Summary
Bu iletişim kuralı tam decellularization insan Miyokardiyum, hücre dışı matriks bileşenlerinin koruma sırasında açıklar. Microparticles ve cytoprotective kendi kendine montaj hidrojel üretiminde hücre dışı matriks sonuçlarının daha fazla alay.
Abstract
Acellular hücre dışı matriks ürünleri hücre-matris etkileşimleri eğitimi için yararlıdır ve rejeneratif hücre terapisi uygulamaları kolaylaştırmak. Birçok ticari hücre dışı matriks ürün hydrogels veya membranlar olarak kullanılabilir, ancak bunlar doku özgü biyolojik aktivitesi sahip değilsin. Perfüzyon decellularization genellikle insan kalp dokusu ile mümkün olmadığı için 3-adım daldırma decellularization süreci geliştirdik. Ameliyat sırasında tedarik insan miyokardiyal dilimleri ilk deterjan-Alerjik hiperozmolar lizis arabellek, iyonik deterjan, Sodyum Lauryl Sülfat ile kuluçka takip ile tedavi ve içsel Dnaz aktivitesini sömürerek tamamlanmıştır Fetal sığır serum. Bu teknik boş hücre yaprak kalp hücre dışı matriks ile büyük ölçüde fibröz doku mimarisi ve biyopolimer kompozisyon, korunmuş olan kardiyak hücre popülasyonlarının ve pluripotent kök için belirli çevre yardım sağlamak için gösterildi sonuçlanır hücreleri. Kardiyak hücre dışı matriks sayfaları daha sonra daha da daha fazla kimyasal değişiklik yapmadan bir microparticle toz içine işlenmiş veya, bir kendi kendine montaj kardiyak hücre dışı matriks hidrojel ile içine kısa vadeli pepsin sindirim yolu ile korunmuş bioactivity.
Introduction
Hücre dışı Matriks (ECM) sadece yapısal destek ama aynı zamanda biyolojik hücre için önemlidir ve doku1işlev sağlar. Kalbinden, fibrozis, iltihap, anjiogenez, cardiomyocyte contractile fonksiyon ve canlılığı ve ikamet progenitör hücre kader gibi Etyopatogenezi yanıt Yönetmeliği ECM katılmaktadır. Birincil bileşenleri ek olarak - lifli glikoproteinlerin, glikozaminoglikan ve Proteoglikanlar - salgılanan büyüme faktörleri, sitokinler ve membranöz veziküller2,3nükleik asitler ve protein içeren bir dizi içerir.
Son zamanlarda acellular ECM hazırlıkları sadece hücre-matris etkileşimleri, potansiyel terapötik hücre tabanlı uygulamalar için de eğitim için çok değerli değildir açık hale gelmiştir. Tedavi hücre ürünlere veya mühendislik dokulara yeterli bir ortam önemini şimdi yaygın kabul edilmektedir. Girişimleri hücre süspansiyonlar veya aktif bileşikler ile tanımlanan biopolymeric hydrogels4,5,6 veya protein kokteyller (Yani, Matrigel, Geltrex) fare sarkomu hücreleri tarafından salgılanan birleştirmek için yapılmıştır 7. ancak, eski bioactivity sınırlı, ikinci GMP-grade süreçlerinde sorunlu ve her ikisi de kalp ECM (cECM)8,9,10, doku özgü bioactivity eksikliği 11,12,13.
Miyokardiyum decellularization daha önce bütün kalp koroner damarlara14,15ile perfüzyon tarafından yapıldı. Bu hayvan kalbimizde mümkün olmakla birlikte, sağlam insan kalpleri nadiren mevcuttur. Bu nedenle, ameliyat odasında alınan doku örnekleri işlemek için izin veren bir daldırma işlemi tercih. Bizim "3-adım" Protokolü 3 ayrı içerir kuluçka Yani lizis, solubilization ve DNA kaldırma adımlarını. Büyük ölçüde korunmuş protein ve glikozaminoglikan kompozisyon16,ile17insan miyokardiyal ECM verimleri. Bu cECM dilimler hücre-matris etkileşimlerin vitro çalışmalar için izin ancak kötü potansiyel insan ölçekli tedavi uygulamaları için uygundur. Üretim sürecinin ardından liyofilize cECM microparticles ya da cECM hidrojel18üretmek için uzatıldı.
Bu iletişim kuralı insan Miyokardiyum miyokard hücre dışı Matriks (ECM) ve biyolojik faaliyetlerini önemli bileşenleri koruyarak cerrahi örneklerinden elde decellularization için izin verir. Bu iletişim kuralı ile korunmuş doku özgü bioactivity insan kalp ECM hücre-matris etkileşimleri deneysel çalışmalar için gerekli olduğunda veya makul bir ortam miyokardiyal rejenerasyon hücre tabanlı yaklaşımlar için gerektiğinde önerilir. İşlenmiş cECM kullanımı mümkün gelecekte tedavi uygulamaları olmalıdır böylece prensipte, bu protokol GMP-sınıf koşullarına, adapte mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma Protokolü Helsinki Bildirgesi içinde özetlenen etik ilkelere uyan ve Kurumsal değerlendirme kurulu ve Etik Komitesi Charité Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalar sağlanan yazılı Onam kalp doku kullanımı deneysel araştırmalar için.
1. kesit için hazırlanması insan Miyokardiyum
- Sol ventrikül Miyokardiyum elde etmek (boyutu ameliyat türüne bağlı olarak değişir) doğrudan doğruya--dan belgili tanımlık ameliyathane ve steril bir kap içinde soğuk PBS nakliyesi.
- Tüm yağ dokusu steril neşter ile steril koşullarda No 10 bıçak kaldırın.
- Miyokardiyum yaklaşık 1 x 1 x 1 neşter kullanarak cm küpler içinde kesilmiş.
- Küpleri steril 50 mL tüplerde yerleştirin.
Not: duraklatmak için gerçekleştirmek adım 1.5, aksi halde adım 2.2 ile devam edin. Protein yıkımı ve doku kalitesi bir düşüş önlemek için yinelenen donma-çözülme döngüsü kaçının. - -80 ° C'de küpleri içeren tüpler depolamak Doku için birkaç ay depolanabilir.
2. kesit Miyokardiyum küpleri dilimler halinde
- Dondurucu dışında hazırlanan küpleri içeren tüpler al.
- Buzda cryostat için taşıma.
- -15 ° c için nesne ve Oda sıcaklığı ayarlamak
Not: Doğru sıcaklığa mükemmel kesit güvence altına almak önemlidir. - Sakin ol boş 50 mL tüpler ve pulları odası veya kuru buz.
- Bir katman ekleyin (yaklaşık 0.5 - 1.0 mL) cryosection orta soğuk damga ve izin üzerine Don o kadar beyaz ve sağlam.
- Cryosection orta ikinci bir katman ekleyin ve bir Miyokardiyum küp bu katman üzerine yerleştirin.
- Devam etmeden önce cryosection orta ve Miyokardiyum tamamen donmuş emin olun.
Not: Değil donmuş her zaman örnek ve cryosection orta kesit olacak. Tamamen dondurulmuş cryosection orta katı, beyaz ve saydam olmayan için sıvı ve şeffaf döner. Miyokardiyal küpleri en az 30 dk 1 s tamamen 1.4 adımından hemen devam Eğer dondurmak için gerekir. Doku dondurulmuş zaman o zaman dokundu/ele cımbız ile deforme değil. - Damga ile dondurulmuş Miyokardiyum yuvasına takın ve tüm vidaları sıkın.
- Hatta parça bir yüzey elde edilir kadar doku yüzeyine kırpın.
- Kesit kalınlığı 300 µm için ayarlayın.
- Donmuş Miyokardiyum otomatik kesit ile bölüm. Bu tek tip kesme bölümleri garanti eder. Yaklaşık 30-40 bölümleri bir küpten dilimlenmiş.
- Her dilimin gevşek bir precooled 50 mL tüp kesit sonra yerleştirin.
Not: dilimler veya paketi sıkıca bastırmayın. Yaklaşık 40 dilimleri bir tüp içinde uyum. - Dolu tüpler kapatın ve Buza koyun.
Not: 2,14 adımla üzerinde git duraklatmak için aksi takdirde adımla 3.2 devam edin. - Miyokardiyum dilimler-80 ° C'de depolayın Dilimleri için birkaç ay depolanabilir.
3. decellularization insan Miyokardiyum dilimleri
- 50 mL tüpler-80 ° C dondurucu ve buz üzerinde taşıma Miyokardiyum bölüm içeren gerekli dizi çekmek.
- Tüm 50 mL tüpler donmuş bölümlerini adım 3.1 den bir steril kabı aktarın. Yaklaşık 40 dilimleri kabı 50 mL tüp başına eklenir. Kabı üç kez 50 mL tüpler hacmi olmalıdır; Örneğin, decellularization bir 50 mL tüp için 150 mL kabı kullanın.
- 50 mL lizis çözüm (10 mM Tris, % 0,1 w/v EDTA, pH 7.4 H2O) 50 mL tüp Miyokardiyum dilimleri ile başına ekleyin.
- 100-150 RPM sürekli oda sıcaklığında 2 h için steril bir ölçek Miyokardiyum dilimleri sallamak.
- Dokusu dilimlerin sıvıyla kaba bir süzgeç aracılığıyla süzün. Dokusu dilimlerin künt bir cımbız ile yeni bir steril ölçek aktarın. 50 mL % 0.5 SDS PBS içinde Miyokardiyum dilimleri (miyokard bölümleri iki 50 mL tüp decellularizedÖrneğin, kullanım 100 mL SDS çözüm varken) ilk 50 mL tüp ekleyin.
- Sürekli 100-150 devirde oda sıcaklığında 6 h için salla.
- Dokusu dilimlerin sıvıyla kaba bir süzgeç aracılığıyla süzün. Dokusu dilimlerin künt bir cımbız ile yeni bir steril ölçek aktarmak ve 3 kez 10 dk 50 mL PBS 150 devir / dakikada sallayarak süre yıkayın. Daha sonra bir gecede PBS içinde %1 penisilin/streptomisin ve % 1 ile yıkayın nistatin (PBS-P/S-N) 100-150 devir/dakika ve sallayarak süre 4 ° C.
Not: Ayrıntılı çamaşır tamamen herhangi bir kalıntı SDS kaldırmak çok önemlidir. ECM hücreleri ile birlikte kullanıldığında SDS kalan izleri zehirlidir. - Çamaşır çözümü kaldırmak ve 25 mL ekleyin ısıtılmış FBS (37 ° C) %1 penisilin/streptomisin ve % 1 ile nistatin Miyokardiyum dilimleri ilk 50 mL tüp başına dilimlere decellularized.
- 37 ° C'de 3 h için kuluçkaya Bu adımda, matris FBS içsel Dnaz etkinliği nedeniyle kalan DNA kaldırılır.
- Dilimleri için yeni bir steril ölçek aktarmak ve 3 kez 10 dk 50 mL PBS 150 devir / dakikada sallayarak süre yıkayın.
Not: ECM dilimleri PBS-P/S-N 4 ° C'de birkaç gün boyunca saklanır. Ancak, bu hemen devam etmek için tavsiye edilir.
4. Decellularized cECM bir toz için işleme
- ECM dilimleri gevşek yeni bir steril 6-şey tabağına yerleştirin. ECM-80 ° C'de dondurmak ve 2 gün içinde bir lyophilizer için lyophilize.
Not: birden fazla dilim iyi yerleştirilebilir. Tamamen iyi yüzey kapsayacak şekilde dilimleri düzenleyin. Dilimleri örtüşen sonraki pulverizasyon başarı etkilemez. - ECM dilim pulverizasyon için kullanım belirli Freze (bkz: Malzemeler tablo) içeren 1.4 mm seramik boncuklar tüpleri. Tüpler gevşek liyofilize ECM ile steril künt cımbız kullanarak doldurun. En iyi sonuçlar için ECM toplam ağırlığı arasında 10-20 mg önerilir.
Not: ECM çok sıkı freze tüplerde doludur pulverizasyon süreci olumsuz etkilenecektir. - Ek-tüpler içinde sıvı azot kıpırdama.
Uyarı: sıvı azot son derece düşük sıcaklık, uygun kişisel koruma giymek. -
Donmuş tüpler freze makinesi yerleştirin ve ECM ezmek.
- Bir süre 30 ayarla s ve maksimum hız ve cihazın başlar.
- Bitirdikten sonra tüpler almak ve ek-tekrar sıvı azot içinde dondurma.
- Beş kez tekrarlayın.
- Tüpler üzerinden microparticles 1 mL GKD2O tüp ve sallamak ya da tam çözücü için girdap başına ekleyerek yıkayın. Türdeş olmayan solution'ı 200 µm kafes 50 mL tüp içine filtre.
- -80 ° C ya da sıvı azot tüp dondur.
- Standart kapak tüp 0,22 µm filtre ile değiştirin. Bu filtre kapağı tüp dışarı akan tozu engeller, ancak su buharlaşma için hava sirkülasyonu sağlar.
- Tüpler içinde lyophilizer takın ve tekrar su adımından (Adım 4.5) kaldırmak için lyophilize
Not: Bu adımda Lyophilization 3 gün sürebilir. - Toz-80 ° C'de daha fazla işleme kadar saklamak veya 5.1 adımıyla devam edin.
5. enzim tabanlı Homogenizing cECM mikro-parçacıklar
- 0,01 M HCl (pH 2.0) konsantrasyonu 1 mg/mL içinde domuz pepsin geçiyoruz. Tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında döner bir shaker yerleştirin.
- Pepsin çözüm için 10 mg/mL nihai bir konsantrasyon içinde lyophilized insan ECM toz (Adım 4.8) geçiyoruz. Pipetting ile iyice karıştırın. Toplam hacim ECM çözümü gerekli miktarına bağlıdır. Örneğin, 10 mg ECM tozu 1 mL pepsin çözümde geçiyoruz.
Not: parçacıklar eriterek nazik vortexing (1000-1500 devir/dakika) ile desteklenebilir. Microparticles topaklar kalan sindirim olumsuz etkiler. - Çözüm 2 mL tüpler 1 ml tüp başına bir birim ile aktarın.
- Tüpler bir tüp shaker 48 h 27 ° c ve 1200 rpm için yerleştirin.
- Tüpler dışarı shaker alın ve buz veya önceden soğutulmuş tüp sahibi yerleştirin.
- Soğuk 10 x PBS (pH 7,4) 1/10 ECM çözümü soğuk 0.1M hacmi ile karışımı 1/9 ECM çözümü hacmi NaOH precooled tüp ve buz üzerinde yer. Bu karışım sindirilir ECM çözümü etkisiz hale getirmek ve geri dönüşümsüz pepsin devre dışı bırakabilirsiniz.
- Nötralizasyon karışımı ve karışımı iyice pipetting veya vortexing yoluyla ECM çözümü ekleyin.
- ECM istenen konsantrasyon ile 1 x PBS (pH 7,4) için ayarlayın. Çözüm pH pH kağıdı ile kontrol edilebilir.
Not: ECM çözümü 10 mL örnek hesaplamasında sindirilmiş:
10 mg domuz pepsin 10 mL HCl (pH 2.0) ekleyin.
100 mg ECM toz pepsin ekleyin.
Not: 10 mL nötralize için örnek hesaplama ECM çözümü ve 8 mg/mL konsantrasyonu ayarlama sindirmek:
Volson = cbaşlatmak x Volbaşlatmak / cson 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = = 12,5 mL
Vol10xPBS = Volbaşlatmak / 9 = 1/9 10 mL = 1.11 mL 10 x PBS üzerinden
VolNaOH = Volbaşlatmak / 10 = 1/10 üzerinden 10 mL = 1 mL
Vol1xPBS VolFinal - Volbaşlatmak - Vol10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0.39 mL =
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3-adım Protokolü insan Miyokardiyum decellularization için burada anahtar ECM bileşenleri ve ECM fibriler yapısını koruyarak süre hücresel malzemenin çıkarılması tamamlamak sonuçları sunulan. Decellularization sonra doku hücrelerinden brüt kaldırılması (şekil 1A) renk değişikliği tarafından belirgindir. H & E ve Masson Trichrome lekeleri ile histolojik çözümleme kalan sağlam hücreleri (şekil 1B) olmaması ortaya. ECM bileşenler için nicel deneyleri SDS yalnız (şekil 2Atarafından) decellularization ile karşılaştırıldığında daha kapsamlı DNA kaldırma ve toplam kollajen, elastin ve glikozaminoglikan daha iyi korunması ortaya koydu. CECM biyolojik aktivitesini fonksiyonel kanıtı şekil 2Biçinde gösterilir. Burada, RT-PCR erken yapısal cardiomyocyte proteinleri (Myh6, Tnnt2), ifade ölçmek için kullanılan (Mef2c, Nkx2.5) ve geç (Gata4) cardiomyogenic transkripsiyon faktörleri ve endotel hücre yüzey marker gen (von Willibrand faktör (vWF), VE-cadherin) içinde fare ESC spontan farklılaşma geçiyor. Kaplamasız kültür çanak yüzeyi ve Matrigel-ECM kaplama ile karşılaştırıldığında, bu cECM ile temas pluripotent kök hücreler tercihen cardiomyocyte benzeri fenotip doğru sürücüler açıktır.
ECM dilimleri liyofilize daha fazla enzimatik veya kimyasal reaktifler kullanılmadan microparticles işlenebilir. Mekanik taşlama veya uygun kitleri ile üniforma büyüklük (şekil 3A) microparticles üretim için izin kullanarak ezildiği. Kütle spektrometresi cECM içinde mevcut tüm tanınabilir proteinlerin genel bir bakış sağlar. Gene Ontoloji çözümleme hücresel bileşenleri üzerinde konsantre ECM proteinler çoğunluğu gerçekten kaç hemoglobin artıkları ve ağırlıklı olarak hücre içi proteinler (şekil 4) bir dizi ile hücre dışı alan türetilmiştir ortaya. Bu desen doku özgü biyolojik fonksiyonu cECM belirleyebilir, ancak daha fazla araştırma bu hipotez gerekir. CECM protein kompozisyon bir Özet gösterilir Tablo 1. ECM microparticles işleme onun biyolojik aktivitesi korur. Simüle "iskemik" koşulları (hipoksi, glikoz ve serum yoksunluk) maruz HL-1 hücreleri hücre metabolizması (şekil 3B) ve cECM (şekil 3 c) kültürlü zaman hücre ölümü bir azalma artış görüntülenir.
Sınırlı pepsin tabanlı sindirim değiştirilmiş bir protokol kollajen arıtma19için geliştirilen temel cECM tozu, homojenize ECM çözeltilerine sonuçlanır. Faz kontrast ışık mikroskobu resimler (şekil 5A) 0 h ve 48 saat sonra sindirim süreci göstermektedir. Homojenizasyon bu adım rejeneratif tıp10uygulamaları kolaylaştırır. Elde edilen işlenmiş cECM şekil 5Biçinde gösterilir. Oda sıcaklığında sıvı kalır (şekil 5B, sol) ama 37 ° C'de bu kendi kendine montaj hidrojel istikrar bir yerleşim için uygun ile hücre süspansiyonlar 3D kültür (temsili resmi şekil 5B , değil hidrojel izin formları «««katmanlı) ile Kültür orta. Canlı/ölü insan kalp fibroblastlar boyama cECM (şekil 5C) kültür yararlı etkilerini gösterir. CECM microparticles ve cECM hidrojel contractile HL1 hücre hücreleri standart kültür (şekil 5C, alt doğru kapı aynası) karşılaştırıldığında iskemik koşullarında metabolik aktivite gelişmiş.
Şekil 1: insan kalp Miyokardiyum Decellularization. (A) cECM stereo mikroskobu tarafından makroskopik analizi ortaya koymaktadır hücresel malzeme 3-adım decellularization protokolü ile kaldırılması. Bu şeffaflık artış açıktır. (B) önce ve sonra decellularization ile o-(solda; Histoloji miyokardiyal dilim boyama Ölçek çubuğu 50 µm =) ve Masson Trichrome boyama (değil; Ölçek çubuğu = 200 µm) doku hücrelerinden başarılı kaldırılması gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: içerik ve cECM dilimleri etkisi. (A) kantitatif biyokimyasal analiz seçili ECM bileşenleri ve DNA, % 0.5 SDS-yalnız decellularization için 3 adım decellularization Protokolü karşılaştırma. Veri yerel Miyokardiyum içeriğinde yüzdesi olarak ifade edilir. 3-adım protokolü ile kalan DNA içeriği neredeyse sıfırdı ve %0,5 9 h kuluçka bir standart ile kombine sonra SDS/lizis arabellek bu kombinasyon ve FBS (SDS 9 s + FBS) önemli ölçüde daha düşük. İlgili biyokimyasal deneyleri yerel doku ve elastin içerik, tüm önemli ölçüde ile daha yüksek yaklaşık % 30 koruma göre yakınındaki tamamlamak bir koruma kollajen, yaklaşık % 20 korunması glikozaminoglikan içerik için gösterdiği (çubuklar ortalama ± SEM gösterir) standart SDS başvuru protokol. (B) mRNA ifade İndüklenmiş pluripotent kök hücreler üzerinde cECM, ayırt seçili genlerin karşılaştırıldığında kaplamasız kültür yemekleri ve Matrigel kaplı yüzey. cECM veri bu ilgili denetimi malzemeler elde normalize (Denetim = 1, kesik çizgi). Kardiyak genlerini çoğunluğu önemli ölçüde daha yüksek (çubuklar ortalama ± SEM gösterir) cECM kültürlü zaman ifade edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: görünüm ve biyolojik etkinliği cECM microparticles. (A) cECM microparticle toz lyophilization sonra. (B) metabolizma (MTS) ve (C) hücre ölüm (karaciğer serbest bırakmak) analizi HL-1 hücre cECM veya jelatin ile kültürlü. cECM önemli ölçüde hücre ölümü azaltır ve metabolizma artar. Çubuklar ortalama ± SEM, istatistiksel anlamlılık test tek yönlü ANOVA ve Bonferroni gösterir. Şekil 3B -C Kappler'ı ve ark. değiştirilme tarihi 18 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Protein bileşimi cECM microparticles. Kütle spektrometresi dize DB analiz cECM, esas olarak ekstrasellüler alanı ile ilişkili olan anahtar bileşenleri gösteriyor (GO: 0005615; kırmızı küre p > 0,05). Çizgiler biyokimyasal deneysel veriler eş ifade veri (siyah), veritabanı etkileşimi (mavi) ve co ifade (yeşil) (mor), protein etkileşimleri dayalı gösterir. Dize DB gerekli güven: skor > 0,4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: bir hidrojel cECM işlenmesi biyolojik etkinliğini korumak. Faz kontrast ışık mikroskobu resimler 48 h sonuçlar daha homojen bir ECM çözümü için cECM o Enzimatik sindirim gösterir; Ölçek çubuğu = 500 µm. (A) ECM çözümü kalır sıvı kadar oda sıcaklığında (B, sol) ve ne zaman (B, sağ) 37 ° C'de inkübe hidrojel doğru kendi kendini araya potansiyeline içerir. Kardiyak insan fibroblast ve cECM olmayan kültürlü canlı/ölü leke ortaya koymaktadır canlı hücreler yoğunluğunu boyama daha yüksek bir calcein; Ölçek çubuğu 50 µm (C)=. CECM hidrojel mikro parçacıklar (C, daha düşük doğru kapı aynası, Kappler'ı ve ark. değişiklik aynı şekilde HL1 hücre iskemik koşullarında metabolik aktiviteyi artırır 18) çubuklar ortalama ± SEM, istatistiksel anlamlılık test tek yönlü ANOVA ve Bonferroni gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Protein tanımı |
| 5-hydroxytryptamine reseptör 7 OS Homo sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = = 2 |
| Aktin benzeri protein 6B OS Homo sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1 = |
| Aktin, aort düz kas OS Homo sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1 = |
| Serum albümin OS Homo sapiens GN = ALB PE = 1 SV = = 2 |
| Antithrombin-III OS Homo sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1 = |
| Apolipoprotein C-III OS Homo sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1 = |
| Apolipoprotein E OS Homo sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1 = |
| Kıvrılmış-coil etki alanını içeren protein 47 OS Homo sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1 = |
| C tipi lektin etki alanı aile 11 üyesi A OS Homo sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1 = |
| Klorür hücre içi kanal proteini 1 OS Homo sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4 = |
| Kollajen alpha-2(I) zinciri OS Homo sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = = 7 |
| Tamamlayıcı C3 OS Homo sapiens GN = C3 PE = 1 SV = = 2 |
| Kollajen alpha-2(IV) zinciri OS Homo sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4 = |
| Siklik AMP-yanıt veren öğe-bağlayıcı protein 3 benzeri protein 4 OS Homo sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1 = |
| Dermatopontin OS Homo sapiens GN = DPT PE = 2 SV = = 2 |
| Fibronektin OS Homo sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4 = |
| Glutatyon peroksidaz 3 OS Homo sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = = 2 |
| Hemoglobin alt birimi alpha OS Homo sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = = 2 |
| Hemoglobin alt birim beta OS Homo sapiens GN = HBB PE = 1 SV = = 2 |
| IG kappa zinciri C bölgesi OS Homo sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1 = |
| Lumican OS Homo sapiens GN = LUM PE = 1 SV = = 2 |
| Mimecan OS Homo sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1 = |
| Nidogen-1 OS Homo sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3 = |
| Atipik kinaz 1 pseudopodium zenginleştirilmiş OS Homo sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4 = |
| Pigment epitel kaynaklı faktörü OS Homo sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4 = |
| Mitokondrial koenzim A ışınlama SLC25A42 OS Homo sapiens GN = SLC25A42 PE = 2 SV = = 2 |
| Serum amiloid P-bileşen OS Homo sapiens GN = ZPT PE = 1 SV = = 2 |
| Transkripsiyon başlangıç faktörü TFIID alt birim 5 OS Homo sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3 = |
| Tudor etki alanını içeren protein 3 OS Homo sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1 = |
| Parmak matrin tipi protein 4 çinko OS Homo sapiens GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1 = |
| Parmak protein 101 çinko OS Homo sapiens GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1 = |
Tablo 1: Kütle spektrometresi tarafından belirlenen cECM toz Protein bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan miyokardiyal ECM hazırlarken aşağıdaki ulaşmak hedeftir: kaldırma ilgili immünojenik hücresel malzemeleri, ECM bütünlüğü ve bioactivity, kısırlık, toksisitesi son ürünü, GMP-işlem uyumluluk, korunması ve ürün işleme açısından belirli bir uygulama için uygunluğunu. Bizim 3-adım decellularization protokol microparticles veya kendi kendine montaj hidrojel işleme daha fazla ile birleştirerek, insan kalp ECM malzeme elde edilir belirli biyolojik aktivitesi sahip, işlemek kolay ve için potansiyele sahiptir çoklu uygulamaları vitro ve in vivo, ne ECM ürünler için çeşitli hayvan türleri11,13,20,21gösterilmiştir benzer.
Bileşik toplama ve tedavi süresi titre 300 µm dilimler için miyokard doku başlangıç işlemi sırasında bölümü miyokardiyal aynı kalınlığı, dilimlere önemlidir çünkü. Daha kalın dilimler eksik olarak decellularized olacak ve daha ince dilimleri ECM bileşenleri istenmeyen dökümünü bioactivity kaybı acı çekecek. Bu özellikle SDS tedavi açısından nerede toksisite olumsuz ECM özellikleri ve hücresel analizler16etkileyebilir önemlidir. Ayrıca, uzun süreli SDS tedavi fibronektin yokluğunda tarafından Godier-Fournement vd. çalışmada görüldüğü gibi tamamlamak için yol açabilir bizim yöntem17ile korunur ise 22. CECM bölümleri (Yani, hücre farklılaşması veya hücre-ECM etkileşimleri analiz 3D kültür modelleri veya "Doku Mühendisliği" hücresel repopulation yaklaşımlar) işleme daha fazla olmadan deneylerde kullanmak için uygundur. FBS kullanımını DNA kaldırma için çok etkilidir, ancak bazı kalıntı FBS proteinlere ECM bölümlerde yol açması olası. Bu herhangi bir FBS hassas deneyleri etkileyebilir. Ancak bir uyum düzenlemelere bağlı olarak gerekli olabilir çeviri bir klinik sınıf GMP protokolüne sertifikalı sera, kullanımı ile mümkün olacaktır. Bu da FBS kalıntılarında ECM yokluğunda teyit veya bir değişiklik Protokolü FBS Dnaz tedavi ile değiştirmek gerekli olacaktır. Son olarak, doku ve ECM bölümleri tekrar tekrar donma-çözülme döngüleri matrix bozulma önlemek için kaçınılması gereken vardır.
CECM hidrojel üretirken, pepsin sindirim sürecinde en önemli adımdır. Bizim ilk deneylerde pepsin sindirim pH 1 37 ° C'de 48 h için pH 2 27 oC., 48 h için kuluçka değiştirerek önlenebileceğini bioactivity kaybına yol açtı Ayrıca, unutmayın ki hidrojel cECM liyofilize microparticle süspansiyon, taze decellularized ıslak cECM dilimleri üzerinden elde edilir. Hidrojel cECM dilimleri ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş genel işleme özelliğine ek olarak, hidrojel o yoğun diğer materyaller ile örneğin farklı konsantrasyonlarda kullanılmak veya 3D için seyreltilmiş bir avantaja sahiptir. Kültür, ya bir düşük yoğunluklu kaplama için hücre kültür yemekleri veya kültür ortamına bir katkı olarak da.
Bu iletişim kuralı olarak son zamanlarda Saldin vd tarafından açıklanan translasyonel rejeneratif tıp boşlukları doldurmak yardımcı olmak insan cECM hazırlık için bir laboratuvar-grade SOP kurmuştur 10 decellularized cECM dilimleri son zamanlarda çevirileri ve vd., domuz cECM, miyokard infarktüsü23, bir fare modeli ile tarafından tanımlandığı gibi hastalıklı kalp epicardial yüzeyi olarak uygulanabilir bir hidrojel işleme cECM enjeksiyon Miyokardiyum içine gibi daha farklı vivo içinde uygulamalar için Singelyn vd tarafından gösterildiği gibi sağlar 13 , 24 doğru klinik translasyonel faaliyetleri devam etmek için geçerli protokol GMP-grade yordamlar için dönüştürülmesi gerekir. Prensip olarak, kullanılan tüm malzemeler de onaylanmış tıbbi cihaz/ATMP üretim süreçleri (decellularizedYani, kalp kapakları ya da kan damarları) parçasıdır ve beklenen herhangi büyük bir engel vardır. Ancak, güvenli saklama süresi ve patojenler yokluğu hakkında bilgi kesinlikle gerekli olacaktır. Sonuçta, güvenilir bir kaynak temiz ve steril kalp doku donör kalp hastalığı olmadan daha büyük miktarlarda gereklidir. Burada, kalp nakli için uygun değildir vefat eden organ bağış en olası senaryo vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Çalışma Protokolü Helsinki Bildirgesi içinde özetlenen etik ilkelere uyan. Hasta Onam doku kullanımı araştırma amacıyla için sağlanan ve doku toplama sürecinin kurumsal Değerlendirme Komitesi ve Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12) Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
