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Immunology and Infection

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421

Summary

세균성 표면에 급속 한 항 원 디스플레이 대 한 새로운 기술, 표면 biotinylation 단위체 avidin와 퓨전에 관심사의 단백질에 노출에 의해 다음을 포함 하 제공 됩니다. 선택 된 항으로 BCG를 성공적으로 로드 표면 장식 전통적인 유전 접근을 대체할 수 있는 제안 그것의 immunogenicity를 향상 시킵니다.

Abstract

결핵 (TB)는 심각한 전염 성 병과 사용 가능한 백신 M. bovis 균 메 게 랭 (BCG)는 안전 하 고 효과적인 어린이 심한 결핵 수 막 염과 결핵 전파의 일부 형태에 대 한 보호 하지만 보호 하기 위해 실패 폐 결핵에 대 한 질병의 가장 일반적인 형태입니다. 현재 BCG를 개선 하기 위해 유망 전략 immunodominant M. 결핵 (Mtb)를암호화 하는 유전자와 그것의 전이 의존-특정 항 원 또는 항 원 자극 하는 것이 공동 요소를 인코딩 하는 유전자와 보완성 셀을 제시. 이러한 접근을 주요 한계는 낮은 효율, 낮은 안정성, 그리고 불확 실한 식 벡터의 안전 수준을 포함합니다. 이 연구에서 우리는 백신 개선, BCG 보완성의 해당 유전자를 인코딩 하는 플라스 미드와 변환 보다는 박테리아의 표면에 대 한 관심의 외 인 단백질로 구성 된 다른 접근 방법 제시. 첫째, 관심사의 단백질은 표현 융합 표준 대장균 에서 단위체 avidin 식 시스템 biotinylated BCG의 표면을 장식 하는 데 사용 하는 고. 동물 실험 꾸며져 대리 ovalbumin 항 BCG 표면을 사용 하 여 수정 된 박테리아는 완벽 하 게 면역성 및 특정 T 세포 응답을 유도 할 수 보여줍니다. 모두, 여기에 강력 하 게 제시 하는 데이터 외 인 핵 산 보완성의 힘 드는 전통적인 접근 방식을 대체 현재 BCG 백신을 재편에 대 한 소설과 효율적인 방법을 지원 합니다.

Introduction

대체 현재 결핵 백신 BCG, 유전자 소개 하도 단백질 보조 시스템, 바이러스 벡터화 기술, 감쇠 라이브 M.tb 긴장, 및 유전자 변형된 BCG 긴장을 포함 한 다양 한 전략 제안 -감염1 또는 Mtb동안 충분히 표현 되지 않는다 BCG 항 원 표현-특정 항 BCG2에 존재 하지. 그러나 유전 공학,, 안전, 시간이 많이 걸리는 프로세스 및 식 벡터4,5의 낮은 효율의 불확 실한 수준을 포함 하는 많은 방 벽을 직면 한다. BCG를 개선에 관해서는 대체 접근 불확 실한 유전 교대에 대 한 필요 없이 immunogenicity를 개선 하기 위해 필요 합니다.

이 연구에서 biotin과 잘 알려진 높은 선호도 avidin 상호 작용을 기반으로 하는 BCG 세포 표면에 대 한 관심의 재조합 단백질의 디스플레이 대 한 새로운 전략을 소개 합니다. 이 접근 방식은 biotinylated BCG, 그것의 우수한 안전 하면서 효능의 최대한 향상을 달성 하기 위해 BCG의 광범위 한 조작을 용이 하 게 표면에 재조합 avidin 융해 단백질의 신속 하 고 재현할 수 첨부 파일 수 기록, 사용의 수 십년 동안 관찰 합니다.

Avidin 비타민 b 복합체에 대 한 선호도 매우 높은 (Kd = 10−15 M) 고 형성, 면 avidin 비타민 b 복합체 복합물은 매우 안정 조건6을 변성 시키기에서 중단 될 수 있습니다. 그러나, 유전자 전송 방법 대안 역할을 상호 작용의이 유형에 대 한 재조합 단백질의 장기 하지만 되돌릴 수 표시가 됩니다. 따라서, 우리는 여기 낮은 선호도 단위체 avidin 도입 (Kd = 10−7 M) 표면에서 단백질의 가역 릴리스 리드 BCG 항 원 제시 세포 안에 섭취 한 번 장식. 개념의 증거를 제공 하기 위해 ovalbumin (OVA)7,8에서 파생 된 대리 항 원에 해당 하는 단위체 avidin 공상 단백질을 사용 하 여이 방법을 테스트 했습니다. 결과 BCG 세포 표면 장식 하실 수 있습니다 쉽고 빠르게 단위체 avidin 융합 단백질 및이 바인딩 BCG 표면에는 안정 되 고 세균성 성장 및 생존에 감지 변경 없이 재현할 수 나타났다. 또한, 우리가 발견 BCG OVA (AviOVA)와 융합 하는 단위체 avidin 장식 BCG에 의해 유도 된 저것과 유사한 면역 반응을 일으킬 수 있다 유전으로 동일한 항 원 표현 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. 이 기술은 세균성 표면에 관심사의 단백질의 가역 디스플레이의 따라서 전통적인 유전자 전송 접근법의 효과적인 보충 이며 BCG의 광범위 한 조작 및 백신에 추가 응용 프로그램을 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 개발입니다.

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Protocol

모든 동물 동물 관리 및 사용 위원회 브리티시 컬럼비아의 대학에 의해 찬성 하는 프로토콜에 따라 유지 되었다. 실험 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었고 캐나다 위원회 동물 관리 지침에 따라 수행. 동물 보증 복지 수는 A11-0247.

1. 플라스 미드를 표현 하는 단위체 Avidin 융해 단백질의 생성

  1. 하위 단위체 avidin 시퀀스12 133에 해당 하는 "CTC"와 "GAA" 사이트 사이 pDEST17 플라스 미드로 복제-134bp. (, 6-histag와 pDEST17 Attr1 재결합 사이트 사이) p17-Avi를.
    참고: 단위체 avidin DNA 순서는 다음과 같습니다. 단위체 avidin를 야생-타입 Avidin에 도입 된 3 개의 돌연변이 굵게 문자에서 표시 됩니다.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt가
  2. At & tb 1과 b 2를 at & t사이트에 해당 OVA polypeptide757-1035 하 형벌 뇌관 디자인 (-Ab-와 H-2_Kb-epitopes를 제한) DNA 순서. 뇌관 순서는: Attb1-OVA
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT와 at & tb 2-OVA
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC입니다. (At & tb 1과 b2 시퀀스를 at & t는 굵게 표시)입니다.
    1. PCR 증폭 OVA polypeptide757-1035 DNA 시퀀스를 템플릿으로 pUC57 OVA 플라스 미드를 사용 하 여 뇌관으로.
    2. 사이트별 생체 외에서 재결합 반응 (예를 들어, BP Clonase) pDONR-OVA를 통해 pDONR-221에 PCR 제품을 복제.
  3. P17-Avi p17-Avi-OVA를 LR Clonase 반응 사용에 관심사의 유전자를 전송 합니다.
    참고: 혈압 및 LR 재조합 복제의 내용은 제조업체의 설명서 참조.

2. 단위체 Avidin 퓨전 단백질 표정, 정화, 및 Refolding

  1. P17-Avi-OVA 플라스 미드를 대장균 BL21 변환 및 대장균 BL21 문화 IPTG (0.1 m M)를 37 ° c.에 3 h의 250 mL를 유도
  2. 포함 시체 가용 화 및 박테리아의 lysis
    1. 원심 분리 g x 4000와 4 ° c.의 30 분 유도 BL21 문화의 250 mL 작은
    2. 세포의 용 해 버퍼의 10 mL에 알 약을 수집 (50 m Tris HCL, 150 m NaCl, m 6 m M Guanidine-HCL, pH 1.5-2.5)와 95 ° c.에 15 분 동안 품 어 회전자에 실 온에서 하룻밤를 품 어.
    3. 30 분 x g와 4 ° C와 수집 상쾌한 15000 원심
  3. Avi-OVA에서 상쾌한 (포함 시체 Solubilized 분수) Ni NTA 열을 사용 하 여 정화.
    1. 세포의 용 해 버퍼 포함 시체 1:2 희석.
    2. Ni NTA 수 지 문화 파생 포함 시체의 250 mL 당 4 mL를 사용 합니다.
    3. 3 배 (pH 7.0) 세포의 용 해 버퍼의 10 mL와 함께 씻으십시오.
    4. 차입 버퍼 (세포의 용 해 버퍼 pH 7.0 250mm 이미와) 10 mL와 함께 elute.
  4. 점진적으로 희석 (1:10)에 의해 eluted 단백질 refold Tris 버퍼 (pH 7.5)에 급속 한 vortexing 포함 1mm DTT, 200 m m NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 m 트윈 80 m, 500mm 아르기닌, 그리고 200 m m NaCl 실 온에서 30 분.
  5. 드 소금과 버퍼 교환 제조 업체의 프로토콜에 따라 단백질 집중으로 PBS에 Tris 버퍼에서 단백질을 refolded.
  6. 3500 x g 와 4 ° C에서 30 분 동안 원심 분리 하 여 집계를 제거 하 고-20 ° c.에 녹는 단백질의 aliquots를 저장

3입니다. BCG 세포 표면 Biotinylation

  1. 미들 7 H에에서 BCG 성장 9 국물 10 %OADC (올레산, 알 부 민 및 포도 당 솔루션) 및 0.05% 트윈 80 세까지 50 rpm에서 통 플랫폼에서 37 ° C에서 0.5-1 =.
    참고: BCG biosafety 수준 2 병원 체 이며 모든 실험에 관한 BCG biosafety 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛에서 이루어져야 한다.
  2. 500 µ L의 얼음도 무료 PBS 플러스 0.1 %Tween80 (PBST) (pH 8.0)와 109 BCG 3 번 세척. 메 마른 내 무료 PBS에 BCG 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  3. 즉시 사용 하기 전에 살 균 필터링 된 물에 10 m m Sulfo NHS SS biotin의 1 mL를 준비 합니다.
    1. 30 분 동안 실내 온도에 Sulfo NHS SS biotin의 0.5 m m의 1 mL와 함께 박테리아를 품 어.
  4. 3 번 비 반응 biotinylation 시 약을 제거 하 아이스 콜드 PBST의 500 µ L로 레이블이 지정 된 박테리아를 씻으십시오.
    1. 다시 PBST의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  5. Biotinylation 효율성 평가, 20 분 동안 실 온에서 108 biotinylated Streptavidin FITC (1: 100, 25 µ L)으로 BCG를 얼룩.
    1. 2%의 1 mL에 얼룩진된 박테리아를 품 어 실 온에서 20 분 동안 PFA와 교류 cytometry 분석에 의해 biotinylation의 레벨을 검사 하 여 다음.

4. Biotinylated Mycobacteria의 표현 형: 성장 및 생존

  1. 미들 7 H에에서 BCG 긴장 성장 9 국물 10 %OADC (올레산, 알 부 민 및 포도 당 솔루션) 및 0.05% 트윈 80 50 rpm에서 통 플랫폼에서 37 ° C에서.
    1. 8 일 동안 세균성 문화의 광학 밀도 (OD600)를 기록 합니다.
  2. 대 식 세포에 박테리아의 생존을 감지 하 BCG-뤽 (앞에서 설명한9)를 사용 합니다.
    1. Biotinylated BCG-루크 (나 10:1)와 RAW264.7 세포를 감염 또는 BCG-뤽 (제어) 치료 및 48 h 동안 37 ° C에서 incubated 기간.
    2. 셀 monolayers 세척 하 고 0.025 %SDS 섭취 박테리아를 출시와 함께 다음 lyse.
    3. 생물 발광 Luciferase 분석 결과 시스템 루미 노 생산을 측정 합니다.
      참고: 발광 신호는 세균 생존 능력의 지표 이다. Luciferase 분석 결과의 내용은 제조업체의 설명서를 참조 하십시오.

5. Biotinylated BCG 표면에 단위체 Avidin-퓨전 단백질 바인딩

  1. Avi-단백질 (PBS-T의 최종 10 μ g/mL) 5 x 108 biotinylated BCG 통 플랫폼에 실 온에서 1 h에 대 한 믹스.
  2. 아이스 콜드 PBST와 얼룩 토끼 방지 avidin 항 체 (Ab) (1: 100 희석, 앞에서 설명한10) 실 온에서 20 분 및 다음 FITC 500 µ L로 3 번 세척 박테리아 염소-토끼 IgG Ab는 동일한 조건에서 활용.
  3. 3 번과 PBST의 500 µ L 세균을 세척 하 고 cytometry 표면 장식의 정도 평가 하 여 분석.

6입니다. Mycobacteria의 동결

  1. Biotinylate 박테리아 단계 3.1-3.4와 코트 biotinylated 박테리아에 따라 Avi OVA와 단계 5.1에 따라.
  2. Aliquot biotinylated 및 코팅된 박테리아 (108), PBS로 세척 하 고 다시 0.5 mL 동결은 미디어에서 일시 중지 (25 %Sauton 매체, 75% H2O, 그리고 1.5% 나 조미료).
  3. 유리 튜브에 박테리아를 전송 하 고 하룻밤-80 ° C 냉동 고에서 얼어.
  4. 동결 건조 기를 사용 하 여 24 시간 냉동된 채워진된 유리 튜브 lyophilize
  5. 실 온에서 말린된 견본을 저장 하 고 필요할 때 PBS에서 다시 구성.
  6. 3.5 biotinylation 및 표면 코팅 안정성 평가를 단계를 반복 합니다.

7. 먹어서 분석 결과

  1. 70-80 %confluency 10 cm 직경 문화 요리 DMEM 매체 포함 5 %FCS, 1%의 L-글루타민, HEPES, 비필수 아미노산, 그리고 페니실린과 스에에서 RAW 264.7 대 식 세포 세포를 성장 한다.
  2. 6 잘 플레이트에서 2 x 106 RAW 264.7 대 식 세포 세포 씨앗 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 준수를 셀 수 있습니다.
  3. DsRed BCG 생성 단계 3.1-3.4 및 5.1 Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) 장식 (앞에서 설명한9).
  4. DsRed BCG-Avi-OVA 또는 치료 DsRed BCG 나 37 ° c.에 24 h에 대 한 20: 1에서 원시 세포를 감염
  5. 셀 세 번 세척 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 부분적으로 분리 된 박테리아를 제거 하 0.25 %trypsin 1 mL를 사용 하 여 trypsinize.
  6. 2.5%에서 수정 PFA 실 온에서 20 분에 대 한 PBS에.
  7. PBS로 3 회 세척 하 고 cytometry 분석.

8. 대 식 세포에 BCG Biotinylated 장식의 OVA 세포내 매매

  1. 형광 현미경 검사 법
    1. Coverslips 24-잘 접시에서에 3 x 105 RAW 264.7 대 식 세포 세포 씨앗 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 준수를 셀 수 있습니다.
    2. 유지 보수 미디어에서 37 ° C, 5% CO2 4 ~ 24 h에 대 한 항생제 없이 mycobacteria (나 10:1)와 대 식 세포 세포를 감염.
    3. 세포를 세척 하 고 단계 7.5로 표면 부착, 비 섭취 박테리아를 제거 하는 trypsinize.
    4. 2.5%에서 감염 수정 셀 PFA 실 온에서 20 분에 대 한 PBS에 PBS 가진 3 세척 옵니다.
    5. 차단/permeabilization 버퍼에 세포를 permeabilize (0.1% 트라이 톤 X-100, PBS에 3 %BSA) 실 온에서 20 분.
      1. 관심의 사용 하 여 특정 항 체 (, 안티 avidin Ab 토끼) permeabilization에서 10 μ g/mL에서 실 온에서 20 분에 대 한 버퍼 다음 이차 항 체 (예를 들어, FITC 염소-토끼 IgG) 20 분.
    6. 워시 번와 물, 형광 photobleaching를 최소화 하기 위해 수성 장착 매체의 10 μ에 슬라이드에 PBS 가진 3 배 세포.
    7. 슬라이드 63 x를 갖춘 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 디지털 confocal 현미경 검사 법으로 검사 / 1.4 계획 Apochromat 목표. 디지털 카메라를 사용 하 여 이미지를 기록 현미경 소프트웨어를 결합.
  2. Immunogold 얼룩 및 전자 현미경 검사 법
    1. 6 잘 플레이트에서 2 x 106 RAW 264.7 대 식 세포 세포 씨앗
    2. 4%로 BCG 감염 세포 수정 PFA 실 온에서 4 시간.
    3. PBS와 두 번 씻는 다.
    4. 4% 낮은 융 점 agarose에서 샘플을 포함 하 고 70% 에탄올에서 탈수.
    5. 아크릴 수 지에 샘플을 전송 하 고 50 ° c.에 유해
    6. 톰으로 60 nm 섹션을 잘라내어 니켈 격자에 섹션을 수집.
    7. 1 시간 실 온에서 또는 부 화 솔루션 (PBS와 0.1 %BSA) 4 ° C 하룻밤에 10 μ g/mL avidin 항 체와 고 부 화 솔루션 금 활용 된 F(ab')2 매우 작은 염소-안티-토끼의 다음 세척 실에서 1 시간 (1/20) IgG 부 화 솔루션에 온도입니다.
    8. 섹션 증류수에 세척, 2%도 얼룩, 다시, 건조, 공기 세척 및 전자 현미경으로 검사.

9. 동물 면역 및 장기 처리

참고: 모든 단계는 biosafety 내각에서 행해져야 한다.

  1. 패스 biotinylated 및 단백질 코팅 박테리아 271/2G 바늘을 통해 10 번 단일 세포 현 탁 액을 만들기 위해.
  2. 1 x 106 박테리아도 무료 PBS의 100 μ에 고는 여성 C57BL/6 쥐 (-Ab, H-2 Kb, 5-6 주 이전) 목에의 아저씨 피하에 면역.
    1. 혼자 PBS의 100 μ와 통제 쥐를 주사.
  3. 뒤에 자 궁 경부 전위 공동2 흡입에 의해 면역된 쥐 20 일 사후 예방 접종을 안락사.
    1. 비장을 분리 하 고 RPMI 미디어로 전송 합니다.
  4. 5 mL 주사기 플런저와 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 비장을 매쉬.
    1. RPMI의 5 mL로 씻으십시오. 원심 분리기 (800 x g, 3 분) 단일 세포 현 탁 액을
    2. Biotin-Ter119/Erythroid 셀 Ab 마우스 biotin 긍정적인 선택 장비로 RBC 고갈 합니다.
    3. 완전 한 RPMI (FCS가 10%, 1 %L-글루타민, 1% 페니실린, 1% 스, 및 50 μ M 2-ME) 10 mL에 원심 분리기와 다시 중단 셀.

10. 난-Ab tetramer 항 원 특정 CD4 주파수+ T 세포 및 결정 주파수의 항 원 특정 T 세포 방출 Cytokines 예방 접종 동물에서을 얼룩이 지는 세포내 Cytokine 확인 얼룩

  1. Tetramer 얼룩
    1. 제어 및 PE 활용-Ab면역된 생쥐 (~ 20 x 106 셀)에서 splenocytes 얼룩-OVA323-339 tetramers (1/12.5 희석) 바인딩 버퍼 (PBS FCS 2%와 0.1% 할머니3)에서 37 ° C에서 1 시간.
    2. 실 온에서 20 분 동안 splenocytes를 AF647 CD4 Ab (1:25)와 7-AAD (죽은 세포를 감지)를 추가 합니다.
    3. Cytometry에 의해 샘플을 분석 합니다.
    4. 500000 이벤트 tetramer 포지티브 이벤트의 빈도 결정 하는 CD4 긍정적인 지역에서 획득.
      참고: 총 splenocytes로 정의 됩니다 SSC/FSC 점 오에 의해 7 AAD 긍정적인 이벤트의 배제에 의해 라이브 세포와 CD4 하위 집합 게이팅 AF647 긍정적인 이벤트.
  2. 발표 T 세포는 항 원 특정 세포내 Cytokine의 주파수
    1. 6 잘 플레이트 또는 재조합 OVA 없이 완전 한 RPMI 매체의 4 mL로 나누며 약 1 × 107 splenocytes (10 µ g/mL)와 16 h에 대 한 품 어.
    2. Brefeldin A (1:1, 000)는 추가 5 h에 대 한 셀을 취급 합니다.
    3. 다음과 같이 얼룩이 지는 세포내 cytokine 및 PBS로 세척:
      1. 30 분 동안 실내 온도에 PE CD8 또는 PE-Cy7-CD4 Ab (바인딩 버퍼에 1:50) 셀 샘플을 얼룩.
      2. 4%에서 수정 PFA 20 분 동안 실내 온도에.
      3. Permeabilize permeabilization 솔루션을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라.
      4. 실 온에서 AF647 활용 IFN-γ Ab (1:50) 20 분에 대 한 레이블을 셀 씻으십시오.
      5. 세포를 세척 하 고 위에서 설명한 대로 흐름 cytometry 분석 대상.

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Representative Results

위에서 설명한 일반 절차, BCG 표면 biotinylation와 대리 항 OVA와 장식의 타당성 시험 했다. 수정된 BCG의 immunogenicity 당시 에 비보를 테스트. 세균성 표면 biotin avidin 공상 항 세균성 고기에 감지 변경 없이 빠른 디스플레이와 쉽게 분류 됐다. 결과 수정된 BCG 항 프레 젠 테이 션 세포에 의해 효율적으로 섭취 하 고 쥐에 OVA-특정 면역 반응을 일으킬 수 있다.

단위체 avidin 퓨전 플라스 미드 및 단백질의 생성
한 식 플라스 미드 p17-Avi 단위체 avidin 융해 단백질을 생산 하는 데 사용할 게이트웨이 방법론과 호환 되도록 생성 되었습니다. OVA는 p17-Avi로 복제 및 대장균, 표현 순화 그리고 refolded (그림 1) 위에서 설명한 대로.

Biotin 세균성 표면에 효율적으로 연결 하 고 세균성 성장 또는 생존에는 영향을 미치지 않습니다.
박테리아는 다양 한 농도 함께 표시 했다 (0-1 m m) biotin의 스테인드 위의 프로토콜에 따라 표면 biotinylation의 효율성을 검토 하 고. 교류 cytometry 분석 0.5 m m biotin (그림 2)와 함께 표시 하는 박테리아에 형광 히스토그램의 총 변화 그리고이 농도 biotinylated 박테리아를 생성 하기 위해이 연구를 통해 사용 되었다. 다음, 우리 세균 표현 형에 세균성 표면 처리의 효과 검사 하 고 biotinylated 및 제어 치료 발견 BCG (그림 3A)는 8 일 동안 비슷한 성장 프로필 표시. BCG luciferase (BCG-뤽)9 표현 세균 생존 세포에서 검사 하 사용 되었다. 발광 신호 지표 세균 생존 능력의 이상 48 h. 얻은 결과 기록 했다 (그림 3B) biotinylated 및 제어 박테리아 사이 점차적인 생존 능력 감소의 유사한 프로필을 보여주었다. 결론적으로, 이러한 데이터는 명확 하 게 그 세균 표면 biotinylation 영향을 주지 않습니다 세균성 성장 또는 생존 세포, 안으로 중요 하다 때문에 세포에서 증가 생존 세균 독성의 증가 의미 수 나타냅니다.

세균성 표면 장식의 효율
Biotinylated 박테리아는 위의 프로토콜에 따라 단위체 avidin와 퓨전에서 OVA 항 원 펩 티 드로 코팅 했다. 흐름 cytometry 분석 OVA의 최소 수준을 보여주었다 비 biotinylated 박테리아에 바인딩 (MFI 8.31 ± 0.42, 그림 4A, 상단 패널 =) OVA의 상당한 수준에 바인딩하여 biotinylated 박테리아 (MFI 54.67 ± 4.98 =) 제어 박테리아에 비해 (MFI 5.92 ± = 0.22, 그림 4A, 낮은 패널).

BCG 표면 장식의 안정성
기존의 라이브 BCG 백신 말린된 분말으로 공식화 된다, 이후이 연구 기간 동안 발생 한 중요 한 질문 수정된 BCG 후 동결, 재구성, 및 저장에 냉장 이나 실 온의 안정성을 했다. 따라서, 우리는 Avi-OVA에서 동결 건조 된 BCG Avi-OVA (표면 장식 Avi OVA)의 표면 표시를 검사 하 고 갓 장식 세균성 준비. 결과 (그림 4B) 보였다 수준 Avi-OVA의 세균성 표면에 동결 및 신선한 BCG Avi-OVA 준비 입증에 비해 실내 온도에 저장 후 안정적이 고 감지 1 개월 남아는 표면 장식 메서드는 백신 개발에 적합 합니다.

대 식 세포 표현 형 세균성 표면 장식의 영향을 받지 않습니다.
이 표면 장식 방법론 호스트 세포로 세균성 항목 방해 여부를 보고, 우리 사용 RAW264.7 세포와 DsRed 박테리아9 위의 프로토콜에 설명 된 먹어서 분석 결과. 그림 4C 세균성 표면 장식 BCG 보였다 세균 항목 (22.5 ± 1.57%) BCG의 표면 장식 대 식 세포에는 영향을 주지 않습니다에 나타내는 uncoated 야생 타입 BCG (24.47 ± 1.18%)에 비해 크게 간섭 하지 않은 표현 형입니다.

Avidin 융해 단백질 침 여행과 공동 MHC 분자와 지역화
Avi-OVA-장식 BCG의 운명을 세포 내에서 검사, 부착 원시 세포 감염 되었고 위의 프로토콜에 설명 된 대로 형광 현미경 검사 법, 검사. 이미지 (그림 5A)를 얻은 Avi OVA가 뿐만 아니라 세균성 표면에 또한 분리 및 translocated 먼 세포질 박테리아를 보여주었다. 추가로이 결과 확인, 우리는 immunogold 얼룩 실험 수행 하 고 얻은 이미지 명확 하 게 보여주었다 Avi OVA 항만 BCG 표면에 존재 하지 않습니다 하지만 또한 BCG 표면에서 분리 수 있습니다 교차 하는 phagosomal 막 여행 향해 cytosol (그림 5B). Avi-OVA 장식 박테리아 항 원 발표 통로에 그들의 표면 단백질 화물을 운반할 수 있었다는 검사 추가, 대 식 세포는 프로토콜에 설명 된 대로 Avi OVA BCG 감염 되었고 confocal 분석을 복종. 결과 (그림 6A)-A 분자로, avidin 융해 단백질 분리 및 항 원 프레 젠 테이 션 구획 그들이 II MHC 분자에 로드 translocated 제안 Avi OVA의 colocalization는 보여주었다. 또한 Avi OVA 펩 티 드와 공동 localizes 보여준 결과 종류 I 분자 BCG phagosomes H-2_kb (그림 6B), CD8 Avi OVA 항 원의 잠재적인 프레 젠 테이 션이 증명에 대 한 얼룩 때 내 여+ T 세포는 대 식 세포입니다. 이러한 데이터를 나타내는 표면 장식 일단 박테리아 입력 대 식 세포, 항 원 항 원 발표 통로 쪽으로 트래픽을 수 있습니다.

표면 장식된 박테리아는 완전히 면역성
표면 장식된 BCG 유도 하는 특정 면역 응답에 비보 C57BL/6 마우스의 가능 여부 검사를 PBS 혼자 (제어), 야생-타입 BCG 접종 했다, Avi-OVA 장식 BCG, 그리고 유전자를 플라스 미드와 변형 BCG 표현 하는 유사한 OVA 항 원입니다. 면역된 생쥐 희생된 20 일 후 되었고 OVA 전용 CD4의 주파수+ T 세포와 OVA 전용 T 세포 cytokines를 풀어 검색 프로토콜에 따라. 결과 (그림 7A-B) OVA 전용 CD4의 더 큰 비율을 보여주었다+동물 Avi-OVA 유전자 BCG WT. BCG에 비해 코팅 BCG 접종에 T 세포 응답 BCG에 유사한 면역 반응을 보였다 OVA를 표현 하도록 수정 Avi-OVA (그림 7). 이러한 데이터 보여주었다 세균성 표면 장식 메서드 수 항 원의 중요 한 확장을 유도 하는 특정 CD4+ T 세포 및 T 세포 응답 유도의 정도 BCG 유전으로 유사한 OVA를 표현 하기 위해 설계 항 원입니다.

세포내 cytokines 또한 항 원 특정 한 T 세포 응답의 중요 한 지표 이기 때문에, (ICS) 실험을 얼룩이 지는 세포내 cytokines 더 표현과의 주파수를 결정 하 여 T 세포 면역 반응을 평가 하기 위해 실시 했다 동물 접종 OVA 장식 박테리아와 플라스 미드를 표현 하는 OVA와 유전자 변형 박테리아에서에서 이펙터 cytokines. 우리는 IFN-γ 방출, 세포내 박테리아11에 대 한 보호 반응의 알려진 지표의 수준 검사. 우리 우리는 OVA 전용 IFN-γ의 유사한 수준을 감지할 수 시연 OVA (BCG-Avi-OVA와 BCG-p19-Avi-OVA) 동물 박테리아 접종에 비해 장식 박테리아 표면 접종 동물에+ 세포 CD4 발표 OVA (BCG-p19-OVA) (그림 8A)을 표현 하는 유전자. 중요 한 것은, 우리는 또한 IFN-γ의 훨씬 더 높은 주파수를 감지 하 수 접종 BCG-Avi-OVA 동물 유전자 OVA (그림 8B-C)을 표현 하는 BCG 접종에 비해 동물에+ T 세포 CD8 생산 는 biotin avidin 항 방법론의 표면 표시 중재 보여줍니다 핵 산으로 BCG 변환 효과적으로 바꿀 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: avidin 융합 단백질의 생산에 대 한 플라스 미드를 클로닝 하는 재결합의 건설. (A) 유전자 세그먼트 단위체 avidin에 대 한 인코딩 금지 사이트 NdeI 및 노트와 함께 합성 되었고 6 x 히스티딘 사이의 게이트웨이 카세트 p17-Avi 플라스 미드를 생성 하는 pDEST17에 subcloned. OVA 펩 티 드252-345 DNA attB 사이트와 종료 시퀀스 pDONR221으로 복제 했다. 그 후, OVA 유전자 p17-Avi로 subcloned 했다. 이미지 편집 및 PLOS 하나12에서 허가로 증 쇄 하는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: BCG biotinylation의 효율. BCG는 NHS-SS-biotin FITC streptavidin 다음 표시 및 cytometry에 의해 분석, 실내 온도에 30 분의 다양 한 농도와 biotinylated 했다. 결과 녹색 형광 강도의 히스토그램으로 표시 됩니다 하 고 삽입 그래프 의미 형광 강도 (MFI) 3 독립적인 실험에서 공제의 평균 ± SEM을 나타냅니다. * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001. 이미지 편집 및 PLOS 하나12에서 허가로 증 쇄 하는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: BCG의 Biotinylation 성장 또는 그것의 생존은 대 식 세포에 영향을 주지 않았다. (A) 비오-BCG와 레이블 없음 야생-타입 BCG 컨트롤에서에서 성장 했다 완전 한 7 H 9 미디어 및 복제는 8 일 기간 동안 모니터링 했습니다. 결과 성장 곡선, , 600에서 흡 광도 의미 표현 3 독립적인 실험에서 시간 ± SEM의 기능으로 nm. (B) 세포 비오 BCG 뤽 감염 되었습니다 하거나 표시 된 기간, 그리고 세포 lysates 했다 준비 하 고 실행 가능한 박테리아를 검출 하기 위하여 생물 발광에 대 한 분석에 대 한 레이블이 BCG-루크를 제어. 결과 의미 상대 빛 단위 3 독립적인 실험에서 (RLU) ± SEM으로 표현 됩니다. 이미지 편집 및 PLOS 하나12에서 허가로 증 쇄 하는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: Avi OVA 비오 BCG와 그것의 안정성을. (A) 비오-dsRed-BCG (빨간색 형광을 표현 하는 박테리아 앞서 설명한9)와 관리 비 biotinylated dsRed-BCG 혼합 했다 1 시간 그리고 OVA의 범위에 대 한 실 온에서 Avi-OVA와 바인딩와 표면 얼룩에 의해 평가 되었다 토끼 반 avidin 항 체와 FITC 염소-토끼 IgG (FL1) 샘플 세척 되었고 cytometry에 의해 분석. 결과 녹색 형광 강도의 히스토그램으로 표시 하 고 값은 평균 ± SEM의 MFI의 비오-BCG-AviOVA 바인딩 3 개의 독립적인 실험에서 얻은. (B) 동결 건조 된 비오-BCG Avi OVA로 코팅 하 고 갓 만든 Avi-OVA-비오-BCG 분류 되었고 a. 에 설명 된 대로 cytometry에 의해 분석 데이터 표시, 3 개의 독립적인 실험의 대표 이며 값은 평균 ± SEM의 MFI의 Avi-OVA-비오-BCG 바인딩 3 개의 독립적인 실험에서 얻은. (C) 원시 세포는 37 ° c.에 24 h에 대 한 DsRed BCG-Avi-OOVA 또는 DsRed-BCG 감염 했다 샘플은 세척, 트립 신으로 처리, 고정, 그리고 FACS에 의해 분석. 결과 식 균 작용의 정도 반영 하는 빨간색 형광 히스토그램으로 표시 됩니다. 값은 3 개의 독립적인 실험에서 얻은 BCG를 섭취 하는 세포의 평균 비율 ±를 SEM을 나타냅니다. 이미지 편집 및 PLOS 하나12에서 허가로 증 쇄 하는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: Avi OVA BCG 표면에서 분리 하 고 건너는 cytosol 향해 phagosomal 막. (A) 덮개 미 끄 러 짐에 점착 원시 셀 OVA 장식 dsRed-BCG 37 ° C에서 24 h에 대 한 감염 다음 고정 permeabilized 그리고 토끼 방지 avidin 항 체와 FITC 염소-토끼 IgG 스테인드. 샘플은 슬라이드를 현미경에 장착 되었고 디지털 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석. 빨간 신호 BCG의 위치 나타내고 녹색 신호 반영 Avi OVA의 지역화 합니다. 점선 macrophage 셀 경계와 패널은 왼쪽된 패널에 표시 된 삽입의 4 배 확대 오른쪽 아래를 나타냅니다. BCG-AviOVA 감염 원시 셀 (B) 얇은 섹션 했다 paraformaldehyde 고정 알을 품을 순차적으로 안티 avidin 항 체와 금 활용 된 염소-토끼 IgG Avi OVA를 시각화 하 고 전자 현미경으로 검사. 12000 X의 배율 표시 됩니다. 화살촉은 Avi OVA BCG 표면에서 해리와 phagosome 막 넘어 수출을 나타냅니다. 표시 된 이미지는 두 개의 독립적인 실험의 대표자. 이미지 편집 및 PLOS 하나12에서 허가로 증 쇄 하는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: Avidin-퓨전 항 원 MHC와 공동 화 된 클래스 II 및 종류 I 분자. 부착 BMA3.1A7 셀, 마우스 대 식 세포 세포 라인 했다 감염 된 OVA 4 h GFP BCG (녹색 형광, 앞에서 설명한9표현) 장식 그리고 24 h. 위해 IFN-γ와 다음 자극 세포 했다 고정/permeabilized로 얼룩진 토끼 반 avidin 항 체, 알 렉 사 594-토끼 IgG 및 중 알 렉 사 647 쥐 반대로 마우스-A (A) 또는 알 렉 사 647 쥐 반대로 마우스 H-2_kb (B). 샘플은 슬라이드를 현미경에 장착 되었고 디지털 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석. 빨간 신호 반영 Avi OVA의 지역화 및 녹색 신호 BCG GFP의 위치를 나타냅니다. 파란 신호 또는 종류 I 분자 MHC 종류 II의 위치를 나타냅니다. 점선의 관심 영역을 나타냅니다. 화살촉에는 MHC 분자와 Avi-OVA colocalization을 나타냅니다. 표시 된 이미지는 두 개의 독립적인 실험의 대표자. 이미지 편집 및 PLOS 하나12에서 허가로 증 쇄 하는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: vivo에서 CD4+ OVA 장식 BCG에 대 한 T 세포 응답. C57BL/6 마우스 OVA, 수정 되지 않은 BCG 야생-타입, PBS (제어), BCG OVA (BCG-p19-OVA)을 표현 하기 위해 유전자 변형으로 장식 하는 BCG 표면 피하 주사 또는 제어로 변환 Avi-OVA (플라스 미드와 표면 장식 BCG-p19-AviOVA). 20 일 기간 후 splenocytes 했다 안락사 동물의 spleens에서 준비 하 고 PE 활용-Ab스테인드-OVA323-339 tetramers (A) AF647-CD4 항 체와 7-AAD 옵니다. 샘플 다음 cytometry에 의해 분석 되었다. 결과 CD4 tetramer의 평균 주파수 ± SEM 긍정적인 이벤트를 표시 하는 두 매개 변수 점 플롯으로 표현 된다+ 두 동물/그룹에서 인구. 표시 된 데이터는 3 개의 독립적인 실험 (6 쥐의 총 3 중에서 평가 된 각 마우스에서 셀 샘플 조사 했다)의 대표. OVA tetramer (500000 이벤트의 총)에서 절대 수의 값 ± SEM을 의미 (B) 그래프에 데이터 표시 됩니다 특정 CD4+ 두 동물/그룹 및 3 개의 독립적인 실험에서 세포. * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001. 이미지 편집 및 PLOS 하나12에서 허가로 증 쇄 하는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: Avi OVA에 대 한 응답에서 cytokines를 풀어 T 세포의 주파수 코팅 BCG 접종. PBS, BCG 야생-타입, BCG WT 표면 장식 Avi OVA, BCG-p19-OVA와 BCG-p19-AviOVA를 가진 면역된 생쥐에서 Splenocytes 16 h Brefeldin A. 셀 5 h 기간 치료를 선행 했다 재조합 OVA 단백질으로 자극 후 세척 하 고 먼저 PE Cy7 안티-CD4 (A) 또는 PE 안티 CD8 항 체 (B) AF647 안티-IFN-γ 항 체와 스테인드. 셀 씻어 그리고 cytometry에 의해 분석 되었다. 결과 2-매개 변수 점 CD4 IFN-γ 생산 셀 하위 집합의 평균 주파수 ± SEM 표시 플롯으로 표현 된다+ 와 CD8+ 두 동물/그룹에서 인구. 표시 된 데이터는 3 개의 독립적인 실험 (6 쥐의 총 3 중에서 평가 된 각 마우스에서 셀 샘플 조사 했다)의 대표. 그래프 (C) 데이터는 IFN-γ의 절대 숫자 ± SEM의 뜻으로 표현 CD4 발표+ T 세포 (왼쪽된 그래프) 또는 IFN-γ 방출 CD8+ T 세포 (오른쪽 그래프)을 두 동물/그룹 및 3 개의 독립적인 실험에서. * P < 0.05; * * P < 0.01; P < 0.001. 이미지 편집 및 PLOS 하나12에서 허가로 증 쇄 하는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

우리 보고이 연구에서 외 인 단백질의 신속 하 고 효과적인 디스플레이 위한 비 유전 접근 특정 항 원 또는 효율적으로 박테리아의 immunogenicity를 향상 시킬 것으로 예상 하는 특정 기능 속성을 추가 하려면 BCG 표면에. 우리는 BCG 세포 표면 수 쉽게 avidin 퓨전 단백질 즉각적인 표면 장식 biotinylated 시연. 유전자 변환 및 긍정적인 클론의 선택 필요 시간 지연의 2 ~ 3 개월 동안 2 h 이내 총 절차를 수행할 수 있습니다. 표면 수정 세균성 성장 및 생존에 영향을 미치지 않습니다. 박테리아는 대리 항 OVA 항 원 발표 통로에 항 원을 제공할 수 있었고, 특정 면역 응답 vivo에서 MHC tetramer 얼룩 등-cytometry 분석 실험에 의해 평가 되었다 유도로 장식 하 고 세포내 cytokine (ICS) 얼룩입니다. 더 중요 한 것은, vivo에서 학문은 명확 하 게 표면 장식 박테리아 BCG 익스프레스 유사한 항 원에 유전자 조작에 비해 면역 반응의 유도 수 있었다 보여주었다.

Avidin 비타민 b 복합체 상호 작용은 Kd 1015 M13의 자연에서 알려진 가장 강한 비 공유 상호 작용. 그것은 생물학 연구14, 일반적으로 사용 되는 유용한 도구만 하지만 최근 암 치료15,16에 적용할 수 있도록 표시 되었습니다. 이 연구에서는 트리플 돌연변이 (N54A, W110K 및 N17I) 야생-타입 avidin tetrameric avidin 단위체 avidin는 크게 avidin 비타민 b 복합체 선호도 감소의 형태로 변환에 적용 된 (Kd= 107 M) 바인딩합니다 biotin 하 역. 이 단위체 avidin 게이트웨이 재결합 (Invitrogen) 관심사의 단백질의 한 단계 빠른 표현에 대 한 복제와 호환 되는 p17-Avi 플라스 미드를 개발 하기 위해 사용 되었다. 이 새로운 버전의 단위체 avidin 큰 세균 덩어리 집계 및 과도/취소가 세균성 표면 표시 관심사의 단백질의 방지 등 여러 장점이 있습니다. 따라서, 호스트 세포에 의해 섭취, 일단 Avi-퓨전 단백질 분리할 수 있습니다 biotinylated 박테리아와 교통의 표면에서 침. 마지막으로, 돌연변이 핵 시스템에 효 모 또는 avidin 융해 단백질의 대량 생산을 위한 유전자 변형 식물17,18 에 적용 될 수 있는 비 당화 형태로 avidin를 변환 합니다. 이 형태의 단위체 avidin 단위체 streptavidin (mSA)19, streptavidin 및 rhizavidin 시퀀스 및 높은 바인딩 선호도 (109 M의Kd ) 했다의 버전 대신 선정 되었다 mAvidin에 비해. 예비 테스트, mSA 키메라 단백질 biotinylated 박테리아 mAvidin 키메라 단백질에 비해 훨씬 낮은 바인딩 효율을 했다. 이 연구는 따라서, mAvidin에 근거 했다 하지만 단위체 streptavidin 또는 streptavidin/avidin 다른 형태의 것도 다른 응용 프로그램에 대 한 가능성.

설명된 프로토콜의 성공적인 구현을 생성 된 융해 단백질의 품질 및 세균성 표면 biotinylation의 효율성에 따라 달라 집니다. Eluted Avi 태그 단백질 드 소금 그리고 적절 한 분자량 단백질 집중 장치를 사용 하 여 PBS에 버퍼 교환 합니다. 강 수는 어떤 단백질에 대 한 높은 농도 요인에서 발생할 수 있습니다 따라서, 농도 테스트 해야 비율과 eluted 단백질의 작은 볼륨을 사용 하 여 첫 번째, 예를 들어, 0.5 ~ 1 mL PBS의 20 mL에 희석 solubilized 포함 바디의에서 결정 다음 집중. 그것은 또한 강 수를 피하기 위해 전체 과정 단백질 약 4 ° C의 온도 유지 하는 것이 중요입니다.

세균성 표면 biotinylation의 효율성을 높이기 위해 Sulfo NHS SS biotin 4 ° c.에 어둠 속에서 그것의 원래 컨테이너에 저장 한다 시 약은 매우 습기 과민 한; 따라서, 튜브는 시 약을 포함 하는 열기 전에 실내 온도에 equilibrated 한다. 또한, biotin 재고 솔루션 (10 mM) NHS 에스테 르 moiety hydrolyzes 사용 하기 바로 전에 만든 한다 고 비 반응성이 매우 신속 하 게 될. Biotin 재고 솔루션을 저장 하 고 다시; 수 없습니다. 새로운 biotin 유리병은 모든 biotinylation 실험을 위해 필요 합니다. 최상의 결과 얻으려면 BCG, 신선한 미디어 뿐만 아니라 신선한 버퍼의 신선한 문화를 사용 하는 것이 좋습니다. 프로토콜에서 설명 했 듯이, biotinylated 및 코팅된 BCG 수 동결 건조 된 되며 표면 코팅의 품질에 영향을 주지 않고 적어도 30 일 동안 보존. 이것은 특히 유용 보내거나 다른 한 위치에서 샘플을 전송 하는 경우 또는 긴 과정 실험을 수행할 때입니다.

이 BCG 표면 장식 메서드는 또한 분석 하 고 신속 하 고 정확한 방법으로 새로 개발된 된 백신 후보자의 immunogenicity를 평가 다른 흥미로운 가능성을 제공 합니다. 소설 결핵 백신의 기본 목표는 TH1 유형 세포 CD4 같은 유도+ 와 CD8+ T 세포 결핵에 대 한 보호에 그의 플레이 중요 한 역할. Avidin 비타민 b 복합체 시스템 연구에서 개발이 T 세포이 응답을 평가 하는 매우 유용한 도구를 제공 합니다. 빠르게 재조합 단백질/항 BCG 표면에 표시의이 새로운 기술을 나타냅니다 신속 하 게 평가 하는 훌륭한 도구와 정확 하 게 많은 면역성 단백질 (예를 들어, 분 비 특정 M.tb 의 보호 효능 단백질), 따라서 효율적인 백신의 개발으로 번역 될 수 있다.

조정 하 고 세균성 표면에 Avi 융해 단백질의 농도 변화,이 방법의 또 다른 장점은 백신의 효과 극대화 하기 위해 세균 표면에 관심의 다른 항을 동시에 표시 될 수 있습니다. 추가로 BCG를 개선 하기 위해 하나의 가능성 BCG 표면 장식 수 있기 때문에 연구는 BCG phagosome 성숙20,21 항 프레 젠 테이 션21등 중요 한 대 식 세포의 기능을 방해, 관심사의 항 원 함께 phagosome 성숙 가속 알려진 요인의 조합.

이 기술의 몇 가지 한계 저소득 지역에서 도전적이 고 비싼 수 있는 재조합 형 단백질의 대규모 생산의 요구 사항을 포함 합니다. 또한, 열심히 단백질 정화 생산 해야 문제 해결 및 최적화 합니다. 그러나, 이러한 한계는 재조합 단백질 생산 기술의 개선으로 피할 수 있습니다. 또 다른 한계는 자연스럽 게 발생 방지 avidin 항 체 실험실 동물 및 인간22 에서 일반적인 avidin 치료 목적 사용을 방해 수 있습니다 가능성을 포함 한다. 그러나, 다른 실험실 안전 및 avidin 치료의 효능 테스트 하 고는 avidin의 안전 성과 효능은 크게 영향을 받지의 immunogenicity23나타났습니다. 흥미롭게도, 상당히 야생-타입 tetrameric avidin 단위체 형태로 변환의 immunogenicity24감소 합니다.

정리해 보면,이 새로운 기술을 신속 하 고 재현성 유전자 비 세균성 표면 단백질의 수정 관심 통해 BCG의 immunogenicity를 개선 하는 avidin 비타민 b 복합체 시스템을 활용 하 여 성공적으로 BCG의 전통적인 변환 바꿀 수 있습니다. 항 원 인코딩 플라스 미드와 또한,이 새로운 방법만 현재 BCG 백신의 향상을 촉진 하지 수 있지만 또한 거의 모든 잠재적인 항 원 또는 단백질 유전자 BCG, 넓은 함께 표현 하 일반적으로 하드의 빠른 평가 위한 새로운 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 결핵 백신 개발에 응용 프로그램입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리 기술 지원에 대 한 A. Talal 닥터 R 스톡 BCG 파스퇴르 스트레인에 대 한 감사합니다. 우리는 또한 유전자 합성에 대 한 GenScript을 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

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References

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면역학 문제 131 결핵균 대 식 세포 면역 반응 재조합 단백질 T 세포 항 원 Biotin avidin 비타민 b 복합체
외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 <em>진 균 bovis</em> BCG 백신에의 표현
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Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J.,More

Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

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