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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

Summary

Eine neuartige Technik für schnelle Antigen-Anzeige auf eine bakterielle Oberfläche präsentiert, die Oberfläche Biotinylierungen, gefolgt von Exposition gegenüber Proteine des Interesses an Fusion mit Monomeren Avidin beinhaltet. Laden von BCG mit ausgewählten Antigene erfolgreich verbessert seine Immunogenität, was darauf hindeutet, dass Oberflächendekoration traditionelle gentechnische Ansätze ersetzen kann.

Abstract

Tuberkulose (TB) ist eine schwere Infektionskrankheit und die einzige verfügbare Impfstoff M. Bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ist sicher und wirksam für Schutz gegen Kinder schwere TB Meningitis und einige Formen von disseminierter TB, aber schützt nicht gegen Lungentuberkulose die häufigste Form der Erkrankung ist. Vielversprechende Strategien zur Verbesserung der BCG derzeit verlassen entweder auf ihre Transformation mit Genen Codierung immundominante M. Tuberculosis (Mtb)-spezifische Antigene und/oder Ergänzung mit Genen Codierung Co-Faktoren, die Antigen stimulieren würde Zellen zu präsentieren. Wesentliche Einschränkungen zu diesen Ansätzen zählen geringe Effizienz, geringe Stabilität und das ungewisse Sicherheitsniveau der Expressionsvektoren. In dieser Studie stellen wir einen alternativen Ansatz zur Impfstoff-Verbesserung, bestehend aus BCG Ergänzung mit exogene Proteine auf der Oberfläche der Bakterien, sondern als Transformation mit entsprechenden Gene Kodierung Plasmide. Erstens interessierender Proteine in Verschmelzung mit Monomeren Avidin im standard E. Coli ausgedrückt werden Expressionssysteme und dann verwendet, um die Oberfläche der biotinylierte BCG zu schmücken. Tierversuche mit BCG Oberfläche verziert mit Surrogat Ovalbumin Antigen nachweisen, dass das geänderte Bakterium vollständig immunogen und in der Lage, spezifische T-Zell-Reaktionen induzieren. Insgesamt unterstützen nachdrücklich die hier vorgestellten Daten eine neuartige und effiziente Methode für die Neugestaltung der aktuellen BCG-Impfstoff, die den mühsamen konventionellen Ansatz der Ergänzung durch exogene Nukleinsäuren ersetzt.

Introduction

Verschiedene Strategien sind vorgeschlagen worden, um die aktuelle TB-Impfstoff BCG, einschließlich Protein adjuvante Systeme, virale vektorieller Technologien, abgeschwächte live M.tb Stämme und genetisch veränderten BCG-Stämmen entweder Gene einzuführen zu ersetzen über Ausdruck BCG-Antigene, die während der Infektion1 oder Mtbnicht hinreichend zum Ausdruck-spezifische Antigene bei BCG2nicht vorhanden. Gentechnik, steht jedoch viele Hindernisse einschließlich der unsicheren Ebene der Sicherheit, die zeitraubende und die geringe Effizienz der Ausdruck Vektoren4,5. Im Hinblick auf die Verbesserung der BCG, ist ein alternativer Ansatz zur Immunogenität ohne die Notwendigkeit einer unsicheren genetische Alternationen Verbesserung notwendig.

In dieser Studie stellen wir eine neue Strategie für die Anzeige der rekombinante Proteine auf der Zelloberfläche von BCG, die auf die bekannte hohe Affinität Avidin Interaktion mit Biotin basiert. Dieser Ansatz ermöglicht schnelle und reproduzierbare Befestigung des rekombinanten Avidin Schmelzverfahren Proteine auf der Oberfläche der biotinylierte BCG, die breitere Manipulationen von BCG, maximale Verbesserung ihrer Wirksamkeit unter Beibehaltung seiner ausgezeichneten Sicherheit zu erreichen erleichtert Zeichnen Sie auf, über Jahrzehnte beobachtet.

Avidin Affinität für Biotin ist extrem hoch (Kd = 10−15 M) und sobald gebildet, die Avidin-Biotin-Komplex ist sehr stabil und kann nur unter denaturierenden Bedingungen6gestört werden. Für diese Art der Interaktion, als gen-Transfer-Methode Alternative zu dienen, ist jedoch langfristig aber reversibel Anzeige von rekombinanten Proteinen erforderlich. Damit wir hier eine geringe Affinität Monomeren Avidin eingeführt (Kd = 10−7 M) führt zur reversiblen Freisetzung des Proteins von der Oberfläche BCG einmal eingenommen innen antigenpräsentierende Zellen versehen. Um ein Proof of Concept zu bieten, haben wir diese Methode mit einem Monomeren Avidin Chimären Protein entspricht ein Surrogat-Antigen abgeleitet von Ovalbumin (OVA)7,8getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die BCG-Zelle-Oberfläche einfach und schnell mit Monomeren Avidin Fusionsproteine dekoriert werden kann und dass diese Bindung an die BCG-Oberfläche stabil und ohne erkennbare Veränderungen in bakterielles Wachstum und überleben reproduzierbar ist. Auch wir fanden, dass BCG dekoriert mit Monomeren Avidin fusioniert mit Eizellen (AviOVA) eine ähnlich dem von BCG induzierte Immunantwort induzieren kann genetisch dasselbe Antigen ausdrücken in Vitro und in Vivo. Diese Technologie umschaltbare Anzeige der Proteine des Interesses auf der bakteriellen Oberfläche ist daher eine effektive Ersatz von traditionellen gen Übertragung Ansätze und kann bieten eine Plattform für breiten Manipulationen der BCG und weitere Anwendungen im Impfstoff Entwicklung.

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Protocol

Alle Tiere wurden entsprechend Protokolle vom Animal Care und Nutzung Ausschüsse an der University of British Columbia genehmigt gewartet. Experimente wurden von Animal Care und Nutzung Ausschüsse genehmigt und nach dem Canadian Council auf Animal Care Richtlinien durchgeführt. Die tierischen Qualitätssicherung Wohlfahrt ist A11-0247.

1. Generation von Monomeren Avidin Fusionsproteinen Plasmide zum Ausdruck zu bringen

  1. Sub-Klonen Monomeren Avidin Sequenz12 in pDEST17 Plasmid zwischen den Standorten "CTC" und "GAA", das entspricht 133-134bp. (d. h.zwischen 6-Histag und pDEST17 Attr1 Rekombination), p17-Avi zu erhalten.
    Hinweis: Die Monomere Avidin DNA-Sequenz ist unten dargestellt. Die drei Mutationen in Wildtyp Avidin erhalten monomerer Avidin eingeführt werden in fett gedruckten Zeichen angezeigt.
    Gccagaaagtgctcg Ctgactggga Aatggaccaa Cgatctgggc TccATCAtga Ccatcggggc tgtgaacagc
    Agaggtgaat Tcacaggcac Ctacatcaca Gccgtaacag Ccacatcaaa Tgagatcaaa Gagtcaccac tgcatgggac
    ACAAGCTAcc Atcaacaaga Ggacccagcc Cacctttggc Ttcaccgtca Attggaagtt Ttcagagtcc accactgtct
    Tcacgggcca Gtgcttcata Gacaggaatg Ggaaggaggt Cctgaagacc Atgtggctgc Tgcggtcaag tgttaatgac
    Attggtgatg AcAAAAaagc Taccagggtc Ggcatcaaca Tcttcactcg Cctgcgcaca Cagaaggagt ga
  2. Design-Primer flankiert mit AttB1 und B2 AttWebsites entsprechend OVA Polypeptid757-1035 (-A-b- und H-2_Kb-Epitope eingeschränkt) DNA-Sequenz. Primer-Sequenzen sind: Attb1-OVA
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT und Attb2-OVA
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 und b2-Sequenzen Attsind fett formatiert).
    1. PCR-verstärken OVA Polypeptid757-1035 DNA-Sequenz mit Primer über das pUC57-OVA-Plasmid als Vorlage verwenden.
    2. Klonen Sie die PCR-Produkte in pDONR-221 durch eine ortsspezifische in-vitro- Rekombination Reaktion (z. B.BP Clonase), pDONR-OVA zu erhalten.
  3. Übertragen Sie das gen des Interesses in p17-Avi mit LR Clonase Reaktion, um p17-Avi-OVA zu erhalten.
    Hinweis: Für Details von BP und LR Rekombination Klonen, siehe Handbuch des Herstellers.

(2) Monomeren Avidin-Fusion-Protein-Expression, Reinigung und Umfaltung

  1. Verwandeln Sie p17-Avi-OVA Plasmid in E. Coli BL21 und induzieren Sie 250 mL von E. Coli BL21 Kultur mit IPTG (0,1 M) für 3 h bei 37 ° C.
  2. Lyse von Bakterien und Einschlusskörperchen Solubilization
    1. Pellet-250 mL der induzierten BL21 Kultur von 30 min Zentrifugation bei 4.000 x g und bei 4 ° C.
    2. Pellets in 10 mL Lyse-Puffer zu sammeln (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M Guanidin-HCL, pH 1,5-2,5) und 15 min bei 95 ° c inkubieren Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur auf ein Rotator.
    3. Zentrifuge 30 min bei 15.000 x g und 4 ° C und sammeln überstand.
  3. Reinigen Sie Avi-OVA von überstand (solubilisiert Einschlusskörperchen Bruch) Ni-NTA Spalten verwenden.
    1. Verdünnen Sie Einschlusskörperchen 1:2 mit Lyse Puffer.
    2. Verwenden Sie 4 mL Ni-NTA Harz pro 250 mL Einschlusskörperchen Kultur abgeleitet.
    3. 3 X mit 10 mL Lyse-Puffer (pH 7,0) zu waschen.
    4. Eluieren Sie mit 10 mL der Elution Buffer (Lyse Puffer pH 7,0 mit 250 mM Imidazol).
  4. Umfalten eluierten Proteins durch schrittweise Verdünnung (01:10) und schnelle Vortexen in Tris-Puffer (pH 7,5) mit 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, Arginin 500 mM und 200 mM NaCl für 30 min bei Raumtemperatur.
  5. De-Salz und Buffer Tausch refolded Protein von Tris-Puffer in PBS mit Protein-Konzentratoren laut des Herstellers Protokolle.
  6. Entfernen Sie Aggregate durch Zentrifugation für 30 min bei 3.500 X g und bei 4 ° C, und lagern Sie Aliquote des löslichen Proteins bei-20 ° C.

3. Biotinylierungen BCG Zelloberfläche

  1. Wachsen BCG in Middlebrook 7H 9 Brühe mit 10 % OADC (Ölsäure, Albumin und Traubenzucker-Lösung) und 0,05 % Tween 80 bei 37 ° C auf einem Shaker-Plattform bei 50 u/min bis OD = 0,5-1.
    Hinweis: BCG ist ein Biosafety Level 2 Erreger und alle Experimente rund um BCG sollte in einen Schrank mit geeignete persönliche Schutzausrüstung Biosafety erfolgen.
  2. Waschen Sie 109 BCG 3 Mal mit 500 µL des eiskalten Endotoxin kostenlose PBS plus 0,1 % Tween80 (PBST) (pH 8,0). BCG Pellet in sterilen Endotoxin kostenlose PBS auszusetzen.
  3. Unmittelbar vor der Anwendung bereiten Sie 1 mL 10 mM Sulfo-NHS SS Biotin in sterilen gefiltertes Wasser.
    1. Inkubieren Sie Bakterien mit 1 mL 0,5 mM von Sulfo-NHS SS Biotin bei Raumtemperatur für 30 min.
  4. Waschen mit der Bezeichnung Bakterien 3 Mal mit 500 µL Eistee kalt PBST nicht reagiert Biotinylierungen Reagenz zu entfernen.
    1. Wieder aussetzen Sie Pellet in 1 mL der PBST.
  5. Um Biotinylierungen Effizienz zu bewerten, Fleck 108 biotinylierte BCG mit Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) bei Raumtemperatur für 20 min.
    1. Inkubieren gefärbte Bakterien in 1 mL 2 % PFA für 20 min bei Raumtemperatur und dann untersuchen Stufen des Biotinylierungen durch Flow-Zytometrie-Analyse.

(4) Phänotyp der biotinylierte Mykobakterien: Wachstum und überleben

  1. Wachsen der BCG-Stämmen in Middlebrook 7H 9 Brühe mit 10 % OADC (Ölsäure, Albumin und Traubenzucker-Lösung) und 0,05 % Tween 80 bei 37 ° C auf einen Shaker-Plattform bei 50 Umdrehungen pro Minute.
    1. Die optische Dichte (OD600) der bakteriellen Kultur über eine 8-Tage-Frist aufnehmen.
  2. Verwenden Sie BCG-Luc (zuvor beschriebenen9), um Überleben der Bakterien zu erkennen, in Makrophagen.
    1. RAW264.7 Zellen mit biotinylierte BCG-Luc (MOI 10:1) infizieren oder unbehandelt BCG-Luc (Kontrolle) und Zeitraum bei 37 ° C über 48 h inkubiert.
    2. Zelle Monolagen waschen und dann mit 0,025 % SDS freizugebende aufgenommene Bakterien lysiert.
    3. Messen Sie Biolumineszenz-Produktion mit Luciferase Assay System und Luminometer.
      Hinweis: Lumineszenz-Signal ist bezeichnend für bakterielle Lebensfähigkeit. Siehe Handbuch des Herstellers für Details der Luciferase Assay.

5. Bindung von Monomeren Avidin-Fusionsprotein biotinylierte BCG Oberfläche

  1. Mischen Sie 5 x 108 biotinylierte BCG mit Avi-Protein (10 μg/mL Finale in PBS-T) für 1 h bei Raumtemperatur auf Shaker Plattform.
  2. Waschen Bakterien 3 Mal mit 500 µL Eistee kalt PBST und Fleck mit Kaninchen Anti-Avidin Antikörper (Ab) (1: 100 Verdünnung, zuvor beschriebenen10) für 20 min bei Raumtemperatur und dann mit FITC konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG Ab unter den gleichen Bedingungen.
  3. Bakterien 3 Mal mit 500 µL PBST waschen und analysieren von Durchflusszytometrie zu bewerten, inwieweit der Oberflächendekoration.

6. die Gefriertrocknung von Mykobakterien

  1. Biotinylate Bakterien nach Schritt 3.1-3.4 und Mantel biotinylierte Bakterien mit Avi-OVA gemäß Schritt 5.1.
  2. Aliquoten biotinylierte und beschichteten Bakterien (108), mit PBS waschen und in 0,5 mL Lyophilisierung Medien erneut aussetzen (25 % Sauton Medium, 75 % H2O und 1,5 % Na-Glutamat).
  3. Übertragen Sie Bakterien, Glasfläschchen und über Nacht in einem-80 ° C Gefrierschrank einfrieren.
  4. Lyophilize gefüllt und gefrorenen Glasfläschchen für 24 h mit einer Gefriertrocknungsanlage.
  5. Getrocknete Proben bei Raumtemperatur lagern und mit PBS-Puffer bei Bedarf wiederherzustellen.
  6. Wiederholen Sie Schritt 3.5, Biotinylierungen und Oberflächenbeschichtung Stabilität zu bewerten.

7. die Phagozytose Assay

  1. Wachsen Sie RAW 264,7 Makrophagen Zellen in 10 cm Durchmesser Kultur Gerichte in DMEM Medium mit 5 % FCS, 1 % L-Glutamin, HEPES, nicht-essentiellen Aminosäuren und Penicillin und Streptomycin bis 70-80 % Konfluenz.
  2. Samen Sie 2 x 106 RAW 264,7 Makrophagen Zellen in einem 6-Well-Platte. Können Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2einzuhalten.
  3. DsRed BCG zu generieren (zuvor beschriebenen9) dekoriert mit Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) Schritte 3.1-3.4 und 5.1.
  4. Infizieren Sie RAW Zellen mit DsRed BCG-Avi-OVA oder unbehandelten DsRed BCG bei MOI 20:1 für 24 h bei 37 ° C.
  5. Zellen dreimal waschen und trypsinize mit 1 mL Trypsin 0,25 % bei 37 ° C für 10 min um teilweise freistehende Bakterien zu entfernen.
  6. Korrigieren Sie in 2,5 % PFA in PBS für 20 min bei Raumtemperatur.
  7. 3 X mit PBS waschen und analysieren von Durchflusszytometrie.

8. die intrazelluläre Handel mit Eizellen dekoriert biotinylierte BCG in Makrophagen

  1. Fluoreszenz-Mikroskopie
    1. Samen Sie 3 x 105 RAW 264,7 Makrophagen Zellen auf Deckgläsern in einer 24-Well-Platte. Können Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2einzuhalten.
    2. Infizieren Sie Makrophagen Zellen mit Mykobakterien (MOI 10:1) in Wartung Medien ohne Antibiotika bei 37 ° C und 5 % CO2 für 4 bis 24 h.
    3. Waschen Sie Zellen und trypsinize Oberfläche angebracht, nicht aufgenommenen Bakterien wie in Schritt 7,5 zu entfernen.
    4. Fix infizierte Zellen in 2,5 % gefolgt von 3 Wäschen mit PBS PFA in PBS für 20 min bei Raumtemperatur.
    5. Permeabilize Zellen blockieren/Permeabilisierung Puffer (0,1 % Triton x-100, 3 % BSA mit PBS-Puffer) für 20 min bei Raumtemperatur.
      1. Nutzung spezifischer Antikörper von Interesse (z.B.Kaninchen Anti-Avidin Ab) bei 10 μg/mL in Permeabilisierung Buffer für 20 min bei Raumtemperatur gefolgt von Sekundärantikörper (z.B.FITC-Ziege-Anti-Kaninchen-IgG) für 20 Minuten.
    6. Wash Zellen 3 X mit PBS, einmal mit Wasser und Berg auf Folien in 10 μL wässrige Eindeckmedium Immunofluoreszenz Fluoreszenz zu minimieren.
    7. Untersuchen Sie Dias digital konfokalen Mikroskopie mit einem Epifluoreszenz Mikroskop ausgestattet mit 63 X / 1.4 Plan-Apochromat Ziel. Aufnahme von Bildern mit einer digitalen Kamera gekoppelt an die Mikroskop-Software.
  2. Immunogold Färbung und Elektronenmikroskopie
    1. Samen Sie 2 x 106 RAW 264,7 Makrophagen Zellen in 6-Well Platten.
    2. Beheben von BCG infizierten Makrophagen mit 4 % PFA für 4 h bei Raumtemperatur.
    3. Waschen Sie Proben zweimal mit PBS.
    4. Proben in 4 % niedriger Schmelzpunkt Agarose einbetten und in 70 % igem Ethanol zu entwässern.
    5. Übertragen Sie Proben auf Acrylharz und polymerisieren bei 50 ° C.
    6. 60 nm Abschnitte mit einem Mikrotom schneiden Sie aus und sammeln Sie Abschnitte auf Nickel Gittern.
    7. Proben mit 10 μg/mL Avidin Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur oder 4 ° C über Nacht in Inkubation Lösung (PBS und 0,1 % BSA) beschriften und dann waschen mit Inkubation Lösung Gold konjugiert F(ab')2 ultra-kleine Ziege-Anti-Kaninchen IgG (1/20) für 1 h bei Zimmer Temperatur in Inkubation Lösung.
    8. Waschen Sie Abschnitte in destilliertem Wasser zu, in 2 % Glutaraldehyd färben Sie, waschen Sie, lufttrocknen und mit Elektronen-Mikroskop zu untersuchen.

9. tierische Immunisierung und Orgel Bearbeitung

Hinweis: Alle Schritte sollten in eine biologische Kabinett erfolgen.

  1. Pass biotinylierte Protein beschichtet und Bakterien durch 271/2G Nadel 10 mal einzelne Zellsuspension zu machen.
  2. 1 x 106 Bakterien in 100 μl PBS Endotoxin-frei zu nehmen und einen weiblichen C57BL/6 Mäusen (-A,b, H - 2 Kb, 5-6 Wochen alt) subkutan in das Genick zu immunisieren.
    1. Kontroll-Mäusen mit 100 μl PBS allein zu injizieren.
  3. Einschläfern Sie immunisierten Mäusen 20 Tage nach Immunisierung durch CO2 einatmen, gefolgt von zervikale Dislokation.
    1. Die Milz zu isolieren und in RPMI Medien zu übertragen.
  4. Zerdrücken Sie Milz durch ein Sieb 70 µm Zelle mit einer 5 mL Spritze Stößel.
    1. Mit 5 mL RPMI waschen. Zentrifuge (800 X g, 3 min), um eine einzelne Zelle Aussetzung zu isolieren.
    2. Zum Abbau RBC mit Maus Biotin Positivauswahl Kit mit Biotin-Ter119/erythroiden Zellen Ab.
    3. Zentrifuge und wieder auszusetzen Zellen in 10 mL komplette RPMI (10 % FCS, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin, Streptomycin 1 % und 50 μM 2-ME).

10. ich-Ab Tetramer Färbung bestimmen die Frequenzen der Antigen-spezifische CD4+ T-Zellen und intrazellulären Zytokin Färbung zu bestimmen, Frequenzen von antigenspezifischen T Zellen Freigabe Zytokine bei immunisierten Tieren

  1. Tetramer Färbung
    1. Fleck Splenocyten von Kontrolle und immunisierten Mäusen (~ 20 x 106 Zellen) mit PE-konjugiert-Ab-OVA323-339 Tetramers (1/12,5 Verdünnung) für 1 h bei 37 ° C in Bindung Puffer (PBS mit 2 % FCS und 0,1 % NaN3).
    2. Splenocyten für 20 min bei Raumtemperatur fügen Sie AF647 CD4 Ab (01:25) und 7-AAD (um abgestorbene Zellen erkennen hinzu).
    3. Analysieren Sie Proben von Durchflusszytometrie.
    4. Erwerben Sie 500.000 Ereignisse in der CD4-positiven-Region das Tetramer positiver Ereignisse fest.
      Hinweis: Total Splenocyten von der SSC/FSC-Dot-Blot, lebenden Zellen durch Ausschluss der 7-AAD positive Ereignisse und CD4 Teilmengen zeichnen sich durch gating AF647 positive Ereignisse.
  2. Häufigkeit der Antigen spezifischen intrazellulären Cytokine Freigabe von T-Zellen
    1. Transfer ca. 1 × 107 Splenocyten in 4 mL des kompletten RPMI Medium in sechs-Well-Platten mit oder ohne rekombinante OVA (10 µg/mL) und 16 h inkubieren.
    2. Behandlung von Zellen mit Brefeldin A (1:1, 000) für weitere 5 h.
    3. Waschen Sie mit PBS und intrazellulären Zytokin Färbung wie folgt:
      1. Färben Sie Zellproben mit PE-CD8 oder PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 in Bindung Puffer) in 30 min bei Raumtemperatur.
      2. Korrigieren Sie in 4 % PFA bei Raumtemperatur für 20 min.
      3. Permeabilize mit Permeabilisierung Lösung entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
      4. Waschen Sie Zellen und Label mit AF647 konjugiert IFN-γ Ab (01:50) für 20 min bei Raumtemperatur.
      5. Waschen Sie Zellen zu und zu Flow-Zytometrie-Analyse zu unterziehen Sie, wie oben beschrieben.

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Representative Results

Mit den oben beschriebenen allgemeinen Verfahren wurde die Machbarkeit von BCG Oberfläche Biotinylierungen und Dekoration mit Surrogat Antigen Eizellen untersucht. Die Immunogenität der modifizierten BCG war dann in Vivogetestet. Die bakterielle Oberfläche war leicht mit Biotin für schnelle Anzeige der Avidin Chimären Antigene ohne nachweisbaren Veränderungen in bakteriellen Phänotypen gekennzeichnet. Die daraus resultierenden veränderte BCG wird effizient von Antigen-Präsentation-Zellen aufgenommen und kann eine OVA-spezifische Immunantwort bei Mäusen zu induzieren.

Generation von Monomeren Avidin Fusion Plasmide und Proteine
Eine Ausdruck Plasmid p17-Avi wurde generiert, um kompatibel mit Gateway-Methodik zur Herstellung von Monomeren Avidin Fusionsproteinen verwendet werden. OVA wurde in p17-Avi kloniert und ausgedrückt in E. Coli, dann gereinigt und refolded wie oben (Abbildung 1) beschrieben.

Biotin legt effizient auf der bakteriellen Oberfläche und bakterielles Wachstum und Überleben nicht beeinträchtigt
Bakterien wurden mit verschiedenen Konzentrationen beschriftet (0-1 mM) von Biotin und voller Flecken, die Effizienz der Oberfläche Biotinylierungen nach oben genannten Protokollen zu untersuchen. Flow-Zytometrie-Analyse zeigte eine vollständige Umstellung der Fluoreszenz Histogramm in Bakterien mit 0,5 mM Biotin (Abbildung 2) gekennzeichnet, und diese Konzentration wurde in dieser Studie verwendet, um biotinylierte Bakterien erzeugen. Anschließend untersuchte die Wirkung der bakteriellen Oberflächenmodifikation auf bakterielle Phänotyp und festgestellt, dass biotinylierte und Kontrolle unbehandelt BCG ein ähnliches Wachstumsprofil über eine 8-Tage-Frist (Abbildung 3A) angezeigt. BCG auszudrücken Luciferase (BCG-Luc)9 wurde verwendet, um bakterielle überleben in Makrophagen zu untersuchen. Lumineszenz Signale indikativ der bakteriellen Rentabilität verzeichneten über 48 h. Ergebnisse zeigten ähnliche Profile schrittweise Lebensfähigkeit Abnahme zwischen biotinylierte und Kontrolle Bakterien (Abb. 3 b). Zusammenfassend deuten diese Daten deutlich, dass bakterielle Oberfläche Biotinylierungen unberührt entweder bakterielles Wachstum oder das Überleben in Makrophagen, was wichtig ist, da erhöhte Überleben in Makrophagen in bakteriellen Virulenz zunehmen könnte.

Effizienz der bakteriellen Oberfläche Dekoration
Biotinylierte Bakterien wurden mit OVA Antigen Peptid in Fusion mit Monomeren Avidin, nach Protokollen oben beschichtet. Flow-Zytometrie-Analyse zeigten nur minimale OVA Bindung an nicht-biotinylierte Bakterien (MFI = 8.31 ± 0,42, Abbildung 4A, Oberseite) und erhebliches Maß an Eizellen an biotinylierte Bakterien binden (MFI = 54.67 ± 4,98) im Vergleich zur Kontrolle Bakterien (MFI = 5,92 ± 0,22, Abbildung 4A, untere Leiste).

Stabilität der BCG Oberflächendekoration
Da konventionelle live BCG-Impfstoffe als getrocknete Pulver formuliert sind, war eine wichtige Frage, die während der Studie entstanden die Stabilität des geänderten BCG nach Gefriertrocknung, Zubereitung und Lagerung bei gekühlt oder Raumtemperatur. Daher wir DGM-Anzeige von Avi-OVA in lyophilisierter BCG Avi-OVA (Oberfläche verziert mit Avi-OVA) geprüft und in frisch dekoriert bakterielle Präparate. (Abbildung 4 b) ergab, dass der Avi-OVA auf der bakteriellen Oberfläche blieben stabil und nachweisbar einen Monat nach Gefriertrocknung und Lagerung bei Raumtemperatur im Vergleich zu frischen BCG Avi-OVA-Präparaten, die bewiesen, dass dieser Oberfläche Dekoration-Methode eignet sich für die Impfstoffentwicklung.

Makrophagen Phänotyp wird durch bakterielle Oberflächendekoration nicht beeinflusst.
Um festzustellen, ob diese Oberflächendekoration Methodik bakterielle Einstieg in Wirtszellen stört, verwendeten wir RAW264.7 Zellen und DsRed Bakterien9 einen Phagozytose Assay in das Protokoll oben beschrieben durchführen. Abbildung 4 gezeigt, dass die bakterielle Oberfläche BCG verziert haben keine nennenswerte Eingriffe mit bakteriellen Eintrag (22,5 ± 1,57 %) im Vergleich zu unbeschichteten Wildtyp BCG (24.47 ± 1,18 %) darauf hinweist, dass Oberflächendekoration BCG keinen Einfluss auf Makrophagen hat Phänotyp.

Avidin Fusionsproteine intrazellulär Reisen und zusammen mit MHC-Moleküle zu lokalisieren
Um Avi-OVA-dekorierten BCG Schicksal innerhalb von Makrophagen zu untersuchen, wurden rohe adhärente Zellen infiziert und durch Fluoreszenz-Mikroskopie, untersucht, wie im obigen Protokoll beschrieben. Bilder erhalten (Abb. 5A) zeigte, dass Avi-OVA nicht nur auf der bakteriellen Oberfläche, sondern auch freistehende und translozierten entfernten Zytoplasma zu den Bakterien. Um dieses Ergebnis weiter zu überprüfen, führten wir eine Immunogold Färbung Experiment und die Bilder zeigten deutlich, dass Avi-OVA Antigene befinden sich nicht nur auf die BCG-Oberfläche, sondern können auch von der BCG-Oberfläche Lösen überqueren die phagosomal Membran und Reisen gegenüber der Zellflüssigkeit (Abb. 5 b). Um weiter prüfen, ob die Avi-OVA dekoriert Bakterien liefern ihre Fracht Oberfläche Protein des Antigen-Präsentation-Weges waren, waren die Makrophagen mit Avi-OVA BCG, infiziert, wie im Protokoll beschrieben und konfokale Analysen unterzogen. Ergebnisse (Abb. 6A) zeigte, dass es NS1 der Avi-OVA mit-A-Moleküle, die darauf hindeutet, dass Schmelzverfahren Protein Avidin losgelöst und Antigen Präsentation Fächer wo sie geladen auf MHC-II Moleküle wurden umgesiedelt. Ergebnisse zeigten auch, dass Avi-OVA Peptid mit Co lokalisiert Klasse I Moleküle innerhalb BCG Phagosom wenn gebeizt für H-2_kb (Abb. 6 b), die zeigten, dass es mögliche Präsentation des Avi-OVA CD8 Antigen+ T-Zellen durch die Makrophagen. Diese Daten deuten darauf hin, dass sobald Oberfläche verziert Bakterien geben Sie Makrophagen, die Antigene sind in der Lage für den Verkehr in Richtung der Antigen-Präsentation-Wege.

Dekorierte Oberfläche Bakterien sind voll immunogen
Zu prüfen, ob die Oberfläche verzierte BCG induzieren eine spezifische Immunantwort in Vivo C57BL/6 Mäusen kann mit PBS allein (Kontrolle), Wildtyp BCG geimpft wurden, Avi-OVA dekoriert, BCG und BCG genetisch mit einem Plasmid transformiert zum Ausdruck bringen eine ähnliche OVA Antigen. Immunisierten Mäusen waren geopferten 20 Tage später und die Frequenzen der OVA-spezifische CD4+ T Zellen und OVA-spezifischen T-Zellen, die Freisetzung von Zytokinen erkannt wurden, gemäß dem Protokoll. Ergebnisse (Abbildung 7A-B) zeigten einen größeren Teil der OVA-spezifische CD4+T-Zell-Antwort bei Tieren immunisiert mit BCG beschichtet mit Avi-OVA im Vergleich zu BCG WT. BCG genetisch modifiziert Eizellen zeigten eine ähnliche Immunantwort zu BCG auszudrücken AVI-OVA (Abbildung 7). Diese Daten zeigten, dass die bakterielle Oberflächendekoration Methode in der Lage, eine deutliche Ausweitung des Antigens zu induzieren spezifische CD4+ T Zellen und der Grad der T-Zell-Antwort-Induktion ist vergleichbar mit BCG gentechnisch auszudrücken, eine ähnliche OVA Antigen.

Da intrazelluläre Zytokinen auch wichtige Indikatoren der Antigen-spezifischen T-Zell-Reaktionen sind, wurden intrazelluläre Zytokinen Färbung (ICS) Experimente durchgeführt, um weitere T-Zell-Immunantworten zu bewerten, indem Sie bestimmen den Ausdruck und die Frequenzen von Effektor Zytokine in Tiere immunisiert OVA dekoriert Bakterien mit Bakterien genetisch mit einer OVA mit dem Ausdruck Plasmid transformiert. Wir untersuchten Ebenen der IFN-γ Release, das ein bekannter Indikator für schützende Reaktion gegen intrazelluläre Bakterien11ist. Wir bewiesen, dass wir ähnliche Niveaus der OVA-spezifischen IFN-γ erkennen konnten Freigabe CD4 Zellen+ bei Tieren, die mit Bakterien Oberfläche verziert mit OVA (BCG-Avi-OVA und BCG-p19-Avi-OVA) im Vergleich zu Tieren, die mit Bakterien geimpft geimpft mit dem genetisch Ausdruck OVA (BCG-p19-OVA) (Abb. 8A). Wichtig ist, konnten wir auch erkennen, deutlich höhere Frequenzen der IFN-γ produzieren CD8+ T Zellen bei Tieren mit BCG-Avi-OVA im Vergleich zu Tieren, die mit genetisch auszudrücken OVA (Abbildung 8 b-C) BCG geimpft geimpft was zeigt, dass die Biotin-Avidin DGM-Anzeige der Antigen-Methodik vermittelt, kann effektiv ersetzen BCG Transformation mit Nukleinsäuren.

Figure 1
Abbildung 1: Aufbau einer Rekombination Klonen Plasmid für die Produktion von Avidin Fusionsproteinen. (A) ein Genabschnitt Codierung für Monomere Avidin war mit Restriktionsschnittstellen NdeI und NotI synthetisiert und subcloned in pDEST17 zwischen 6 X-Histidin und der Gateway-Kassette, p17-Avi Plasmid zu generieren. OVA Peptid252-345 DNA-Sequenzen mit AttB Seiten gekündigt wurden in pDONR221 kloniert. Danach wurden die OVA Gene in p17-Avi subcloned. Bild bearbeitet und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von PLOS ONE12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Wirksamkeit der BCG-Biotinylierungen. BCG war biotinylierte mit verschiedenen Konzentration von NHS-SS-Biotin für 30 min bei Raumtemperatur, dann mit FITC-Streptavidin gekennzeichnet und durch Durchflusszytometrie analysiert. Ergebnisse werden als die Histogramme der grünen Fluoreszenzintensität und das Einfügen-Diagramm stellt den Mittelwert ± SEM mittlere Fluoreszenz-Intensitäten (MFI) von 3 unabhängigen Experimenten abgezogen. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Bild bearbeitet und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von PLOS ONE12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Biotinylierungen von BCG Oberfläche hatte keinen Einfluss auf das Wachstum oder das Überleben in den Makrophagen. (A) Biot-BCG und Kontrolle unmarkiertem Wildtyp BCG wurden im kompletten 7 H 9 Medien gewachsen und Replikation wurde über eine 8-Tage-Zeitraum überwacht. Das Ergebnis wird ausgedrückt, wie Wachstumskurven, d. h., Extinktion bei 600 nm als Funktion der Zeit ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten. (B) Makrophagen mit Biot-BCG-Luc infiziert oder Steuern unbeschriftete BCG-Luc für die angegebenen Zeiträume und dann Zelle Lysates wurden vorbereitet und getestet für die Biolumineszenz, lebensfähige Bakterien zu erkennen. Ergebnisse sind als relative leichte Einheiten bedeuten (RLU) ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten. Bild bearbeitet und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von PLOS ONE12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Avi-OVA Bindung an Biot-BCG und seine Stabilität. (A) Biot-DsRed-BCG (Bakterien, die mit dem Ausdruck rote Fluoreszenz, zuvor beschriebenen9) und Kontrolle nicht biotinylierte DsRed-BCG waren gemischt mit Avi-OVA bei Raumtemperatur für 1 h und das Ausmaß der OVA Bindung von Oberfläche Färbung mit bewertet wurde Kaninchen-Anti-Avidin-Antikörper und Anti-Kaninchen FITC-Ziege IgG (FL1). Proben wurden gewaschen und von Durchflusszytometrie analysiert. Ergebnisse werden als die Histogramme der grünen Fluoreszenzintensität, und Werte sind Mittelwert ± SEM von MFI von Biot-BCG-AviOVA Bindung aus drei unabhängigen Experimenten gewonnen. (B) lyophilisiert Biot-BCG beschichtet mit Avi-OVA und frisch zubereitete Avi-OVA-Biot-BCG wurden beschriftet und von Durchflusszytometrie analysiert, wie in a beschrieben Angezeigten Daten sind Vertreter von drei unabhängigen Experimenten und Werte sind Mittelwert ± SEM von MFI von Avi-OVA-Biot-BCG verbindlich aus drei unabhängigen Experimenten gewonnen. (C) RAW Makrophagen infiziert wurden mit DsRed BCG-Avi-OOVA oder DsRed-BCG für 24 h bei 37 ° C. Proben wurden dann gewaschen, mit Trypsin behandelt, fixiert und durch FACS analysiert. Ergebnisse werden als rote Fluoreszenz Histogramme, ausgedrückt, die das Ausmaß der Phagozytose widerspiegeln. Werte zeigen eine durchschnittliche Prozentsatz ± SEM von Zellen, die Einnahme von BCG, die aus drei unabhängigen Experimenten gewonnen. Bild bearbeitet und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von PLOS ONE12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Avi-OVA losgelöst von BCG Oberfläche und überquerte die phagosomal Membran in Richtung der Zellflüssigkeit. (A) RAW adhärenten Zellen auf Deckel rutscht waren infiziert mit OVA dekoriert DsRed-BCG für 24 h bei 37 ° C und dann fixiert/permeabilized und befleckt mit Kaninchen Anti-Avidin Antikörper, FITC-Ziege Anti-Kaninchen IgG. Proben wurden auf Objektträger montiert und analysiert digital konfokalen Mikroskopie. Rote Signale geben die Position der BCG und grüne Signale reflektieren die Lokalisierung von Avi-OVA. Die gepunktete Linie zeigt die Makrophagen Zelle Grenze und der unteren rechten Panel ist ein 4 X Vergrößerung des Einsatzes im linken Fenster angezeigt. (B) Dünnschliffe von BCG-AviOVA infiziert RAW Zellen wurden mit Paraformaldehyd fixiert und inkubiert sequenziell mit Anti-Avidin Antikörper und Gold konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG, Avi-OVA zu visualisieren und mit einem Elektronenmikroskop untersucht. Vergrößerung von 12.000 X wird angezeigt. Die Pfeilspitzen zeigen Avi-OVA von BCG Oberfläche getrennt und exportiert darüber hinaus die Phagosom-Membran. Die gezeigten Bilder sind Vertreter von zwei unabhängigen Experimenten. Bild bearbeitet und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von PLOS ONE12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Avidin-Fusion Antigen lokalisiert zusammen mit MHC Klasse II und Klasse I Moleküle. Anhaftende BMA3.1A7 Zellen, eine Maus-Makrophagen-Zelllinie waren infiziert mit OVA dekoriert GFP-BCG (Ausdruck von grün fluoreszierenden, zuvor beschriebenen9) für 4 h und dann stimuliert mit IFN-γ für 24 h Zellen wurden dann behoben/permeabilized und gebeizt mit Kaninchen-Anti-Avidin-Antikörper, Alexa 594-Anti-Kaninchen-IgG und Alexa 647 Ratte Anti-Maus-A (A) oder Alexa 647 Ratte Anti-Maus H-2_kb (B). Proben wurden auf Objektträger montiert und analysiert digital konfokalen Mikroskopie. Grüne Signale geben die Position der BCG-GFP und rote Signale reflektieren die Lokalisierung von Avi-OVA. Blaue Signale geben die Position der MHC-Klasse II und Klasse I Moleküle. Die gepunktete Linie zeigt den Bereich von Interesse. Pfeilspitzen zeigen Avi-OVA NS1 mit MHC-Moleküle. Die gezeigten Bilder sind Vertreter von zwei unabhängigen Experimenten. Bild bearbeitet und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von PLOS ONE12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: In Vivo CD4+ T-Zell-Antwort zu BCG OVA dekoriert. C57BL/6 Mäusen subkutan injiziert mit BCG Oberfläche verziert mit OVA, unveränderte BCG Wildtyp, PBS (Kontrolle), BCG genetisch auszudrücken, OVA (BCG-p19-OVA) umgewandelt wurden, oder mit Steuerung umgewandelt Plasmid und Oberfläche verziert mit Avi-OVA ( BCG-p19-AviOVA). Nach einem Zeitraum von 20 Tagen wurden Splenocyten aus der Milz euthanasierten Tiere vorbereitet und gefärbt mit PE-konjugiert-Ab-OVA323-339 Tetramers (A) gefolgt von AF647-CD4 Antikörper und 7-AAD. Proben wurden dann von Durchflusszytometrie analysiert. Ergebnisse werden als zwei-Parameter-Punkt plottet, die durchschnittliche Frequenzen ± SEM von Tetramer positive Ereignisse in die CD4 zeigen ausgedrückt+ Bevölkerung von zwei Tieren pro Gruppe. Angezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente (mit Zellproben aus jeder Maus in dreifacher Ausfertigung ausgewertet wurden insgesamt sechs Mäusen untersucht). Die Daten in Diagrammen (B) werden ausgedrückt als Wert ± SEM der absolute Zahl (insgesamt 500.000 Ereignisse) der OVA Tetramer bedeuten spezifische CD4+ Zellen in zwei Tiere/Gruppe und drei unabhängigen Experimenten. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Bild bearbeitet und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von PLOS ONE12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Frequenzen von T-Zellen, die Freigabe von Zytokinen in Reaktion auf Avi-OVA beschichtet BCG-Impfung. Splenocyten von immunisierten Mäusen mit PBS, BCG Wildtyp-BCG WT Oberfläche verziert mit Avi-OVA, BCG-p19-OVA und BCG-p19-AviOVA waren mit rekombinanten Proteins Eizellen stimuliert, 16 Uhr, gefolgt von einer 5 h-Zeitraum-Behandlung mit Brefeldin A. Cells waren dann gewaschen und zuerst befleckt mit PE-Cy7 Anti-CD4 (A) oder PE-Anti-CD8-Antikörper (B) dann AF647 Anti-IFN-γ Antikörper. Zellen wurden dann gewaschen und von Durchflusszytometrie analysiert. Ergebnisse sind als zwei-Parameter-Dot-plots, um durchschnittliche Frequenzen ± SEM von IFN-γ produzierenden Zelle Teilmengen in CD4 zeigen+ und CD8+ Populationen von zwei Tieren pro Gruppe. Angezeigten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente (mit Zellproben aus jeder Maus in dreifacher Ausfertigung ausgewertet wurden insgesamt sechs Mäusen untersucht). Die Daten in Diagrammen (C) werden als der Mittelwert der absoluten Zahl ± SEM von IFN-γ ausgedrückt+ T Freigabe CD4-Zellen (linke Grafik) oder IFN-γ Freigabe CD8 Zellen+ T (Grafik rechts) von zwei Tieren pro Gruppe und drei unabhängigen Experimenten. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Bild bearbeitet und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von PLOS ONE12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In dieser Studie berichten wir einen nicht-genetische Ansatz für schnelle und effektive Darstellung der exogene Proteine auf BCG Oberfläche hinzufügen entweder spezifische Antigene oder bestimmte funktionale Eigenschaften erwartet, dass das Bakterium Immunogenität effizient zu verbessern. Wir bewiesen, dass die BCG-Zelloberfläche biotinylierte für sofortige Oberflächendekoration mit Avidin Fusionsproteine leicht sein könnte. Das gesamte Verfahren kann innerhalb von 2 h, während genetische Veränderung und Selektion der positive Klone erfordert 2 bis 3 Monate Verzögerung durchgeführt werden. Oberflächenmodifizierung wirkt nicht bakterielle Wachstum und überleben. Bakterien mit Surrogat Antigen Eizellen konnten das Antigen in der Antigen-Präsentation-Pfad bereitstellen und induzierten spezifische Immunantwort in vivo die Durchflusszytometrie Assays einschließlich MHC Tetramer Färbung bewertet wurde eingerichtet und intrazelluläre Zytokin Färbung (ICS). Noch wichtiger ist, zeigte in Vivo Studien deutlich, dass die Oberfläche verziert Bakterien konnten ähnliche Ebenen der Immunantwort im Vergleich zu BCG gentechnisch auf ausdrückliche ähnliche Antigene induzieren.

Avidin-Biotin-Interaktion ist die stärkste nicht-kovalente Wechselwirkung in der Natur mit einem K-d 10−15 M13bekannt. Es ist nicht nur ein nützliches Werkzeug, die häufigsten in der biologischen Forschung14, aber auch vor kurzem gezeigt worden, um Krebs Therapie15,16anwendbar. In dieser Studie wurde eine dreifache Mutation (N54A, W110K und N17I) an Wildtyp Avidin tetrameres Avidin in eine Form von Monomeren Avidin umwandeln, die Avidin-Biotin-Affinität deutlich reduziert hat angewendet (Kd= 10−7 M) und bindet reversibel, Biotin. Diese Monomere Avidin wurde verwendet, um ein p17-Avi-Plasmid zu entwickeln, die kompatibel mit Gateway Rekombination Klonen (Invitrogen) für einen einstufigen schnellen Ausdruck eines Proteins von Interesse ist. Diese neue Version von Monomeren Avidin hat mehrere Vorteile, einschließlich verhindert große bakterielle Büschel Aggregation und Transient/Reversible bakterielle Oberfläche Anzeige der interessierenden Proteine. Daher können sobald von der Wirtszelle aufgenommen, Avi-Schmelzverfahren Proteine von der Oberfläche der biotinylierte Bakterien und Verkehr intrazellulär lösen. Schließlich wandeln die Mutationen Avidin in eine nicht-glykosylierten Form, die in Hefe oder transgener Pflanzen17,18 für die Produktion großer Mengen von Fusionsproteinen Avidin in eukaryontischen Systemen gelten könnte. Diese Form der Monomeren Avidin wurde anstelle einer Version von Monomeren Streptavidin (mSA)19, gewählt, hat Streptavidin und Rhizavidin Sequenzen und hatte eine höhere Bindungsaffinität (Kd von 10−9 M) im Vergleich zu mAvidin. Mit ersten Tests musste mSA Chimäre Protein einen viel niedrigeren Wirkungsgrad der Bindung biotinylierte Bakterien im Vergleich zu mAvidin Chimäre Protein. Diese Studie basierte daher auf mAvidin, aber Monomeren Streptavidin oder andere Formen von Streptavidin/Avidin wäre auch eine Möglichkeit für andere Anwendungen.

Erfolgreiche Umsetzung der beschriebenen Protokolle hängt die Qualität des erzeugten Fusionsproteins und Effizienz der bakteriellen Oberfläche Biotinylierungen. Eluierten Avi-markierte Protein sollte de-gesalzene und Puffer in PBS mit der richtigen Molekulargewicht Protein Konzentrator ausgetauscht. Niederschläge auftreten bei hoher Konzentration Faktoren für einige Proteine, daher Konzentrationsfaktor sollte geprüft werden und anhand von Kleinmengen eluierten Proteins am ersten, z.B.0,5 bis 1 mL solubilisiert Einbeziehung Körper in 20 mL PBS verdünnt und dann konzentriert. Es ist auch wichtig, die Temperatur des Proteins um 4 ° C während des gesamten Prozesses Niederschlag zu vermeiden.

Um die Effizienz der bakteriellen Oberfläche Biotinylierungen zu verbessern, sollten Sulfo-NHS SS Biotin in seinem ursprünglichen Container im Dunkeln bei 4 ° c gelagert werden Das Reagenz ist extrem Feuchtigkeit empfindlich; Ampullen mit dem Reagenz sollte daher vor dem Öffnen auf Raumtemperatur equilibriert werden. Auch sollte Biotin-Stammlösung (10 mM) unmittelbar vor dem Gebrauch gemacht, wie die NHS-Ester glyko-hydrolysiert und werden sehr schnell nicht reaktiv. Biotin-Stammlösung kann nicht gespeichert und wiederverwendet werden; ein neues Fläschchen Biotin ist für jeden Biotinylierungen Experiment benötigt. Für optimale Ergebnisse sind frische Kulturen von BCG, neue Medien, sowie frische Puffer empfohlen. Wie im Protokoll erwähnt, Biotinylierte und beschichtete BCG könnte lyophilisiert und für mindestens 30 Tage erhalten, ohne dass die Qualität der Oberflächenbeschichtung. Dies ist besonders nützlich, wenn senden oder Proben von einem Ort zum anderen zu übertragen oder beim langen Kurs Experimente durchführen.

Diese BCG Oberflächendekoration Methode bietet auch weitere spannende Möglichkeiten zum analysieren und bewerten die Immunogenität des neu entwickelten Impfstoff-Kandidaten auf eine schnelle und präzise Weise. Das primäre Ziel der Roman TB Impfstoffe induzieren TH1-Typ-Zellen wie CD4 ist+ und CD8+ T-Zellen, spielen eine wichtige Rolle im Schutz gegen die Tuberkulose. In dieser Studie entwickelte Avidin-Biotin-System bietet ein sehr nützliches Werkzeug um diese T-Zellen Antworten zu bewerten. Diese neuartige Technologie schnell rekombinante Proteine/Antigene auf BCG Oberfläche anzeigen steht für ein großartiges Werkzeug, um schnell zu bewerten und genau die Schutzwirkung von immunogen Proteine (z.B.abgesondert spezifische M.tb (Proteine), und somit in der Entwicklung von effizienten Impfstoffen übersetzt werden kann.

Durch Anpassung und die Konzentration der Avi-Fusionsproteine auf bakterielle Oberfläche variieren, könnte ein weiterer Vorteil dieser Methode gleichzeitig verschiedene Antigene von Interesse anzeigen auf der bakteriellen Oberfläche, die Wirksamkeit des Impfstoffs zu maximieren. Denn Studien gezeigt haben, dass BCG mit wichtigen Makrophagen Funktionen wie Phagosom Reifung20,21 und Antigen Präsentation21stört, könnte eine Möglichkeit zur weiteren Verbesserung BCG BCG Oberfläche mit dekorieren werden eine Kombination von Faktoren, die bekanntermaßen Phagosom Reifung zusammen mit Antigenen von Interesse zu beschleunigen.

Einige Einschränkungen dieser Technologie gehören das Erfordernis der großtechnische Produktion von rekombinanten Proteinen, die in Gebieten mit niedrigem Einkommen anspruchsvoll und teuer sein könnte. Herstellung von hart, um Proteine zu reinigen würde auch zur Fehlerbehebung und Optimierung benötigen. Jedoch können diese Einschränkungen umgangen werden, mit der Verbesserung des rekombinanten Proteins Produktionstechnologien. Eine weitere Einschränkung beinhaltet die Möglichkeit, dass natürlich vorkommende Anti-Avidin Antikörper im Labor Tier und Mensch22 die Verwendung von Avidin zu therapeutischen Zwecken behindern könnten. Jedoch andere Labore haben die Sicherheit und Wirksamkeit von Avidin Therapie getestet und haben gezeigt, dass durch seine Immunogenität23Avidin die Sicherheit und Wirksamkeit nicht nennenswert betroffen waren. Interessant ist, verringert die Umwandlung der Wildtyp tetrameres Avidin in monomerer Form deutlich seine Immunogenität24.

Zusammenfassend lässt sich sagen, kann diese neuartige Technologie nutzt einen Avidin-Biotin-System zur Verbesserung der BCG Immunogenität über eine schnelle und reproduzierbare nichtgenetische bakterielle Oberflächenmodifikation mit Proteinen von Interesse erfolgreich ersetzen traditionelle Transformation von BCG mit Antigen-Kodierung Plasmide. Darüber hinaus diese neuartige Methode kann nicht nur erleichtern, Verbesserung der aktuellen BCG-Impfstoff, sondern bieten auch eine neuartige Plattform für schnelle Auswertung von nahezu jedem potenziellen Antigen oder Proteine normalerweise schwer zu BCG, mit breiten genetisch ausdrücken Anwendungen in der Impfstoffentwicklung TB.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken Dr. R Stokes für die BCG Pasteur Belastung und A. Talal für den technischen Support. Wir danken auch GenScript für Hilfe bei der Gensynthese.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

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References

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Immunologie Ausgabe 131 Mycobacterium Tuberculosis Makrophagen Immunantwort rekombinante Proteine T-Zellen Antigene Biotin Avidin-Biotin
Ausdruck der exogene Antigene im <em>Mycobacterium Bovis</em> BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System
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