Summary
En mycket ren population av megakaryocyter kan erhållas från sladd blod-derived CD34+ celler. En metod för CD34+ isolering och megakaryocyt celldifferentiering beskrivs här.
Abstract
Trombocytantal produktion uppstår huvudsakligen i benmärgen i en process som kallas thrombopoiesis. Under thrombopoiesis skilja hematopoetiska stamceller att bilda trombocyter prekursorer kallas megakaryocyter, som obotligt gör åtskillnad mellan för att släppa trombocyter från länge cytoplasmiska processer kallas proplatelets. Megakaryocyter är sällsynta celler begränsad till benmärgen och är därför svåra att skörda i tillräckligt antal för laboratoriebruk. Effektiv produktion av mänskliga megakaryocyter kan vara uppnådda i vitro genom odling CD34+ celler under lämpliga betingelser. Protokollet beskrivs här beskriver isolering av CD34+ celler av magnetiska cell sortering från navelsträngen blodprov. Nödvändiga åtgärder för att producera mycket ren, Mogen megakaryocyter serumfritt villkor beskrivs. Detaljer av fenotypiska analys av megakaryocyt differentiering och bestämning av proplatelet bildning och trombocytantal produktion finns också. Effektorer som påverkar megakaryocyt differentiering eller proplatelet bildande, såsom trombocythämmande antikroppar eller trombopoetin mimetika, kan läggas till odlade celler att undersöka biologisk funktion.
Introduction
Isolering av ett tillräckligt antal primära mänskliga megakaryocyter (MK) för regelbundna laboratoriebruk är inte möjlig på grund av deras låga frekvens i benmärgen, där de står för ~0.01% av kärnförsedda celler1. Ett bekvämt alternativ är ex vivo expansion och differentiering av hematopoetiska stamceller och stamceller i närvaro av specifika tillväxtfaktorer. Ett antal cytokiner inklusive stamceller faktor (SCF; c-kit-ligand) och interleukin (IL) -3 och IL-11 har varit är anställd i kultur system att producera MKs. Thrombopoietin (TPO) den mest effektiva tillväxt och differentiering faktorn för megakaryocytic kulturer och är effektiv ensam eller med andra cytokiner, såsom SCF och IL-32. TPO kan agera på stem cellpopulationer att resultera i både spridning och mognaden av MKs2.
MK produkter trombocyter från cytoplasmiska utbuktningar kallas proplatelets och, in vivo ca 1 x 1011 trombocyter är är bildas dagligen för att upprätthålla trombocytantal 150-400 x 109/l. trombocytantalet produktion i vitro upp till 1000 -Vik lägre än den i vivo uppskattar3, och detta har gett upphov till många kultur förhållanden med hjälp av CD34+ hematopoetiska progenitorceller att förbättra MK och trombocytantal produktion i vitro. Ursprungliga källan av CD34+ celler som används för MK differentiering var humant perifert blod4. Andra cell-källor är benmärgen5,6, embryonala stamceller/inducerade pluripotenta stamceller (ESC/iPSC)7och navelsträngen blod (UCB)8,9,10 . Mänsklig benmärg CD34+ 11 och mus härstamning negativa benmärg celler5 råvaror MK och trombocyter in vitro; Trots bristen på tillgänglighet av mänsklig benmärg begränsar dess användning som en källa av CD34+ celler. Däremot representerar ESC och iPSC en obegränsad källa av celler för in vitro- produktion av trombocyter. Trombocytantal produktionen från dessa celler kräver feeder celler murina OP9 och kultur längre. Trombocyter härrör i feeder-fria förhållanden verkar vara mindre funktionella12. iPSC-derived trombocyter är sannolikt att vara av användning i kliniska inställningar eftersom de kan utökas till stor skala. Denna process kräver lentiviral-medierad transduktion transkriptionsfaktorer och långsiktiga cell kultur13.
UCB är en lättillgänglig källa av CD34+ celler som lätt kan användas i forskning inställningar. TPO ensam kan främja differentiering av sladd blod-derived CD34+ celler och detta ger upphov till högt rena, Mogen MKs utan behov av serum tillskott eller samtidig kultur med feeder celler. Andra cytokiner såsom SCF kan minska differentiering från UCB CD34+ celler, medan Flt-3 ligand och IL-11 främja produktionen av omogna megakaryocyter14. Det här protokollet beskriver produktionen av högt rent MK kulturer från navelsträngsblod CD34+ celler i serumfritt villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av South Eastern Sydney mänsklig forskning etikkommitté och ratificerats av i University of New South Wales' mänskliga forskningsetisk kommitté. Navelsträngsblod från friska donatorer lämnades av den Sydney navelsträngsblod Bank (Sydney, NSW, Australien). Volymer av cirka 100 mL användes för detta förfarande.
Obs: Fungera i en klass II biosäkerhet skåp med aseptisk teknik. Sanera utsidan av sladd blod påsen med 70% etanol. Använd sterila instrument (saxar, pincetter) för detta förfarande.
1. cord blodkroppar förberedelse och isolering av CD34+ celler
- Förbereda sterila separation buffert (SB) med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), vid pH 7,2, och innehållande 0,5% bovint serumalbumin och 2 mM EDTA.
- Fördela 10 mL av SB i en 50 mL konisk tub (en tub per 10 mL blod krävs). Rita 10 mL blod ur påsen med en G18 trubbig nål monterad på en 10 mL-spruta och fördela i de 50 mL rör innehållande 10 mL SB.
- Tillsätt 15 mL av lymfocyter separation media (se Tabell för material) till botten av röret som innehåller den utspädda blod, skapa två lager.
Obs: Dosera media långsamt på botten av röret för att undvika att blanda olika lager. - Centrifugera rören vid 1200 × g i 30 min i rumstemperatur (RT) med ingen rast och ingen acceleration.
- Överföra lagret nära mitten av röret som innehåller mononukleära celler (cirka 5-10 mL från varje tub) i en ny 50 mL tub med en Pasteur-pipett. Lägga till SB varje tub till en total volym om 50 mL.
- Centrifugera vid 400 × g i 10 min vid RT. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cell pellets noggrant med en Pasteur-pipett i 5-10 mL SB. kombinera de suspenderade cellerna och ge volym 50 mL med SB.
- Räkna celler använder Trypan blå färgning och en hemocytometer eller automatiserad cell counter (se Tabell för material). För att bestämma procentandelen av CD34 celler+ i provet, Omsuspendera 2,5 × 105 celler i 100 µL av SB och fläcken genom att lägga till 10 µL anti-CD34-PE antikropp för 15-30 min vid 4 ° C. Analysera med flödescytometri (figur 1A).
- Centrifugrör vid 400 × g i 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
Obs: om inte krävs omedelbart, mononukleära celler kan frysas i detta skede. - Att resuspendera cellerna i 300 µL av SB per 108 celler. Tillsätt 100 µL av FcR humant IgG (blockerar reagens, se Tabell av material) och 100 µL av CD34 magnetiska pärlor per 108 celler. Blanda försiktigt och inkubera vid 4 ° C i 30-40 min.
Obs: En enda cellsuspension krävs (om det behövs, passera cellerna men ett 30 µm filter innan du lägger till reagenser). Använd reagens volym beskrivs här för 108 celler eller mindre. För mer än 108 celler, skala upp reagenserna (SB, blockerar lösning och CD34 magnetiska pärlor) med detta. - Kolumnen LS separation under inkubationstiden förbereda genom att placera kolumnen LS i en Magnethållare och tvätt med 3 mL SB. Kassera utflödet.
Obs: LS Separationskolonner kan laddas med upp till 2 × 108 totalt celler. Det finns mindre och större kolumner. - Tillsätt 5-10 mL SB till cell blandningen och centrifugera vid 400 × g i 10 min. avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 1,5 mL SB och ladda cellsuspensionen (1,5 mL) på kolumnen LS. Samla in flödet genom innehållande omärkt cellerna i en 15 mL collection tube (negativa fraktion #1). Låt vätskan rinna och Tvätta kolonnen med 1,5 mL SB.
- Ladda insamlade flödet genom (3 mL) tillbaka in i kolonnen och samla flödet genom i samma 15 mL samling röret (negativa fraktion #1). Tvätta kolumnen LS 3 gånger med 3 mL SB.
Obs: Om så krävs, celler i negativa fraktionen (12 mL) kan färgas med anti-CD34 antikropp att fastställa tillfångatagandet av CD34+ celler av kolumnen LS. - Ta bort kolumnen från den magnetiska avskiljaren och spola celler långsamt med en sprutkolven till en ny 15 mL rör med 2 mL av SB.
- Placera kolumnen tillbaka på magnetisk separator och belastning på 2 mL av celler tillbaka i kolumnen. Samla flödet genom och tvätta med 2 mL SB. Detta är den negativa bråkdel #2 (4 mL).
- Ta bort LS kolumn från magnetisk separator och tillsätt 2 mL av SB. Flush celler stadigt och bestämt med en sprutkolven till samla CD34+ cell bråkdel. Räkna cellerna använder trypan blå färgning och en hemocytometer eller automatiserade cell räknare.
- Centrifugrör med det positiva bråket vid 400 × g i 15 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten. Återsuspendera cellerna i serumfritt media för CD34+ celler (SFM, se Tabell för material).
Obs: om det inte krävs omedelbart celler kan frysas i flytande kväve i detta skede.
2. renhetskontroll av isolerade CD34+ celler
- Fläcken 2 x 104 celler den positiva delen med 10 µL anti-CD34-PE antikropp och 20 µL anti-CD45-PerCP antikropp för 15 minuter vid 4 ° C (Använd en separat tube för isotypen kontroller) (figur 1B).
- Tillsätt 1 mL SB att tvätta. Centrifugera vid 400 × g i 10 min. återsuspendera pelleten i 200 µL av SB.
- Flöde flödescytometrisk analys samt gate levande cell befolkningen för att utesluta skräp (figur 1B). Utfärda utegångsförbud för PE och PerCP positiva populationer med hjälp av PE och PerCP isotypen kontrollerna (figur 1B) och bestämma procentandelen av CD34+/CD45+ celler.
3. megakaryocyt differentiering
- Utsäde 5 × 105 celler/mL CD34+ celler i 2 mL SFM kompletteras med 50 ng/mL rekombinant humant trombopoetin (rhTPO) per brunn i en 12-bra platta. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad atmosfär. Om cellerna är konfluenta innan de är nödvändig för analysen, skörda cellerna och delas upp i flera brunnar med färsk medie- och rhTPO.
Obs: Två eller tre brunnar bör vara beredd att övervaka differentiering vid olika tidpunkter (t.ex., dagar 7, 9 och 10). - Skörda celler från brunnarna som avsatts för att övervaka differentiering utan att störa cellerna i andra brunnarna.
- Fläcken celler med 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC-antikropp och 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antikropp i en slutlig volym av 100 µL. ställa in en kontroll tube använder respektive isotypen kontroll antikropparna. Inkubera i 15-30 min vid 4 ° C.
- Tillsätt 1 mL SB att tvätta.
- Tillsätt 1 mL SB att tvätta. Centrifugera vid 400 × g i 10 min. återsuspendera pelleten i 100 µL av SB och snurra på en glasskiva vid 1 000 x g i 5 min. Fix celler i bilden genom att doppa i metanol för 30 s. luften torr, tillsätt 20 µL av montering av media som innehåller DAPI (se Tabell för material) , täck med ett täckglas och visualisera med fluorescerande Mikroskop (figur 2A).
- Tvätta med 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 och centrifugera 400 × g i 10 min, Återsuspendera i 100 µL av samma bufferten, och lägga antimus IgG-Alexa 594 och anti-kanin IgG-Alexa 488 (1: 100). Inkubera i 30 min i rumstemperatur, tvätta med 2 mL PBS/0.1% triton-X 100, Återsuspendera i 100 µL av den samma buffert och tillsätt 20 µL anti CD42b-APC. Sedan snurra cellerna på glasskivor som beskrivs i steg 3.6.1 och förbereda prover för mikroskopiska visualisering som beskrivs i steg 3.6.1.
- Tvätta en gång i 1 mL av SB och återsuspendera pelleten i 300 µL av hypoton citrat buffert (1,25 mM natriumcitrat, natriumklorid 2,5 mM, 3,5 mM dextros) innehållande 20 µg/ml propidium jodid och 0,05% Triton-X 100. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C skyddas från ljus.
- Lägg till RNase till en slutlig koncentration på 20 µg/mL och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C skyddas från ljus. Bestämma intensiteten av propidium jodid genom flödescytometri av händelseinsamlingsprocessen 30,000 till 50,000 av befolkningens CD41-FITC+ (figur 2 c).
4. proplatelet räknar, trombocyter uppräkning och trombocytaktivering
- Skörda celler (från steg 3.1) dagar 8 eller 9 av differentiering och utsäde på 1 × 104 celler per brunn i 48 brunnar i 200 µL av färska SFM kompletteras med 50 ng/mL rhTPO. Kultur i 5 dagar vid 37 ° C, 5% CO2.
Obs: För kvantitering ändamål, utsäde brunnar i tre exemplar. Här låg densitet krävs för visualisering och räkna av proplatelet-bärande MK. Proplatelets brukar börja visas efter 2 dagar av kultur. Toppen är mellan dag 4 och 5. - Räkna antalet proplatelet-bärande MK i hela brunnen på ett inverterat ljusmikroskop med 10 X eller 20 X mål.
Obs: En uppvärmd (37 ° C) Mikroskop scenen är att föredra, eftersom att hålla cellerna vid rumstemperatur under längre perioder orsakar krympning av proplatelet-tillägg. Proplatelets observeras som en lång förlängning från MK kroppen. Varje MK kan ha flera proplatelet utskjutande delar. Som proplatelets utveckla, minskar kroppen av MK i storlek. - Skörda celler och centrifugera 400 x g under 10 minuter vid rumstemperatur. Färga celler med 20 µL anti-humant CD41-FITC antikropp, enligt beskrivningen i steg 3.3 och 3.4. Beräkna procentandelen av proplatelet-bärande MK (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet-bärande MKs/väl) / (Total CD41+ celler / väl)] x 100
- Om du vill räkna trombocyter släppt i odlingsmediet, försiktigt blanda cellerna med en Pasteur-pipett och samla 100 µL dagar 14 eller 15 i kultur.
- Fläcken med 20 µL anti-humant CD41-FITC-antikropp under 20-30 minuter vid 4 ° C. Ställa in en kontrollrör med den respektiva isotypen kontroll antikroppen.
- Tillsätt 150 µL av SB och 50 µL räknar pärlor.
- För flöde flödescytometrisk analys, ange FSC och SSC logga skala. Använd normala mänskliga blodplättar från trombocyt-rich plasma färgas med CD41-FITC som beskrivs i avsnitt 4.4.1 ställa den gating för trombocyter (figur 3A).
- Analysera de färgade blodplättarna med räknar pärlor av flödescytometri. Samla in 1 000 händelser räknar pärlor använder FSC kontra SSC spridningsdiagram (figur 3A). Beräkna antalet trombocyter utifrån CD41-FITC positiva händelser (figur 3B) med hjälp av formeln:
Blodplättar per µL = [(antal CD41-FITC positiva händelser)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/urval volym)]
- För att analysera trombocytaktivering, försiktigt blanda cellerna med en Pasteur-pipett och samla 100 µL dagar 14 eller 15 i kultur. Tillsätt 1 mL Tyrodes buffert (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glukos, pH 6,5) och centrifugera vid 200 x g i 5 min till pellet celler.
- Samla in supernatanten och centrifugera vid 800 x g i 10 min till pellet trombocyt-storlek partiklar.
- Kassera supernatanten och återsuspendera i 100 µL av Tyrodes buffert. Tillsätt 20 µL av PAC1-FITC antikropp och adenosindifosfat (ADP) till en slutkoncentration av 20 µM. Inkubera i rumstemperatur i 20 min. analysera av flödescytometri att bestämma procentandelen av FITC positiva händelser. Använd färska humana trombocyter behandlas på samma sätt som en positiv kontroll (figur 3 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll tillåter framställning av högt rent MK kulturer från sladd blod-derived CD34+ celler. Procentandelen av CD34+ celler i sladd blod är ca 1,3%15 (figur 1A) och det totala antalet mononukleära celler (steg 1,8) varierar från 90-300 x 106 UCB styck. Renhet av CD34 + / CD45 + celler efter isolering varierar från 90 till 99% (figur 1B). MK (definieras som CD41+ celler) observeras tidigt i serumfritt CD34+ cell kulturer i närvaro av rhTPO. Dag 7, andelen mogen MK (CD41+ och CD42a+ celler) är oftast 30-40% (figur 1 c). De högsta nivåerna av CD41+ och CD42a+ dubbel positiva celler (90-99%) observeras mellan dag 10 och 12 i differentiering (figur 1 c). Variabiliteten observerats beror huvudsakligen på sladd blod källan och om CD34 renhet+/CD45+ celler isolerade i steg 1.17. Avkastningen av mogen MK på dag 10 varierar från 5-10 per ingående CD34+ cell. Mogen MK (CD41+/CD42b+) observerats under fluorescerande mikroskopi visas i figur 2A. Odlade MK visas som stora, vanligtvis Multinucleära celler (figur 2A, pilspetsar). MKS granulat innehåll bestämdes av vWf (grön) och CD62p (p-selektin, röd) färgning (figur 2B). Ploiditeten fördelningen hos odlade MKs visas i figur 2 c.
Proplatelets är långa, pärlstav fibrer eller trådar som sträcker sig från MK kroppen. Proplatelets kan vara flera hundra mikrometer långa16 och innehålla grenar och utspänd regioner. En karakteristisk proplatelet räntebärande MK illustreras i figur 2D. Andelen proplatelet räntebärande MK (pbMK) var 1,3 ± 0,17%.
Trombocyter kan analyseras och räknas som beskrivs i protokollet. Som visas i figur 3B, faller de flesta trombocyter i cellkultur supernatant inom analytisk grinden av perifera blodplättar och är positiva för trombocyter markören CD41 (figur 3B). Trombocytantal avkastningen från denna metod varierar från 19 till 42 blodplättar per MK. trombocyter som produceras i kultur kan aktiveras av trombocyt-agonister såsom ADP som bestämts genom ökad bindning av aktivering-specifika PAC1 monoklonal antikropp (figur 3 c) .
Figur 1: Flow flödescytometri tomter av CD34+ cell isolering och MK differentiering i kultur. (A) mononukleära celler (gated som visas i den vänstra panelen) renat från humant navelsträngsblod (steg 1,8) var fläckade av anti-CD34-PE antikropp att bestämma procentandelen av CD34+ celler i provet (1,3%, högra panelen). (B) efter separation, var andelen positiva (steg 1.17) färgas med anti-CD34-PE och anti-CD45 PerCP antikroppar. Den berikade CD34+ befolkningen indikeras i figuren (98,1%, högra, övre högra kvadranten). (C) fenotypiska analys av MK differentierade i vitro från CD34 + celler i 7 dagar eller 11 dagar var fläckade av antikroppar mot anti-CD41 och anti-CD42a. Mogen MK är positivt för både CD41+ och CD42a+ (övre högra kvadranten). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: MK färgning, ploiditeten och proplatelet bildning i vitro. (A) fluorescerande bilder av dag 11 MK färgas med anti-CD41-PE och CD42b-APC antikroppar. Atomkärnor var fläckade av DAPI. Gula pilspets anger flera kärn MKs. skala bar, 30 µm. (B) fluorescerande bilder av dag 14 MK fläckade anti vWf (grön), anti CD62p (röd) och anti-CD42b-APC (magenta) antikroppar. Atomkärnor var fläckade av DAPI. Skalstapeln, 15 µm (C) representativa Usenets strategi visar ploiditeten fördelningen av CD41+ händelser. Visar grafen (nedre panelen) observerade fördelningen av ploiditeten klasser (n = 4), felstaplar, SD. (D) morfologin som är karakteristisk för proplatelet-bärande MK visas. MK kroppen indikeras av pilen. De långa cytoplasmiska processer som sträcker sig från MK (proplatelets) indikeras av pilspetsar. Det kan vara oklart inom vissa områden/Visa om en eller två MK producerar dessa proplatelet filändelser. Detta bör räknas som en proplatelet-bärande MK. bilder tagna med ett inverterat Mikroskop, 10 X-objektiv. Skalstapeln, 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Överflöd av trombocyter produceras i vitro och trombocytaktivering. (A) humana trombocyter från trombocyt-rich plasma användes för att ange analytisk grinden med logaritmisk skala för framåt och side scatter (till vänster). Den högra panelen visar celler från MK kulturer. Trombocyter producerade i vitro observeras i den analytiska porten som definierats för humana trombocyter. Celler och räknande pärlor indikeras i figuren. PLT, trombocyter (B) trombocyter producerade i vitro var fläckade av anti-CD41 antikroppar. Humana trombocyter från trombocyt-rich plasma användes att ställa analytiska porten med hjälp av log-skala för framåt och side scatter och jämföra profilen i CD41-FITC grinden. C-FITC FITC-isotyp kontroll (C) trombocytantal aktiveringen efter behandling av ADP till en slutlig koncentration av 20 µM. humana trombocyter från trombocyt-rich plasma användes som kontroll (övre paneler). Trombocyter som produceras i kultur visas i nedre panelerna. Bindning av PAC1 indikerar antikroppar trombocytaktivering. C-FITC FITC-isotyp-kontrollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här är lämplig för konsekvent produktion av MK och trombocyter i kultur från navelsträngsblod. Dessa celler kan användas för att studera olika processer såsom effekten av läkemedel eller biologiska aktiviteter på MK proliferation, differentiering, proplatelet bildning och trombocytantal produktion.
En mängd kultur media och cytokin kombinationer har presenterats i litteraturen. Tillägg av cytokiner såsom stamceller faktor, Flt-3 ligand, IL-3 och IL-6 stöder CD34+ cell spridning. Dock resulterar denna expansion i minskad MK renhet kultur och14. Metoden presenteras här, med hjälp av serum-fria medier och rhTPO ensam, tillåter inte betydande expansion av stamceller, men tillåter unilinjär megakaryocytic proliferation och differentiering och konsekvent produktion av MK (90-99% CD41+ CD42a+ dubbel positiva celler) utan kontaminering från andra. Kultur är för MK bildandet 10 till 12 dagar utan att behöva stödja stromaceller eller feeder celler. Detta jämför positivt med andra metoder som kräver större kultur perioder (över 20 dagar)17,18. Trombocytantal avkastningen från detta protokoll är 19-42 trombocyter per MK eller upp till 420 blodplättar per ingående CD34+ cell. De flesta protokoll resultera i lägre trombocytantal ger18,19.
Även om avkastningen är hög i förhållande till andra metoder, behövs stora källor av CD34 celler att producera tillräckligt antal trombocyter för terapeutiskt bruk. Sladd blod MK mogna till ett lägre pris, är i allmänhet mindre (av lägre ploiditeten klasser) och minskat trombocytantal produktion kapacitet20. Dock fräsch UCB är i allmänhet en mer tillgänglig resurs och detta utgör en betydande fördel för forskare. Andra metoder som kan producera större skördar av MK och blodplättar med terapeutiska mål har också beskrivits13,17.
Det finns några källor till variation att överväga: A) kvaliteten på sladd blod enheten. Endast sladd blod samlas in inom 24 h bör användas som en källa av CD34+ celler. Sladd blod enheter innehållande blodproppar ska också kasseras. (B) andelen CD34+ celler i mononukleära celler fraktionen (steg 1,8): använda mononukleära celler fraktioner med mindre än 0,3% CD34+ celler kan resultera i låg avkastning med relativt låg renhetsgrad CD34+ celler. Dessa celler rekommenderas inte för MK differentiering. Det är viktigt att låta flytande avloppet genom tyngdkraften endast (t.ex., steg 1.13, 1.14, 1.16). Vid kolumn blockering rekommenderas det att ta bort kolumnen från magneten, driva cellerna försiktigt med sprutkolven till en ny tub och ladda om på en ny skakad kolumn.
Ett antal villkor påverka trombocyt antal och funktion. Trombocytopeni hänvisar till en tydlig nedgång i trombocyter siffror som kan leda till yttre och inre blödningar. Autoimmuna sjukdomar såsom immun trombocytopeni (ITP) och läkemedelsinducerad trombocytopeni (DITP) är välkända orsaker till trombocytopeni21,22. Andra immuna sjukdomar såsom systemisk lupus erythematosus och reumatoid artrit kan också ha skadliga effekter på trombocyter. Icke-immun orsaker trombocytopeni cancerbehandling, allvarligt trauma, infektioner, benmärgssvikt och kirurgi. På grund av högt utnyttjande av trombocyter av patienter som genomgår kemoterapi eller tar emot stamcells transplantationer, har trombocyttransfusion stadigt ökat under de senaste decennierna. MK och trombocytantal forskning hjälper utan tvekan utvecklingen av storskalig trombocytantal produktion för kliniska tillämpningar. Tillgänglighet av in vitro- producerade funktionella trombocyter skulle förhindra blodplättar brist och tillåta trombocyttransfusioner till eldfasta patienter. MK differentiering och trombocytantal produktion i vitro är viktiga verktyg för att studera och förståelse för både sjukliga tillstånd och de fysiologiska mekanismer som leda till trombocyter bildas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner stöd av australiska hälsa och medicinska forskningsrådet (projekt grant 1012409 kopplade till BHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Reagents | |||
| Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
| Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
| PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
| FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
| APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
| Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
| V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
| V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
| PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
| Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
| MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
| Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
| Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |
References
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
- Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
- Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
- Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
- Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
- Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
- Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
- Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
- Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
- Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
- Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
- Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208 (2016).
- De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
- Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).
- Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
- Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
- Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
- Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
- Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
- Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).
