Summary
Een zeer zuivere bevolking van megakaryocytes kan worden verkregen van koord bloed afkomstige CD34+ cellen. Een methode voor CD34+ celdifferentiatie isolatie en Megakaryocyt is hier beschreven.
Abstract
Bloedplaatjes productie komt voornamelijk in het beenmerg in een proces dat bekend staat als thrombopoiesis. Tijdens thrombopoiesis onderscheid hematopoïetische voorlopercellen naar vorm bloedplaatjes precursoren genaamd megakaryocytes, die terminaal differentiëren om bloedplaatjes van lang cytoplasmatische processen genoemd proplatelets vrij te geven. Megakaryocytes zijn zeldzame cellen beperkt tot het beenmerg en zijn daarom moeilijk om te oogsten in voldoende aantallen voor laboratoriumgebruik. Efficiënte productie van menselijke megakaryocytes kan worden bereikt in vitro door het kweken van CD34+ cellen onder adequate omstandigheden. Het protocol hier gedetailleerde beschrijving Isolatievan CD34+ cellen door magnetische cel sorteren van bloedmonsters van de navelstreng. De nodige maatregelen om het produceren van zeer zuivere, volwassen megakaryocytes onder serumvrij voorwaarden worden beschreven. Details van fenotypische analyse van differentiatie van de Megakaryocyt en bepaling van de proplatelet formatie en bloedplaatjes productie zijn ook aanwezig. Effectoren die van invloed zijn Megakaryocyt differentiatie en/of de vorming van de proplatelet, zoals anti-bloedplaatjes antilichamen of thrombopoietin mimetics, kunnen worden toegevoegd aan gekweekte cellen te bestuderen van de biologische functie.
Introduction
Isolatie van een voldoende aantal primaire menselijke megakaryocytes (MK) voor regelmatige laboratoriumgebruik is niet haalbaar vanwege hun lage frequentie in het beenmerg, waar ze goed voor ~0.01% voor genucleëerde cellen1. Een handig alternatief is de ex vivo uitbreiding en differentiatie van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen in de aanwezigheid van bepaalde groeifactoren. Een aantal cytokines waaronder stamcel factor (SCF; c-kit ligand) en Interleukine (IL) -3 en IL-11 geweest is werkzaam in cultuur systemen te produceren MKs. Thrombopoietin (TPO) de meest effectieve groei en differentiatie factor voor megakaryocytic culturen en is effectief, alleen of samen met andere cytokines, zoals SCF en IL-32. TPO kan optreden op de populaties van de cel van de stam leiden tot zowel de proliferatie en de rijping van MKs2.
MK producten bloedplaatjes van cytoplasmatische uitsteeksels genaamd proplatelets en, in vivo, ongeveer 1 x 1011 bloedplaatjes worden is gevormd dagelijks om bloedplaatjes graven van 150-400 x 109muurkast bloedplaatjes productie in vitro tot 1000 -Vouw lager dan de in vivo 3 schat, en dit heeft aanleiding gegeven tot talrijke kweekomstandigheden met behulp van CD34+ hematopoïetische voorlopercellen te verbeteren MK en bloedplaatjes productie in vitro. De eerste bron van CD34+ cellen die worden gebruikt voor MK differentiatie was perifere bloed4. Andere mobiele bronnen omvatten beenmerg5,6, embryonale stamcellen/geïnduceerde pluripotente stamcellen (ESC/iPSC)7en navelstreng bloed (UCB)8,9,10 . Menselijke beenmerg CD34+ 11 en muis lineage negatieve beenmerg cellen5 produceren MK en bloedplaatjes in vitro; echter het gebrek aan beschikbaarheid van menselijke beenmerg beperkt het gebruik ervan als een bron van CD34+ cellen. In tegenstelling, vertegenwoordigen ESC en iPSC een onbeperkte bron van cellen voor in vitro bloedplaatjes productie. Bloedplaatjes productie van deze cellen vereist feeder cellen zoals lymfkliertest OP9 cellen en langere cultuur. Bloedplaatjes afgeleid in feeder-vrij voorwaarden lijken minder functionele12. iPSC afkomstige bloedplaatjes dreigen te worden voor gebruik in klinische instellingen aangezien zij kunnen worden uitgebreid tot een grote schaal. Dit proces vereist lentivirale-gemedieerde transductie van transcriptiefactoren en op lange termijn cel cultuur13.
UCB is een toegankelijke bron van CD34+ cellen die gemakkelijk kunnen worden gebruikt in onderzoek instellingen. Alleen TPO kan bevorderen differentiatie van koord bloed afkomstige CD34+ cellen en dit leidt tot zeer zuivere, volwassen MKs zonder de noodzaak van serum suppletie of co cultuur met feeder cellen. Andere cytokines zoals SCF kan afnemen differentiatie van UCB CD34+ cellen, terwijl Flt-3 ligand en IL-11 de productie van onrijpe megakaryocytes14 bevorderen. Dit protocol beschrijft de productie van zeer zuivere MK culturen uit navelstrengbloed CD34+ cellen in serumvrij voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door de zuid-oostelijke Sydney menselijke ethiek Commissie onderzoek en door de Commissie van de ethiek van het onderzoek van de Universiteit van New South Wales het menselijke geratificeerd. Navelstrengbloed verkregen van gezonde donoren werd verstrekt door de Sydney navelstrengbloed Bank (Sydney, NSW, Australië). Volumes van ongeveer 100 mL werden gebruikt voor deze procedure.
Let op: Brei in een klasse II bioveiligheid kabinet met behulp van aseptische techniek. Ontsmetten van de buitenkant van de koord bloed zak met 70% ethanol. Steriele instrumenten (schaar, pincet) gebruik voor deze procedure.
1. aansluitsnoer bloedcel voorbereiding en isolatie van CD34+ cellen
- Bereiden steriele scheiding buffer (SB) met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,2 en met 0,5% boviene serum albumine en 2 mM EDTA.
- Breng in een conische tube van 50 mL (één tube per 10 mL bloed is vereist) 10 mL van SB. Met behulp van een G18 botte naald gemonteerd op een 10 mL spuit, 10 mL bloed trekken uit de zak en afzien in de 50 mL tubes met 10 mL SB.
- Voeg toe 15 mL lymfocyt scheiding media (Zie Tabel van materialen) naar de onderkant van de buis met het verdunde bloed, twee lagen maken.
Opmerking: Afzien media langzaam aan de onderkant van de buis om te voorkomen dat het mengen van de verschillende lagen. - Centrifugeer buizen bij 1200 × g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) met geen pauze en geen versnelling.
- Overdracht van de laag in de buurt van het midden van de buis met mononucleaire cellen (ongeveer 5-10 mL uit elke buis) in een nieuwe tube van 50 mL, met behulp van een precisiepipet Pasteur. SB toevoegen aan elke buis tot een totaal volume van 50 mL.
- Centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 minuten op RT. Discard het supernatant.
- Resuspendeer cel pellets zorgvuldig met een pipet van Pasteur in 5-10 mL SB. combineren de zwevende cellen en brengen volume op 50 mL met SB.
- Cellen tellen met behulp van Trypan blauw kleuring en een hemocytometer of geautomatiseerde cell counter (Zie Tabel van materialen). Om te bepalen van het percentage van de CD34+ cellen in het monster, resuspendeer 2,5 × 105 cellen in 100 µL van SB en vlek door het toevoegen van 10 µL van anti-CD34-PE antilichamen tegen 15-30 min bij 4 ° C. Analyseren met stroom cytometry (figuur 1A).
- Centrifuge buizen bij 400 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Vloeistof wordt weggeworpen.
Opmerking: als niet onmiddellijk nodig, mononucleaire cellen kunnen worden bevroren in dit stadium. - Resuspendeer de cellen in 300 µL van SB per 108 cellen. Voeg 100 µL van FcR menselijke IgG (blokkeren reagens, Zie Tabel van materialen) en 100 µL van de magnetische kralen CD34 per 108 cellen. Meng voorzichtig en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30-40 min.
Opmerking: Een enkele celsuspensie is vereist (indien nodig, de cellen al een 30 µm filter overgaan alvorens toe te voegen reagentia). Kunt u de volumes van de reagens hier beschreven voor 108 cellen of minder gebruiken. Voor meer dan 108 cellen, schaal omhoog de reagentia (SB, blokkeren van oplossing en CD34 magnetische kralen) dienovereenkomstig. - Bereid de LS scheiding kolom tijdens de incubatieperiode door plaatsen van de LS-kolom in een magnetische houder en wassen met 3 mL SB. teruggooiverbod het effluent.
Opmerking: LS scheiding kolommen kunnen worden geladen met maximaal 2 × 108 totaal aantal cellen. Kleinere en grotere kolommen zijn beschikbaar. - 5-10 mL SB toevoegen aan het mengsel van de cel en centrifuge op 400 × g voor 10 min. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 1,5 mL SB en laden van de celsuspensie (1,5 mL) op de LS-kolom. Het verzamelen van de stroom door de met de labelloze cellen in een collectie-tube van 15 mL (negatieve fractie #1). Laat de vloeistof drain en was de kolom met 1,5 mL SB.
- Laden van de verzamelde stroom door (3 mL) terug in de kolom en verzamel de stroom door in de dezelfde 15 mL collectie buis (negatieve fractie #1). Was de kolom van LS 3 keer met 3 mL SB.
Opmerking: Indien nodig, kunnen de cellen in de negatieve fractie (12 mL) worden gekleurd met anti-CD34 antistof om na te gaan van de vangst van CD34+ cellen door de LS-kolom. - Kolom verwijderen uit het magnetische scheidingsteken en spoel cellen langzaam met een zuiger van de spuit in een nieuwe tube van 15 mL met 2 mL SB.
- Plaats kolom terug op magnetische scheidingsteken en lading de 2 mL van cellen terug in de kolom. De stroom door verzamelen en wassen met 2 mL SB. Dit is de negatieve fractie #2 (4 mL).
- LS kolom verwijderen uit magnetische scheidingsteken en voeg 2 mL SB. Flush cellen gestaag en stevig met een zuiger van de spuit om te verzamelen van de CD34+ cel breuk. Met behulp van trypan blauw kleuring en een hemocytometer of teller van geautomatiseerde cel cellen te tellen.
- Centrifugebuis met de positieve breuk bij 400 × g gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in serumvrij media voor CD34+ cellen (SFM, Zie Tabel van materialen).
Opmerking: als niet onmiddellijk nodig, cellen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof in dit stadium.
2. zuiverheid Check van geïsoleerde CD34+ cellen
- Vlekken van 2 x 104 cellen uit de positieve afvalfractie met 10 µL anti-CD34-PE antilichaam en 20 µL anti-CD45-PerCP antilichaam voor 15 min bij 4 ° C (gebruik een aparte buis voor isotype besturingselementen) (figuur 1B).
- Voeg vervolgens 1 mL van SB te wassen. Centrifugeer bij 400 × g voor 10 min. resuspendeer pellet in 200 µL van SB.
- Stroom cytometrische analyses uit te voeren en de bevolking van de levende cel als u wilt uitsluiten van puin (figuur 1B) poort. De poort instellen voor PE en PerCP positieve populaties met de PE en PerCP isotype besturingselementen (figuur 1B) en het bepalen van het percentage van de CD34+/CD45+ cellen.
3. Megakaryocyt differentiatie
- Zaad 5 × 105 cellen/mL CD34+ cellen in 2 mL zuiver SFM aangevuld met 50 ng/mL recombinante menselijke thrombopoietin (rhTPO) per putje in een 12-well-plate. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde sfeer. Als cellen confluente worden voordat ze vereist voor analyse zijn, oogsten van de cellen en splitsen in meerdere putten met verse media en rhTPO.
Opmerking: Twee of drie putten moeten bereid zijn specifiek te controleren van differentiatie op verschillende tijdstippen (bv, dagen 7, 9 en 10). - Oogsten van cellen uit de putten die zijn gereserveerd voor het controleren van differentiatie zonder verstoring van de cellen in de andere putten.
- Vlek cellen met 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antilichaam en 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antilichaam in een eindvolume van 100 µL. tube een besturingselement instellen met behulp van de respectieve isotype controle antilichamen. Incubeer gedurende 15-30 min bij 4 ° C.
- Voeg vervolgens 1 mL van SB te wassen.
- Voeg vervolgens 1 mL van SB te wassen. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 min. resuspendeer de pellet in 100 µL van SB en spin op een glasplaatje bij 1.000 x g gedurende 5 min. Fix cellen op de dia door dompelen in methanol voor 30 s. lucht droog, Voeg 20 µL van montage DAPI met media (Zie Tabel van materialen) , dek af met een dekglaasje aan, en visualiseren met behulp van een fluorescente microscoop (figuur 2A).
- Wassen met 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 en centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 min, resuspendeer in 100 µL van de dezelfde buffer en anti-muis IgG-Alexa 594 en anti-konijn IgG-Alexa 488 (1:100) toevoegen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, wassen met 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 resuspendeer in 100 µL van de dezelfde buffer en Voeg 20 µL van anti CD42b-APC. Vervolgens draaien de cellen op glas dia's zoals beschreven in stap 3.6.1 en monsters voorbereiden met microscopische visualisatie, zoals beschreven in stap 3.6.1.
- Een keer wassen met 1 mL SB en resuspendeer de pellet in 300 µL van hypotone citraat buffer (1.25 mM Natriumcitraat, 2.5 mM natriumchloride, 3.5 mM dextrose) met 20 µg Mo/ml propidium jodide en 0.05% Triton-X 100. Incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C beschermd tegen licht.
- RNase toevoegen om een eindconcentratie van 20 µg/mL en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C beschermd tegen licht. Het bepalen van de intensiteit van propidium jodide door stroom cytometry door het verzamelen van 30.000 tot 50.000 evenementen van de CD41-FITC+ -bevolking (figuur 2C).
4. proplatelet tellen, bloedplaatjes opsomming en bloedplaatjes activering
- Oogsten van cellen (uit stap 3.1) dagen 8 of 9 van differentiatie en zaad bij 1 × 104 cellen/well in 48-Wells-platen in 200 µL van verse SFM aangevuld met 50 ng/mL rhTPO. Cultuur voor 5 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.
Opmerking: Voor kwantificatie doeleinden wells zaad in drievoud. Deze lage dichtheid is vereist voor visualisatie en tellen van proplatelet-bevattende MK. Proplatelets meestal start verschijnen na 2 dagen van cultuur. De piek is tussen 4 en 5 dagen. - Het aantal proplatelet-bevattende MK in de hele put op een omgekeerde licht microscope met behulp van 10 X of 20 X doelstellingen.
Opmerking: Een verwarmd (37 ° C) Microscoop stadium verdient de voorkeur, aangezien de cellen houden bij kamertemperatuur gedurende langere perioden krimp van de proplatelet extensies veroorzaakt. Proplatelets worden waargenomen als lange extensies uit het lichaam MK. Elke MK wellicht verschillende proplatelet uitsteeksels. Aangezien proplatelets ontwikkelen, vermindert het lichaam voor de MK in grootte. - Oogsten van cellen samen en centrifugeer bij 400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vlek cellen met 20 µL anti-menselijke CD41-FITC antilichaam, zoals beschreven in stap 3.3 en 3.4. Bereken het percentage voor proplatelet-dragende MK (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet-bevattende MKs/goed) / (totale CD41+ cellen / well)] x 100
- Als u wilt tellen bloedplaatjes vrijkomen van het kweekmedium, zachtjes Meng de cellen met een pipet van Pasteur en 100 µL verzamelen op dagen 14 of 15 van de cultuur.
- Vlek met 20 µL anti-menselijke CD41-FITC antilichaam voor 20-30 min bij 4 ° C. Instellen van een controle-buis met behulp van de respectieve isotype controle antilichaam.
- Voeg 150 µL van SB en 50 µL van het tellen van de kralen.
- Voor de analyse van de cytometrische van de stroom, stel de FSC en de SSC te melden van de schaal. Gebruik normaal menselijk bloed bloedplaatjes van platelet-rich plasma gekleurd met CD41-FITC zoals beschreven in paragraaf 4.4.1 instellen de gating voor bloedplaatjes (figuur 3A).
- De gekleurde bloedplaatjes met kralen tellen door stroom cytometry analyseren. Het verzamelen van 1000 gebeurtenissen tellen kralen met behulp van de FSC versus SSC scatterplot (figuur 3A). Bereken het aantal bloedplaatjes op basis van CD41-FITC positieve gebeurtenissen (figuur 3B) met behulp van de formule:
Bloedplaatjes per µL = [(aantal CD41-FITC positieve gebeurtenissen)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/monster volume)]
- Voor het analyseren van de activering van de bloedplaatjes, zachtjes Meng de cellen met een pipet van Pasteur en 100 µL verzamelen op dagen 14 of 15 van de cultuur. Voeg 1 mL Tyrode de buffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM nb2HPO4,3NaHCO 12 mM, 5.5 mM D-glucose, pH 6,5) en centrifuge bij 200 x g gedurende 5 min naar pellet cellen.
- De bovendrijvende vloeistof en centrifuge bij 800 x g gedurende 10 minuten naar de pellet van bloedplaatjes en middelgrote deeltjes verzamelen.
- Verwijder supernatant en resuspendeer in 100 µL Tyrode de buffer. 20 µL van PAC1-FITC antilichaam en adenosinedifosfaat (ADP) toevoegen om een eindconcentratie van 20 µM. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten analyseren door stroom cytometry om te bepalen van het percentage van FITC positieve gebeurtenissen. Gebruik verse menselijke bloedplaatjes behandeld op dezelfde wijze als positieve controle (Figuur 3 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol staat toe de voorbereiding van zeer MK reinculturen van koord bloed afkomstige CD34+ cellen. Het percentage van de CD34+ cellen in koord bloed is ongeveer 1,3%15 (figuur 1A) en het totale aantal mononucleaire cellen (stap 1.8) varieert van 90-300 x 106 per UCB eenheid. De zuiverheid van CD34 +/ CD45 + cellen na isolatie varieert van 90 tot 99% (figuur 1B). MK (gedefinieerd als CD41+ cellen) worden waargenomen vroeg in serumvrij CD34+ cel culturen in aanwezigheid van rhTPO. Op dag 7, het percentage oudere MK (CD41+ en CD42a+ cellen) is meestal 30-40% (Figuur 1 c). De hoogste niveaus van CD41+ en CD42a+ dubbele positieve cellen (90-99%) tussen 10 en 12 van differentiatie (Figuur 1 c) dagen in acht worden genomen. De variabiliteit waargenomen is afhankelijk van vooral de koord-bloed-bron en de zuiverheid van de CD34+/CD45+ cellen in stap 1.17 geïsoleerd. De opbrengst van volwassen MK op dag 10 varieert van 5-10 per input CD34+ cel. Oudere MK (CD41+/CD42b+) waargenomen onder tl microscopie worden weergegeven in figuur 2A. Gekweekte MK weergegeven als grote, meestal multinucleaire cellen (figuur 2A, pijlpunten). De MK granulaire inhoud werd bepaald door vWf (groen) en CD62p (p-selectine, rood) vlekken (figuur 2B). De verdeling van de ploïdie waargenomen in gekweekte MKs is afgebeeld in figuur 2C.
Proplatelets zijn lange, beaded vezels of filamenten die uit de MK-lichaam uitsteken. Proplatelets kan worden verschillende honderd micrometer lang16 en takken en opgezwollen regio's bevatten. Een karakteristiek proplatelet-bevattende MK wordt geïllustreerd in figuur 2D. Het percentage voor proplatelet-dragende MK (pbMK) werd 1,3 ± 0,17%.
Bloedplaatjes kunnen worden geanalyseerd en geteld zoals beschreven in het protocol. Zoals blijkt uit figuur 3B, vallen de meeste bloedplaatjes in de celcultuur supernatant de analytische poort van perifere bloed bloedplaatjes en zijn positief voor de markering van de bloedplaatjes CD41 (figuur 3B). De opbrengst van de bloedplaatjes van dit varieert van de methode van 19 tot 42 bloedplaatjes per MK. bloedplaatjes geproduceerd in cultuur kan worden geactiveerd door bloedplaatjes agonisten zoals ADP zoals bepaald door de toegenomen afhankelijkheid van de activering-specifieke PAC1 monoklonaal antilichaam (Figuur 3 c) .
Figuur 1: Stroom cytometry percelen CD34+ cel isolatie en MK differentiatie in cultuur. (A) mononucleaire cellen (gated zoals in het linker paneel) gezuiverd uit menselijke navelstrengbloed (stap 1.8) werden gekleurd met anti-CD34-PE antilichaam om te bepalen van het percentage van de CD34+ cellen in het monster (1,3%, rechter paneel). (B) na de scheiding, de positieve breuk (stap 1.17) was gekleurd met anti-CD34-PE en anti-CD45 PerCP-antilichamen. De verrijkte CD34+ bevolking is aangegeven in de figuur (98,1% rechterpaneel, bovenste juiste kwadrant). (C) fenotypische analyse van MK gedifferentieerd in vitro van CD34 + cellen voor 7 dagen of 11 dagen zijn gekleurd met anti-CD41 en anti-CD42a antilichamen. Volwassen MK zijn positief voor beide CD41+ en CD42a+ (bovenste juiste kwadrant). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: MK kleuring, ploïdie en de vorming van de proplatelet in vitro. (A) TL beelden van dag 11 MK gekleurd met anti-CD41-PE en CD42b-APC antilichamen. Kernen werden gekleurd met DAPI. Gele pijlpunt geeft multi nucleaire MKs. schaal bar, 30 µm. (B) TL beelden van dag 14 MK gekleurd met anti vWf (groen), anti-CD62p (rood) en anti-CD42b-APC (magenta) antistoffen aan. Kernen werden gekleurd met DAPI. Schaal bar, 15 µm (C) vertegenwoordiger gating strategie waarin de ploïdie verdeling van CD41+ gebeurtenissen. De grafiek (lagere paneel) toont de waargenomen verdeling van ploïdie klassen (n = 4), foutbalken, SD. (D) de kenmerkende morfologie voor proplatelet-dragende MK wordt weergegeven. De MK-lichaam wordt aangegeven door de pijl. De lange cytoplasmatische processen die zich uitstrekt van de MK (proplatelets) worden aangeduid met pijlpunten. Het kan zijn onduidelijk in sommige gebieden/velden van weergave of één of twee MK produceren deze proplatelet extensies. Dit moet worden geteld als één proplatelet-bevattende MK. beelden genomen met een omgekeerde Microscoop, 10 X doelstelling. Schaal Bar, 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Overvloed van bloedplaatjes geproduceerd in vitro en bloedplaatjes activering. (A) menselijke bloedplaatjes van platelet-rich plasma werden gebruikt voor het instellen van de analytische poort met behulp van de logschaal voor voorwaartse en zijdelingse scatter (linkerdeel). Het rechterpaneel bevat cellen uit MK culturen. Bloedplaatjes geproduceerd in vitro worden waargenomen in de analytische poort voor menselijke bloedplaatjes gedefinieerd. Cellen en tellen kralen zijn aangegeven in de figuur. PLT, bloedplaatjes (B) bloedplaatjes geproduceerd in vitro waren bevlekt met anti-CD41 antistof. Menselijke bloedplaatjes van platelet-rich plasma werden gebruikt om in te stellen van de analytische poort met behulp van de logschaal voor forward en kant scatter en te vergelijken het profiel binnen de CD41-FITC-poort. C-FITC, FITC isotype controle (C) bloedplaatjes activering na behandeling van ADP aan een eindconcentratie van 20 µM. menselijke bloedplaatjes van platelet-rich plasma werden gebruikt als besturingselement (bovenste panelen). Bloedplaatjes geproduceerd in cultuur staan in de onderste panelen. Binden van PAC1 geeft antilichaam aan bloedplaatjes activering. C-FITC, isotype FITC-controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven is geschikt voor de constante productie van MK en bloedplaatjes in de cultuur van navelstrengbloed. Deze cellen kunnen worden gebruikt om verschillende processen zoals het effect van geneesmiddelen of biologische activiteiten op MK proliferatie, differentiatie, proplatelet formatie en bloedplaatjes productie te bestuderen.
Een verscheidenheid van cultuurmedia en cytokine combinaties zijn aangebracht in de literatuur. Toevoeging van cytokinen zoals stamcel factor, Flt-3 ligand, IL-3 en IL-6 ondersteunt CD34+ cel proliferatie. Echter, deze uitbreiding resulteert in verminderde MK zuiverheid in de cultuur-14. De methode die hier gepresenteerd met behulp van serum-vrije media en rhTPO alleen, kan geen aanzienlijke uitbreiding van de voorlopercellen, maar vergunningen unilineage megakaryocytic proliferatie en differentiatie en constante productie van MK (90-99% CD41+ CD42a+ dubbele positieve cellen) zonder besmetting van andere geslachten. De periode van de cultuur voor MK vorming is 10 tot 12 dagen zonder de behoefte aan ondersteunende stromale of feeder cellen. Dit vergeleken gunstig met andere methodes die grotere cultuur perioden (meer dan 20 dagen)-17,18 vereisen. De opbrengst van de bloedplaatjes van dit protocol is 19-42 bloedplaatjes per MK of maximaal 420 bloedplaatjes per input CD34+ cel. De meeste protocollen resulteren in lagere bloedplaatjes levert18,19.
Hoewel rendement hoog ten opzichte van andere methoden is, zijn grote bronnen van CD34 cellen nodig om het produceren van voldoende aantal bloedplaatjes voor therapeutisch gebruik. Koord bloed MK oudere tegen een lager tarief, zijn over het algemeen kleiner is (van lagere klassen van de ploïdie) en afgenomen bloedplaatjes productie capaciteit20. Niettemin, verse UCB is over het algemeen een meer toegankelijke bron en hiermee een belangrijk voordeel voor onderzoekers. Andere methoden die hogere opbrengsten van MK en bloedplaatjes met therapeutische doeleinden produceren kunnen zijn ook beschreven13,17.
Er zijn een aantal bronnen van variabiliteit te overwegen: A) kwaliteit van de eenheid van het koord bloed. Alleen navelstrengbloed verzameld binnen de 24 uur moet worden gebruikt als een bron van CD34+ cellen. Koord bloed eenheden met stolsels moeten ook worden weggegooid. B) percentage CD34+ cellen in de mononucleaire cellen fractie (stap 1.8): gebruik mononucleaire cellen breuken met minder dan 0,3% CD34+ cellen kunnen leiden tot lage opbrengst van de relatief lage zuiverheid CD34+ cellen. Deze cellen worden niet aanbevolen voor MK differentiatie. Het is essentieel om te laten de vloeistof afvoer alleen gewapenderhand zwaartekracht (bijvoorbeeldstappen 1.13, 1.14, 1.16). In geval van verstopping van de kolom, wordt het aanbevolen om herladen op een nieuwe equilibrated kolom, verwijder de kolom uit de magneet en de cellen zachtjes met de plunjer van de injectiespuit te duwen in een nieuwe buis.
Een aantal voorwaarden beïnvloeden bloedplaatjes nummer en functie. Trombocytopenie verwijst naar een sterke daling van bloedplaatjes getallen die tot het externe en interne bloeden leiden kan. Auto-immuun aandoeningen zoals immuun trombocytopenie (ITP) en drug-geïnduceerde trombocytopenie (DITP) zijn bekende oorzaken van trombocytopenie21,22. Systemische lupus erythematosus, reumatoïde artritis en vele andere immuun ziektes kunnen ook nadelige gevolgen hebben voor bloedplaatjes. Niet-immune oorzaken van trombocytopenie zijn kankerbehandeling, ernstige trauma, infecties, beenmerg mislukking en chirurgie. Als gevolg van het hoge gebruik van bloedplaatjes door patiënten die chemotherapie ondergaan of ontvangen van stamcel transplantatie, is bloedplaatjes transfusie gestaag toegenomen in de afgelopen decennia. MK en bloedplaatjes onderzoek zal ongetwijfeld helpen bij de ontwikkeling van grootschalige bloedplaatjes productie voor klinische toepassingen. Beschikbaarheid van in vitro geproduceerde functionele bloedplaatjes zou verhinderen bloedplaatjes tekorten en bloedplaatjes transfusies in vuurvaste patiënten. MK differentiatie en bloedplaatjes productie in vitro zijn essentiële hulpmiddelen voor studie en begrip van zowel pathologische condities en de fysiologische mechanismen die tot de vorming van de bloedplaatjes leiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de steun van de Australische Health and Medical Research Council (project subsidie 1012409 gekoppeld aan BHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
