Summary
Denne protokollen beskriver den fullstendig decellularization av menneskelig myocardium samtidig bevare komponentene ekstracellulær matrix. Videre behandling av ekstracellulær matrix resulterer i produksjon av microparticles og en cytoprotective selv av hydrogel.
Abstract
Acellular ekstracellulær matrix forberedelser er nyttige for å studere celle matrise interaksjoner og lette regenerativ cellen terapi programmer. Flere kommersielle ekstracellulær matrix produkter er tilgjengelig som hydrogels eller membraner, men dette har ikke vev-spesifikke biologiske aktivitet. Fordi perfusjon decellularization ikke er vanligvis mulig med menneskelig hjerte vev, utviklet vi en 3-trinns nedsenking decellularization prosess. Menneskelige hjerteinfarkt skiver anskaffet under operasjonen behandles først med vaskemiddel uten hyperosmolar lyseringsbuffer, etterfulgt av inkubasjon med den joniske vaskemiddel, natrium dodecyl sulfat, og prosessen er fullført ved å utnytte den iboende DNase aktiviteten fosterets bovin serum. Denne teknikken resulterer i celle-fri ark av cardiac ekstracellulær matrix med hovedsakelig bevart bindevev arkitektur og Research komposisjon, som ble vist å gi spesifikke miljø signaler til hjerte celle populasjoner og pluripotent stilk celler. CARDIAC ekstracellulær matrix ark kan deretter videre behandlet til en microparticle pulver uten kjemiske, eller via kortsiktige pepsin fordøyelsen, til en selvstendig montering cardiac ekstracellulær matrix hydrogel med bevart bioactivity.
Introduction
Den ekstracellulære matrisen (EFM) gir ikke bare strukturell støtte, men er også viktig for biologiske celle og vev funksjon1. I hjertet deltar ECM i regulering av pathophysiologic svar som fibrosis, betennelse, angiogenese, cardiomyocyte kontraktile funksjonen og levedyktigheten og bosatt stamfar celle skjebne. I tillegg til sin primære komponenter fibrøs glykoproteiner, glycosaminoglycans og proteoglycans - inneholder den en rekke utskilles vekst faktorer cytokiner og membranous blemmer som inneholder nucleic syrer og proteiner2,3.
Nylig har det blitt klart at acellular ECM forberedelser ikke er bare uvurderlig for å studere celle matrise interaksjoner, men også for potensielle terapeutiske celle-baserte programmer. Viktigheten av å tilby et tilstrekkelig miljø terapeutiske celler eller utviklet vev er nå allment anerkjent. Forsøk har blitt gjort å kombinere celle suspensjon eller aktive forbindelser med definerte biopolymeric hydrogels4,5,6 eller protein cocktailer utskilles av murine sarkomspesialitet celler (dvs. Matrigel, Geltrex) 7. men tidligere har begrenset bioactivity, sistnevnte er problematisk i GMP-grade prosesser, og både mangler vev-spesifikke bioactivity av cardiac ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization i myokard er tidligere utført av perfusjon av hele sentrum via koronar blodkar14,15. Dette er mulig i dyr hjerter, er intakt menneskenes hjerter sjelden tilgjengelig. Derfor ble en nedsenkning prosess der for håndtering av vevsprøver innhentet i operasjonssalen foretrukket. Vår "3-step" protokollen inneholder 3 separate inkubasjon trinn nemlig lysis, solubilization og DNA fjerning. Det gir menneskelige hjerteinfarkt ECM med i stor grad bevart komposisjon16,17-med protein og glycosaminoglycan. Disse cECM skiver tillate i vitro studier av celle-matrix interaksjoner, men egnet dårlig for potensielle menneskelig skala terapeutiske programmer. Produksjonen ble deretter utvidet til å produsere lyofilisert cECM microparticles eller en cECM hydrogel18.
Denne protokollen tillater decellularization av menneskelig myocardium fra kirurgisk prøver, bevare hovedkomponentene i hjerteinfarkt ekstracellulær matrix (ECM) og deres biologiske aktivitet. Denne protokollen anbefales når menneskets hjerte ECM med bevarte vev-spesifikke bioactivity kreves for eksperimentelle studier av celle-matrix interaksjoner, eller når et egnet miljø er nødvendig for cellen-basert hjerteinfarkt regeneration tilnærminger. I prinsippet er det også mulig å tilpasse denne protokollen GMP-grade forhold, slik at bruk av behandlet cECM bør være gjennomførbart i fremtiden terapeutiske programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien protokollen overholder de etiske prinsippene i deklarasjonen i Helsinki og ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styret og etikk av Charité medisinske universitet. Alle pasienter gitt skrevet, samtykke til bruk av hjertet vev for eksperimentelle studier.
1. utarbeidelse av menneskelig myokard snitting
- Få venstre ventrikkel myokard (størrelse varierer avhengig av kirurgi) direkte fra operasjonsstuen og transport i kalde PBS i en sterile containeren.
- Fjern alle fettvev med sterilt skalpell med nr. 10 blad under sterile forhold.
- Kuttet myokard i terninger ca 1 x 1 x 1 cm ved hjelp av en skalpell.
- Plass kuber i sterilt 50 mL rør.
Merk: for å stanse utføre trinn 1.5, ellers fortsetter du med trinn 2.2. Unngå gjentatte fryse-Tin sykluser for å unngå protein fornedrelse og en nedgang i vevet kvalitet. - Lagre rør som inneholder kubene på-80 ° C. Vevet kan lagres i flere måneder.
2. skjæring av myokard kuber i skiver
- Ta lysrør som inneholder forberedt kubene ut av fryseren.
- Transport på is til kryostaten.
- Angi objektet og chamber temperaturen til-15 ° C.
Merk: Riktig temperatur er avgjørende for å sikre perfekt snitting. - Chill tom 50 mL rør og frimerker i kammeret eller tørris.
- Legg et lag (ca 0,5 - 1,0 mL) av cryosection medium på kalde stempel og la det fryse til den er hvit og solid.
- Legge til et ekstra lag av cryosection medium og plassere en myokard kube på dette laget.
- Kontroller at cryosection mediet og myokard er helt frosset før du fortsetter.
Merk: Når prøven og cryosection mediet ikke-fryste inndelingen blir svekket. Fullstendig frossen cryosection medium svinger fra flytende og gjennomsiktig solid, hvit og ikke-transparente. Hjerteinfarkt kuber må minst 30 minutter til 1 h helt fryse hvis fortsetter umiddelbart fra trinn 1.4. Når vev er frosset bør det ikke deformere når rørt/håndteres med pinsett. - Sett stempel med frosne myokard inn i holderen og Skru fast alle skruene.
- Trim overflaten av vev til en selv snitting overflate er oppnådd.
- Angi snitting tykkelse til 300 µm.
- Delen frosne myokard med automatisk skjæring. Dette garanterer uniform kutt deler. Ca 30-40 delene kan være skiver fra en kube.
- Plass hvert stykke etter skjæring løst i en forkjøles 50 mL tube.
Merk: Ikke trykk skiver eller pack tett. Ca 40 skiver kan passe i en tube. - Lukk fylt rør og plassere på is.
Merk: for å stanse gå på trinn 2.14 ellers Fortsett med trinn 3.2. - Lagre myokard skiver på-80 ° C. Skiver kan lagres i flere måneder.
3. decellularization av menneskelig myokard skiver
- Ta det nødvendige antallet 50 mL rør som inneholder myokard inndelinger ut av-80 ° C fryser og transport på is.
- Overfør de frosne snitt av alle 50 mL rør fra trinn 3.1 til en steril kanne. Ca 40 skiver legges til begeret per 50 mL tube. Begeret skal tre ganger volumet av 50 mL rør; for eksempel, for decellularization med en 50 mL tube bruk et 150 mL beger.
- Legge til 50 mL lysis løsning (10 mM Tris, 0,1% w/v EDTA, pH 7.4 i H2O) per 50 mL tube med myokard skiver.
- Riste myokard sektorene i et sterilt beaker på 100-150 rpm kontinuerlig for 2 timer ved romtemperatur.
- Belastning væske med vev skiver gjennom en grov sil. Overføre vev skiver med en stump tweezer til et nytt sterilt beger. Legg til 50 mL av 0,5% SDS i PBS per første 50 mL tube av myokard skiver (f.eks bruk 100 mL SDS løsning når to 50 mL rør av hjerteinfarkt er å være decellularized).
- Riste kontinuerlig 6 h på 100-150 rpm ved romtemperatur.
- Belastning væske med vev skiver gjennom en grov sil. Overføre vev skiver med en stump tweezer til en ny sterilt kanne og vask 3 ganger med 50 mL PBS i 10 min mens riste på 150 rpm. Deretter vaske over natten i PBS med 1% Penicillin/Streptomycin og 1% Nystatin (PBS-P/S-N) på 100-150 rpm og 4 ° C mens risting.
Merk: Grundig vask er avgjørende for å fjerne eventuelle gjenværende SDS. Gjenværende spor av SDS er giftige når ECM brukes i kombinasjon med celler. - Fjerne vask løsningen og legge til 25 mL forvarmet FBS (37 ° C) med 1% Penicillin/Streptomycin og 1% Nystatin i decellularized sektorene per første 50 mL tube av myokard skiver.
- Inkuber for 3t på 37 ° C. I dette trinnet fjernes eventuelle gjenværende DNA fra matrisen på grunn av iboende DNase aktiviteten til FBS.
- Overføre sektorene til et nytt sterilt beaker og vask 3 ganger med 50 mL PBS i 10 min mens riste på 150 rpm.
Merk: ECM skiver kan lagres i PBS-P/S-N på 4 ° C i flere dager. Det anbefales imidlertid å fortsette umiddelbart.
4. prosessering Decellularized cECM til et pulver
- Plass ECM skiver løst i en ny sterilt 6-vel plate. Fryse ECM-80 ° c og lyophilize for 2 dager i en lyophilizer.
Merk: mer enn én sektor kan plasseres per brønn. Ordne skiver å dekker overflaten av brønnen. Overlappende skiver påvirker ikke påfølgende pulverisering suksess. - For pulverisering på ECM-sektoren rør bruk spesifikk fresing (se Tabell for materiale) som inneholder 1,4 mm keramisk perler. Fyll rørene løst med lyofilisert ECM ved hjelp av sterile sløv pinsett. For optimale resultater anbefales en totalvekt av ECM mellom 10-20 mg.
Merk: Hvis ECM er pakket for hardt i fresing rør pulverisering prosessen vil bli negativt påvirket. - Snapin-fryse rør i flytende nitrogen.
Advarsel: flytende nitrogen er ekstremt lav temperatur, bruke riktig personlig verneutstyr. -
Frosne rør inn fresemaskin og pulverisere ECM.
- Angi en varighet på 30 s og maksimum hastighet og starte enheten.
- Etter endt, ta ut rør og snapin-fryse igjen i flytende nitrogen.
- Gjenta fem ganger.
- Vask microparticles fra rørene ved å legge til 1 mL ddH2O per rør og riste eller vortex for fullstendig solubilizing. Filtrere heterogene løsningen gjennom en 200 µm mesh i en 50 mL tube.
- Fryse røret i-80 ° C eller flytende nitrogen.
- Erstatte standard lokket av rør med filtere 0.22 µm. Dette filteret lokket hindrer at pulveret strømmer ut av røret, men tillater luftsirkulasjon for fordampning.
- Sett inn rørene i lyophilizer og lyophilize igjen for å fjerne vannet fra trinn (trinn 4.5)
Merk: Lyophilization på dette trinnet kan ta opptil 3 dager. - Lagre pulver-80 ° c før videre behandling eller fortsetter du med trinn 5.1.
5. enzym basert Homogenizing av cECM mikro-partikler
- Oppløse svin pepsin i 0.01 M HCl (pH 2.0) å en konsentrasjon av 1 mg/mL. Plasser på en roterende shaker ved romtemperatur før det er fullstendig oppløst.
- Oppløse den lyofilisert menneskelige ECM pulveret (trinn 4,8) i pepsin løsningen på en siste konsentrasjon av 10 mg/mL. Bland godt gjennom pipettering. Det totale volumet avhenger av hvor mye ECM løsning nødvendig. For eksempel oppløse 10 mg av ECM pulver i 1 mL pepsin løsning.
Merk: Oppløsende partikler kan bli støttet gjennom milde vortexing (1000-1500 RPM). Gjenværende klumper av microparticles vil negativt påvirke fordøyelsen. - Overføre løsningen til 2 mL rør med et volum på 1 mL per rør.
- Plass rør i en tube shaker 48 h ved 27 ° C og 1200 rpm.
- Ta rør av shaker og plassere på is eller en pre-avkjølt tube holder.
- Mix 1/9 av volumet av ECM løsning av kaldt 10 x PBS (pH 7.4) med 1/10 av volumet av ECM løsning av kalde 0.1M NaOH i en forkjøles og plasser på is. Denne blandingen vil nøytralisere fordøyd ECM løsningen og irreversibelt deaktivere pepsin.
- Legge ECM løsningen til nøytralisering blandingen og bland grundig gjennom pipettering eller vortexing.
- Angi ECM ønsket konsentrasjonen med 1 x PBS (pH 7.4). PH av løsningen kan kontrolleres med pH papir.
Merk: Eksempel beregning for 10 mL fordøyd ECM løsning:
Legge til 10 mg svin pepsin 10 mL HCl (pH 2.0).
Legge til 100 mg ECM pulver pepsin løsning.
Merk: Eksempel beregning for å nøytralisere 10 mL fordøyd ECM løsning og sette konsentrasjonen til 8 mg/mL:
Volsiste = cstarte x Volstarte / csiste = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
Vol10xPBS = Volstarte / 9 = 1/9 fra 10 mL = 1.11 mL 10 x PBS
VolNaOH = Volstarte / 10 = 1/10 fra 10 mL = 1 mL
Vol1xPBS = VolFinal - Volstarte - Vol10xPBS - VolNaOH = 12.5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0.39 mL
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3-trinns protokollen for decellularization av menneskelig myocardium presentert her resultater i nesten fullstendig fjerning av mobilnettet materiale, samtidig som de viktigste ECM-komponentene og fibrillar strukturen i ECM. Etter decellularization er brutto fjerning av celler fra vevet tydelig av endringer i farge (figur 1A). Histologiske analyse med H & E og Masson Trichrome flekker viste den komplette fraværet av resterende intakt celler (figur 1B). Kvantitative analyser for ECM enkeltkomponenter avslørte en mer komplett DNA fjerning og bedre bevaring av totale kollagen og elastin glycosaminoglycans sammenlignet med decellularization av SDS alene (figur 2A). Funksjonell bevis på den biologiske aktiviteten til cECM vises i figur 2B. Her, RT PCR ble brukt om å kvantifisere uttrykk for strukturelle cardiomyocyte proteiner (Myh6, Tnnt2) tidlig (Mef2c, Nkx2.5) og slutten (Gata4) cardiomyogenic transkripsjonsfaktorer og endothelial celle overflaten markør gener (von Willibrand faktor (vWF), VE-cadherin) i murine ESC under spontan differensiering. I forhold til både ubestrøket kultur tallerken overflate og Matrigel-ECM belegg, er det klart at kontakt med cECM kjører pluripotent stamceller fortrinnsvis mot en cardiomyocyte-lignende fenotypen.
Lyofilisert ECM skiver kan bearbeides videre til microparticles uten å bruke enzymatisk eller kjemisk reagenser. Mekanisk sliping eller pulverisere bruke egnet kits tillatt for produksjon av microparticles med en enhetlig størrelse (figur 3A). Massespektrometri gir en oversikt over alle gjenkjennelig proteiner i cECM. Gene ontologi analyse konsentrere seg om cellulære komponenter viste at fleste av ECM proteiner er faktisk utledet fra ekstracellulære rommet, med noen hemoglobin rester og en rekke hovedsakelig intracellulær proteiner (Figur 4). Dette mønsteret kan bestemme vev-spesifikke biologiske funksjonen av cECM, men denne hypotesen må videre forskning. Et sammendrag av cECM protein sammensetningen vises i tabell 1. Behandling ECM til microparticles bevarer sin biologiske aktivitet. HL-1 celler utsatt for simulert "iskemiske" forhold (hypoksi, glukose og serum deprivasjon) vises en økning i celle metabolismen (figur 3B) og en nedgang i celledød når kultivert på cECM (Figur 3 c).
Begrenset pepsin-baserte fordøyelsen av cECM pulver, basert på en endret protokoll utviklet for kollagen rensing19, resulterer i en homogenisert ECM-løsning. Fase kontrast * lys bilder (figur 5A) viser fordøyelsen prosessen etter 0t og 48 timer. Dette homogenisere trinnet forenkler programmer i regenerativ medisin10. Den resulterende behandlet cECM er vist i figur 5B. Under romtemperatur det fortsatt flytende (figur 5B, venstre) men på 37 ° C en selvstendig montering hydrogel med stabilitet egnet for et overlegg med cellen suspensjoner slik at 3D kultur (representativt bilde, figur 5B høyre, hydrogel lag med kultur medium). Live/døde flekker av menneskelig hjerte fibroblaster viser også de gunstige effektene av dyrking på cECM (figur 5C). Både cECM microparticles og cECM hydrogel forbedret metabolske aktiviteten til kontraktile HL1 celler i iskemiske tilstander i forhold til celler i standard kultur (figur 5C, nedre høyre panel).
Figur 1: Decellularization av menneskelig hjerte myokard. (A) makroskopisk analyse av cECM av stereo mikroskopi avslører fjerning av mobilnettet materiale med 3-trinns decellularization protokollen. Dette er tydelig ved økningen i åpenhet. (B) Histology farging av hjerteinfarkt skiver før og etter decellularization med han-(venstre; Skala bar = 50 µm) og Masson Trichrome flekker (rett; Skala bar = 200 µm) viser vellykket fjerning av celler fra vevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: innhold og effekten av cECM skiver. (A) kvantitativ analyse biokjemiske valgte ECM komponenter og DNA, sammenligne 3-trinns decellularization protokollen til 0,5% SDS-alene decellularization. Dataene er uttrykt som prosent av innholdet i native myokard. Med 3-trinns protokollen, gjenværende DNA innholdet var nesten null og betydelig lavere enn at etter en 9 h inkubasjon med standard kombinert 0,5% SDS/lysis buffer kombinasjon og FBS (SDS 9 h + FBS). Respektive biokjemiske analyser har vist en nesten komplett bevaring av kollagen, ca 20% bevaring av glycosaminoglycan innhold sammenlignet med eget vev, og en nesten 30% bevaring av elastin innhold, alle betydelig høyere enn med SDS referanse standardprotokollen (barer representerer gjennomsnittlig ± SEM). (B) mRNA uttrykk for valgte gener i indusert pluripotent stamceller skille på cECM, sammenlignet med ubestrøket kultur retter og Matrigel-belagt overflaten. cECM dataene er normalisert de innhentet respektive kontroll materialet (kontroll = 1, stiplet linje). Fleste av cardiac gener uttrykkes betydelig mer høyt når kultivert på cECM (barer representerer gjennomsnittlig ± SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: utseende og biologiske aktiviteten til cECM microparticles. (A) cECM microparticle pulver etter lyophilization. (B) metabolisme (MTS) og (C) celle død (LDH utgivelse) analyse av HL-1 celler kulturperler med cECM eller gelatin. cECM betydelig reduserer celledød og øker metabolismen. Stolpene angir gjennomsnittlig ± SEM, statistisk signifikans testet av enveis ANOVA og Bonferroni. Figur 3B -C er endret fra Kappler et al. 18 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Protein sammensetningen av cECM microparticles. Etter massespektrometri, streng DB analyse viser hovedkomponentene i cECM, som er hovedsakelig forbundet med den ekstracellulære plassen (gå: 0005615, rød kuler p > 0,05). Linjene indikerer protein interaksjoner basert på eksperimentell-biokjemiske data (lilla), på co uttrykk data (svart), database samhandling (blå) og co uttrykk (grønn). Streng DB kreves tillit: score > 0.4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: behandling av cECM til en hydrogel bevare biologisk effectivity. Fase kontrast * lys bilder viser at enzymatisk fordøyelsen av cECM 48t resultater i en mer homogenisert ECM-løsning. Skala bar = 500 µm. (A) The ECM løsning forblir flytende til romtemperatur (B, venstre) og inneholder potensial til å selv sette sammen mot en hydrogel når ruges på 37 ° C (B, høyre). Live/dead flekk av cardiac menneskelig fibroblaster kultivert med og uten cECM avslører en høyere calcein flekker intensiteten av levende celler. Skala bar = 50 µm (C). CECM-hydrogel øker metabolske aktiviteten til HL1 celler i iskemiske tilstander på samme måte som mikro partikler (C, nedre høyre panel, endret fra Kappler et al. 18) stolpene angir gjennomsnittlig ± SEM, statistisk signifikans testet av enveis ANOVA og Bonferroni. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protein beskrivelse |
| 5-hydroxytryptamine reseptor 7 OS = Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2 |
| Utgangen som protein 6B OS = Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1 |
| Utgangen, aorta glatt muskel OS = Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1 |
| Serum albumin OS = Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2 |
| Antithrombin-III OS = Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1 |
| Apolipoprotein C-III OS = Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1 |
| Apolipoprotein E OS = Homo sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1 |
| Kveilet-coil domenet inneholder protein 47 OS = Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1 |
| C-type Lektiner domenemedlem familie 11 A OS = Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1 |
| Klorid intracellulær kanal protein 1 OS = Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4 |
| Kollagen alpha-2(I) kjeden OS = Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7 |
| Utfylle C3 OS = Homo sapiens GN = C3 PE = 1 SV = 2 |
| Kollagen alpha-2(IV) kjeden OS = Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4 |
| Syklisk AMP svarer element-bindende protein 3-lignende protein 4 OS = Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1 |
| Dermatopontin OS = Homo sapiens GN = DPT PE = 2 SV = 2 |
| Fibronectin OS = Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4 |
| Glutation peroxidase 3 OS = Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2 |
| Hemoglobin delenhet alpha OS = Homo sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = 2 |
| Hemoglobin delenhet beta OS = Homo sapiens GN = HBB PE = 1 SV = 2 |
| IG kappa kjeden C regionen OS = Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1 |
| Lumican OS = Homo sapiens GN = LUM PE = 1 SV = 2 |
| Mimecan OS = Homo sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1 |
| Nidogen-1 OS = Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3 |
| Pseudopodium-beriket atypisk kinase 1 OS = Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4 |
| Pigment epitel-avledet faktor OS = Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4 |
| Mitokondrielt coenzyme A transporter SLC25A42 OS = Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = 2 SV = 2 |
| Serum amyloid P-komponent-OS = Homo sapiens GN = APCS PE = 1 SV = 2 |
| Transkripsjon initiering faktor TFIID delenhet 5 OS = Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3 |
| Tudor domenet inneholder protein 3 OS = Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1 |
| Sink finger matrin-type protein 4 OS = Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1 |
| Sink finger protein 101 OS = Homo sapiens GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1 |
Tabell 1: Protein sammensetning av cECM pulver som massespektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når du forbereder menneskelige hjerteinfarkt ECM, målet er å oppnå følgende: fjerning av relevante immunogenic mobilnettet materiale, ECM integritet og bioactivity, sterilitet, ikke-toksisitet av sluttproduktet, GMP-prosessen kompatibilitet, og egnethet av produktet for et gitt program i håndtering. Ved å kombinere våre 3-trinns decellularization protokollen med ytterligere behandling i microparticles eller selv av hydrogel, menneskets hjerte ECM materiale er innhentet som besitter biologiske aktiviteten, er lett å håndtere, og har potensial for flere programmer i vitro og i vivo, lik som er vist for ECM produkter fra flere dyr arter11,13,20,21.
Under den første behandlingen av hjerteinfarkt vev er det viktig å delen hjerteinfarkt skiver av identiske tykkelse, fordi sammensatte konsentrasjon og behandling varighet har vært titreres for 300 µm skiver. Tykkere skiver blir ufullstendig decellularized og tynnere skiver vil lide uønskede sammenbrudd av ECM komponenter med tap av bioactivity. Dette er spesielt viktig med hensyn til SDS behandling, der toksisitet kan negativt påvirke ECM egenskaper og mobilnettet analyser16. Videre kan langvarig SDS behandling føre til fullstendig fravær av fibronectin sett i studiet av Godier-Fournement et al. 22, mens det er bevart med våre metoden17. Delene cECM er egnet for bruk i eksperimenter uten videre behandling (dvs. 3D kultur modeller analyserer celledifferensiering eller cellen-ECM interaksjoner eller "tissue engineering" mobilnettet repopulation tilnærminger). Bruk av FBS for DNA fjerning er svært effektive, men kan føre til noen gjenværende FBS proteiner i delene ECM. Dette kan påvirke noen FBS følsom analyser. Oversettelsen til en klinisk klasse GMP protokoll bør være mulig med bruk av sertifisert sera, men en tilpasning kan være nødvendig avhengig av forskrifter. Dette kan enten være bekrefter at FBS rester i ECM eller en endring i protokollen må erstatte FBS med DNase behandling. Til slutt, gjentatte fryse-Tin sykluser av vev og ECM deler er unngås for å hindre nedbrytning av matrix.
Produksjon cECM hydrogel, er pepsin fordøyelsen det viktigste trinnet i prosessen. I vårt første forsøk førte pepsin fordøyelsen ved pH 1 48 h på 37 ° C til tap av bioactivity, som kan forebygges ved å endre inkubering til pH 2 48 h på 27 oC. Også huske på at hydrogel produseres lyofilisert cECM microparticle suspensjon, ikke fra ferske decellularized våt cECM skiver. I tillegg til forbedret generell håndtering av hydrogel sammenlignet med cECM skiver har hydrogel fordelen at det kan bli utvannet for bruk i ulike konsentrasjoner, for eksempel ved en høyere konsentrasjon i kombinasjon med andre materialer eller 3D kultur, eller i en lavere konsentrasjon for belegg celle kultur retter eller som tilsetningsstoff til kultur medium.
Denne protokollen er opprettet som et laboratorium-grade SOP for menneskelig cECM forberedelser for å fylle hullene i translasjonsforskning regenerativ medisin som ble nylig beskrevet av Saldin et al. 10 mens decellularized cECM skiver kan brukes som ark på epicardial overflaten av syke hjertet, som nylig beskrevet av Sarig et al., med svin cECM i en rotte modell av hjerteinfarkt23, behandling til en hydrogel tillater mer variert i vivo programmer, for eksempel injeksjon av cECM i myokard som vist av Singelyn et al. 13 , 24 for å fortsette mot klinisk translasjonsforskning aktiviteter, gjeldende protokollen må konverteres til GMP-grade prosedyrer. I prinsippet alle materialer er også en del av godkjent medisinsk enhet/ATMP produksjonsprosesser (dvs. decellularized hjertet ventiler eller blod fartøy) og ingen store hindringer er å forvente. Imidlertid vil informasjon sikker oppbevaring varighet og fravær av patogener sikkert være nødvendig. Til slutt, en pålitelig kilde til større mengder frisk og sterile hjertet vev fra givere uten hjerte sykdom er nødvendig. Her er hjerter fra avdøde orgel givere som ikke er egnet for transplantasjon det mest sannsynlige scenarioet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Studien protokollen overholder de etiske prinsippene i deklarasjonen i Helsinki. Pasienter gitt samtykke for bruk av vev til forskningsformål, og prosessen med vev samling ble godkjent av institusjonelle Review Board og etikk av Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
