelle o idrogel autoassemblanti, materiale ECM cardiaco umano viene ottenuto che possiede attività biologica specifica, è facile da gestire, e ha il potenziale per più applicazioni in vitro e in vivo, simile a quello che è stato indicato per prodotti ECM da diversi animali specie11,13,20,21.
Durante l'elaborazione iniziale del tessuto miocardico, è importante a sezioni del miocardio di identico spessore, perché composta concentrazione e durata del trattamento hanno stato titolato per 300 µm fette. Fette spesse sarà in modo incompleto decellularizzati e fette sottili soffrirà indesiderata ripartizione dei componenti della ECM con perdita di bioattività. Ciò è particolarmente importante per quanto riguarda il trattamento di SDS, dove la tossicità può influire negativamente sulle proprietà di ECM e analisi cellulare16. Inoltre, il trattamento prolungato SDS può portare a completa assenza di fibronectin come visto nello studio di Godier-Fournement et al. 22, mentre è conservato con il nostro metodo17. Le sezioni di cECM sono adatte per uso negli esperimenti senza ulteriore elaborazione (vale a dire, in modelli di coltura 3D analisi di differenziazione cellulare o interazioni cellula-ECM, o per gli approcci di ripopolamento cellulare "ingegneria tissutale"). L'uso di FB per la rimozione del DNA è altamente efficiente, ma potenzialmente potrebbe portare ad alcune proteine residue FBS nelle sezioni ECM. Questo potrebbe influenzare qualsiasi analisi sensibili di FBS. La traduzione di un protocollo clinico grado GMP dovrebbe essere possibile con l'uso dei sieri certificate, tuttavia un adattamento potrebbe essere necessario a seconda delle normative. Questo potrebbe essere sia che conferma l'assenza di residui FBS in ECM o un'alterazione del protocollo sarà necessaria sostituire i FB con trattamento della dnasi. Infine, cicli ripetuti di congelamento-scongelamento dei tessuti e delle sezioni di ECM sono a essere evitato per prevenire la degradazione della matrice.
Quando si produce l'idrogel di cECM, digestione pepsina è la fase più critica nel processo. Nei nostri esperimenti iniziali, digestione pepsina a pH 1 per 48 h a 37 ° C hanno portato a una perdita di bioattività, che potrebbe essere evitata modificando l'incubazione a pH 2 per 48 h a 27 oC. Inoltre, tenete a mente che l'idrogel è prodotto da liofilizzato cECM microparticella sospensione, non da fette fresco decellularizzati cECM bagnato. Oltre alla migliorata gestione degli generale di idrogel rispetto alle fette di cECM, l'idrogel ha il vantaggio che possono essere diluito per l'uso in diverse concentrazioni, per esempio a una concentrazione più elevata in combinazione con altri materiali o per 3D cultura, o ad una concentrazione più bassa per il rivestimento delle piastre di coltura delle cellule o come additivo per mezzo di coltura.
Questo protocollo è stato stabilito come una laboratorio-grado SOP per la preparazione di cECM umano aiutare a colmare le lacune nella medicina rigenerativa traslazionale che recentemente sono stati descritti da Sogos et al. 10 mentre decellularizzati cECM fette possono essere applicati come fogli sulla superficie dell'epicardio del cuore malato, come recentemente descritta da George et al., con porcino cECM in un modello del ratto di infarto miocardico23, trasformazione in un idrogel consente più diversificata in vivo applicazioni, come ad esempio l'iniezione di cECM nel miocardio come illustrato da Singelyn et al. 13 , 24 al fine di procedere verso attività traslazionale clinica, l'attuale protocollo dovrà essere convertito in procedure GMP-grado. In linea di principio, tutti i materiali utilizzati sono anche parte dei processi di produzione approvato dispositivo medico/ATMP (cioè, decellularized valvole cardiache o dei vasi sanguigni) e ostacoli principali non sono da attendersi. Tuttavia, le informazioni sulla durata di stoccaggio sicuro e assenza di agenti patogeni certamente sarà richiesti. In ultima analisi, è necessaria una fonte affidabile di maggiori quantità di tessuto del cuore fresco e sterile da donatori senza malattia di cuore. Qui, cuori da donatori deceduti che non sono adatti per il trapianto sono lo scenario più probabile.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il protocollo di studio è conforme ai principi etici delineati nella dichiarazione di Helsinki. Pazienti hanno fornito il consenso informato per l'uso del tessuto per scopi di ricerca, e il processo di raccolta del tessuto è stato approvato dal comitato di etica della Charité - Universitätsmedizin Berlino (EA4/028/12) e Institutional Review Board.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
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