Summary
Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.
Abstract
Acellulair extracellulaire matrix preparaten zijn nuttig voor het bestuderen van de cel-matrix interacties en regeneratieve cel therapie toepassingen vergemakkelijken. Verschillende commerciële extracellulaire matrixproducten zijn beschikbaar als hydrogels of membranen, maar deze niet beschikken over weefsel-specifieke biologische activiteit. Want perfusie decellularization meestal niet mogelijk met menselijke hartweefsel is, ontwikkelden we een 3-stap onderdompeling decellularization proces. Menselijke myocardiale segmenten aangeschaft tijdens een operatie worden eerst behandeld met wasmiddel-vrije hyperosmolar lysis-buffermengsel, gevolgd door incubatie met de Ionische detergent, natrium dodecyl sulfaat, en het proces is voltooid door te profiteren van de intrinsieke activiteit van de DNase van foetale runderserum. Deze techniek resulteert in cel-gratis bladen van cardiale extracellulaire matrix met grotendeels bewaard vezelig weefsel architectuur en biopolymeer samenstelling, die getoond werden specifieke milieu signalen doorgeven aan cardiale cel populaties en pluripotente stamcellen cellen. Cardiale extracellulaire matrix bladen kunnen vervolgens worden verder verwerkt tot een poeder microparticle zonder verdere chemische modificatie, of, via korte pepsine spijsvertering, in een zelfassemblerende cardiale extracellulaire matrix hydrogel met verduurzaamd topicale.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) biedt niet alleen structurele ondersteuning maar is ook belangrijk voor biologische cel en weefsel functioneren1. In het hart participeert de ECM in de regulering van de pathofysiologische reacties zoals fibrose, ontsteking angiogenese, cardiomyocyte contractiele functie en levensvatbaarheid en resident progenitor cel lot. Naast haar primaire onderdelen - vezelig glycoproteïnen glycosaminoglycanen en proteoglycans - bevat het een heleboel secreted groeifactoren en cytokines membraanachtig blaasjes met nucleïnezuren en proteïnen2,3.
Het is onlangs duidelijk dat Acellulair ECM preparaten niet alleen zijn voor het bestuderen van de cel-matrix interacties, maar ook voor potentiële therapeutische cel-gebaseerde toepassingen van onschatbare waarde geworden. Het belang van een adequate omgeving naar therapeutische cel producten of gemodificeerde weefsels wordt nu algemeen erkend. Pogingen hebben gedaan om te combineren cel suspensies of actieve samenstellingen met gedefinieerde biopolymeric hydrogels4,5,6 of met eiwit cocktails uitgescheiden door lymfkliertest Sarcoom cellen (dat wil zeggen, Matrigel, Geltrex) 7. de voormalige topicale hebben beperkt, de laatste zijn echter problematisch in GMP-grade processen, en beide ontbreken de weefsel-specifieke topicale van cardiale ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization van het myocardium is eerder uitgevoerd door perfusie van het hele hart via de coronaire therapieën14,15. Hoewel dit mogelijk is in dierlijke harten, zijn intact menselijke harten zelden beschikbaar. Dus, een onderdompeling proces waarmee voor de behandeling van weefselmonsters verkregen in de operatiekamer was favoriet. Onze "3-stap" protocol bevat 3 aparte incubatie stappen namelijk lysis van de solubilisatie en DNA-verwijdering. Het levert de menselijke myocardiale ECM met grotendeels bewaard gebleven eiwitten en glycosaminoglycaan samenstelling16,17. Deze cECM segmenten toestaan voor in vitro studies van cel-matrix interacties, maar zijn slecht geschikt voor potentiële therapeutische toepassingen van de mens-schaal. Het productieproces werd vervolgens uitgebreid produceren gelyofiliseerd cECM microdeeltjes of een cECM hydrogel18.
Dit protocol voorziet in de decellularization van menselijke myocard verkregen chirurgische monsters, behoud van de hoofdcomponenten van myocardiale extracellulaire matrix (ECM) en hun biologische activiteit. Dit protocol is aanbevolen wanneer menselijke cardiale ECM met bewaarde weefsel-specifieke topicale is vereist voor experimentele studies van cel-matrix interacties, of wanneer een geschikt milieu voor cel-gebaseerde regeneratie van het myocardium benaderingen nodig is. In principe is het ook mogelijk om aan te passen van dit protocol aan GMP-grade omstandigheden, zodat het gebruik van verwerkte cECM haalbaar voortaan therapeutische toepassingen moet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het studie-protocol voldoet aan de ethische beginselen die worden beschreven in de verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de Raad van bestuur en ethiek Commissie van Charité Medizinische Universität op institutionele beoordeling. Alle patiënten geboden geschreven, geïnformeerde toestemming voor gebruik van hartweefsel voor experimentele studies.
1. bereiding van menselijke myocard segmenteren
- Verkrijgen van links ventriculaire myocard (grootte varieert afhankelijk van het type van chirurgie) rechtstreeks van de operatiekamer en vervoer in koude PBS in een steriele container.
- Verwijder alle vetweefsel met een steriel scalpel met een mes van de no. 10 onder steriele omstandigheden.
- Snijd het myocardium in blokjes van ongeveer 1 x 1 x 1 cm met behulp van een scalpel.
- Plaats de kubussen in steriele 50 mL tubes.
Opmerking: Als u wilt onderbreken, uitvoeren van stap 1.5, ga anders verder met stap 2.2. Vermijd het herhaaldelijk bevriezen-ontdooien cycli om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit en een afname van de kwaliteit van het weefsel. - Opslaan van de buizen met de kubussen bij-80 ° C. Het weefsel kan worden opgeslagen voor enkele maanden.
2. afdelen van het Myocardium kubussen in plakjes
- Neem de sproeibuis(-buizen) met de bereid kubussen uit de vriezer.
- Vervoer op ijs om de cryostaat.
- Het object en de kamer temperatuur instellen tot-15 ° C.
Opmerking: De juiste temperatuur is cruciaal voor het garanderen van perfecte segmenteren. - Chill lege 50 mL tubes en stempels in de zaal of op droog ijs.
- Voeg een laag toe (ongeveer 0,5 - 1,0 mL) van cryosection medium op de koude stempel en laat het bevriezen totdat het is wit en solide.
- Voeg een tweede laag van cryosection medium toe en plaats een myocard kubus op deze laag.
- Zorg ervoor dat het cryosection medium en myocard zijn volledig bevroren voordat u verdergaat.
Opmerking: Wanneer het monster en cryosection medium niet zijn bevroren het segmenteren zouden worden geschaad. Volledig bevroren cryosection medium verandert van vloeistof en transparante solide, wit en niet-transparante. De myocardiale kubussen moeten minstens 30 min tot 1 h tot het volledig bevriezen als verdergaat onmiddellijk uit stap 1.4. Wanneer het weefsel is bevroren moet het niet vervormen wanneer aangeraakt/behandeld met een pincet. - Stempel met bevroren myocard invoegen in de houder en draai alle schroeven.
- Trim het oppervlak van het weefsel tot een nog vectorafbeeldingsbestanden oppervlak is verkregen.
- Afdelen dikte 300 µm instellen
- Sectie het bevroren myocardium met automatische segmenteren. Dit garandeert eenvormige gesneden secties. Ongeveer 30-40 secties kunnen worden gesneden uit een kubus.
- Plaats elk segment na afdelen losjes in een precooled 50 mL-buis.
Opmerking: Druk niet op de segmenten of pack strak. Ongeveer 40 segmenten kunnen passen in een buis. - Sluit de gevulde buizen en ijs opleggen.
Opmerking: Als u wilt onderbreken Ga op met stap 2.14, anders verder met stap 3.2. - Winkel myocard segmenten bij-80 ° C. De segmenten kunnen worden opgeslagen voor enkele maanden.
3. decellularization van menselijke myocard segmenten
- Neem het nodige aantal 50 mL buisjes met myocard secties uit de diepvries-80 ° C en het vervoer op het ijs.
- De bevroren secties van alle 50 mL tubes van stap 3.1 overbrengen in een steriele bekerglas. Ongeveer 40 segmenten worden toegevoegd aan het bekerglas per tube 50 mL. Het bekerglas moet drie maal het volume van de 50 mL tubes; Gebruik een 150 mL-bekerglas bijvoorbeeld, voor decellularization voor een tube van 50 mL.
- Voeg 50 mL lysis van de oplossing (10 mM Tris, 0,1% w/v EDTA, pH 7.4 in H2O) per tube van 50 mL met myocard segmenten.
- Schud de plakjes myocard in een steriele bekerglas van 100-150 toeren per minuut continu gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Stam de vloeistof met de plakjes weefsel door een grove zeef. De plakjes weefsel met een botte pincetten overbrengen in een nieuwe steriele bekerglas. Voeg 50 mL 0,5% SDS in PBS per tube van de eerste 50 mL van myocard segmenten (bijvoorbeeld gebruiken 100 mL SDS oplossing wanneer twee 50 mL tubes myocardiale secties zijn wordt decellularized).
- Schud voortdurend voor 6 h van 100-150 toeren per minuut bij kamertemperatuur.
- Stam de vloeistof met de plakjes weefsel door een grove zeef. De plakjes weefsel met een botte pincetten overbrengen in een nieuwe steriele bekerglas en wassen 3 keer met 50 mL PBS voor elke 10 min terwijl het schudden van 150 toeren per minuut. Vervolgens wassen 's nachts in PBS met 1% penicilline/streptomycine en 1% nystatine (PBS-P/S-N) bij 100-150 rpm en 4 ° C terwijl het schudden.
Opmerking: Grondig wassen is essentieel voor het volledig verwijderen van alle resterende SDS. Resterende sporen van SDS zijn giftig wanneer de ECM wordt gebruikt in combinatie met cellen. - De wassen-oplossing verwijderen en voeg 25 mL voorverwarmd FBS (37 ° C) met 1% penicilline/streptomycine en 1% nystatine aan de decellularized segmenten per tube eerste 50 mL van het myocard segmenten.
- Incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C. In deze stap wordt elke resterende DNA uit de matrix vanwege de intrinsieke activiteit van de DNase van de FBS verwijderd.
- De segmenten overbrengen in een nieuwe steriele bekerglas en wassen 3 keer met 50 mL PBS voor elke 10 min terwijl het schudden van 150 toeren per minuut.
Opmerking: De ECM-segmenten kunnen worden opgeslagen in PBS-P/S-N bij 4 ° C voor meerdere dagen. Het is echter raadzaam onmiddellijk over te gaan.
4. verwerking van de cECM van de Decellularized tot een poeder
- Plaats de ECM plakjes losjes in een nieuwe steriele 6-well plaat. Bevriezen van de ECM bij-80 ° C en lyophilize voor 2 dagen in een lyophilizer.
Opmerking: meer dan één segment kan per putje geplaatst worden. Schik de plakjes om volledig bedekt het oppervlak van de put. Overlappende segmenten, heeft dit geen invloed op het latere vermaling succes. - Voor de verpulvering van het ECM-segment buizen gebruik specifieke frezen (Zie Tabel van materialen) met 1.4 mm keramische kralen. Vul de buizen losjes met gelyofiliseerd ECM met behulp van steriele botte pincet. Voor een optimaal resultaat wordt een totaalgewicht van ECM tussen 10-20 mg aanbevolen.
Opmerking: Als de ECM te strak in de buizen frezen verpakt is de verpulvering proces will be negatively impacted. - Module-freeze de buizen in vloeibare stikstof.
Let op: vloeibare stikstof is extreem lage temperatuur, passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen. -
De bevroren buizen invoegen met het freestoestel en verpulveren de ECM.
- Een duur van 30 s en een maximale snelheid en beginnen met het apparaat.
- Na afwerking, neem de buizen en module-freeze weer in vloeibare stikstof.
- Herhaal dit vijf keer.
- Het wassen van de deeltjes van de buizen door toevoeging van 1 mL ddH2O per buis en schudden of vortex voor volledige solubilizing. Filtreer de heterogene oplossing via een maaswijdte van 200 µm in een tube van 50 mL.
- Het bevriezen van de buis in-80 ° C of vloeibare stikstof.
- Vervang de standaard deksel van de buis door een 0,22 µm filter. Dit filter deksel voorkomt dat het poeder uit de buis stromen maar kunt luchtcirculatie voor verdamping van water.
- Plaats de buizen in de lyophilizer en lyophilize weer als u wilt verwijderen van het water van de stap (4.5)
Opmerking: Lyofilisatie bij deze stap kan duren tot 3 dagen. - Poeder bij-80 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt of ga verder met stap 5.1.
5. enzym op basis van Homogenizing van cECM Micro-deeltjes
- Ontbinden varkens pepsine in 0,01 M HCl (pH 2.0) tot een concentratie van 1 mg/mL. Plaats op een rondschudapparaat bij kamertemperatuur totdat het volledig is opgelost.
- Los van het gelyofiliseerd poeder voor menselijke ECM (stap 4.8) in de pepsine-oplossing voor een eindconcentratie van 10 mg/mL. Meng door pipetteren. Het totale volume is afhankelijk van de hoeveelheid ECM-oplossing nodig. Bijvoorbeeld, Los 10 mg voor ECM powder in 1 mL pepsine-oplossing.
Opmerking: Ontbinding van deeltjes kan worden ondersteund door middel van zacht vortexing (1.000-1.500 RPM). Resterende brokken van microdeeltjes zal een negatieve invloed hebben op de spijsvertering. - Breng de oplossing over in 2 mL buisjes met een volume van 1 mL per buis.
- Plaats de buizen in een tube-shaker voor 48 uur bij 27 ° C en 1200 rpm.
- Neem de buizen uit de shaker en plaats op ijs of de houder van een vooraf gekoelde buis.
- Mix 1/9 van het volume van ECM-oplossing van koude 10 x PBS (pH 7.4) met 1/10 van het volume van ECM-oplossing van koude 0,1 M NaOH in een precooled buis en plaats op het ijs. Dit mengsel zal neutraliseren de verteerd ECM-oplossing en onherroepelijk inactivering van de pepsine.
- De ECM-oplossing aan de neutralisatie mengsel en meng grondig door pipetteren of vortexing toevoegen.
- De ECM ingesteld op de gewenste concentratie met 1 x PBS (pH 7.4). De pH van de oplossing kan worden gecontroleerd met pH-papier.
Opmerking: Voorbeeld berekening voor 10 mL verteerd ECM-oplossing:
Voeg 10 mg varkens pepsine tot 10 mL HCl (pH 2.0).
Voeg 100 mg ECM poeder tot pepsine-oplossing.
Opmerking: Voorbeeld berekening voor het neutraliseren van 10 mL verteerd ECM-oplossing en de concentratie te stellen op 8 mg/mL:
Voldefinitieve = cstart x Volstart / cdefinitieve = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
Vol10xPBS = Volstart / 9 = 1/9 van 10 mL = 1.11 mL 10 x PBS
VolNaOH = Volstart / 10 = 1/10 van 10 mL = 1 mL
Vol1xPBS = Voldefinitieve - Volstart - Vol10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0.39 mL
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het 3-staps protocol voor decellularization van menselijke myocard hier resultaten gepresenteerd in in de buurt van-volledige verwijdering van celmateriaal, met behoud van de belangrijke onderdelen van de ECM en de fibrillar structuur van ECM. Na decellularization blijkt de bruto verwijdering van cellen van het weefsel door de verandering in kleur (figuur 1A). Histologisch onderzoek met H & E en Masson Trichrome vlekken bleek het volledig ontbreken van residuele intact cellen (figuur 1B). Kwantitatieve tests voor afzonderlijke onderdelen van de ECM een meer volledige verwijdering van DNA en een beter behoud van totale collageen, elastine en glycosaminoglycanen zoals geopenbaard in vergelijking met decellularization door SDS alleen (figuur 2A). Functionele bewijs van de biologische activiteit van cECM wordt getoond in figuur 2B. Hier, RT-PCR werd gebruikt om te kwantificeren van de expressie van structurele cardiomyocyte eiwitten (Myh6, Tnnt2), vroeg (Mef2c, Nkx2.5) en eind (Gata4) cardiomyogenic transcriptiefactoren en endothelial cel-oppervlakte markers (von Willibrand-Factor (vWF), VE-cadherin) in lymfkliertest ESC spontane differentiatie ondergaan. In vergelijking met zowel ongecoate cultuur schotel oppervlak en Matrigel-ECM coating, is het duidelijk dat contact met cECM pluripotente stamcellen bij voorkeur naar een cardiomyocyte-achtige fenotype drijft.
Gelyofiliseerd ECM segmenten kunnen verder worden verwerkt tot microdeeltjes zonder het gebruik van enzymatische of chemische reagentia. Mechanisch slijpen of pulverizing met behulp van geschikte kits die zijn toegestaan voor de productie van deeltjes met een uniforme grootte (figuur 3A). Massaspectrometrie geeft een overzicht van alle herkenbare eiwitten aanwezig in cECM. Gene ontologie analyse zich te concentreren op cellulaire componenten bleek dat de meerderheid van de ECM eiwitten inderdaad zijn afgeleid van de extracellulaire ruimte, met enkele hemoglobine residuen en een aantal overwegend intracellulaire eiwitten (Figuur 4). Dit patroon kan bepalen de weefsel-specifieke biologische functie van cECM, maar deze hypothese moet verder onderzoek. Een overzicht van de samenstelling van de proteïne cECM wordt weergegeven in tabel 1. Verwerking van de ECM tot microdeeltjes behoudt haar biologische activiteit. HL-1 cellen blootgesteld aan gesimuleerde "ischemische" voorwaarden (hypoxie, glucose en serum ontbering) weergegeven een verhoging op cellulair metabolisme (figuur 3B) en een afname van de dood van de cel als gekweekt op cECM (Figuur 3 c).
Beperkte pepsine gebaseerde vertering van het poeder van de cECM, op basis van een gewijzigde protocol ontwikkeld voor collageen zuivering19, resulteert in een gehomogeniseerde ECM-oplossing. Fase contrast de lichte microscopie van afbeeldingen (figuur 5A) tonen het spijsverteringsproces na 0 uur en 48 uur. Deze homogenisator stap vergemakkelijkt toepassingen in regeneratieve geneeskunde10. De resulterende verwerkte cECM is afgebeeld in figuur 5B. Het blijft onder kamertemperatuur vloeibaar (figuur 5B, links) maar bij 37 ° C vormt een zelfassemblerende hydrogel met stabiliteit geschikt voor een overlay met schorsingen van de cel waardoor 3D cultuur (representatief beeld, figuur 5B recht, hydrogel gelaagd met kweekmedium). Leven/dood kleuring van menselijke cardiale fibroblasten blijkt ook de gunstige effecten van kweken op cECM (figuur 5C). Zowel de cECM microdeeltjes en de cECM hydrogel verbeterd de metabole activiteit van contractiele HL1 cellen in ischemische voorwaarden ten opzichte van cellen in standaard cultuur (figuur 5C, lagere rechter paneel).
Figuur 1 : Decellularization van menselijke cardiale myocard. (A) macroscopische analyse van cECM door de stereo microscopie blijkt de verwijdering van celmateriaal met het 3-staps decellularization protocol. Dit is duidelijk door de toename van de transparantie. (B) histologie kleuring van myocardiale segmenten voor en na decellularization met HE-(links; Schaal bar = 50 µm) en Masson Trichrome kleuring (rechts; Schaal bar = 200 µm) toont de geslaagde verwijdering van cellen van het weefsel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: inhoud en gevolgen van cECM segmenten. (A) kwantitatieve biochemische analyse van geselecteerde onderdelen van de ECM en DNA, het 3-staps decellularization protocol bij 0,5% SDS-alone decellularization vergelijken. Gegevens worden uitgedrukt als percentage van de inhoud in native myocard. Met het 3-staps-protocol, het restgehalte van DNA was bijna nul en aanzienlijk lager dan dat na een incubatie van 9 h met een standaard gecombineerd 0,5% SDS/lysis buffer combinatie en FBS (SDS 9 h + FBS). Respectieve biochemische testen aangetoond een in de buurt van-volledig behoud van collageen, ongeveer 20% behoud van glycosaminoglycaan inhoud in vergelijking met eigen weefsel, en een bijna 30% behoud van elastine inhoud, alle aanzienlijk hoger dan bij de SDS referentie standaardprotocol (gemiddelde ± SEM de staven). (B) mRNA uitdrukking van geselecteerde genen in geïnduceerde pluripotente stamcellen differentiëren op cECM, in vergelijking met ongecoate cultuur gerechten en op Matrigel-gecoate oppervlak. cECM gegevens worden genormaliseerd die verkregen op de respectieve controlematerialen (controle = 1, onderbroken lijn). De meerderheid van de cardiale genen worden aanzienlijk meer hoogst uitgedrukt wanneer gekweekt op cECM (gemiddelde ± SEM de staven). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: uiterlijk en de biologische activiteit van cECM microdeeltjes. (A) cECM microparticle poeder na lyofilisatie. (B) metabolisme (MTS) en (C) cel dood (LDH release) analyse van HL-1 cellen gekweekte met cECM of gelatine. cECM aanzienlijk vermindert van celdood en verhoogt stofwisseling. De staven gemiddelde ± SEM, statistische significantie getest door one-way ANOVA en Bonferroni. Figuur 3B -C zijn van Kappler et al. gewijzigd 18 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: samenstelling van het eiwit van cECM microdeeltjes. Naar aanleiding van de Spectrometrie van de massa, String DB analyse toont de belangrijkste onderdelen van de cECM, die voornamelijk verband houden met de extracellulaire ruimte (GO: 0005615; rode bollen p > 0,05). Lijnen geven aan eiwitinteractie gebaseerd op experimentele-biochemische gegevens (paars), over co expressie gegevens (zwart), over database interacties (blauw), en mede expressie (groen). Tekenreeks DB vereist vertrouwen: score > 0.4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: verwerking van cECM naar een hydrogel behouden de biologische effectiviteit. Fase contrast de lichte microscopie van foto's tonen dat enzymatische vertering van de cECM voor 48u resulteert in een meer gehomogeniseerde ECM-oplossing; Schaal bar = 500 µm. (A) de ECM oplossing blijft vloeibaar tot kamertemperatuur (B, links) en bevat de potentie om zelf monteren naar een hydrogel wanneer geïncubeerd bij 37 ° C (B, rechts). Live/dode vlek van cardiale menselijke fibroblasten gekweekt met en zonder cECM onthult een hogere calceïne kleuring van intensiteit van levende cellen; Schaal bar = 50 µm (C). De cECM hydrogel verhoogt de metabole activiteit van HL1 cellen in ischemische omstandigheden op dezelfde manier als de micro-deeltjes (C, lagere rechterpaneel van Kappler et al. gewijzigd De staven met gemiddelde ± SEM, statistische significantie getest door one-way ANOVA en Bonferroni 18). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Beschrijving van het eiwit |
| 5-hydroxytryptamine receptor 7 OS = Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2 |
| Actin-achtige eiwitten 6B OS = Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1 |
| Actine, aorta glad spierweefsel OS = Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1 |
| Serumalbumine OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2 |
| Antithrombin-III OS = Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1 |
| Apolipoproteïne CIII OS = Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1 |
| Apolipoproteïne E OS = Homo sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1 |
| Spiraalsnoer-spoel domein-bevattende eiwitten 47 OS = Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1 |
| Lid van de familie 11 C-type lectine domein A OS = Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1 |
| Chloride kanaal van intracellulaire eiwitten 1 OS = Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4 |
| Collageen alpha-2(I) keten OS = Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7 |
| Aanvulling op C3 OS = Homo sapiens GN = C3 PE = 1 SV = 2 |
| Collageen alpha-2(IV) keten OS = Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4 |
| Cyclisch ADENOSINEMONOFOSFAAT-responsief element-bindende eiwit 3-achtig eiwit 4 OS = Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1 |
| Dermatopontin OS = Homo sapiens GN = DPT PE = 2 SV = 2 |
| Fibronectine OS = Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4 |
| Glutathion peroxidase 3 OS = Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2 |
| Hemoglobine subeenheid alpha OS = Homo sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = 2 |
| Hemoglobine subeenheid beta OS = Homo sapiens GN = HBB PE = 1 SV = 2 |
| IG kappa keten C regio OS = Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1 |
| Lumican OS = Homo sapiens GN = LUM PE = 1 SV = 2 |
| Mimecan OS = Homo sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1 |
| Nidogen-1 OS = Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3 |
| Pseudopodium-verrijkt atypische kinase 1 OS = Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4 |
| Pigment epitheel-afgeleide factor OS = Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4 |
| Mitochondriale coenzym A transporter SLC25A42 OS = Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = 2 SV = 2 |
| Serum amyloid P-component OS = Homo sapiens GN = APCS PE = 1 SV = 2 |
| Transcriptie initiatie factor TFIID subeenheid 5 OS = Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3 |
| Tudor domein-bevattende eiwitten 3 OS = Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1 |
| Zink vinger matrin-type eiwit 4 OS = Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1 |
| Zink vinger eiwit 101 OS = Homo sapiens GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1 |
Tabel 1: Eiwit samenstelling van cECM poeder zoals bepaald door de Spectrometrie van de massa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij de voorbereiding van menselijke myocardiale ECM, het doel is het bereiken van het volgende: verwijdering van relevante immunogene celmateriaal, behoud van ECM integriteit en topicale, steriliteit, niet-giftigheid van het eindproduct, GMP-proces-compatibiliteit, en geschiktheid van het product voor een bepaalde toepassing op het gebied van de behandeling. Door het combineren van ons 3-staps decellularization protocol met verdere verwerking in microdeeltjes of zelfassemblerende hydrogel, menselijk cardiale ECM materiaal wordt verkregen die beschikt over specifieke biologische activiteit, is gemakkelijk te hanteren, en heeft het potentieel voor meerdere toepassingen in vitro en in vivo, vergelijkbaar met wat voor ECM producten van diverse diersoorten11,13,20,21 gebleken.
Tijdens de eerste verwerking van het myocard weefsel is het belangrijk aan sectie myocardiale segmenten van dezelfde dikte, omdat samengestelde concentratie en behandeling duur hebben zijn getitreerd voor 300 µm segmenten. Dikkere segmenten zullen onvolledig decellularized en dunner segmenten ongewenste uitsplitsing van ECM componenten met verlies van topicale zal lijden. Dit is vooral belangrijk met betrekking tot de behandeling SDS, waar de toxiciteit kan negatief beïnvloeden ECM eigenschappen en cellulaire analyses16. Bovendien, langdurige SDS behandeling kan leiden tot de volledige afwezigheid van fibronectine zoals gezien in de studie door Godier-Fournement et al. 22, terwijl het met onze methode17is bewaard. De cECM-secties zijn geschikt voor gebruik in proeven zonder verdere bewerking (dat wil zeggen, in 3D cultuur modellen analyseren van celdifferentiatie of cel-ECM interacties of voor "tissue engineering" cellulaire herbevolking benaderingen). Het gebruik van FBS voor DNA verwijdering is zeer efficiënt, maar kan leiden tot sommige residuele FBS eiwitten in de ECM-secties. Dit kan elke FBS gevoelige testen beïnvloeden. De vertaling naar een klinische rang GMP protocol moet mogelijk zijn met het gebruik van gecertificeerde sera, maar een aanpassing nodig afhankelijk van de regelgeving zou kunnen zijn. Dit kan ofwel het ontbreken van FBS residuen in de ECM bevestigen of een wijziging van het protocol zullen nodig zijn ter vervanging van de FBS met DNase behandeling. Tenslotte zijn herhaalde bevriezen-ontdooien cycli van het weefsel en de ECM secties te vermijden om te voorkomen dat de afbraak van de matrix.
Bij de productie van de cECM hydrogel, is pepsine spijsvertering de meest kritische stap in het proces. In onze eerste experimenten, pepsine spijsvertering bij pH 1 gedurende 48 uur bij 37 ° C geleid tot een verlies van topicale, die zou kunnen worden voorkomen door aanpassing van de incubatie pH 2 gedurende 48 uur bij 27 oC. Ook, houd in gedachten dat de hydrogel wordt geproduceerd uit gelyofiliseerd cECM microparticle suspensie, niet van vers decellularized natte cECM segmenten. Naast de verbeterde algemene behandeling van de hydrogel in vergelijking met cECM segmenten heeft de hydrogel het voordeel dat het kan worden verdund voor gebruik in verschillende concentraties, bijvoorbeeld bij een hogere concentratie in combinatie met andere materialen of voor 3D cultuur, of op een lagere concentratie voor coating van cel cultuur gerechten of als een additief aan kweekmedium.
Dit protocol is opgericht als een laboratorium-grade SOP om te helpen de leemten in translationeel regeneratieve geneeskunde die onlangs werden beschreven door Saldin et al. voorbereiding menselijke cECM 10 terwijl decellularized cECM segmenten kunnen worden toegepast als bladen op het epicardial oppervlak van het zieke hart, zoals onlangs beschreven door Sarig et al., met varkens cECM in een rat model van myocardinfarct23, verwerking tot een hydrogel zorgt voor meer divers in vivo toepassingen, zoals de injectie van cECM in myocard, zoals aangegeven door Singelyn et al. 13 , 24 om door te gaan naar klinische translationeel activiteiten, het huidige protocol zal moeten worden omgezet in GMP-grade procedures. In principe, alle gebruikte materialen zijn ook onderdeel van erkende medische apparaat/ATMP productieprocessen (dat wil zeggen, decellularized hartkleppen of bloedvaten) en geen grote obstakels zijn te verwachten. Informatie over de duur van de veilige opslag en de afwezigheid van ziekteverwekkers zal zeker wel vereist. Uiteindelijk, een betrouwbare bron van grotere hoeveelheden verse en steriele hartweefsel van donoren zonder hart-en vaatziekten is nodig. Harten van overleden orgaandonoren die niet geschikt is voor transplantatie zijn hier de meest waarschijnlijke scenario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het studie-protocol voldoet aan de ethische beginselen die worden beschreven in de verklaring van Helsinki. Patiënten geboden geïnformeerde toestemming voor het gebruik van het weefsel voor onderzoeksdoeleinden, en het proces van weefsel collectie werd goedgekeurd door de institutionele Review Board en de ethische commissie van Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
