Summary
Ce protocole décrit la DÉCELLULARISATION complete du myocarde humaine tout en préservant ses constituants de la matrice extracellulaire. Traitement ultérieur des résultats dans la production de microparticules et un hydrogel auto-assemblage cytoprotecteurs matrice extracellulaire.
Abstract
Préparations de la matrice extracellulaire acellulaire sont utiles pour étudier les interactions cellule-matrice et facilitent les demandes de thérapie régénératrice des cellules. Plusieurs produits commerciaux de la matrice extracellulaire sont disponibles comme les hydrogels ou membranes, mais ceux-ci ne possèdent pas d’activité biologique spécifique des tissus. Car DÉCELLULARISATION de perfusion n’est habituellement pas possible avec les tissus du coeur humain, nous avons développé un procédé de DÉCELLULARISATION d’immersion 3 étapes. Humaines tranches myocardiques achetés au cours de la chirurgie sont d’abord traitées avec tampon de lyse hyperosmolaire sans tensioactifs, suivie d’une incubation avec l’ionique détergent, dodécyl sulfate de sodium, et le processus s’achève en exploitant l’activité DNase intrinsèque des sérum de veau fœtal. Cette technique aboutit à feuilles acellulaire de matrice extracellulaire cardiaque avec en grande partie préservée composition d’architecture et des biopolymères de tissu fibreux, qui apparaissaient pour offrir des repères écologiques spécifiques aux populations de cellules cardiaques et souches pluripotentes cellules. Feuilles de matrice extracellulaire cardiaque peuvent ensuite être encore transformés en une poudre de microparticules sans modification supplémentaire chimique, ou, via la digestion pepsique à court terme, dans un hydrogel auto-assemblage de matrice extracellulaire cardiaque avec conservés bioactivité.
Introduction
La matrice extracellulaire (ECM) fournit non seulement structurelle soutenir mais est également importante pour la cellule biologique et tissu int1. Dans le coeur, l’ECM participe à la régulation des réponses physiopathologiques comme la fibrose, inflammation, angiogenèse, cardiomyocyte fonction contractile et viabilité et sort de cellules progénitrices résident. En plus de ses principaux composants - glycoprotéines fibreuses, glycosaminoglycanes et protéoglycanes - il contient une foule de facteurs de croissance sécrétés, cytokines et vésicules membraneux contenant des acides nucléiques et protéines2,3.
Récemment, il est devenu clair que les préparations d’ECM acellulaires ne sont pas seulement inestimables pour l’étude des interactions cellule-matrice, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles basés sur les cellules. L’importance d’offrir un environnement adapté aux produits thérapeutiques cellulaires ou tissus ingénieries est maintenant largement reconnu. Ont tenté de combiner des suspensions cellulaires ou des composés actifs avec des hydrogels biopolymères défini4,5,6 ou avec des cocktails de protéines sécrétées par les cellules de sarcome murin (c.-à-d., Matrigel, Geltrex) 7. Toutefois, les anciens ont limité bioactivité, ces derniers sont problématiques dans les processus de qualité GMP, et tous deux n’ont pas la bioactivité spécifique des tissus cardiaques ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
DÉCELLULARISATION du myocarde a précédemment été interprétée par perfusion du cœur tout via le système vasculaire coronaire14,15. Tout cela est possible dans le cœur animal, des cœurs humains intacts sont rarement disponibles. Par conséquent, un processus d’immersion qui permet pour la manipulation des échantillons de tissus obtenus dans la salle d’opération a été favorisé. Notre protocole de « 3-step » contient 3 separate incubation étapes à savoir lyse, solubilisation et l’enlèvement de l’ADN. Il donne humain ECM myocardique avec en grande partie préservé protéine et glycosaminoglycanes composition16,17. Ces tranches de cECM permettent des études in vitro des interactions cellule-matrice, mais sont mal adaptés pour des applications thérapeutiques potentielles de taille humaine. Le procédé de fabrication a été étendu ensuite pour produire des microparticules de cECM lyophilisée ou un hydrogel de cECM18.
Ce protocole permet la DÉCELLULARISATION du myocarde humain obtenu à partir des échantillons chirurgicales, préservant les principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) myocardique et leur activité biologique. Ce protocole est recommandé lorsque l’humain ECM cardiaque avec conserve bioactivité de tissu-spécifique est requis pour l’étude expérimentale des interactions cellule-matrice, ou lorsqu’un environnement adéquat est nécessaire pour des approches basées sur les cellules myocardiques régénération. En principe, il est également possible d’adapter ce protocole se rapportant à des conditions de qualité GMP, afin que l’utilisation de la cECM transformé devrait être faisables applications thérapeutiques à l’avenir.
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Protocol
Le protocole de l’étude respecte les principes éthiques énoncés dans la déclaration d’Helsinki et a été approuvé par le Comité de Conseil et de l’éthique d’étude institutionnelle de l’Université de médecine Charité. Tous les patients fournis écrit, un consentement éclairé pour l’utilisation du tissu cardiaque dans les études expérimentales.
1. préparation du myocarde humain pour le sectionnement
- Obtenir le myocarde ventriculaire gauche (la taille varie selon le type de chirurgie) directement à partir de la salle d’opération et le transport en froid PBS dans un récipient stérile.
- Enlever tous les tissus adipeux avec un scalpel stérile avec une lame n° 10 dans des conditions stériles.
- Couper le myocarde en cubes d’environ 1 x 1 x 1 cm à l’aide d’un scalpel.
- Placez les cubes dans des tubes stériles 50 mL.
Remarque : Pour mettre en pause, effectuez l’étape 1.5, sinon passez à l’étape 2.2. Éviter les cycles de gel-dégel répétés afin d’éviter la dégradation des protéines et une diminution de la qualité du tissu. - Stocker les tubes contenant les cubes à-80 ° C. Le tissu peut être conservé pendant plusieurs mois.
2. séparer les cubes du myocarde en tranches
- Prendre les tubes contenant les glaçons préparés sortis du congélateur.
- Transport sur glace pour le cryostat.
- Régler la température de la salle et l’objet à-15 ° C.
NOTE : La bonne température est cruciale pour garantir une coupe parfaite. - Tubes de refroidissement vide 50 mL et timbres dans la chambre ou sur la glace sèche.
- Ajouter une couche (environ 0,5 - 1,0 mL) du milieu de la cryosection sur le timbre froid et laissez le congeler jusqu'à ce qu’il est blanc et solide.
- Ajouter une deuxième couche de médium cryosection et placez un cube de myocarde sur cette couche.
- Assurez-vous que le support de cryosection et le myocarde sont complètement gelée avant de continuer.
Remarque : Lorsque le support de l’échantillon et cryosection ne sont pas gelés le sectionnement sera affectée. Cryosection complètement gelé moyen passe du fluide et transparente au solide, blanc et opaque. Les cubes myocardiques besoin d’au moins 30 min, jusqu'à 1 h pour geler complètement si continuer immédiatement à l’étape 1.4. Lorsque le tissu est gelé il ne devrait pas déformer quand touché/manipulés avec des pincettes. - Insérez le timbre avec myocarde congelé dans le support et serrer toutes les vis.
- Couper la surface du tissu jusqu'à l’obtention d’une surface de même section.
- Définir l’épaisseur à 300 µm de sectionnement.
- Section le myocarde congelé avec sectionnement automatique. Cela garantit des sections coupées uniformes. Environ 30-40 sections peuvent être tranchées d’un cube.
- Placez chaque tranche après lamélisation lâchement dans un tube rafraîchies 50 mL.
Remarque : N’appuyez pas sur les tranches ou les pack étroitement. Environ 40 tranches peuvent s’insérer dans un tube. - Fermer les tubes remplis et la placer sur la glace.
Remarque : Pour mettre en pause aller sur avec étape 2.14, sinon passez à l’étape 3.2. - Tranches de myocarde magasin à-80 ° C. Les tranches peuvent être stockés pendant plusieurs mois.
3. DÉCELLULARISATION de tranches de myocarde humain
- Prenez le nombre nécessaire de tubes de 50 mL contenant des sections de myocarde hors du congélateur-80 ° C et le transport sur la glace.
- Transférer les coupes congelées de tous les tubes de 50 mL d’étape 3.1 dans un bécher stérile. Environ 40 tranches sont ajoutés dans le bécher par tube de 50 mL. Le bol doit être trois fois le volume des tubes 50 mL ; par exemple, pour DÉCELLULARISATION d’un tube de 50 mL, utilisez un bécher de 150 mL.
- Ajouter 50 mL de solution de lyse (10 mM Tris, 0,1 % p/v EDTA, pH 7,4 en H2O) par le tube de 50 mL avec des tranches de myocarde.
- Secouez les tranches du myocarde dans un bécher stérile à 100-150 tr/min en continu pendant 2 h à température ambiante.
- Filtrer le liquide avec les tranches de tissus à travers un tamis grossier. Transférer les tranches de tissus avec une pince émoussée dans un bécher stérile de nouveau. Ajouter 50 mL de la SDD de 0,5 % dans du PBS par tube initial de 50 mL de tranches de myocarde (p. ex., utilisation solution 100 mL SDS lorsque deux tubes de 50 mL de sections myocardiques sont étant DECELLULARISE).
- Agitez continuellement pendant 6 h à 100-150 tr/min à température ambiante.
- Filtrer le liquide avec les tranches de tissus à travers un tamis grossier. Transférer les tranches de tissus avec une pince émoussée dans un bécher stérile nouvel et laver 3 fois avec 50 mL de PBS pendant 10 min chaque et en agitant à 150 tr/min. Ensuite, lavez toute la nuit dans du PBS 1 % pénicilline/streptomycine et 1 % à 100-150 tr/min et 4 ° C en agitant la nystatine (PBS-P/S-N).
NOTE : Lavage complet est crucial afin d’éliminer complètement toute SDS résiduel. Les traces restantes de la SDD sont toxiques lorsque l’ECM est utilisée en combinaison avec les cellules. - Enlever la solution de lavage et ajouter 25 mL préchauffé FBS (37 ° C) avec 1 % pénicilline/streptomycine et 1 % Nystatin pour les tranches DECELLULARISE par tube initial de 50 mL de tranches de myocarde.
- Incuber pendant 3 h à 37 ° C. Dans cette étape, aucun ADN restant est supprimée de la matrice en raison de l’activité DNase intrinsèque de la FBS.
- Transférer les tranches dans un bécher stérile nouvel et laver 3 fois avec 50 mL de PBS de 10 min chacun et en agitant à 150 tr/min.
Remarque : Les tranches de ECM peuvent être stockés dans le PBS-P/S-N à 4 ° C pendant plusieurs jours. Toutefois, il est recommandé de procéder immédiatement.
4. traitement de la cECM Decellularized en poudre
- Déposer les tranches de ECM vaguement dans une nouvelle plaque 6 puits stérile. Geler l’ECM à-80 ° C et lyophiliser pour 2 jours dans un lyophilisateur.
Remarque : plus d’une tranche peut être placée par puits. Disposer les tranches pour recouvrir entièrement la surface du puits. Chevauchant les tranches n’affecte pas la réussite ultérieure de pulvérisation. - Pour la pulvérisation de la tranche de l’ECM, le fraisage spécifiques d’utilisation tubes (voir Table des matières) contenant perles en céramique de 1,4 mm. Remplir les tubes souplement avec lyophilisée ECM à l’aide de pincettes émoussé stérile. Pour des résultats optimaux, un poids total de ECM entre 10-20 mg est recommandé.
Remarque : Si l’ECM est trop étroitement emballée dans les tubes de fraisage le processus de pulvérisation sera négativement affecté. - Clin d’oeil-gel les tubes dans l’azote liquide.
Avertissement: l’azote liquide est très basse température, porter une protection personnelle appropriée. -
Insérer les tubes congelés dans la fraiseuse et pulvériser l’ECM.
- Définir une durée de 30 s et un maximum de vitesse et démarrer l’appareil.
- Après avoir terminé, retirez les tubes et nouveau clin d’oeil-congélation dans l’azote liquide.
- Répéter cinq fois.
- Laver les microparticules des tubes en ajoutant 1 mL FD2O par le tube et agiter ou vortex pour solubilisation complète. Filtrer la solution hétérogène au travers d’une maille de 200 µm dans un tube de 50 mL.
- Congeler le tube dans l’azote liquide ou de-80 ° C.
- Replacez le couvercle standard du tube avec un filtre de 0,22 µm. Ce couvercle de filtre empêche la poudre ne s’écoule hors du tube, mais permet une circulation d’air pour l’évaporation de l’eau.
- Insérer les tubes dans le lyophilisateur et lyophiliser à nouveau pour retirer l’eau de l’étape (étape 4.5)
Remarque : La lyophilisation à cette étape peut prendre jusqu'à 3 jours. - Stocker la poudre à-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure ou continuez au point 5.1.
5. enzyme basé accolés de cECM micro-particules
- Dissoudre la pepsine porcine à 0,01 M HCl (pH 2,0) à une concentration de 1 mg/mL. Placer sur un agitateur rotatif à température ambiante jusqu'à ce qu’il soit complètement dissous.
- Dissoudre la poudre lyophilisée de l’ECM humaine (étape 4.8) dans la solution de pepsine à une concentration finale de 10 mg/mL. Mélanger soigneusement par le biais de pipetage. Le volume total dépend de la quantité de solution ECM nécessaire. Par exemple, dissoudre 10 mg de poudre de l’ECM dans 1 mL de solution de pepsine.
NOTE : Dissoudre les particules peut être soutenu par agitation douce (1 000-1 500 tr/min). Restant des grumeaux de microparticules affectera négativement la digestion. - Transvaser la solution dans les tubes de 2 mL avec un volume de 1 mL par tube.
- Placer les tubes dans un shaker de tube pendant 48 h à 27 ° C et 1 200 tr/min.
- Retirer les tubes de l’agitateur et placer sur glace ou un tube préalablement refroidi.
- Mélange 1/9 du volume de la solution ECM de froid 10 x PBS (pH 7,4) avec 1/10 du volume de la solution ECM de froid 0,1 M NaOH dans un tube rafraîchie et la place sur la glace. Ce mélange va neutraliser la solution ECM digérée et inactiver irréversiblement la pepsine.
- Ajouter la solution ECM au mélange de neutralisation et mélanger soigneusement grâce à la pipette ou l’agitation.
- L’ECM de la valeur de la concentration désirée avec 1 x PBS (pH 7,4). Le pH de la solution peut être vérifié avec papier pH.
Remarque : Exemple de calcul pour 10 mL digéré solution ECM :
Ajouter la pepsine porcine 10 mg pour 10 mL de HCl (pH 2,0).
Ajouter 100 mg ECM poudre pour solution de pepsine.
Remarque : Exemple de calcul pour la neutralisation des 10 mL digéré solution ECM et en réglant la concentration de 8 mg/mL :
Le volFinal = ccommencer x VolDémarrer / cFinal = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
Vol10xPBS = VolDémarrer / 9 = 1/9 de PBS 10 x 10 mL = 1,11 mL
Vol deNaOH = VolDémarrer / 10 = 1/10 de 10 mL = 1 mL
Vol1xPBS = Vol VolFinal - Volcommencer -10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 et 1 mL = 0,39 mL
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Representative Results
Le protocole 3 étapes pour DÉCELLULARISATION du myocarde humain présenté ici résultats dans l’élimination presque complète du matériel cellulaire, tout en préservant les principales composantes de l’ECM et la structure fibrillaire d’ECM. Après DÉCELLULARISATION, le brut prélèvement de cellules du tissu est évident par le changement de couleur (Figure 1 a). L’analyse histologique avec des taches de H & E et Trichrome de Masson a révélé l’absence totale de cellules intactes résiduelles (Figure 1 b). Dosages quantitatifs pour les composants individuels de ECM a révélé une élimination plus complète de l’ADN et la meilleure préservation du total collagène, d’élastine et de glycosaminoglycanes, comparativement aux DÉCELLULARISATION par SDS seul (Figure 2 a). Fonctionnelle l’activité biologique de la cECM est en évidence dans la Figure 2 b. Ici, RT-PCR a été utilisée pour quantifier l’expression des protéines structurales cardiomyocyte (Myh6, Tnnt2), dès le début (Mef2c, Nkx2.5) et fin (Gata4) cardiomyogénique facteurs de transcription et gènes de marqueurs de surface des cellules endothéliales (von Willibrand, facteur (vWF), VE-cadherin) en ESC murine en cours de différenciation spontanée. Par rapport à la culture non revêtus plat surface et revêtement de Matrigel-ECM, il est évident que contact avec cECM pousse les cellules souches pluripotentes préférence vers un phénotype de type cardiomyocyte.
Lyophilisé tranches ECM peuvent être transformés en microparticules sans utiliser des réactifs enzymatiques ou chimiques. Mécanique de meulage ou de pulvérisation utilisant des kits adaptés a permis la production de microparticules avec une taille unique (Figure 3 a). Spectrométrie de masse donne un aperçu de toutes les protéines reconnaissables dans la cECM. Gene ontology analyse se concentrant sur les éléments cellulaires a révélé que la majorité des protéines ECM est en effet issue de l’espace extracellulaire, avec quelques résidus d’hémoglobine et un certain nombre de protéines principalement intracellulaires (Figure 4). Ce modèle peut déterminer la fonction biologique du tissu-spécifique de la cECM, mais cette hypothèse a besoin de recherches plus poussées. Un aperçu de la composition en protéines cECM Table 1. Transformation de l’ECM en microparticules conserve son activité biologique. HL-1 cellules exposées à des conditions simulées « ischémique » (privation d’hypoxie, de glucose et de sérum) affichent une augmentation de métabolisme cellulaire (Figure 3 b) et une diminution dans la mort cellulaire lorsqu’il est cultivé sur la cECM (Figure 3).
Digestion limitée basée sur la pepsine, de la poudre de la cECM, basée sur un protocole modifié mis au point pour le collagène purification19, se traduit par une solution d’ECM homogénéisée. Images de microscopie photonique contraste phase (Figure 5 a) démontrent le processus de digestion après 0 h et 48 h. Cette étape d’homogénéisation facilite les applications dans la médecine régénérative,10. La cECM transformé qui en résulte est illustrée à la Figure 5 b. Sous la température ambiante, il reste liquide (Figure 5 b, à gauche), mais à 37 ° C, il forme un hydrogel auto-assemblage avec stabilité convenable pour une superposition avec des suspensions de cellules permettant la culture 3D (image représentative, droit de la Figure 5 b , hydrogel couches avec milieu de culture). Live/dead coloration des fibroblastes cardiaques humaines montre aussi les effets bénéfiques de culture sur la cECM (Figure 5). Les microparticules de cECM et hydrogel cECM amélioré l’activité métabolique des cellules contractiles HL1 conditions ischémiques par rapport aux cellules en culture standard (Figure 5, tableau droit inférieur).
Figure 1 : DÉCELLULARISATION du myocarde cardiaque humaine. (A) analyse macroscopique de la cECM au microscope stéréo révèle l’enlèvement du matériel cellulaire avec le protocole DÉCELLULARISATION de 3 étapes. Cela est évident par l’augmentation de la transparence. (B) histologie coloration des tranches myocardiques avant et après DÉCELLULARISATION avec HE-(à gauche ; Echelle = 50 µm) et Trichrome de Masson coloration (à droite ; Echelle = 200 µm) montre la suppression réussie de cellules provenant du tissu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : contenu et effet de tranches de cECM. (A) une analyse biochimique Quantitative de certains composants ECM et ADN, comparant le protocole 3-étape DÉCELLULARISATION DÉCELLULARISATION SDS seuls 0,5 %. Données sont exprimées en pourcentage de la teneur dans le myocarde native. Avec le protocole 3-étape, la teneur en ADN résiduelle était presque nulle et sensiblement inférieurs qu’après qu’une incubation de 9 h avec une norme combiné 0,5 % SDS/lyse tampon combinaison et FBS (SDS 9 h + FBS). Des épreuves biochimiques respectifs ont démontré une préservation quasi-complète du collagène, environ 20 % de préservation des glycosaminoglycanes contenu par rapport aux tissus natifs et une préservation de près de 30 % de la teneur en élastine, nettement supérieure à celle d' le protocole standard de référence du SDS (barres représentent en moyenne ± SEM). Expression de l’ARNm (B) de certains gènes dans les cellules souches pluripotentes induites différenciant sur cECM, comparé au non revêtus de Pétri et à surface enduite Matrigel. cECM données sont normalisées à celles obtenues sur les matériaux de contrôle respectifs (contrôle = 1, ligne de pointillés). La majorité des gènes cardiaques est significativement plus fortement exprimée lorsqu’il est cultivé sur la cECM (barres représentent en moyenne ± SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : aspect et l’activité biologique de microparticules de cECM. (A) au moyen de microparticules poudre de cECM après lyophilisation. (B) métabolisme (MTS) et (C) cellules mort (libération de LDH) analyse des cellules HL-1 cultivées avec la cECM ou gélatine. cECM a significativement réduit la mort cellulaire et augmente le métabolisme. Les barres représentent la moyenne ± SEM, signification statistique testée par aller simple ANOVA et Bonferroni. Figure 3 b -C ont été modifiés de Kappler et al. 18 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : composition en protéines des microparticules de cECM. Suite à la spectrométrie de masse, analyse de la chaîne DB représente les composantes clés de la cECM, qui sont principalement liés à l’espace extracellulaire (GO : 0005615 ; sphères rouges p > 0,05). Lignes indiquent les interactions protéine basée sur des données expérimentales-biochimiques (violettes), sur la co-expression données (noires), sur les interactions de base de données (bleues) et sur la co-expression (vert). DB de chaîne nécessaire confiance : score > 0,4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : transformation de la cECM à un hydrogel préserver l’effectivité biologique. Images de microscopie photonique contraste phase démontrent que la digestion enzymatique de la cECM pour résultats de 48 h dans une solution d’ECM plus homogénéisée ; Echelle = 500 µm. (A) The ECM solution reste liquide à température ambiante (B, gauche) et contient le potentiel de s’auto-assembler vers un hydrogel incubés à 37 ° C (B, droit). Vivre/dé tache des fibroblastes cardiaques humaines cultivées avec ou sans la cECM révèle un supérieur calcéine coloration intensité des cellules vivantes ; Echelle = 50 µm (C). L’hydrogel cECM augmente l’activité métabolique des cellules HL1 en conditions ischémiques de la même manière que les micro particules (C, panneau droit inférieur, modifiée de Kappler et al. Les barres de 18) représentent la moyenne ± SEM, signification statistique testée par aller simple ANOVA et Bonferroni. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Description de la protéine |
| 5-hydroxytryptamine receptor 7 OS = Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2 |
| Actine-comme la protéine OS 6 b = Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1 |
| Actine, les fibres musculaires lisses aortiques OS = Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1 |
| Sérum albumine OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2 |
| Antithrombine III OS = Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1 |
| Apolipoprotein C-III OS = Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1 |
| L’apolipoprotéine E OS = Homo sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1 |
| Coiled-coil contenant du domaine protéine 47 OS = Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1 |
| Membre de la famille 11 domaine lectine de type C A OS = Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1 |
| La protéine intracellulaire canal chlorure 1 OS = Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4 |
| Chaîne de alpha-2(I) de collagène OS = Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7 |
| Complément C3 OS = Homo sapiens GN = PE C3 = 1 SV = 2 |
| Chaîne de alpha-2(IV) de collagène OS = Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4 |
| Favorisant l’AMP cyclique-liaison élément 3-comme la protéine 4 OS = Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1 |
| Dermatopontin OS = Homo sapiens GN = DPT PE = 2 SV = 2 |
| La fibronectine OS = Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4 |
| Glutathion peroxydase 3 OS = Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2 |
| Alpha de sous-unité de l’hémoglobine OS = Homo sapiens GN = PE HBA1 = 1 SV = 2 |
| Bêta de l’hémoglobine sous-unité OS = Homo sapiens GN = HBB PE = 1 SV = 2 |
| Région de IG kappa chain C OS = Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1 |
| Lumican OS = Homo sapiens GN = PE LUM = 1 SV = 2 |
| Mimecan OS = Homo sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1 |
| Nidogene-1 OS = Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3 |
| Enrichi de pseudopode atypique kinase 1 OS = Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4 |
| Facteur de dérivé de l’épithélium pigmentaire OS = Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4 |
| Mitochondrial A coenzyme transporteur SLC25A42 OS = Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = 2 SV = 2 |
| Amyloïde sérique OS composant P = Homo sapiens GN = TTB PE = 1 SV = 2 |
| Sous-unité 5 d’initiation de facteur de transcription TFIID OS = Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3 |
| Tudor protéine contenant du domaine 3 OS = Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1 |
| Protéine de matrin-type 4 de doigt de zinc OS = Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1 |
| La protéine 101 de doigt de zinc OS = Homo sapiens GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1 |
Tableau 1 : Composition en protéines de cECM poudre telle que déterminée par spectrométrie de masse.
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Discussion
Lors de la préparation humaine ECM myocardique, l’objectif est de réaliser ce qui suit : enlèvement du matériel cellulaire immunogène pertinent, préservation de l’intégrité de l’ECM et la bioactivité, stérilité, absence de toxicité du produit fini, compatibilité GMP-process, et qualités du produit pour une application donnée en termes de manipulation. En combinant notre protocole DÉCELLULARISATION 3 étapes avec un traitement ultérieur dans des microparticules ou hydrogel auto-assemblage, matériel d’ECM cardiaque humain qui possède une activité biologique spécifique, est facile à manipuler, est obtenu et a le potentiel pour multiples applications in vitro et in vivo, semblable à ce qui a été démontré pour les produits de l’ECM de plusieurs animaux espèces11,13,20,21.
Lors du traitement initial du tissu myocardique, il est important article myocardique des tranches de même épaisseur, parce que la durée de concentration et le traitement composée ont été titré pour 300 µm tranches. Tranches plus épaisses seront incomplètement DECELLULARISE et plus minces tranches souffrira indésirable ventilation des composantes d’ECM avec perte de bioactivité. Ceci est particulièrement important en ce qui concerne le traitement de la SDS, où la toxicité peut compromettre les propriétés ECM et des analyses cellulaires16. En outre, un traitement prolongé SDS peut conduire à l’absence de la fibronectine totale comme en témoigne l’étude Godier-Fournement et al. 22, alors qu’il est préservé avec notre méthode17. Les sections de la cECM conviennent pour une utilisation dans des expériences sans transformation ultérieure (par exemple, dans les modèles 3D culture analysant la différenciation des cellules ou des interactions cellule-ECM ou d’approches cellulaires repeuplement « ingénierie tissulaire »). L’utilisation de FBS pour l’enlèvement de l’ADN est très efficace, mais susceptible d’entraîner de certaines protéines résiduelles de FBS dans les sections de l’ECM. Cela pourrait influencer les épreuves sensibles FBS. La traduction d’un protocole clinique qualité GMP devrait être possible avec l’utilisation de sérums certifiées, mais une adaptation pourrait être nécessaire selon les réglementations. Cela pourrait être soit confirmant l’absence de résidus de FBS dans l’ECM ou une altération du protocole sera nécessaire pour remplacer le FBS avec traitement de DNase. Enfin, des cycles de gel-dégel répétés du tissu et des sections de l’ECM sont à éviter pour prévenir la dégradation de la matrice.
Lorsque vous générez l’hydrogel cECM, digestion pepsique est l’étape la plus critique dans le processus. Dans nos premières expériences, la digestion pepsique à pH 1 pendant 48 h à 37 ° C a entraîné une perte de la bioactivité, qui pourrait être évitée en modifiant l’incubation à pH 2 pendant 48 h à 27 oC. Aussi, gardez à l’esprit que l’hydrogel est extraite de la cECM lyophilisée MICROPARTICULE suspension, pas de tranches fraîchement DECELLULARISE cECM humide. Outre la meilleure maniabilité générale de l’hydrogel par rapport aux tranches de la cECM, l’hydrogel a l’avantage qu’il peut être dilué pour une utilisation dans des concentrations différentes, par exemple à une concentration plus élevée en combinaison avec d’autres matériaux ou pour la 3D la culture, ou à une concentration inférieure pour le revêtement des récipients de culture cellulaire ou comme additif au milieu de culture.
Ce protocole a été établi comme un POS de qualité laboratoire pour la préparation de la cECM humain aider à combler les lacunes dans la médecine régénérative translationnelle qui ont été récemment décrits par Saldin et al. 10 alors que la cECM DECELLULARISE tranches peuvent être utilisées comme les feuilles sur la surface épicardique du cœur malade, récemment décrite par Sarig et al., avec la cECM porcine dans un modèle de rat de l’infarctus du myocarde23, transformation en un hydrogel permet plus en vivo applications diverses, telles que l’injection de la cECM dans le myocarde comme indiqué par Singelyn et al. 13 , 24 afin d’aller de l’avant vers les activités de traduction cliniques, le protocole actuel devra être converti en procédures GMP-grade. En principe, tous les matériaux utilisés font également partie des procédés de production approuvés dispositif médical/ATMP (c.-à-d., DECELLULARISE des valves cardiaques ou les vaisseaux sanguins) et aucuns obstacles majeurs ne sont à prévoir. Cependant, les informations sur la durée de stockage en toute sécurité et l’absence des agents pathogènes sera certainement requises. En fin de compte, une source fiable de plus grandes quantités de tissus cœur frais et stérile de donneurs sans maladie cardiaque est nécessaire. Ici, les coeurs des donneurs d’organes décédée qui ne conviennent pas à la transplantation sont le scénario le plus probable.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le protocole de l’étude respecte les principes éthiques énoncés dans la déclaration d’Helsinki. Les patients fourni un consentement éclairé pour l’utilisation du tissu à des fins de recherche, et le processus de prélèvement tissulaire a été approuvé par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de la Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
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