Summary
Dieses Protokoll beschreibt die komplette Decellularization des menschlichen Myokard unter Beibehaltung seiner Komponenten der extrazellulären Matrix. Weiterverarbeitung der extrazellulären Matrix Ergebnisse bei der Herstellung von Mikropartikeln und einer zellschützenden selbstorganisierende Hydrogel.
Abstract
Azellulärer extrazelluläre Matrix Präparate eignen sich für das Studium der Zellmatrix Interaktionen und regenerative Therapieanwendungen erleichtern. Einige kommerzielle extrazelluläre Matrix Produkte sind erhältlich als Hydrogele oder Membranen, aber diese besitzen keine Gewebe-spezifische biologischen Aktivität. Da Perfusion Decellularization in der Regel nicht mit menschlichen Herzgewebe möglich ist, haben wir einen 3-Stufen-eintauchen-Decellularization-Prozess entwickelt. Menschlichen myokardiale Scheiben beschafft während der Operation werden zunächst mit Waschmittel-freie Hyperosmolar Lyse Puffer, gefolgt von Inkubation mit ionischen Waschmittel, Sodium Dodecyl Sulfat behandelt und der Vorgang abgeschlossen ist, durch Ausnutzung der intrinsischen DNase-Aktivität des fetale Rinderserum. Diese Technik führt zu zellfreie Blätter der kardialen extrazelluläre Matrix mit weitgehend erhaltenen Bindegewebe Architektur und Biopolymer Zusammensetzung, die erwiesen sich als kardiale Zellpopulationen und pluripotenten Stammzellen bestimmte ökologische Hinweise anzubieten Zellen. Kardiale extrazelluläre Matrix Blätter können dann weiter verarbeitet zu einem Mikropartikel Pulver ohne weitere chemische Modifikation oder, über kurzfristige Pepsin Verdauung in einem selbstorganisierenden kardiale extrazelluläre Matrix Hydrogel mit erhalten Bioaktivität.
Introduction
Die extrazelluläre Matrix (ECM) bietet nicht nur strukturelle Unterstützung ist aber auch wichtig für biologische Zelle und Gewebe Funktion1. Im Herzen beteiligt sich das ECM bei der Regulierung der pathophysiologische Reaktionen wie Fibrose, Entzündungen, Angiogenese, Cardiomyocyte kontraktile Funktion und Lebensfähigkeit und resident Stammvater Zelle Schicksal. Es enthält neben seiner primären Komponenten - faserige Glykoproteine, Glykosaminoglykane und Proteoglykane - eine Vielzahl von sekretierten Wachstumsfaktoren, Zytokine und häutigen Vesikel mit Nukleinsäuren und Proteine,2,3.
Es kürzlich klar geworden, dass azelluläre ECM Vorbereitungen nicht nur für das Studium der Zellmatrix Interaktionen, aber auch für potentielle therapeutische Zell-basierte Anwendungen von unschätzbarem Wert sind. Die Bedeutung der Bereitstellung einer geeigneten Umgebung auf therapeutische Zelle Produkte oder technische Gewebe ist jetzt weithin anerkannt. Versuche wurden unternommen, Zellsuspensionen oder Wirkstoffe kombinieren mit definierten biopolymeric Hydrogele4,5,6 oder mit Protein Cocktails sezerniert murinen Sarkom Zellen (d. h. Matrigel, Geltrex) 7. Erstere haben begrenzte Bioaktivität, letztere sind jedoch problematisch in GMP-Klasse Prozesse, und beide fehlt die gewebespezifischen Bioaktivität von kardialen ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization der Herzmuskel wurde zuvor von Perfusion von ganzem Herzen über den koronaren Gefäßsystem14,15durchgeführt. Dies ist, zwar möglich in tierische Herzen sind intakte Menschenherzen nur selten zur Verfügung. Daher wurde ein Eintauchen-Prozess, für den Umgang mit Gewebeproben im OP-Saal ermöglicht, begünstigt. Unser "3-Step"-Protokoll enthält 3 Separate Inkubation Schritte, nämlich Lyse Solubilisierung und DNA-Entnahme. Es ergibt sich menschlichen myokardialen ECM mit weitgehend erhaltenen Protein und Glykosaminoglykan Zusammensetzung16,17. Diese cECM Scheiben für in-vitro- Studien der Zelle-Matrix Interaktionen ermöglichen aber sind schlecht für Menschen-Skala therapeutische Anwendungsmöglichkeiten geeignet. Der Herstellungsprozess wurde dann erweitert, um entweder lyophilisierten cECM Mikropartikel oder ein cECM Hydrogel18produzieren.
Dieses Protokoll ermöglicht die Decellularization des menschlichen Myokard von chirurgischen Proben, Erhaltung der Hauptkomponenten des myokardialen extrazelluläre Matrix (ECM) und deren biologische Aktivität erreicht. Dieses Protokoll wird empfohlen, wenn menschliche Herz ECM mit erhaltenen Gewebe-spezifische Bioaktivität für experimentelle Studien der Zelle-Matrix Interaktionen erforderlich ist oder wenn ein geeignetes Umfeld für zellbasierte Herzmuskelregeneration Ansätze benötigt wird. Im Prinzip ist es auch möglich, dieses Protokoll zum GMP-Klasse Bedingungen anzupassen, so dass die Verwendung von verarbeitetem cECM machbar in Zukunft therapeutisch sein sollte.
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Protocol
Das Studienprotokoll passt sich an die ethischen Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki und der institutionellen Beitrag Board und Ethik-Ausschuss der Charité medizinische Universität verabschiedet. Alle Patienten zur Verfügung gestellt geschrieben, informierte Zustimmung für den Einsatz von Herzgewebe für experimentelle Studien.
1. Vorbereitung des menschlichen Myokard-Schnitt
- Erhalten Links ventrikulären Myokard (Größe hängt von der Art der Operation) direkt aus dem OP-Saal und Transport in kaltem PBS in einen sterilen Behälter.
- Entfernen Sie alle Fettgewebe mit einem sterilen Skalpell mit Klinge Nr. 10 unter sterilen Bedingungen.
- Schneiden Sie das Myokard in Würfel von ca. 1 x 1 x 1 cm mit einem Skalpell.
- Legen Sie die Würfel in sterilen 50 mL-Tuben.
Hinweis: Um zu pausieren, führen Sie Schritt 1.5, Andernfalls fahren Sie mit Schritt 2.2. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen um Proteinabbau und eine Abnahme der Qualität der Gewebe zu verhindern. - Speichern Sie die Röhrchen mit den Würfeln bei-80 ° C. Das Gewebe kann mehrere Monate aufbewahrt werden.
(2) Schneiden der Herzmuskel Würfel in Scheiben
- Nehmen Sie die Tube(n) enthält die vorbereitete Würfel aus dem Gefrierschrank.
- Transport auf Eis, um den Kryostaten.
- Stellen Sie die Objekt und Raum Temperatur bis-15 ° C.
Hinweis: Die richtige Temperatur ist entscheidend für den perfekten Schnitt zu gewährleisten. - Chill leer 50 mL-Tuben und Briefmarken in der Kammer oder Trockeneis.
- Fügen Sie eine Schicht (ca. 0,5 - 1,0 mL) des Cryosection Mediums auf den kalten Stempel und lassen Sie es einfrieren, bis es weiß und solide.
- Fügen Sie eine zweite Schicht des Cryosection Mediums und legen Sie einen Myokard-Würfel auf dieser Ebene.
- Stellen Sie sicher, dass das Cryosection Medium und Myokard vollständig gefroren sind, bevor Sie fortfahren.
Hinweis: Wenn die Probe und Cryosection Medium sind nicht gefroren der Schnitt beeinträchtigt wird. Vollständig gefroren Cryosection Medium wechselt von flüssig und transparent zu festen, weiß und undurchsichtig. Die myokardiale Würfel benötigen mindestens 30 min bis 1 h komplett gefrieren, wenn sofort Schritt 1.4 Vorgang fortsetzen. Wenn das Gewebe fixiert ist sollte es nicht verformen, wenn berührt/behandelt mit einer Pinzette. - Legen Sie Stempel mit gefrorenen Myokard in der Halterung und ziehen Sie alle Schrauben fest.
- Schneiden Sie die Oberfläche des Gewebes, bis eine sogar Stationspunkte Oberfläche erzielt wird.
- Set bis 300 µm Dicke schneiden.
- Abschnitt der gefrorenen Myokard mit automatischen schneiden. Dies garantiert einheitliche Zuschnitte. Ca. 30-40 Abschnitte können aus einem Würfel geschnitten werden.
- Legen Sie jede Scheibe nach schneiden lose in eine vorgekühlte 50 mL-Tube.
Hinweis: Drücken Sie nicht die Scheiben oder Pack fest. Ca. 40 Scheiben passen in eine Röhre. - Schließen Sie die gefüllten Röhrchen und auf Eis legen.
Hinweis: Um gehen auf Schritt 2.14 pausieren, sonst fahren Sie mit Schritt 3.2. - Shop-Myokard-Scheiben bei-80 ° C. Die Scheiben können für mehrere Monate gespeichert werden.
3. Decellularization der menschlichen Myokard Scheiben
- Nehmen Sie die erforderliche Anzahl von 50 mL Röhrchen mit Myokard Abschnitte aus den-80 ° C Gefrierschrank und Transport auf dem Eis.
- Übertragen Sie die Gefrierschnitte alle 50 mL-Tuben von Schritt 3.1 in einem sterilen Becher. Ca. 40 Scheiben werden die Becher pro 50 mL-Tube hinzugefügt. Der Becher sollte dreimal das Volumen von 50 mL Röhrchen; Verwenden Sie zum Beispiel, für Decellularization eine 50 mL Tube eine 150 mL-Becherglas.
- 50 mL Lyse-Lösung (10 mM Tris, 0,1 % w/V EDTA, pH 7.4 in H2O) pro 50 mL-Tube mit Myokard Scheiben hinzufügen.
- Schütteln Sie die Myokard-Scheiben in einem sterilen Becher bei 100-150 u/min kontinuierlich für 2 h bei Raumtemperatur.
- Die Flüssigkeit mit dem Gewebe Scheiben durch ein grobes Sieb abseihen. Übertragen Sie die Gewebe-Scheiben mit einer stumpfen Pinzette auf einen neuen sterilen Becher. Fügen Sie 50 mL 0,5 % SDS in PBS pro erste 50 mL Tube Myokard Scheiben (z. B. 100 mL SDS Lösung wenn zwei 50 mL Röhrchen der myokardialen Abschnitte sind decellularized wird).
- Schütteln Sie kontinuierlich für 6 h bei 100-150 u/min bei Raumtemperatur.
- Die Flüssigkeit mit dem Gewebe Scheiben durch ein grobes Sieb abseihen. Übertragen Sie die Gewebe-Scheiben mit einer stumpfen Pinzette auf einen neuen sterilen Becher und 3 Mal mit 50 mL PBS für 10 min unter Schütteln bei 150 u/min waschen. Als nächstes über Nacht waschen in PBS mit 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % Nystatin (PBS-P/S-N) bei 100-150 u/min und 4 ° C unter schütteln.
Hinweis: Gründliches Waschen ist entscheidend für jede verbleibende SDS vollständig zu entfernen. Verbleibende Spuren von SDS sind giftig, wenn das ECM in Kombination mit Zellen verwendet wird. - Entfernen Sie die Waschlösung und 25 mL vorgewärmt FBS (37 ° C) mit 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % Nystatin, die decellularized Scheiben pro erste 50 mL-Tube Myokard Scheiben.
- 3 h bei 37 ° c inkubieren In diesem Schritt wird die Matrix aufgrund der intrinsischen DNase-Aktivität von der FBS keine verbleibenden DNA entfernt.
- Übertragen Sie die Scheiben auf einen neuen sterilen Becher und unter Schütteln bei 150 u/min 3 Mal mit 50 mL PBS für 10 min waschen.
Hinweis: Die ECM-Scheiben können im PBS-P/S-N bei 4 ° C mehrere Tage aufbewahrt werden. Es wird jedoch empfohlen, sofort fortfahren.
(4) verarbeiten die Decellularized cECM zu einem Pulver
- Legen Sie die ECM-Scheiben lose in eine neue sterile 6-Well-Platte. Das ECM bei-80 ° C eingefroren und für 2 Tage in ein Gefriertrockner lyophilize.
Hinweis: mehr als eine Scheibe kann pro Bohrloch platziert werden. Ordnen Sie die Scheiben um vollständig bedecken die Oberfläche des Brunnens. Überlappenden Slices hat keinen Einfluss auf den Erfolg der späteren Pulverisierung. - Für die Pulverisierung des ECM-Slice Röhren Verwendung bestimmten Fräsen (siehe Tabelle der Materialien) mit 1,4 mm keramische Perlen. Füllen Sie die Rohre mit lyophilisierten ECM sterile stumpfen Pinzette locker. Um optimale Ergebnisse zu erzielen empfiehlt sich ein Gesamtgewicht von ECM zwischen 10-20 mg.
Hinweis: Wenn das ECM in den Fräsen Röhren zu dicht ist der Pulverisierung Prozess wird negativ beeinflusst werden. - Snap-Einfrieren der Rohre in flüssigem Stickstoff.
Vorsicht: Flüssigstickstoff ist extrem niedrige Temperaturen, geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen. -
Legen Sie die eingefrorene Rohre in die Fräsmaschine und pulverisieren Sie das ECM zu.
- Legen Sie eine Dauer von 30 s und eine maximale Geschwindigkeit und starten Sie das Gerät.
- Nehmen Sie nach Beendigung die Rohre und Snap-Freeze wieder in flüssigem Stickstoff.
- Wiederholen Sie fünfmal.
- Waschen Sie die Mikropartikel aus den Rohren durch Zugabe von 1 mL DdH2O pro Rohr und schütteln oder Wirbel für komplette Gefäss-. Filtern Sie die heterogene Lösung durch ein Netz von 200 µm in einem 50 mL-Tube.
- Fixieren Sie das Rohr in-80 ° C oder flüssiger Stickstoff.
- Den standard Deckel des Rohres mit einem 0,22 µm-Filter. Dieser Filterdeckel verhindert, dass das Pulver aus dem Rohr fließt sondern ermöglicht Luftzirkulation für Wasserverdunstung.
- Legen Sie die Rohre in den Gefriertrockner und lyophilize wieder um das Wasser aus den Schritt (4.5) entfernen
Hinweis: Lyophilisierung bei diesem Schritt kann bis zu 3 Tage dauern. - Lagern Sie Puder bei-80 ° C bis zur Weiterverarbeitung oder fahren Sie mit Schritt 5.1.
(5) Enzym basierend Homogenizing von cECM Mikropartikel
- Porcines Pepsin in 0,01 M HCl (pH 2.0) zu einer Konzentration von 1 mg/mL auflösen. Legen Sie auf einem rotary Schüttler bei Raumtemperatur, bis sie vollständig aufgelöst ist.
- Die gefriergetrockneten menschlichen ECM Pulver (Schritt 4.8) in die Pepsin-Lösung, um eine Endkonzentration von 10 mg/mL auflösen. Mischen Sie durch Pipettieren gründlich. Das Gesamtvolumen hängt die Höhe der ECM-Lösung benötigt. Z. B. 10 mg ECM Pulver in 1 mL Pepsin Lösung auflösen.
Hinweis: Auflösen von Teilchen kann durch sanfte vortexen (1.000-1.500 u/min) unterstützt werden. Verbleibenden Klumpen von Mikropartikeln wird die Verdauung negativ beeinflussen. - Übertragen Sie die Lösung auf 2 mL Röhrchen mit einem Volumen von 1 mL pro Rohr.
- Legen Sie die Rohre in einem Rohr-Shaker für 48 h bei 27 ° C und 1.200 u/min.
- Nehmen Sie die Rohre aus den Shaker und auf Eis oder einem vorgekühlten Rohrhalter.
- Mix 1/9 des Volumens der ECM-Lösung von kalten 10 X PBS (pH 7,4) mit 1/10 des Volumens der ECM-Lösung von Kälte 0,1 M NaOH in eine vorgekühlte Rohr- und Platz auf dem Eis. Diese Mischung wird der verdaute ECM-Lösung zu neutralisieren und irreversibel inaktivieren das Pepsin.
- Die Neutralisation Mischung und die Mischung gründlich durch Pipettieren oder Aufschütteln der ECM-Lösung hinzufügen.
- Legen Sie die ECM auf die gewünschte Konzentration mit 1 X PBS (pH 7,4). Der pH-Wert der Lösung kann mit pH-Papier überprüft werden.
Hinweis: Beispielrechnung für 10 mL verdaut ECM-Lösung:
Porcines Pepsin 10 mg zu 10 mL HCl (pH 2.0) hinzufügen.
100 mg ECM Pulver Pepsin Projektmappe hinzufügen.
Hinweis: Beispielrechnung zur Neutralisation 10 mL verdaut ECM-Lösung und die Konzentration auf 8 mg/mL:
VolFinal = Cstart X Volstart / cFinal = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
Vol10xPBS = Volstarten / 9 = 1/9 von 10 mL = 1,11 mL 10 X PBS
VolNaOH = Volstarten / 10 = 1/10 von 10 mL = 1 mL
Vol1xPBS = VolFinal - Volstarten - Vol10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL
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Representative Results
Das 3-Stufen-Protokoll für Decellularization der menschlichen Myokard hier vorgestellten Ergebnisse in nahezu vollständigen Entfernung von Zellmaterial, unter Beibehaltung der wichtigsten ECM-Komponenten und die fibrillären Struktur des ECM. Nach Decellularization zeigt sich die grobe Entfernung von Zellen aus dem Gewebe durch die Änderung der Farbe (Abbildung 1A). Histologischen Untersuchung mit H & E und Masson Trichrome Flecken offenbart das völlige Fehlen von verbleibenden intakten Zellen (Abbildung 1 b). Quantitativen Assays für die einzelnen ECM-Komponenten offenbart eine vollständige DNA-Entnahme und besseren Schutz der gesamten Kollagen, Elastin und Glykosaminoglykane, verglichen mit Decellularization von SDS allein (Abbildung 2A). Funktionalen Beweise für die biologische Aktivität der cECM ist in Abbildung 2 bdargestellt. Hier, RT-PCR wurde verwendet, um den Ausdruck der strukturellen Cardiomyocyte Proteine (Myh6, Tnnt2), früh zu quantifizieren (Mef2c, Nkx2.5) und Ende (Gata4) Cardiomyogenic Transkriptionsfaktoren, und Endothelzellen Oberfläche Markergene (von Willibrand-Faktor (vWF), VE-cadherin) in murine ESC in der spontanen Differenzierung. Im Vergleich zu unbeschichteten Kultur Gericht Oberfläche und Matrigel-ECM-Beschichtung, ist es offensichtlich, dass Kontakt mit cECM pluripotenten Stammzellen bevorzugt gegenüber einem Cardiomyocyte-ähnlichen Phänotyp treibt.
Lyophilisierte ECM-Scheiben werden in Mikropartikel weiterverarbeitet ohne Verwendung von enzymatischen oder chemischen Reagenzien. Mechanisches Schleifen oder pulverisieren mit geeigneten Kits für Herstellung von Mikropartikeln mit einer einheitlichen Größe (Abbildung 3A) erlaubt. Massenspektrometrie bietet einen Überblick über alle erkennbaren Proteine in cECM vorhanden. Gen Ontologie Analyse konzentriert sich auf zellularen Bestandteilen ergab, dass die Mehrheit der ECM-Proteine in der Tat aus extrazellulären Raum, mit einigen Hämoglobin Rückstände und eine Reihe von vorwiegend intrazelluläre Proteine (Abbildung 4). Dieses Muster kann die Gewebe-spezifische biologische Funktion der cECM festlegen, aber diese Hypothese Bedarf weiteren Forschung. Eine Übersicht über die Proteinzusammensetzung cECM zeigt sich in Tabelle 1. Verarbeitung der ECM in Mikropartikel bewahrt seine biologischen Aktivität. HL-1 Zellen, simulierten "ischämische" Bedingungen (Hypoxie, Glukose und Serum Deprivation) angezeigt eine Erhöhung im Zellstoffwechsel (Abb. 3 b) und eine Abnahme der Zelltod bei auf cECM (Abbildung 3) kultiviert.
Begrenzte Pepsin basierende Verdauung des cECM Pulvers, basierend auf einem modifizierten Protokoll entwickelt für Kollagen Reinigung19, entsteht eine homogenisierte ECM-Lösung. Phase Kontrast lichtmikroskopische Bilder (Abb. 5A) zeigen die Verdauung nach 0 h und 48 h. Dieser homogenisierenden Schritt erleichtert die Anwendungen in der regenerativen Medizin10. Die daraus resultierende verarbeiteten cECM ist in Abbildung 5 bgezeigt. Unterhalb der Raumtemperatur es flüssig bleibt (Abb. 5 b, links) aber bei 37 ° C bildet es eine selbstorganisierende Hydrogel mit Stabilität für eine Überlagerung mit Zellsuspensionen erlaubt 3D Culture (repräsentatives Bild, Abbildung 5 b rechts, Hydrogel geschichtet mit Nährmedium). Lebenden/Toten Färbung des menschlichen kardialen Fibroblasten zeigt auch die wohltuende Wirkung der Kultivierung auf cECM (Abbildung 5). CECM Mikropartikel und cECM Hydrogel erhöht die Stoffwechselaktivität der kontraktilen HL1-Zellen im ischämischen Bedingungen im Vergleich zu Zellen in standard-Kultur (Abbildung 5, unteren rechten Fensterbereich).
Abbildung 1: Decellularization des menschlichen Herzens Myokard. (A) makroskopische Analyse der cECM von Stereo-Mikroskopie zeigt die Entfernung von Zellmaterial mit dem 3-Stufen-Decellularization-Protokoll. Dies wird deutlich durch die Erhöhung der Transparenz. (B) Histologie Färbung der myokardialen Scheiben vor und nach Decellularization mit HE-(links; Maßstabsleiste = 50 µm) und Masson Trichrome Färbung (rechts; Maßstabsleiste = 200 µm) zeigt Abwahl von Zellen aus dem Gewebe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Inhalt und Wirkung der cECM Scheiben. (A) Quantitative biochemische Analyse der ausgewählten ECM-Komponenten und DNA, Vergleich der 3-Stufen-Decellularization Protokoll um 0,5 % SDS-allein Decellularization. Daten werden als Prozentsatz des Inhalts in native Myokard ausgedrückt. Mit dem 3-Schritt-Protokoll den Restgehalt von DNA war fast gleich Null und deutlich niedriger als, dass nach eine 9 h Inkubation mit einem Standard kombiniert 0,5 % SDS/Lyse Puffer Kombination und FBS (SDS 9 h + FBS). Jeweiligen biochemischen Assays zeigte eine nahezu vollständigen Erhaltung des Kollagens, ca. 20 % Erhaltung der Glykosaminoglykan Inhalte im Vergleich zu nativen Gewebe und eine fast 30 % Erhaltung von Elastin Inhalt, alle deutlich höher als bei die SDS Referenz Standardprotokoll (Balken stehen für Mittelwert ± SEM). (B) mRNA Expression von ausgewählten Genen in induzierte pluripotente Stammzellen differenzieren auf cECM, im Vergleich zu unbeschichteten Kultur Gerichte und Matrigel beschichtete Oberfläche. cECM Daten werden normalisiert, um denen, die auf die jeweiligen Kontrollmaterialien (Kontrolle = 1, gestrichelte Linie). Die Mehrheit der kardialen Gene werden deutlich höher angegeben, wenn auf cECM kultiviert (Balken stehen für Mittelwert ± SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Darstellung und biologische Aktivität des cECM Mikropartikel. (A) cECM Mikropartikel Pulver nach Gefriertrocknung. (B) Stoffwechsel (MTS) und (C) Zelle Tod (LDH-Freisetzung) Analyse der HL-1-Zellen kultiviert mit cECM oder Gelatine. cECM Zelltod reduziert und erhöht den Stoffwechsel. Balken stehen für Mittelwert ± SEM, statistische Signifikanz von One-Way ANOVA und Bonferroni getestet. Abbildung 3 b -C wurden von Kappler Et Al. geändert 18 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Proteinzusammensetzung von cECM Mikropartikel. Nach Massenspektrometrie, String DB Analyse zeigt die wichtigsten Komponenten von cECM, die vor allem mit den Extrazellulärraum verbunden sind (GO: 0005615; rote Kugeln p > 0.05). Linien zeigen die Protein-Interaktionen anhand von experimentellen biochemischen Daten (lila), auf Co Daten (schwarz), Datenbank-Interaktionen (blau), und Co Ausdruck (grün). Zeichenfolge DB erforderliche Vertrauen: Partitur > 0,4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Verarbeitung von cECM, ein Hydrogel bewahren die biologische Wirksamkeit. Phase Kontrast lichtmikroskopische Bilder zeigen, dass enzymatische Verdauung von cECM für 48 h Ergebnisse in einer mehr homogenisierten ECM-Lösung; Maßstabsleiste = 500 µm. (A) der ECM-Lösung bleibt flüssig bis Raumtemperatur (B, links) und enthält das Potenzial, zu einem Hydrogel als bei 37 ° C (B, rechts) inkubiert selbst zusammensetzen. Lebenden/Toten Fleck der kardialen menschlichen Fibroblasten kultiviert mit und ohne cECM zeigt eine höhere Calcein Färbung Intensität von lebenden Zellen; Maßstabsleiste = 50 µm (C). CECM Hydrogel erhöht die Stoffwechselaktivität der HL1-Zellen im ischämischen Bedingungen in der gleichen Weise wie die Mikro-Partikeln (C, unteren rechten Bereich, modifiziert von Kappler Et al. 18) Balken stehen für Mittelwert ± SEM, statistische Signifikanz von One-Way ANOVA und Bonferroni getestet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Protein-Beschreibung |
| 5-Hydroxytryptamine Rezeptor 7 OS = Homo Sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2 |
| Actin-wie Protein 6 b OS = Homo Sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1 |
| Aktin, Aorten-Glattmuskel OS = Homo Sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1 |
| Serum-Albumin OS = Homo Sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2 |
| Antithrombin III OS = Homo Sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1 |
| Apolipoprotein C‑III OS = Homo Sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1 |
| Apolipoprotein E OS = Homo Sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1 |
| Coiled-Coil Domäne-haltige Protein 47 OS = Homo Sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1 |
| C-Art Lectin Domänenmitglied Familie 11 A OS = Homo Sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1 |
| Chlorid-intrazelluläre Kanal-Protein 1 OS = Homo Sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4 |
| Kollagen alpha-2(I) Kette OS = Homo Sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7 |
| Ergänzung C3 OS = Homo Sapiens GN = C3 PE = 1 SV = 2 |
| Kollagen alpha-2(IV) Kette OS = Homo Sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4 |
| Zyklisches AMP-responsive Element-Binding Protein 3-wie Protein 4 OS = Homo Sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1 |
| Dermatopontin OS = Homo Sapiens GN = DPT PE = 2 SV = 2 |
| Fibronektin OS = Homo Sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4 |
| Glutathion Peroxidase 3 OS = Homo Sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2 |
| Hämoglobin-Untereinheit Alpha OS = Homo Sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = 2 |
| Hämoglobin-Untereinheit Beta OS = Homo Sapiens GN = HBB PE = 1 SV = 2 |
| IG-Kappa-Kette C-Region OS = Homo Sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1 |
| Lumican OS = Homo Sapiens GN = LUM PE = 1 SV = 2 |
| Mimecan OS = Homo Sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1 |
| Nidogen-1 OS = Homo Sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3 |
| Pseudopodium angereicherte atypische Kinase 1 OS = Homo Sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4 |
| Pigment Epithel abgeleitet Faktor OS = Homo Sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4 |
| Mitochondriale Coenzym A Transporter SLC25A42 OS = Homo Sapiens GN = SLC25A42 PE = 2 SV = 2 |
| Serum Amyloid P-Anteil OS = Homo Sapiens GN = APCS PE = 1 SV = 2 |
| Transkription Einleitung Faktor TFIID Untereinheit 5 OS = Homo Sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3 |
| Tudor Domäne-haltige Protein 3 OS = Homo Sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1 |
| Zink-Finger Organa-Typ Protein 4 OS = Homo Sapiens GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1 |
| Zink-Finger Protein 101 OS = Homo Sapiens GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1 |
Tabelle 1: Proteinzusammensetzung cECM Pulver durch Massenspektrometrie bestimmt.
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Discussion
Beim menschlichen myokardialen ECM vorbereiten, das Ziel ist es, Folgendes zu erreichen: Entfernung von relevanten immunogen Zellmaterial, Erhaltung der Integrität von ECM und Bioaktivität, Sterilität, Ungiftigkeit des Endproduktes, GMP-Prozess Kompatibilität und Eignung des Produkts für eine bestimmte Anwendung in Bezug auf die Handhabung. Durch die Kombination unserer 3-Stufen-Decellularization-Protokoll mit Weiterverarbeitung zu Mikropartikeln oder selbstorganisierende Hydrogel, kardiale ECM Menschenmaterial ergibt, die spezifische biologischen Aktivität besitzt, ist einfach zu handhaben, und hat das Potenzial für mehrere Anwendungen in Vitro und in Vivo, ähnlich wie was für ECM-Produkten von mehreren Tierarten11,13,20,21nachgewiesen wurde.
Während der anfänglichen Verarbeitung das Herzmuskelgewebe ist es wichtig, Abschnitt myokardialen identischen dicke Scheiben, weil zusammengesetzte Konzentration und Behandlung Dauer haben für 300 µm Scheiben titriert wurde. Dickere Scheiben werden unvollständig decellularized und dünnere Scheiben werden unerwünschte Aufschlüsselung der ECM-Komponenten mit Verlust der Bioaktivität leiden. Dies ist besonders wichtig im Hinblick auf die SDS-Behandlung, wo kann Toxizität ECM Eigenschaften und zelluläre Analysen16beeinträchtigen. Darüber hinaus kann längere SDS-Behandlung führen zu fehlender Fibronektin abzuschließen, wie in der Studie von Godier-Fournement Et al. 22, während es mit unserer Methode17erhalten bleibt. Die cECM Abschnitte sind geeignet für den Einsatz in Experimenten ohne weitere Bearbeitung (z.B. in 3D Culture Modelle analysieren Zelldifferenzierung oder Zelle-ECM-Interaktionen oder für "Tissue Engineering" zelluläre Wiederbesiedlung Ansätze). Die Verwendung von FBS für DNA-Entnahme ist hocheffizient, aber könnte möglicherweise dazu führen, einige restliche FBS-Proteine in den ECM-Abschnitten. Dies könnte jede FBS empfindliche Tests beeinflussen. Die Übersetzung zu einem klinischen Klasse GMP-Protokoll sollte mit dem Einsatz von zertifizierten Sera, jedoch eine Anpassung je nach Vorschriften erforderlich sein könnten. Dies könnte entweder bestätigen das Fehlen von FBS-Rückständen in der ECM oder eine Änderung des Protokolls wird notwendig sein, die FBS mit DNase-Behandlung zu ersetzen. Zu guter Letzt sollen wiederholte Frost-Tau-Zyklen der Gewebe und ECM-Abschnitte vermieden werden, um Abbau der Matrix zu verhindern.
Bei der Herstellung der cECM Hydrogel ist Pepsin Verdauung der wichtigste Schritt in diesem Prozess. In unseren ersten Experimenten führte Pepsin Verdauung bei pH 1 für 48 h bei 37 ° C zu einem Verlust der Bioaktivität, die verhindert werden könnten, indem Sie ändern die Inkubation auf pH 2 für 48 h bei 27 oC. Auch, denken Sie daran, dass das Hydrogel aus lyophilisierten cECM Mikropartikel Suspension, nicht aus frisch decellularized nass cECM Scheiben hergestellt wird. Neben der verbesserten allgemeinen Umgang mit Hydrogel verglichen mit cECM Scheiben hat Hydrogel den Vorteil, dass es für den Einsatz in unterschiedlichen Konzentrationen, zum Beispiel auf eine höhere Konzentration in Kombination mit anderen Materialien oder für 3D verdünnt werden können Kultur, oder bei einer niedrigeren Konzentration für die Beschichtung von Zelle Kultur Gerichten oder als Zusatz zum Kulturmedium.
Dieses Protokoll wurde eingerichtet als eine Laborqualität SOP für menschliche cECM Vorbereitung zu helfen, die Lücken in der translationalen regenerative Medizin, die vor kurzem von Saldin Et Al. beschrieben wurden 10 während decellularized cECM Scheiben als Blätter auf der epicardial Oberfläche des erkrankten Herzens, wie kürzlich beschrieben durch Sarig Et Al., mit Schweinen cECM in einem Rattenmodell Myokardinfarkt23, angewendet werden können die Verarbeitung zu einem hydrogel ermöglicht vielfältiger in Vivo Anwendungen, wie z. B. die Injektion von cECM in Myokard dargestellt durch Singelyn Et al. 13 , 24 um hin zu klinischen translationale Aktivitäten fortzufahren, müssen das aktuelle Protokoll auf GMP-Klasse Verfahren umgestellt werden. Im Prinzip alle verwendeten Materialien sind auch Teil der zugelassenen medizinischen Gerät/ATMP Produktionsprozesse (d. h. decellularized Herzklappen oder Blutgefäße) und keine wesentlichen Hindernisse sind zu erwarten. Informationen über die sichere Lagerung Dauer und Abwesenheit von Krankheitserregern werden jedoch sicherlich erforderlich. Letztlich braucht man eine zuverlässige Quelle für größere Mengen an frischen und sterile Herzgewebe von Spendern ohne Herz-Kreislauferkrankungen. Hier sind die Herzen von verstorbenen Organspender, die nicht für eine Transplantation geeignet sind das wahrscheinlichste Szenario.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Das Studienprotokoll passt sich an die ethischen Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki. Patienten zur Verfügung gestellt informierte Zustimmung für die Verwendung des Gewebes um zu Forschungszwecken und der Prozess der Gewebe Sammlung von Institutional Review Board und Ethikkommission der Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12) genehmigt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
