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Immunology and Infection

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421

Summary

Una nuova tecnica per la visualizzazione rapida dell'antigene su una superficie batterica è presentata, che coinvolge la superficie biotinylation seguita dall'esposizione alle proteine di interesse in fusione con avidina monomerico. Caricamento di BCG con antigeni selezionati correttamente, migliora la sua immunogenicità, suggerendo che la decorazione di superficie può sostituire tradizionali approcci genetici.

Abstract

Tubercolosi (TB) è una malattia infettiva grave e il bacillo di M. bovis vaccino disponibile solo Calmette-Guérin (BCG) è sicuro ed efficace per la protezione contro la meningite di TB severa per bambini e alcune forme di TB diffusa, ma non riesce a proteggere contro la tubercolosi polmonare, che è la forma più diffusa della malattia. Strategie più promettenti per migliorare BCG attualmente si basano sia sulla sua trasformazione con geni codificanti immunodominanti M. tuberculosis (Mtb)-antigeni specifici e/o complementazione con geni codificanti co-fattori di che stimolerebbero l'antigene cellule presentanti. Principali limiti di questi approcci includono bassa efficienza, bassa stabilità e l'incerto livello di sicurezza dei vettori di espressione. In questo studio, presentiamo un approccio alternativo al miglioramento di vaccino, che consiste di complementazione di BCG con proteine esogene di interesse sulla superficie dei batteri, piuttosto che la trasformazione con plasmidi codifica geni corrispondenti. In primo luogo, le proteine di interesse sono espressi in fusione con avidina monomerica in standard Escherichia coli sistemi di espressione e quindi utilizzato per decorare la superficie di biotinylated BCG. Utilizzando BCG superficie decorata con antigene ovoalbumina surrogato gli esperimenti sugli animali dimostrano che il batterio modificato è completamente immunogenico e capace di indurre risposte delle cellule T specifiche. Complessivamente, i dati presentati qui fortemente sostengono un romanzo e un metodo efficiente per rimodellare l'attuale vaccino BCG che sostituisce l'approccio convenzionale laborioso di complementazione con acidi nucleici esogeni.

Introduction

Sono state proposte varie strategie per sostituire l'attuale vaccino BCG, inclusi sistemi proteici adiuvante, tecnologie basato su vettori virali, ceppi di M.tb vivo attenuati e geneticamente ceppi di BCG, sia per introdurre geni di TB che iper-esprimono gli antigeni di BCG che non sono sufficientemente espressi durante infezione1 o Mtb-antigeni specifici non presentano in BCG2. Ingegneria genetica, tuttavia, affronta molte barriere tra cui l'incerto livello di sicurezza, il processo che richiede tempo e la bassa efficienza di vettori di espressione4,5. Per quanto riguarda il miglioramento BCG, è necessario un approccio alternativo per migliorare immunogenicità senza la necessità di alternanze genetiche incerti.

In questo studio, presentiamo una nuova strategia per la visualizzazione di proteine ricombinanti di interesse sulla superficie della cellula di BCG che si basa sull'interazione ben noto ad alta affinità avidina con biotina. Questo approccio permette di attacco rapido e riproducibile di proteine di fusione ricombinante avidina sulla superficie di biotinylated BCG, che facilita la vaste manipolazioni di BCG per conseguire il miglioramento massimo della sua efficacia pur mantenendo la sicurezza eccellente registrare, osservato in decenni di utilizzo.

Affinità avidina biotina è estremamente alta (Kd = 10− 15 M) e una volta che formato, il complesso avidina-biotina è molto stabile e può essere interrotta solo sotto condizioni6di denaturazione. Tuttavia, per questo tipo di interazione per servire come un'alternativa di metodo di trasferimento gene, esposizione a lungo termine ma reversibile di proteine ricombinanti è richiesto. Così, abbiamo qui introdotto un avidina monomerico bassa affinità (Kd = 10− 7 M) che conduce al rilascio reversibile della proteina dalla superficie decorata BCG una volta ingeriti all'interno di cellule presentanti l'antigene. Al fine di fornire una prova di concetto, abbiamo testato questo metodo utilizzando una proteina chimerica monomerico avidina corrispondente ad un antigene di surrogato derivato da ovoalbumina (uova)7,8. I risultati hanno mostrato che la superficie della cellula di BCG può essere facilmente e rapidamente decorata con proteine di fusione di avidina monomerico e che questa associazione alla superficie di BCG è stabile e riproducibile senza variazioni rilevabili in crescita batterica e la sopravvivenza. Inoltre, abbiamo trovato che BCG decorato con avidina monomerico fuso con ovuli (AviOVA) può indurre una risposta immunitaria simile a quella indotta da BCG geneticamente che esprimono l'antigene stesso sia in vitro che in vivo. Questa tecnologia di schermo reversibile di proteine di interesse sulla superficie batterica è pertanto un efficace sostituto di gene tradizionale trasferimento approcci e può fornire una piattaforma per ulteriori applicazioni nel vaccino e ampia manipolazioni di BCG sviluppo.

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Protocol

Tutti gli animali sono stati mantenuti secondo protocolli approvati dalle commissioni di utilizzo presso la University of British Columbia e cura degli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dalle commissioni di utilizzo e cura degli animali ed eseguiti secondo il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali. Il numero di benessere animale assicurazione è A11-0247.

1. generazione di proteine di fusione di avidina monomerico esprimendo plasmidi

  1. Sub-clonare monomerico avidina sequenza12 in plasmide pDEST17 tra i siti "CTC" e "GAA", che corrisponde a 133-134bp. (vale a dire, tra il 6-histag e il sito di ricombinazione Attr1 pDEST17) per ottenere p17-Avi.
    Nota: La sequenza di DNA di avidina monomerica è mostrata di seguito. Tre mutazioni introdotte nel selvaggio-tipo avidina ottenere monomerico avidina sono indicate in caratteri in grassetto.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. Disegnare primers affiancato con AttB1 e B2 Attsiti corrispondenti a OVA polipeptide757-1035 (-Ab- e H-2_Kb-limitato epitopi) sequenza di DNA. Sono sequenze dell'iniettore: Attb1-OVA
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT e Attb2-OVA
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 e Attb2 sequenze sono in grassetto).
    1. PCR-amplificare OVA polipeptide757-1035 sequenza di DNA con i primer sopra utilizzando il plasmide pUC57-OVA come modello.
    2. Duplicare i prodotti PCR in pDONR-221 attraverso una site-specific in vitro reazione di ricombinazione (ad es., BP Clonase) per ottenere pDONR-OVA.
  3. Trasferire il gene di interesse in p17-Avi usando la reazione di LR Clonase per ottenere p17-Avi-OVA.
    Nota: Per dettagli di clonazione di ricombinazione BP e LR, vedere il manuale del produttore.

2. espressione della proteina di fusione monomerico avidina, purificazione e Refolding

  1. Trasformare p17-Avi-OVA plasmide in e. coli BL21 e indurre 250 mL di e. coli BL21 cultura con IPTG (0,1 M) per 3 ore a 37 ° C.
  2. Lisi dei batteri e corpi di inclusione solubilizzazione
    1. Pellet i 250 mL di indotto BL21 cultura da 30 min di centrifugazione a 4.000 x g e a 4 ° C.
    2. Raccogliere palline in 10 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidina-HCL, pH 1.5-2.5) e incubare per 15 min a 95 ° C. Incubare per una notte a temperatura ambiente in un rotatore.
    3. Centrifugare 30 min a 15.000 x g e 4 ° C e raccogliere surnatante.
  3. Purificare l'Avi-OVA da supernatante (frazione solubilizzata corpi di inclusione) utilizzando colonne di Ni-NTA.
    1. Diluire 1:2 di corpi di inclusione con tampone di lisi.
    2. Utilizzare 4 mL di resina Ni-NTA per 250 mL di cultura-derivato di corpi di inclusione.
    3. Lavare 3 volte con 10 mL di tampone di lisi (pH 7.0).
    4. Eluire con 10 mL di tampone di eluizione (lisi tampone pH 7.0 con imidazolo 250 mM).
  4. Ripiegare le proteine eluite diluendo graduale (01:10) e rapida nel Vortex in tampone Tris (pH 7,5) contenente 1 millimetro DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, arginina 500 mM e 200 mM NaCl per 30 min a temperatura ambiente.
  5. De-sale e cambio buffer riavvolgerlo proteina da tampone Tris in PBS con concentratori di proteina secondo i protocolli del produttore.
  6. Rimuovere gli aggregati mediante centrifugazione per 30 min a 3.500 x g e a 4 ° C e conservare le aliquote di proteina solubile a-20 ° C.

3. biotinilazione della superficie delle cellule di BCG

  1. Crescere di BCG in brodo Middlebrook 7H 9 brodo con 10% OADC (acido oleico, albumina e destrosio soluzione) e 0.05% Tween 80 a 37 ° C su una piattaforma di agitatore a 50 giri/min fino a OD = 0,5-1.
    Nota: BCG è un patogeno di livello 2 di biosicurezza e tutti gli esperimenti riguardanti BCG dovrebbero essere fatto in una cappa di biosicurezza con dispositivi di protezione personale.
  2. Lavare 109 BCG 3 volte con 500 µ l di PBS gratis endotossina ghiacciata più 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Sospendere a pellet BCG in gratuito PBS sterile endotossina.
  3. Immediatamente prima dell'uso, preparare 1 mL di biotina di Sulfo-NHS SS 10 mM in acqua filtrata sterile.
    1. Incubare i batteri con 1 mL di 0.5 mM di biotina Sulfo-NHS SS a temperatura ambiente per 30 min.
  4. Lavare con etichettati batteri 3 volte con 500 µ l di PBST freddo ghiacciato per rimuovere non reagiti biotinylation reagente.
    1. Risospendere il pellet in 1 mL di PBST.
  5. Per valutare l'efficienza biotinylation, macchia 108 biotinilati BCG con Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µ l) a temperatura ambiente per 20 min.
    1. Incubare i batteri macchiati in 1 mL di 2% PFA per 20 min a temperatura ambiente e quindi esaminare i livelli di biotinilazione dall'analisi di citometria a flusso.

4. fenotipo di Biotinylated micobatteri: crescita e sopravvivenza

  1. Coltivare ceppi di BCG in brodo Middlebrook 7H 9 brodo con 10% OADC (acido oleico, albumina e destrosio soluzione) e 0.05% Tween 80 a 37 ° C su una piattaforma di agitatore a 50 giri/min.
    1. Registrare la densità ottica (OD600) della coltura batterica per un periodo di 8 giorni.
  2. Utilizzare BCG-Luc (precedentemente descritto9) per rilevare la sopravvivenza dei batteri in macrofagi.
    1. Infettare le cellule RAW 264.7 con biotinilati BCG-Luc (MOI 10:1) o non trattata di BCG-Luc (controllo) e incubate a 37 ° C sopra un 48h periodo di tempo.
    2. Lavare monostrati di cellule umane e quindi lisare con 0.025% SDS per rilasciare batteri ingeriti.
    3. Misurare la produzione di bioluminescenza con sistema di analisi di Luciferase e luminometro.
      Nota: Il segnale di luminescenza è indicativo della vitalità batterica. Fare riferimento al manuale del produttore per ulteriori informazioni di analisi di luciferase.

5. associazione di proteina monomerica avidina-Fusion biotinilati BCG superficie

  1. Mix 5 x 108 biotinilati BCG con Avi-proteina (finale di 10 μg/mL in PBS-T) per 1 h a temperatura ambiente su piattaforma shaker.
  2. Batteri di lavare 3 volte con 500 µ l di PBST freddo ghiacciato e macchia con anticorpo di coniglio anti-avidina (Ab) (diluizione 1: 100, precedentemente descritti10) per 20 min a temperatura ambiente e poi con FITC Coniugato anti-coniglio di capra Ab IgG nelle stesse condizioni.
  3. Lavare i batteri 3 volte con 500 µ l di PBST e analizzare mediante citometria a flusso per valutare l'entità della decorazione di superficie.

6. liofilizzazione di micobatteri

  1. Biotinylate batteri secondo passo 3.1-3.4 e cappotto biotinilati batteri con Avi-OVA secondo punto 5.1.
  2. Aliquota biotinilato e rivestite con batteri (108), lavate con PBS e risospendere in media di liofilizzazione di 0,5 mL (mezzo Sauton 25% e 75% H2O 1,5% Na-glutammato).
  3. Trasferire i batteri a fiale di vetro e congelare in un congelatore a-80 ° C durante la notte.
  4. Lyophilize fiale di vetro riempito e congelato per 24 ore utilizzando un essiccatore di congelamento.
  5. Conservare i campioni essiccati a temperatura ambiente e ricostituire in PBS quando necessario.
  6. Ripetere il passaggio 3.5 per valutare biotinylation e rivestimento stabilità superficiale.

7. test di fagocitosi

  1. Crescere 264.7 celle grezze del macrofago in piastre di coltura di diametro di 10 cm in DMEM Media contenente 5% FCS, 1% di L-Glutammina, HEPES, gli aminoacidi non essenziali e penicillina e streptomicina fino al confluency di 70-80%.
  2. 2 x 106 RAW 264.7 cellule macrofagiche in una piastra a 6 pozzetti del seme. Consentire alle cellule di aderire durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.
  3. Generare DsRed BCG (precedentemente descritto9) decorate con Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) secondo una gradualità 3.1-3.4 e 5.1.
  4. Infettare cellule RAW con DsRed BCG-Avi-OVA o non trattata DsRed BCG a MOI 20:1 per 24 h a 37 ° C.
  5. Lavare le cellule tre volte e tripsinizzano con 1 mL di tripsina 0,25% a 37 ° C per 10 min per rimuovere batteri parzialmente disconnesso.
  6. Difficoltà nel 2,5% PFA in PBS per 20 min a temperatura ambiente.
  7. Lavare 3 volte con PBS e analizzare tramite flusso cytometry.

8. intracellulare di ovuli decorato biotinilati BCG in macrofagi

  1. Microscopia a fluorescenza
    1. 3 x 105 RAW 264.7 cellule macrofagiche sulle lamelle in una piastra a 24 pozzetti del seme. Consentire alle cellule di aderire durante la notte a 37 ° C e 5% CO2.
    2. Infettare cellule del macrofago con micobatteri (MOI 10:1) nei mezzi di manutenzione senza antibiotici a 37 ° C e 5% CO2 per 4-24 h.
    3. Lavare le cellule e tripsinizzano per rimuovere i batteri dalla superficie allegati, non ingerito come al punto 7.5.
    4. Correzione infettato cellule nel 2,5% PFA in PBS per 20 min a temperatura ambiente seguito da 3 lavaggi con PBS.
    5. Permeabilize le cellule nel buffer blocco/permeabilizzazione (0,1% Triton X-100, 3% BSA in PBS) per 20 min a temperatura ambiente.
      1. Anticorpo specifico uso di interesse (ad es., coniglio Ab anti-avidina) a 10 μg/mL in permeabilizzazione buffer per 20 min a temperatura ambiente seguito da anticorpo secondario (ad es., FITC-goat anti-rabbit IgG) per 20 min.
    6. Lavare le cellule 3 volte con PBS, una volta con acqua e montare su diapositive in 10 μL di mezzo di montaggio acquoso per minimizzare la fluorescenza photobleaching.
    7. Esaminare i vetrini al microscopio confocale digitale utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato x 63 / 1.4 obiettivo piano-apocromatico. Registrare le immagini utilizzando una fotocamera digitale accoppiato al software di microscopio.
  2. Immunogold macchiatura e microscopia elettronica
    1. 2 x 106 RAW 264.7 cellule macrofagiche in piastre da 6 pozzetti del seme.
    2. Difficoltà macrofagi infettati BCG con 4% PFA per 4 h a temperatura ambiente.
    3. Lavare campioni due volte con PBS.
    4. Incorporare i campioni nel 4% basso punto di fusione dell'agarosi e disidratare in etanolo al 70%.
    5. Trasferire campioni di resina acrilica e polimerizzare a 50 ° C.
    6. Tagliare 60 sezioni nm con un microtomo e raccogliere le sezioni sulle griglie di nichel.
    7. Etichettare i campioni con l'anticorpo di avidina 10 μg/mL per 1 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte nella soluzione di incubazione (PBS e 0.1% BSA) e poi lavare con incubazione soluzione coniugato oro f2 di ultra-piccolo goat-anti-rabbit IgG (1/20) per 1 h a camera temperatura nella soluzione di incubazione.
    8. Sezioni di lavare in acqua distillata, macchia in glutaraldeide al 2%, lavare di nuovo, lasciare asciugare all'aria ed esaminare con microscopio elettronico.

9. animale immunizzazione ed elaborazione dell'organo

Nota: Tutti i passaggi dovrebbero essere fatto in una cappa di biosicurezza.

  1. Pass biotinilato e proteina rivestito batteri attraverso 271/2G ago 10 volte per rendere sospensione unicellulare.
  2. Prendere 1 x 106 batteri in 100 μL di PBS privo di endotossina e immunizzare un topi C57BL/6 femminili (-A,b, H - 2Kb, 5-6 settimana vecchia) per via sottocutanea nella collottola del collo.
    1. Iniettare topi di controllo con 100 μL di PBS da solo.
  3. Eutanasia topi immunizzati 20 giorni post-immunizzazione per inalazione di CO2 seguita da dislocazione cervicale.
    1. Isolare la milza e trasferirlo nel supporto di RPMI.
  4. Poltiglia della milza attraverso un colino di cella di 70 µm con un pistone della siringa 5 mL.
    1. Lavare con 5 mL di RPMI. Centrifuga (800 x g, 3 min) per isolare una sospensione unicellulare.
    2. Impoveriscono RBC con kit di selezione positiva di biotina mouse con biotina-Ter119/degli eritrociti cellule Ab.
    3. Centrifuga e risospendere le cellule in 10 mL di RPMI completo (10% FCS, 1% L-Glutammina, penicillina 1%, 1% streptomicina e 50 μM 2-ME).

10. I-Ab tetramero macchiatura per determinare le frequenze di antigene-specifici CD4+ le cellule di T e Cytokine colorazione intracellulare per determinare le frequenze di antigene-specifiche T cellule rilasciando citochine in animali immunizzati

  1. Tetramero di colorazione
    1. Macchia splenocytes dai topi immunizzati (~ 20 x 106 cellule) con PE-coniugato-Abe controllo-tetrameri di323-339 OVA (diluizione 1/12,5) per 1 h a 37 ° C nel buffer di associazione (PBS con FCS 2% e 0,1% di NaN3).
    2. Aggiungere AF647 CD4 Ab (01:25) e 7-AAD (per rilevare le cellule morte) gli splenocytes per 20 min a temperatura ambiente.
    3. Analizzare i campioni mediante citometria a flusso.
    4. Acquisire 500.000 eventi della regione per determinare la frequenza di eventi positivi tetramero positiva CD4.
      Nota: Totale splenocytes sono definiti dalla macchia del puntino SSC/FSC, cellule vive dall'esclusione degli eventi positivi 7-AAD e sottoinsiemi di CD4 di gating AF647 eventi positivi.
  2. Frequenza di antigene specifico intracellulare Cytokine rilascio di cellule T
    1. Trasferimento di circa 1 × 107 splenocytes in 4 mL di terreno RPMI completo in sei pozzetti con o senza OVA ricombinante (10 µ g/mL) e incubare per 16 h.
    2. Curare le cellule con brefeldina A (1:1, 000) per altre 5 h.
    3. Lavaggio con PBS e soggette a intracellulare cytokine colorazione come segue:
      1. Macchia di campioni di cellule con PE-CD8 o PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 in buffer obbligatorio) a temperatura ambiente per 30 min.
      2. Difficoltà nel 4% PFA a temperatura ambiente per 20 min.
      3. Permeabilize utilizzando soluzione di permeabilizzazione, secondo le istruzioni del produttore.
      4. Lavare le cellule ed etichetta con AF647-coniugato IFN-γ Ab (01:50) per 20 min a temperatura ambiente.
      5. Lavare le cellule e soggetto a analisi di citometria a flusso, come descritto in precedenza.

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Representative Results

Con le procedure generali descritte sopra, è stata esaminata la fattibilità di BCG superficie biotinylation e decorazione con antigene surrogato OVA. L'immunogenicità del BCG modificate è stato poi testato in vivo. La superficie batterica è stato facilmente etichettata con biotina per la visualizzazione rapida di antigeni chimerico avidina senza modifiche rilevabili nei fenotipi batterici. Il BCG modificate risultante viene ingerito efficientemente dalle cellule di presentazione dell'antigene e può indurre una risposta immunitaria di ovuli specifici nei topi.

Generazione di avidina monomerico fusione plasmidi e proteine
Un plasmide di espressione p17-Avi è stato generato per essere compatibile con la metodologia di Gateway da utilizzare per la produzione di proteine di fusione di avidina monomerico. OVA è stata clonata in p17-Avi ed espressa in e. coli, poi purificato e riavvolgerlo come descritto in precedenza (Figura 1).

Biotina attribuisce in modo efficiente sulla superficie batterica e non pregiudica la crescita batterica o sopravvivenza
I batteri sono stati etichettati con le varie concentrazioni (0-1 mM) di biotina e macchiato per esaminare l'efficacia di superficie biotinylation secondo protocolli di cui sopra. Analisi di citometria a flusso ha mostrato un cambiamento totale dell'istogramma di fluorescenza in batteri etichettati con biotina 0,5 mM (Figura 2), e questa concentrazione è stata utilizzata nel corso di questo studio per generare biotinilati batteri. Successivamente, abbiamo esaminato l'effetto di modificazione della superficie batterica sul fenotipo batterico e abbiamo trovato che biotinilato e controllo non trattato BCG visualizzato un simile profilo di crescita su un periodo di 8 giorni (Figura 3A). BCG esprimendo la luciferasi (BCG-Luc)9 è stato utilizzato per esaminare la sopravvivenza batterica nei macrofagi. Luminescenza segnali indicativi di attuabilità batteriche sono state registrate oltre 48 h. risultati ottenuti hanno mostrato i simili profili di attuabilità graduale diminuzione tra batteri biotinilato e controllo (Figura 3B). In conclusione, questi dati indicano chiaramente che biotinylation superficie batterica non pregiudica la crescita batterica o la sopravvivenza all'interno dei macrofagi, che è importante poiché l'aumento della sopravvivenza nei macrofagi potrebbe significare un aumento nella virulenza batterica.

Efficienza di decorazione di superficie batterica
Biotinilati batteri sono stati rivestiti con peptide dell'antigene OVA in fusione con avidina monomerico, secondo protocolli di cui sopra. Analisi di citometria a flusso ha mostrato i livelli minimi di ovuli vincolante ai batteri non-biotinylated (MFI = 8,31 ± 0,42, Figura 4A, pannello superiore) e associazione di livelli significativi di ovuli a biotinylated batteri (MFI = 54.67 ± 4,98) rispetto al controllo batteri (MFI = ± 5.92 0,22, Figura 4A, pannello inferiore).

Stabilità di decorazione di superficie di BCG
Poiché i vaccini vivi convenzionali di BCG sono formulati come polveri secche, un'importante questione che sorse nel corso di questo studio era la stabilità di BCG modificate dopo liofilizzazione, ricostituzione e deposito presso refrigerati o a temperatura ambiente. Pertanto, abbiamo esaminato la visualizzazione della superficie di Avi-ovuli in liofilizzato BCG Avi-OVA (superficie decorata con Avi-OVA) ed in appena decorato preparazioni batteriche. I risultati (Figura 4B) ha mostrato che livelli di Avi-OVA sulla superficie batterica è rimasto stabile e rilevabile un mese dopo liofilizzazione e stoccaggio a temperatura ambiente rispetto al fresco preparati di BCG Avi-OVA, che ha dimostrato che questo superficiale Metodo di decorazione è adatto per lo sviluppo di vaccini.

Fenotipo del macrofago non risente della decorazione di superficie batterica
Per vedere se questa metodologia di decorazione di superficie interferisce con batterica entrata nelle cellule ospiti, abbiamo usato le cellule RAW 264.7 e DsRed batteri9 per eseguire un test di fagocitosi descritto nel protocollo di cui sopra. Figura 4 ha mostrato che quella superficie batterica decorato BCG non ha interferenza significativa con entrata batterica (22,5 ± 1.57%) rispetto al non patinata wild-type BCG (24.47 ± 1,18%) che indica che la decorazione superficiale di BCG non ha alcun effetto sul macrofago fenotipo.

Proteine di fusione di avidina viaggiano intracellulare e co-localizzano con molecole di MHC
Per esaminare il destino di Avi-OVA-decorato BCG all'interno dei macrofagi, cellule RAW aderenti sono state infettate ed esaminate mediante microscopia a fluorescenza, come descritto nel protocollo di cui sopra. Immagini ottenute (Figura 5A) ha mostrato che Avi-OVA era non solo presenti sulla superficie batterica, ma anche indipendente e spostato al citoplasma distante ai batteri. Per verificare ulteriormente questo risultato, abbiamo effettuato un esperimento di colorazione del immunogold e le immagini ottenute hanno mostrato chiaramente che gli antigeni Avi-OVA sono presenti sulla superficie del BCG non solo, ma possono anche staccare dalla superficie del BCG, attraversano la membrana phagosomal e viaggio verso il citosol (figura 5B). Per esaminare ulteriormente se i batteri Avi-OVA decorate erano in grado di fornire il loro carico di proteina di superficie per il percorso di presentazione dell'antigene, i macrofagi sono stati infettati con BCG Avi-OVA, come descritto nel protocollo e sottoposte ad analisi confocale. Risultati (Figura 6A) ha mostrato che c'era colocalizzazione di Avi-ovuli con molecole-A, suggerendo che la proteina di fusione di avidina staccati e traslocata a compartimenti di presentazione dell'antigene dove sono stati caricati a molecole MHC II. Risultati hanno anche mostrato che il peptide Avi-OVA co-localizza con classe I molecole all'interno di fagosomi BCG quando macchiato per H-2_kb (Figura 6B), che ha dimostrato che c'è potenziale presentazione antigene CD8 Avi-OVA+ T cellule tramite il macrofago. Questi dati indicano che una volta la superficie decorata batteri entrano i macrofagi, gli antigeni sono in grado di traffico verso le vie di presentazione dell'antigene.

Superfici decorati batteri sono completamente immunogeni
Per esaminare la superficie decorata BCG è in grado di indurre una risposta immunitaria specifica in vivo, C57BL/6 topi sono stati immunizzati con PBS da solo (controllo), il selvaggio-tipo BCG, Avi-OVA decorato BCG e BCG geneticamente trasformato con un plasmide per esprimere un antigene OVA simile. Topi immunizzati sono stati sacrificati dopo 20 giorni e le frequenze di ovuli specifici CD4+ T cellule e cellule di T di ovuli specifici rilasciando citochine sono state rilevate, secondo il protocollo. Risultati (figura 7A-B) ha mostrato una più grande proporzione di ovuli specifici CD4+risposta a cellula T negli animali vaccinati con BCG rivestite con Avi-OVA rispetto al BCG WT. BCG geneticamente modificati per esprimere gli ovuli hanno mostrati una risposta immunitaria simile a BCG AVI-OVA (Figura 7). Questi dati hanno mostrato che il metodo di decorazione di superficie batterica è in grado di indurre una significativa espansione dell'antigene CD4 specifici+ T cellule e il grado di induzione di risposta delle cellule T è paragonabile a BCG geneticamente ingegnerizzate ad per esprimere un simile OVA antigene.

Poiché citochine intracellulari sono anche importanti indicatori delle risposte delle cellule T specifiche dell'antigene, citochine intracellulari (ICS) esperimenti di colorazione sono stati condotti per valutare ulteriormente le risposte immunitarie a cellula T determinando l'espressione e le frequenze di citochine effettrici in animali immunizzati con batteri decorato a ovuli e batteri geneticamente trasformati con un OAV esprimendo plasmide. Abbiamo esaminato i livelli di rilascio di IFN-γ, che è un noto indicatore di risposta protettiva contro i batteri intracellulari11. Abbiamo dimostrato che siamo stati in grado di rilevare livelli simili di ovuli specifici IFN-γ rilasciando CD4+ cellule in animali immunizzati con batteri superficie decorata con ovuli (BCG-Avi-OVA e BCG-p19-Avi-OVA) rispetto agli animali immunizzati con batteri geneticamente esprimendo OVA (BCG-p19-OVA) (Figura 8A). Cosa importante, siamo stati anche in grado di rilevare le frequenze significativamente più alte di IFN-γ produzione CD8+ T cellule negli animali vaccinati con BCG-Avi-OVA rispetto agli animali vaccinati con BCG geneticamente esprimendo OVA (Figura 8B-C) che dimostra che la biotina-avidina mediata visualizzazione della superficie della metodologia dell'antigene può efficacemente sostituire la trasformazione di BCG con acidi nucleici.

Figure 1
Figura 1: costruzione di una ricombinazione di clonazione del plasmide per la produzione di proteine di fusione di avidina. (A) un segmento di gene che codifica per monomerico avidina è stato sintetizzato con siti di restrizione NdeI e NotI e subclonato in pDEST17 tra l'istidina 6 x e la cassetta di gateway per generare p17-Avi plasmide. OVA peptide252-345 DNA sequenze terminati con attB siti sono stati clonati in pDONR221. Da allora in poi, geni di ovuli erano subclonati in p17-Avi. Immagine modificato e ristampato con il permesso da PLOS ONE12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: efficienza di BCG biotinylation. BCG è stato biotinilato con varie concentrazioni di NHS-SS-biotina per 30 min a temperatura ambiente, poi etichettato con FITC-streptavidina e analizzati tramite flusso cytometry. Risultati sono presentati come gli istogrammi di intensità di fluorescenza verde e inserto grafico rappresenta la media ± SEM di intensità media di fluorescenza (MFI) detratto dal 3 esperimenti indipendenti. * P < 0,05; * * P < 0.01; P < 0,001. Immagine modificato e ristampato con il permesso da PLOS ONE12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: biotinilazione della superficie di BCG non ha influenzato la crescita o la sopravvivenza in macrofago. (A) Biot-BCG e controllo senza etichetta di selvaggio-tipo BCG sono state coltivate in completa 7h 9 mezzi, e la replica è stata monitorata per un periodo di 8 giorni. I risultati sono espressi come curve di crescita, vale a dire, media assorbanza a 600 nm come funzione del tempo ± SEM da 3 esperimenti indipendenti. (B) i macrofagi sono stati infettati con Biot-BCG-Luc o senza etichetta BCG-Luc di controllo per i periodi di tempo indicato e poi cella lisati sono stati preparati e analizzati per bioluminescenza rilevare batteri vitali. Risultati sono espressi come media unità di luce relativa (RLU) ± SEM da 3 esperimenti indipendenti. Immagine modificato e ristampato con il permesso da PLOS ONE12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Avi-OVA associazione a Biot-BCG e la sua stabilità. (A) Biot-dsRed-BCG (batteri esprimendo la fluorescenza rossa, precedentemente descritto9) e controllo non-biotinylated dsRed-BCG sono stati mescolati con Avi-OVA a temperatura ambiente per 1 h e la misura degli ovuli associazione è stata valutata mediante colorazione superficiale con anticorpo di coniglio anti-avidina e FITC-capra anti-coniglio IgG (FL1). Campioni sono stati lavati e analizzati tramite flusso cytometry. Risultati sono presentati come gli istogrammi di intensità di fluorescenza verde, e i valori sono la media ± SEM di MFI di Biot-BCG-AviOVA associazione ottenuti da tre esperimenti indipendenti. (B) liofilizzato Biot-BCG rivestite con Avi-OVA e preparata Avi-OVA-Biot-BCG sono stati etichettati e analizzati mediante citometria a flusso, come descritto in A. I dati indicati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti, e valori sono media ± SEM di MFI di Avi-OVA-Biot-BCG vincolanti ottenuti da tre esperimenti indipendenti. (C) i macrofagi RAW sono stati infettati con DsRed BCG-Avi-Angylabiond o DsRed-BCG per 24 h a 37 ° C. Campioni sono stati poi lavati, trattati con tripsina, corretti e analizzati mediante FACS. Risultati sono espressi come istogrammi di fluorescenza rossa, che riflettono l'entità della fagocitosi. I valori indicano la percentuale media ± SEM di cellule che ingeriscono BCG ottenuti da tre esperimenti indipendenti. Immagine modificato e ristampato con il permesso da PLOS ONE12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Avi-OVA staccato dalla superficie di BCG e attraversato la membrana phagosomal verso il citosol. (A) cellule aderenti RAW su vetrini coprioggetto erano infettate con ovuli-decorato dsRed-BCG per 24 h a 37 ° C e quindi fisso/permeabilizzate e macchiate con FITC-capra anti-coniglio IgG e dell'anticorpo di coniglio anti-avidina. Campioni erano montati su vetrini da microscopio e analizzati mediante microscopia confocale a digitale. Segnali rossi indicano la posizione di BCG e segnali verdi riflettono la localizzazione di Avi-OVA. La linea tratteggiata indica il limite di cella del macrofago e basso a destra il pannello è un ingrandimento 4x dell'inserto mostrato nel pannello di sinistra. (B) sezioni sottili delle cellule RAW BCG-AviOVA infettata erano fissate con paraformaldeide e incubati in sequenza con l'anticorpo anti-avidina e oro-coniugato capra anti-coniglio IgG visualizzare Avi-OVA ed esaminati con un microscopio elettronico. Viene visualizzata la finestra di ingrandimento di 12.000 X. Le frecce indicano Avi-OVA dissociato dalla superficie di BCG ed esportato di là della membrana del fagosoma. Le immagini mostrate sono rappresentanti dei due esperimenti indipendenti. Immagine modificato e ristampato con il permesso da PLOS ONE12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: avidina-fusione antigene co-localizzati con MHC classe II e molecole di classe I. BMA3.1A7 le celle aderenti, una linea cellulare del macrofago di topo, sono state infettate con ovuli decorate GFP-BCG (esprimendo verde fluorescente, precedentemente descritto9) per 4 h e quindi stimolate con IFN-γ per 24 h. cellule erano quindi fisso/permeabilizzate e macchiate con anticorpo di coniglio anti-avidina, Alexa 594 anti-coniglio IgG e Alexa 647 ratto anti-topo-A (A) o Alexa 647 ratto anti-topo H-2_kb (B). Campioni erano montati su vetrini da microscopio e analizzati mediante microscopia confocale a digitale. Segnali verdi indicano la posizione di BCG-GFP e segnali rossi riflettono la localizzazione di Avi-OVA. I segnali blu indicano la posizione di MHC di classe II o molecole di classe I. La linea tratteggiata indica l'area di interesse. Le frecce indicano colocalizzazione di Avi-OVA con molecole di MHC. Le immagini sono rappresentanti dei due esperimenti indipendenti. Immagine modificato e ristampato con il permesso da PLOS ONE12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: In vivo CD4+ risposta a cellula T di BCG OVA-decorato. Topi C57BL/6 sono stati iniettati per via sottocutanea con BCG superficie decorata con BCG non modificato tipo selvatico, PBS (controllo), OVA, BCG geneticamente trasformato per esprimere OVA (BCG-p19-OVA), o trasformati con controllo plasmide e superficie decorata con Avi-OVA ( BCG-p19-AviOVA). Dopo un periodo di 20 giorni, gli splenocytes erano preparati dalle milze degli animali eutanasizzati e macchiati con PE-coniugato-Ab-tetrameri di OVA323-339 (A) seguirono da anticorpo AF647-CD4 e 7-AAD. Campioni sono stati quindi analizzati mediante citometria a flusso. Risultati sono espressi come trame di dot due parametri che indicano le frequenze media ± SEM del tetramero eventi positivi nel CD4+ popolazione da due animali/gruppo. I dati indicati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti (un totale di sei topi sono stati esaminati con campioni di cellule da ogni mouse valutati in triplice copia). I dati in grafici (B) sono espressi come media ± SEM di valore del numero assoluto (in un totale di 500.000 eventi) di tetramero ovuli specifici CD4 cellule di+ in da due animali/gruppo e tre esperimenti indipendenti. * P < 0,05; * * P < 0.01; P < 0,001. Immagine modificato e ristampato con il permesso da PLOS ONE12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: frequenze di cellule T rilasciando citochine in risposta a Avi-OVA rivestito BCG-immunizzazione. Splenocytes dai topi immunizzati con PBS, BCG Wild-type, superficie di BCG WT decorata con Avi-OVA, BCG-p19-OVA e BCG-p19-AviOVA sono stati stimolati con proteina ricombinante di ovuli per 16 h seguita da un trattamento di h-periodo 5 con brefeldina A.v. Cells erano poi lavato e in primo luogo macchiato con PE-Cy7 anti-CD4 (A) o anticorpi anti-CD8 di PE (B) poi AF647 l'anticorpo anti-IFN-γ. Le cellule erano quindi lavate e analizzate tramite flusso cytometry. I risultati sono espressi come dot due parametri grafici mostrare la frequenze media ± SEM di sottoinsiemi di cellule produttrici di IFN-γ in CD4+ e CD8+ popolazioni da due animali/gruppo. I dati indicati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti (un totale di sei topi sono stati esaminati con campioni di cellule da ogni mouse valutati in triplice copia). I dati in grafici (C) sono espressi come media ± numero assoluto SEM di IFN-γ rilasciando CD4+ T cellule (grafico di sinistro) o IFN-γ rilasciando CD8+ T cellule (destro grafico) da due animali/gruppo e tre esperimenti indipendenti. * P < 0,05; * * P < 0.01; P < 0,001. Immagine modificato e ristampato con il permesso da PLOS ONE12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo segnalato in questo studio un approccio non-genetica per visualizzazione rapida ed efficace delle proteine esogene sulla superficie di BCG per aggiungere gli antigeni specifici o specifiche proprietà funzionali dovuto migliorare in modo efficiente l'immunogenicità del batterio. Abbiamo dimostrato che la superficie della cellula di BCG potrebbe essere facilmente biotinilato per decorazione di superficie istantanea con proteine di fusione di avidina. La procedura totale può essere eseguita entro 2 h, mentre la trasformazione genetica e selezione dei cloni positivi richiede 2-3 mesi di ritardo. Modificazione della superficie non influenzare la sopravvivenza e la crescita batterica. I batteri decorato con antigene surrogato gli ovuli sono stati in grado di consegnare l'antigene nel pathway di presentazione dell'antigene e indotta risposta immunitaria specifica in vivo, che è stata valutata tramite analisi di citometria a flusso compreso MHC tetramero macchiatura e intracellulari di cytokine colorazione (ICS). Ancora più importante, gli studi in vivo ha mostrato chiaramente che superficie decorata batteri erano in grado di indurre simili livelli di risposta immunitaria rispetto al BCG geneticamente agli antigeni espresso simili.

Avidina biotina interazione è il più forte interazione non-covalente in natura con un Kd di 1015 M13. Non è solo un utile strumento comunemente utilizzato nella ricerca biologica14, ma anche recentemente è stato indicato per essere applicabile in cancro terapia15,16. In questo studio, una mutazione tripla (N54A, W110K e N17I) è stata applicata al selvaggio-tipo avidina per convertire tetrameric avidina in una forma di avidina monomerica che ha ridotto significativamente l'affinità di avidina-biotina (Kd= 107 M) e si lega reversibilmente alla biotina. Questo avidina monomerica è stato utilizzato per sviluppare un plasmide p17-Avi compatibile con ricombinazione Gateway clonazione (Invitrogen) per un'espressione rapida One-Step di una proteina di interesse. Questa nuova versione di avidina monomerica ha diversi vantaggi tra cui impedire grande ciuffo batterica aggregazione e transitorio e reversibile visualizzazione batterica superficiale di proteine di interesse. Pertanto, una volta ingerito dalla cellula ospite, proteine di Avi-fusione possono staccare dalla superficie dei batteri biotinilato e traffico intracellulare. Infine, le mutazioni convertono avidina in una forma non glicosilata che potrebbe essere applicabile in lievito o piante transgeniche17,18 per la produzione di grandi quantità di proteine di fusione di avidina in sistemi eucariotici. Questa forma di avidina monomerica è stato scelto invece di una versione di streptavidina monomerico (mSA)19, che ha sequenze streptavidina e di rhizavidin e aveva una maggiore affinità di legame (Kd di 109 M) rispetto al mAvidin. Con test preliminari, proteina chimera mSA dovuto un'efficienza molto bassa di associazione biotinilati batteri rispetto alla proteina chimera mAvidin. Questo studio, pertanto, è stato basato su mAvidin, ma streptavidina monomerica o altre forme di streptavidina/avidina sarebbe anche una possibilità per altre applicazioni.

Efficace attuazione dei protocolli descritti dipende la qualità della proteina di fusione generata e l'efficienza della biotinilazione superficie batterica. Proteine eluite Avi-etichetta dovrebbero essere de-salata e buffer scambiati in PBS utilizzando il concentratore di proteina di peso molecolare adeguato. Precipitazione può verificarsi a fattori di concentrazione alta per alcune proteine, pertanto, fattore di concentrazione dovrebbe essere testato e determinato utilizzando piccole quantità di proteine eluite al primo, ad esempio, 0,5-1 mL di corpo di inclusione solubilizzato diluito in 20 mL di PBS e poi concentrati. È anche importante mantenere la temperatura della proteina intorno a 4 ° C durante l'intero processo per evitare la precipitazione.

Per migliorare l'efficienza della superficie batterica biotinylation, biotina Sulfo-NHS SS deve essere conservata nel suo contenitore originale al buio a 4 ° C. Il reagente è estremamente igroscopico; di conseguenza, fiale contenenti il reagente dovrebbero essere equilibrati a temperatura ambiente prima dell'apertura. Inoltre, soluzione di riserva di biotina (10 mM) dovrebbe essere effettuata immediatamente prima dell'uso, come la frazione di NHS-estere idrolizza e diventare non reattivo molto rapidamente. Soluzione di riserva di biotina non può essere memorizzati e riutilizzati; un nuovo flacone di biotina è necessaria per ogni esperimento di biotinilazione. Per risultati ottimali, colture fresche di BCG, mezzi freschi, nonché fresco buffer sono raccomandati. Come indicato nel protocollo, biotinilato e rivestite con BCG potrebbe essere liofilizzata e conservati per almeno 30 giorni senza compromettere la qualità del rivestimento. Questo è particolarmente utile durante l'invio o trasferimento di campioni da un luogo a altro o durante gli esperimenti di lungo corso.

Questo metodo di decorazione di superficie di BCG offre anche altre interessanti possibilità per analizzare e valutare l'immunogenicità di recente sviluppato vaccini candidati in modo rapido e preciso. L'obiettivo primario di nuovi vaccini di TB è di indurre le cellule di tipo TH1 come CD4+ e CD8+ T cellule che gioca ruoli importanti nella protezione contro la tubercolosi. Il sistema avidina-biotina sviluppato in questo studio offre uno strumento molto utile per valutare le risposte di queste cellule di T. Questa nuova tecnologia di visualizzazione rapida di proteine/antigeni ricombinanti sulla superficie di BCG rappresenta un ottimo strumento per valutare rapidamente e con precisione l'efficacia protettiva di molte proteine immunogeniche (ad es., secreto specifici M.tb proteine) e così possono essere tradotte in sviluppo di efficienti vaccini.

Regolazione e variando la concentrazione delle proteine di fusione Avi sulla superficie batterica, un altro vantaggio di questo metodo potrebbe essere di visualizzare contemporaneamente diversi antigeni di interesse sulla superficie batterica per massimizzare l'efficacia del vaccino. Poiché gli studi hanno indicato che BCG interferisce con le funzioni importanti del macrofago come phagosome maturazione20,21 e antigene presentazione21, una possibilità di migliorare ulteriormente il BCG potrebbe essere decorare superficie di BCG con una combinazione di fattori noti per accelerare la maturazione del fagosoma insieme con gli antigeni di interesse.

Le limitazioni di questa tecnologia includono il requisito di produzione su larga scala di proteine ricombinanti, che potrebbe essere difficile e costoso in aree a basso reddito. Inoltre, producendo duramente per purificare proteine richiederebbe ottimizzazione e risoluzione dei problemi. Tuttavia, queste limitazioni possono essere eluse con il miglioramento delle tecnologie di produzione di proteine ricombinanti. Un'altra limitazione comprende la possibilità che naturalmente che si verificano gli anticorpi anti-avidina comuni in laboratorio animali ed esseri umani22 potrebbero ostacolare l'uso di avidina per scopi terapeutici. Tuttavia, altri laboratori hanno testato la sicurezza e l'efficacia della terapia di avidina e hanno dimostrato che di avidina sicurezza ed efficacia non sono state significativamente influenzati dal sua immunogenicità23. È interessante notare che, convertendo il selvaggio-tipo tetrameric avidina in una forma monomerica significativamente diminuita sua immunogenicità24.

Per riassumere, questa nuova tecnologia che utilizza un sistema avidina-biotina per migliorare l'immunogenicità di BCG tramite una rapida e riproducibile non-genetica batterica modificazione superficiale con le proteine di interesse può sostituire con successo tradizionale trasformazione di BCG con antigene-codifica plasmidi. Inoltre, questo metodo novello può non solo facilitare il miglioramento del vaccino BCG corrente, ma può anche fornire una nuova piattaforma per la valutazione rapida di qualsiasi potenziale antigene o proteine normalmente difficili da esprimere geneticamente in BCG, all'ampio applicazioni in sviluppo di un vaccino TB.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Dr. R Stokes per il ceppo di BCG Pasteur e r. Talal per il supporto tecnico. Ringraziamo anche GenScript per aiuto con sintesi di geni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

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References

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Espressione di antigeni esogeni nel <em>Mycobacterium bovis</em> BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina
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Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

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