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Immunology and Infection

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

Summary

Uma nova técnica para antígeno rápida exposição sobre uma superfície bacteriana é apresentada, que envolve a superfície biotinylation seguido por exposição às proteínas de interesse em fusão com avidin monomérico. Carregando a BCG com antígenos selecionados com êxito melhora sua imunogenicidade, sugerindo que a decoração de superfície pode substituir abordagens genéticas tradicionais.

Abstract

Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa grave e o bacilo da vacina disponível apenas M. bovis Calmette-Guérin (BCG) é segura e eficaz para proteção contra meningite de TB infantil grave e algumas formas de tuberculose disseminada, mas não consegue proteger contra a tuberculose pulmonar, que é a forma mais prevalente da doença. Promissoras para melhorar BCG atualmente confiam na sua transformação com genes que codificam imunodominantes M. tuberculosis (Mtb)-antígenos específicos e/ou complementação com genes que codificam co-fatores que estimulam o antígeno apresentação de células. Maiores limitações para essas abordagens incluem baixa eficiência e baixa estabilidade do nível incerto de segurança de vetores de expressão. Neste estudo, apresentamos uma abordagem alternativa para melhoria da vacina, que consiste de complementação do BCG com proteínas exógenas de interesse na superfície de bactérias, ao invés de transformação com plasmídeos codificação de genes correspondentes. Primeiro, as proteínas de interesse são expressos em fusão com avidin monomérico em padrão Escherichia coli sistemas de expressão e, em seguida, usado para decorar a superfície de biotinilado BCG. Usando a superfície de BCG decorado com antígeno de ovalbumina substituto das experiências com animais demonstram que a bactéria modificada é totalmente imunogênicas e capazes de induzir respostas de célula T específica. No total, os dados aqui apresentados fortemente apoiar um romance e um método eficiente para remodelar a vacina BCG atual que substitui a abordagem convencional laboriosa de complementação com os ácidos nucleicos exógenos.

Introduction

Várias estratégias têm sido propostas para substituir a atual vacina contra tuberculose BCG, incluindo sistemas de adjuvante da proteína, tecnologias em vetor virais, M.tb cepas atenuadas e cepas de BCG geneticamente modificadas, também para introduzir genes excesso, expressando antígenos de BCG que não são suficientemente expressa durante infecção1 ou Mtb-antígenos específicos, não presentes na BCG2. Engenharia genética, no entanto, enfrenta muitos obstáculos, incluindo o nível incerto de segurança, o processo demorado e a baixa eficiência de expressão vetores4,5. Com relação à melhoria da BCG, uma abordagem alternativa é necessário para melhorar a imunogenicidade sem a necessidade de alternações genéticas incertas.

Neste estudo, apresentamos uma estratégia romance para exibição de proteínas recombinantes de interesse na superfície das células de BCG que baseia-se na interação conhecida avidin alta afinidade com biotina. Esta abordagem permite fixação rápida e reprodutível de proteínas recombinantes avidin da fusão na superfície do biotinilado BCG, o que facilita o amplas manipulações de BCG para alcançar a máxima melhoria da sua eficácia, mantendo sua segurança excelente grave, observada ao longo de décadas de uso.

Afinidade avidina biotina é extremamente alta (Kd = 10−15 M) e uma vez formado, o complexo biotina-avidina é muito estável e pode ser interrompido somente sob condições6de desnaturação. No entanto, para este tipo de interação para servir como uma alternativa de método de transferência genética, exposição a longo prazo mas reversível das proteínas recombinantes é necessária. Assim, apresentamos aqui uma avidina monomérica de baixa afinidade (Kd = 10−7 M) que leva à liberação reversível de proteína da superfície decorada BCG, uma vez ingerido dentro de células apresentadoras. A fim de fornecer uma prova de conceito, nós testamos esse método usando uma proteína quimérico avidin monomérico, correspondente a um antígeno substituto derivado de ovalbumina (OVA)7,8. Os resultados mostraram que a superfície da célula BCG pode ser facilmente e rapidamente decorada com proteínas da fusão avidin monoméricos e que essa ligação à superfície de BCG é estável e pode ser reproduzido sem alterações detectáveis no crescimento bacteriano e sobrevivência. Além disso, encontramos que a BCG decorado com avidin monomérico fundida com óvulos (AviOVA) pode induzir uma resposta imune semelhante àquela induzida por BCG geneticamente expressando o mesmo antígeno tanto in vitro e in vivo. Esta tecnologia de display reversível das proteínas de interesse na superfície bacteriana é, portanto, um substituto eficaz das abordagens de transferência do gene tradicional e pode fornecer uma plataforma para grandes manipulações de BCG e outras aplicações em vacina desenvolvimento.

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Protocol

Todos os animais foram mantidos em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado Animal e comissões de utilização na Universidade da Colúmbia Britânica. Experimentos foram aprovados pelos comitês de uso e cuidado Animal e executados de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal. O número de bem-estar animal garantia é A11-0247.

1. geração de proteínas da fusão Avidin monomérico expressando plasmídeos

  1. Clone sub avidin monomérico sequência12 em plasmídeo pDEST17 entre os sites "CTC" e "Ga", que corresponde a 133-134bp. (ou seja, entre o 6-histag e o site de recombinação Attr1 pDEST17) para obter p17-Avi.
    Nota: A sequência de DNA monomérico avidina é mostrada abaixo. As três mutações introduzidas no selvagem-tipo Avidin obter avidin monomérico são mostradas em caracteres em negrito.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. Projetar primers ladeados com AttB1 e B2 Attsites correspondentes a óvulos polipeptídeo757-1035 (-Ab- e H-2_Kb-restrito epítopos) sequência de ADN. Primeira demão sequências são: Attb1-OVA
    B2-óvulos GregorioACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT e Att
    GregorioACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 e Attb2 sequências estão em negrito).
    1. PCR-amplificação de óvulos polipeptídeo757-1035 sequência de DNA com os primers acima usando o plasmídeo pUC57-óvulos como um modelo.
    2. Clone os produtos PCR em pDONR-221 através de uma site-specific em vitro recombinação reação (por exemplo, BP Clonase) para obter pDONR-óvulos.
  3. Transferência do gene de interesse em p17-Avi usando a reação de Clonase LR para obter p17-Avi-óvulos.
    Nota: Para detalhes da BP e LR recombinação clonagem, consulte o manual do fabricante.

2. expressão de proteínas de fusão monomérico Avidin, purificação e dobrar

  1. Transformar o plasmídeo p17-Avi-óvulos em Escherichia coli BL21 e induzir a 250 mL de Escherichia coli BL21 cultura com IPTG (0,1 M) para 3 h a 37 ° C.
  2. Lise de bactérias e solubilização de corpos de inclusão
    1. Pelota a 250 mL de cultura de BL21 induzida por 30 min de centrifugação em 4.000 x g e a 4 ° C.
    2. Coletar pelotas em 10 mL de tampão de lise (50 mM Tris-HCL, NaCl, de 150 mM 6 M guanidina-HCL, pH 1,5-2,5) e incube por 15 min a 95 ° C. Incube durante uma noite em temperatura ambiente em rotacao.
    3. Centrífuga de 30 min em 15.000 x g e 4 ° C e coletar sobrenadante.
  3. Purifica o Avi-óvulos de sobrenadante (fração de corpos de inclusão solubilizado) usando colunas Ni-NTA.
    1. Dilua 1:2 de corpos de inclusão com Lise.
    2. Use 4 mL de resina Ni-NTA por 250 mL de cultura-derivada de corpos de inclusão.
    3. Lave 3x com 10 mL de tampão de lise (pH 7.0).
    4. Eluir com 10 mL de tampão de eluição (lise tampão pH 7,0 com imidazol 250 mM).
  4. Redobrar a proteína eluted por diluição gradual (01:10) e rápida num Vortex em tampão Tris (pH 7,5) contendo 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 mM Tween 80, arginina 500 mM e 200 mM de NaCl durante 30 min à temperatura ambiente.
  5. De sal e troca de amortecedor dobrado proteína de tampão Tris em PBS com concentradores de proteína de acordo com os protocolos do fabricante.
  6. Remover agregados por centrifugação por 30 min em 3.500 x g e a 4 ° C e armazenar as alíquotas de proteína solúvel a-20 ° C.

3. Biotinylation da superfície celular de BCG

  1. Crescer a BCG em Middlebrook 7H 9 caldo com 10% OADC (ácido oleico, solução de albumina e dextrose) e 0,05% de Tween 80 a 37 ° C em uma plataforma de abanador a 50 rpm até OD = 0.5-1.
    Nota: O BCG é um patógeno de nível 2 de biossegurança e todas as experiências relativas à BCG devem ser feitas em uma armário com equipamento de proteção pessoal adequado de biossegurança.
  2. Lave 109 BCG 3 vezes com 500 µ l de PBS livre de endotoxinas gelada mais 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Suspenda a pelota de BCG na enciclopédia PBS estéril endotoxinas.
  3. Imediatamente antes do uso, prepare-se 1 mL de biotina de Sulfo-NHS SS 10 mM em água filtrada estéril.
    1. Incube as bactérias com 1 mL de 0,5 mM de biotina Sulfo-NHS SS em temperatura ambiente por 30 min.
  4. Lavagem rotulada bactérias 3 vezes com 500 µ l de PBST frio gelado para remover não reagidos biotinylation reagente.
    1. Ressuspender o pellet em 1 mL de PBST.
  5. Para avaliar a eficiência de biotinylation, mancha 108 biotinilado BCG com Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µ l) em temperatura ambiente por 20 min.
    1. Incubar as bactérias coradas em 1 mL de 2% PFA por 20 min em temperatura ambiente e então examinar os níveis de biotinylation por análise de citometria de fluxo.

4. o fenótipo de micobactérias biotinilado: crescimento e sobrevivência

  1. Crescem as cepas de BCG em Middlebrook 7H 9 caldo com 10% OADC (ácido oleico, solução de albumina e dextrose) e 0,05% de Tween 80 a 37 ° C em uma plataforma de abanador a 50 rpm.
    1. Grave a densidade óptica (OD600) de cultura bacteriana ao longo de um período de 8 dias.
  2. Use o BCG-Luc (descrito anteriormente9) para detectar a sobrevivência de bactérias em macrófagos.
    1. Infectar células RAW264.7 com biotinilado BCG-Luc (MOI 10:1) ou não tratada BCG-Luc (controle) e incubadas a 37 ° C, mais um 48 h, período de tempo.
    2. Lave monocamadas de células e em seguida lyse com 0.025% SDS para liberar bactérias ingeridas.
    3. Medir a produção de bioluminescência com sistema de ensaio de Luciferase e luminómetro.
      Nota: O sinal de luminescência é indicativo de viabilidade bacteriana. Refira por favor o manual do fabricante para obter detalhes do ensaio de luciferase.

5. ligação de proteína monomérica de avidina-fusão à superfície de BCG biotinilado

  1. Misture 5 x 108 biotinilado BCG com Avi-proteína (final de 10 μg/mL em PBS-T) por 1h à temperatura ambiente na plataforma do agitador.
  2. Bactérias de lavagem 3 vezes com 500 µ l de PBST frio gelado e mancha com anticorpo de coelho antiavidina (Ab) (diluição 1: 100, descrito anteriormente10) por 20 min em temperatura ambiente e, em seguida, com FITC Conjugado IgG Ab nas mesmas condições de cabra anticoelho.
  3. Lavar as bactérias 3 vezes com 500 µ l de PBST e analisar por citometria de fluxo, para avaliar a extensão da decoração de superfície.

6. liofilização de micobactérias

  1. Biotinylate bactérias de acordo com o passo 3.1-3.4 e casaco biotinilado bactérias com Avi-óvulos conforme item 5.1.
  2. Alíquota biotinilado e bactérias revestidas (108), lavagem com PBS e ressuspender em mídia de liofilização de 0,5 mL (meio de Sauton de 25%, 75% H2O e 1,5% at-glutamato).
  3. Transferir as bactérias para frascos de vidro e congelar em um freezer-80 ° C durante a noite.
  4. Lyophilize frascos de vidro enchido e congelados para 24 h, usando um secador de gelo.
  5. Armazenar as amostras secas à temperatura ambiente e reconstituir em PBS, quando necessário.
  6. Repita a etapa 3.5 avaliar biotinylation e superfície de revestimento estabilidade.

7. fagocitose ensaio

  1. Cresce 264.7 pilhas de macrófagos em pratos de cultura de diâmetro de 10 cm em DMEM médio contendo 5% FCS, 1% cada de L-glutamina, HEPES, não aminoácidos essenciais e penicilina e estreptomicina até a confluência de 70-80%.
  2. Sementes de 2 x 106 RAW 264.7 células de macrófagos em uma placa de 6. Permitir que as células a aderir a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
  3. Gerar DsRed BCG (descrito anteriormente9) decorado com Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-óvulos) de acordo com passos 3.1-3.4 e 5.1.
  4. Infectar células crus com DsRed BCG-Avi-óvulos ou não tratada DsRed BCG em MOI 20:1 para 24h a 37 ° C.
  5. Lavar as células três vezes e trypsinize com 1 mL de tripsina 0,25% a 37 ° C por 10 min para remover bactérias parcialmente isoladas.
  6. Corrigir em 2,5% PFA em PBS por 20 min em temperatura ambiente.
  7. Lavar 3x com PBS e analisar por citometria de fluxo.

8. intracelular tráfico de óvulos decorado biotinilado BCG em macrófagos

  1. Microscopia de fluorescência
    1. Sementes de 3 x 105 RAW 264.7 células de macrófagos em lamelas em uma placa de 24. Permitir que as células a aderir a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
    2. Infectar células de macrófagos com micobactérias (MOI 10:1) em meios de manutenção sem antibióticos a 37 ° C e 5% de CO2 para 4 a 24 h.
    3. Lavar as células e trypsinize para remover as bactérias de superfície Unidas, não ingerido como na etapa 7.5.
    4. Células de reparo infectado em 2,5% PFA em PBS por 20 min em temperatura seguido de 3 lavagens com PBS.
    5. Permeabilize de células no buffer de bloqueio/permeabilização (0,1% Triton X-100, 3% BSA em PBS) por 20 min em temperatura ambiente.
      1. Anticorpos específicos de uso de interesse (por exemplo, coelho anti-avidin Ab) em 10 μg/mL em permeabilização buffer para 20 min à temperatura seguido de anticorpo secundário (por exemplo, IgG de anti-coelho FITC-bode) por 20 min.
    6. Lavagem de células 3x com PBS, uma vez com água e monte nos slides em 10 μL de meio de montagem aquoso para minimizar fotobranqueamento fluorescência.
    7. Examinar lâminas de microscopia confocal digital usando um microscópio de epifluorescência equipado com 63 x / 1.4 plano-Apochromat objectivo. Gravar imagens usando uma câmera digital acoplada ao software do microscópio.
  2. Immunogold coloração e microscopia eletrônica
    1. Sementes de 2 x 106 RAW 264.7 células de macrófagos em placas 6-boas.
    2. Corrigir os macrófagos BCG infectado com 4% PFA para 4 horas em temperatura ambiente.
    3. Lave as amostras duas vezes com PBS.
    4. Incorporar amostras em agarose de baixo ponto de fusão de 4% e desidratar em etanol a 70%.
    5. Transferir amostras de resina acrílica e polimerizar a 50 ° C.
    6. Corte 60 seções nm com um micrótomo e recolher seções sobre grades de níquel.
    7. Etiquetar amostras com anticorpos de avidina 10 μg/mL por 1h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite em solução de incubação (PBS e 0,1% BSA) e em seguida lavar com incubação solução conjugada ouro F(ab')2 de ultra pequeno de cabra anticoelho IgG (1/20) por 1h no quarto temperatura em solução de incubação.
    8. Seções de lavagem em água destilada, mancha em glutaraldeído 2%, lavar, secar ao ar e examinar com microscópio eletrônico.

9. animal imunização e processamento de órgão

Nota: Todas as etapas devem ser feitas em uma armário de biossegurança.

  1. Passe biotinilado e proteína revestido bactérias através de agulha de1/2G 27 10 vezes para fazer a suspensão de célula única.
  2. Tomar 1 x 106 bactérias em 100 μL de PBS livre de endotoxinas e imunizar um feminino camundongos C57BL/6 (-A,b, H - 2Kb, 5-6 semanas) por via subcutânea na nuca do pescoço.
    1. Injete o controle de ratos com 100 μL de PBS sozinho.
  3. Eutanásia em camundongos imunizados 20 dias pós-imunização por inalação de CO2 seguida por deslocamento cervical.
    1. Isolar o baço e transferi-lo para mídia RPMI.
  4. Mash-baço através de um filtro de célula de 70 µm com um êmbolo de seringa de 5 mL.
    1. Lavar com 5 mL de RPMI. Centrífuga (800 x g, 3 min) para isolar uma suspensão de célula única.
    2. Empobrecem RBC com kit de selecção positiva de biotina rato com biotina-Ter119/eritroide células Ab.
    3. Centrifugue e ressuspender as células em 10 mL de RPMI completa (FCS de 10%, 1% L-glutamina, 1% penicilina, estreptomicina 1% e 2-ME da 50 μM).

10. eu-Ab tetrâmero coloração para determinar as frequências de antígeno-específicos CD4+ células T e coloracao intracelular de citocina para determinar as frequências de antígeno-específicas T células liberando citocinas em animais imunizados

  1. Tetrâmero de coloração
    1. Mancha splenocytes de controle e os ratos imunizados (~ 20 x 106 células) com PE-conjugados-Ab-tetrâmeros de323-339 de óvulos (diluição 1/12,5) para 1 h a 37 ° C em tampão de ligação (PBS com FCS 2% e 0,1% NaN3).
    2. Adicione AF647 CD4 Ab (01:25) e 7-AAD (para detectar células mortas) para splenocytes por 20 min em temperatura ambiente.
    3. Analise as amostras por citometria de fluxo.
    4. Adquira 500.000 eventos na região de CD4 positivo para determinar a frequência de eventos positivos tetrâmero.
      Nota: Total splenocytes são definidos pelo Borrão de ponto SSC/FSC, células vivas pela exclusão dos eventos positivos 7-AAD e subconjuntos de CD4 por retenção de eventos positivos AF647.
  2. Frequência do antígeno específico Cytokine Intracellular liberando células T
    1. Transferência de cerca de 1 × 107 splenocytes em 4 mL de meio RPMI completo em seis poços chapas com ou sem óvulos recombinantes (10 µ g/mL) e incubar durante 16 h.
    2. Trate as células com A Brefeldin (1:1, 000) para um adicional 5 h.
    3. Lavagem com PBS e sujeitos a citocinas intracelulares de coloração como segue:
      1. Mancha de amostras de células CD8-PE ou PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 em tampão de ligação) em temperatura ambiente por 30 min.
      2. Corrigir em 4% PFA em temperatura ambiente por 20 min.
      3. Permeabilize usando solução de permeabilização, de acordo com as instruções do fabricante.
      4. Lave as células e etiqueta com IFN-γ conjugados a AF647 Ab (01:50) por 20 min em temperatura ambiente.
      5. Lavar as células e sujeito a análise de citometria de fluxo, como descrito acima.

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Representative Results

Com os procedimentos gerais descritos acima, foi examinada a viabilidade da superfície biotinylation BCG e decoração com substituto do antígeno óvulos. A imunogenicidade do BCG modificado foi então testado em vivo. A superfície bacteriana foi facilmente rotulada com biotina para exibição rápida dos antígenos quimérico de avidina sem qualquer alteração detectável em fenótipos bacterianas. A BCG modificada resultante é eficientemente ingerido pelas células de apresentação de antígeno e pode induzir uma resposta imune de óvulos específicos em camundongos.

Geração de plasmídeos de fusão avidin monoméricos e proteínas
Um plasmídeo de expressão p17-Avi foi gerado para ser compatível com a metodologia de Gateway deve ser usado para produzir proteínas monoméricas avidin da fusão. ÓVULOS foi clonado em p17-Avi e expressos em Escherichia coli, em seguida, purificada e novamente como descrito acima (Figura 1).

Biotina eficientemente anexa à superfície bacteriana e não afeta o crescimento bacteriano ou sobrevivência
As bactérias foram rotuladas com diferentes concentrações (0-1 mM) de biotina e manchados para examinar a eficácia da superfície biotinylation de acordo com os protocolos acima. Análise de citometria de fluxo mostrou uma mudança total do histograma de fluorescência em bactérias rotuladas com biotina 0.5 mM (Figura 2), e esta concentração foi usada durante todo este estudo para gerar bactérias biotinilado. Em seguida, examinou o efeito da modificação da superfície bacteriana no fenótipo bacteriana e encontrado que biotinilado e controle não tratado BCG exibido um perfil de crescimento semelhante ao longo de um período de 8 dias (Figura 3A). BCG expressando luciferase (BCG-Luc)9 foi usado para examinar a sobrevivência bacteriana em macrófagos. Luminescência sinais indicativo de viabilidade bacteriana foram gravadas mais 48 h. os resultados obtidos mostraram perfis semelhantes de viabilidade gradual diminuição entre bactérias biotinilado e controle (Figura 3B). Em conclusão, estes dados indicam claramente que biotinylation superfície bacteriana não afeta crescimento bacteriano ou sobrevivência dentro de macrófagos, que é importante, já que maior sobrevivência nos macrófagos pode significar um aumento na virulência bacteriana.

Eficiência da decoração de superfície bacteriana
Biotinilado bactérias foram revestidas com peptídeo de antígeno de óvulos em fusão com avidin monomérico, de acordo com os protocolos acima. Análise de citometria de fluxo mostrou níveis mínimos de óvulos vinculativas para as bactérias não-biotinilado (MFI = 8,31 ± 0,42, Figura 4A, painel superior) e níveis significativos de óvulos vinculando a bactérias biotinilado (IFM = ± 54.67 4.98) em relação ao controle de bactérias (IFM = ± 5.92 0.22, Figura 4A, mais baixo do painel).

Estabilidade da decoração de superfície de BCG
Desde que vacinas BCG convencionais são formuladas como pós secos, uma importante questão que surgiu durante este estudo foi a estabilidade do BCG modificado depois de liofilização, reconstituição e armazenagem em refrigerado ou temperatura ambiente. Portanto, examinou a superfície exibição de Avi-óvulos em liofilizado BCG Avi-OVA (superfície decorada com Avi-óvulos) e na recém decorado preparações bacterianas. Os resultados (Figura 4B) mostraram que os níveis de Avi-óvulos na superfície bacteriana permaneceram estável e detectável um mês após a liofilização e armazenamento em temperatura ambiente em comparação com preparações de BCG Avi-óvulos frescos, que provaram que esta superfície decoração método é adequado para o desenvolvimento de vacinas.

Fenótipo de macrófagos não é afetado pela decoração de superfície bacteriana
Para ver se esta metodologia de decoração de superfície interfere com bacteriana entrada em células hospedeiras, usamos RAW264.7 células e DsRed bactérias9 para realizar um ensaio de fagocitose descrito no protocolo acima. Figura 4 mostrou que essa superfície bacteriana decorado BCG não tinha interferência significativa com entrada bacteriana (22,5 ± 1,57%) em relação ao tipo selvagem não revestido BCG (± 24.47 1.18%) indicando que decoração de superfície do BCG não tem efeito no macrófago fenótipo.

Proteínas da fusão avidin viajam intracelular e co localizar com moléculas de MHC
Para examinar o destino do BCG Avi-óvulos-decorado dentro de macrófagos, células aderentes de RAW foram infectadas e examinadas por microscopia de fluorescência, conforme descrito no protocolo acima. Imagens obtidas (Figura 5A) mostraram que Avi-óvulos não apenas presentes na superfície bacteriana, mas também destacada e translocados para o citoplasma distante para as bactérias. Para verificar mais este resultado, realizamos um immunogold manchando a experiência e as imagens obtidas mostraram claramente que antígenos de Avi-óvulos não só estão presentes na superfície de BCG, mas também podem separar da superfície de BCG, atravessam a membrana phagosomal e viajar para o citosol (Figura 5B). Para continuar a analisar se as bactérias Avi-óvulos decorados eram capazes de transportar sua carga de proteína para o percurso de apresentação de antígeno, os macrófagos foram infectados com Avi-óvulos BCG, conforme descrito no protocolo e submetidos a análises confocal. Resultados (figura 6A) mostraram que houve colocalization de Avi-óvulos com moléculas-A, sugerindo que a proteína de fusão avidin desanexado e translocados para compartimentos de apresentação de antígeno onde foram carregados em moléculas de MHC II. Os resultados também mostraram que o peptídeo Avi-óvulos co localiza com classe I moléculas dentro de phagosomes BCG quando manchado para H-2_kb (Figura 6B), que demonstrou que há potencial apresentação de antígeno de Avi-óvulos para CD8+ T células pelo macrófago. Estes dados indicam que uma vez que a superfície decorada bactérias entrar os macrófagos, os antígenos são capazes de tráfego para os caminhos de apresentação do antígeno.

Bactérias de superfície decoradas são totalmente imunogênicas
Para examinar se a superfície decorada BCG é capaz de induzir uma resposta imune específica em vivo, C57BL/6 ratos foram imunizados com PBS sozinho (controle), selvagem-tipo BCG, Avi-óvulos decorada BCG, BCG geneticamente transformado com um plasmídeo para expressar uma antígeno de óvulos semelhante. Camundongos imunizados foram sacrificados 20 dias depois e as frequências de óvulos específicos CD4+ T células e células T OVA-específicas liberando citocinas foram detectadas, de acordo com o protocolo. Resultados (Figura 7A-B) mostraram uma maior proporção de óvulos específicos CD4+resposta das células T em animais imunizados com BCG revestido com Avi-óvulos, em comparação com BCG de WT. BCG geneticamente modificados para expressar óvulos mostrou uma resposta imune semelhante ao BCG AVI-OVA (Figura 7). Estes dados mostraram que o método de decoração de superfície bacteriana é capaz de induzir uma expansão significativa do antígeno CD4 específicas+ T células e o grau de indução de resposta de células T é comparável ao BCG geneticamente modificado para expressar um OVA semelhantes antigénio.

Desde citocinas intracelulares também são importantes indicadores de respostas de célula T específica do antígeno, citocinas intracelulares coloração (ICS) experimentos foram realizadas para avaliar respostas imunes de células T, determinando-se a expressão e frequências de citocinas efetoras em animais imunizados com OVA-decorado bactérias e bactérias geneticamente transformadas com um OVA expressando de shRNA. Examinamos os níveis de liberação de IFN-γ, que é um indicador conhecido da resposta protetora contra bactérias intracelulares11. Demonstrámos que fomos capazes de detectar níveis semelhantes de óvulos específicos IFN-γ liberando CD4+ células em animais imunizados com bactérias de superfície decorada com óvulos (BCG-Avi-óvulos e BCG-p19-Avi-óvulos) em comparação com animais imunizados com bactérias geneticamente, expressando óvulos (BCG-p19-OVA) (Figura 8A). Importante, também fomos capazes de detectar frequências significativamente mais elevadas de IFN-γ produzindo CD8+ T células em animais imunizados com BCG-Avi-óvulos, em comparação com animais imunizados com BCG geneticamente expressando óvulos (Figura 8B-C) que demonstra que a biotina-avidina mediada superfície exposição da metodologia antígeno efetivamente pode substituir a transformação de BCG com ácidos nucleicos.

Figure 1
Figura 1: construção de uma recombinação de clonagem do plasmídeo para a produção de proteínas da fusão avidina. (A) um segmento de gene codificação para avidin monomérica foi sintetizado com restrição sites NdeI e NotI e subcloned em pDEST17 entre a histidina 6 x e a fita de porta de entrada para gerar o plasmídeo p17-Avi. ÓVULOS peptídeo252-345 DNA sequências finalizadas com attB sites foram clonadas em pDONR221. Depois disso, os genes de óvulos subcloned p17-Avi. Imagem editada e reimpresso com permissão da PLOS ONE12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: eficiência de BCG biotinylation. BCG foi biotinilado com vários concentração de biotina-NHS-SS por 30 min à temperatura ambiente, então rotulado com FITC-estreptavidina e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados são apresentados como histogramas de intensidade de fluorescência verde e inserir gráfico representa a média ± SEM das intensidades de fluorescência média (IFM) deduzidos 3 experimentos independentes. * P < 0,05; * * P < 0,01; P < 0,001. Imagem editada e reimpresso com permissão da PLOS ONE12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Biotinylation de superfície do BCG não afetou seu crescimento ou sua sobrevivência no macrófago. (A) Biot-BCG e controle unlabeled selvagem-tipo BCG foram cultivadas em completa 7 H 9 mídias e replicação foi monitorizada durante um período de 8 dias. Os resultados são expressos como as curvas de crescimento, ou seja, significa a absorvância a 600 nm como função do tempo ± SEM de 3 experimentos independentes. (B) macrófagos foram infectados com Biot-BCG-Luc ou BCG-Luc sem rótulo de controle para os períodos de tempo indicado e então célula lisados foram elaborados e analisados pela bioluminescência detectar bactérias viáveis. Os resultados são expressos como média unidades de luz relativas (RLU) ± SEM de 3 experimentos independentes. Imagem editada e reimpresso com permissão da PLOS ONE12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Avi-óvulos vinculando a Biot-BCG e sua estabilidade. (A) Biot-dsRed-BCG (bactérias expressando fluorescência vermelha, descrita anteriormente9) e controle não-biotinilado dsRed-BCG foram misturadas com Avi-óvulos em temperatura ambiente por 1 h e a extensão dos óvulos vinculação foi avaliada pela coloração da superfície com anticorpo antiavidina e FITC-cabra anti-coelho IgG (FL1). Amostras foram lavadas e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados são apresentados como histogramas de intensidade de fluorescência verde, e os valores são média ± SEM de IFM de Biot-BCG-AviOVA ligação Obtida de três experimentos independentes. (B) Biot-BCG liofilizado revestido com Avi-óvulos e acabadas Avi-óvulos-Biot-BCG foram rotulados e analisadas por citometria de fluxo, conforme descrito no r. Dados mostrados são representativos de três experimentos independentes, e os valores são média ± vinculação de SEM de IFM de Avi-óvulos-Biot-BCG Obtida de três experimentos independentes. (C) RAW macrófagos foram infectados com DsRed BCG-Avi-OOVA ou DsRed-BCG por 24 h a 37 ° C. Amostras foram então lavadas, tratadas com tripsina, corrigidas e analisadas por FACS. Os resultados são expressos como histogramas de fluorescência vermelha, que refletem o grau de fagocitose. Valores indicam a percentagem média ± SEM de células ingerindo BCG obtido de três experimentos independentes. Imagem editada e reimpresso com permissão da PLOS ONE12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Avi-óvulos separada da superfície de BCG e atravessou a membrana phagosomal na direção do citosol. (A) células aderentes RAW em lamínulas foram infectadas com óvulos decorados dsRed-BCG por 24 h a 37 ° C e então fixo/permeabilizado e coradas com anticorpo de coelho antiavidina e IgG de anti-coelho FITC-cabra. Amostras foram montadas em lâminas de microscópio e analisadas por microscopia confocal digital. Sinais vermelhos indicam a posição do BCG e sinais verdes refletem a localização do Avi-óvulos. A linha pontilhada indica o limite da célula macrófago e inferior direito painel é uma ampliação de 4x da inserção mostrada no painel esquerdo. (B) secções finas de RAW pilhas BCG-AviOVA infectado foram corrigidas com paraformaldeído e sequencialmente incubadas com anticorpo antiavidina e ouro-conjugados de cabra anticoelho IgG Visualizar Avi-óvulos e examinadas com um microscópio eletrônico. Ampliação de 12.000 X é mostrada. As setas indicam Avi-óvulos dissociado da superfície de BCG e exportados para além da membrana do fagossoma. As imagens mostradas são representantes de dois experimentos independentes. Imagem editada e reimpresso com permissão da PLOS ONE12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: antígeno avidina-fusão co localizado com MHC classe II e moléculas de classe I. BMA3.1A7 pilhas aderentes, uma linhagem de células de macrófagos de rato, foram infectadas com óvulos decorado GFP-BCG (expressando verde fluorescente, descrito anteriormente9) para 4h e então estimulados com IFN-γ por 24 h. células foram então fixo/permeabilizado e coradas com anticorpo anti-avidin, IgG de anti-coelho 594 Alexa e Alexa 647 rato anti-rato-A (A) ou Alexa 647 rato anti-rato H-2_kb (B). Amostras foram montadas em lâminas de microscópio e analisadas por microscopia confocal digital. Sinais verdes indicam a posição do BCG-GFP e vermelhos sinais refletem a localização do Avi-óvulos. Os sinais azuis indicam a posição de MHC-classe II ou classe I moléculas. A linha pontilhada indica a área de interesse. Setas indicam colocalization Avi-óvulos com moléculas de MHC. Imagens mostradas são representantes de dois experimentos independentes. Imagem editada e reimpresso com permissão da PLOS ONE12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: No vivo CD4+ resposta de célula T a BCG óvulos-decorado. Camundongos C57BL/6 foram injetados por via subcutânea com BCG superfície decorada com óvulos, BCG não modificado tipo selvagem, PBS (controle), BCG geneticamente transformado para expressar óvulos (BCG-p19-óvulos), ou transformados com controle plasmídeo e superfície decorada com (Avi-OVA BCG-p19-AviOVA). Após um período de 20 dias, splenocytes foram preparados a partir do baço de animais sacrificados e manchados com PE-conjugados-Ab-tetrâmeros de323-339 de óvulos (A) seguiram de anticorpo AF647-CD4 e 7-AAD. As amostras foram então analisadas por citometria de fluxo. Os resultados são expressos como lotes do ponto de dois parâmetros que mostram as frequências média ± SEM de tetrâmero eventos positivos no CD4+ população de dois animais/grupo. Dados mostrados são representativos de três experimentos independentes (um total de seis ratos foram examinados com amostras de células de cada mouse avaliada em triplicado). Os dados em gráficos (B) são expressos como média valor ± SEM o número absoluto (em um total de 500.000 eventos) de tetrâmero de óvulos específicos CD4+ em células de animais/grupo de dois e três experimentos independentes. * P < 0,05; * * P < 0,01; P < 0,001. Imagem editada e reimpresso com permissão da PLOS ONE12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: frequências de células T, liberando citocinas em resposta a Avi-óvulos revestidos BCG-imunização. Splenocytes de camundongos imunizados com PBS, BCG selvagem-tipo, superfície de BCG WT decorado com Avi-óvulos, BCG-p19-óvulos e BCG-p19-AviOVA foram estimulados com proteínas recombinantes de óvulos para 16 h seguido de um tratamento de h-período 5 com Brefeldin A. Cells foram, em seguida, lavadas e manchado primeiro com PE-Cy7 anti-CD4 (A) ou anticorpo anti-CD8 de PE (B), em seguida, anticorpo anti-IFN-γ de AF647. As células foram então lavadas e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados são apresentados como dois parâmetros ponto parcelas para mostrar as frequências média ± SEM de subconjuntos de células produtoras de IFN-γ em CD4+ e CD8+ populações de dois animais/grupo. Dados mostrados são representativos de três experimentos independentes (um total de seis ratos foram examinados com amostras de células de cada mouse avaliada em triplicado). Os dados em gráficos (C) são expressos como média ± número absoluto SEM de IFN-γ liberando CD4+ T células (gráfico à esquerda) ou IFN-γ liberando CD8+ T células (gráfico) de dois animais/grupo e três experimentos independentes. * P < 0,05; * * P < 0,01; P < 0,001. Imagem editada e reimpresso com permissão da PLOS ONE12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós relatamos neste estudo uma abordagem não-genético para exibição rápida e eficaz de proteínas exógenas na superfície de BCG para adicionar propriedades funcionais específicas eficientemente melhore imunogenicidade da bactéria ou antígenos específicos. Demonstrámos que superfície celular BCG pode ser facilmente biotinilado para decoração de superfície instantânea com proteínas da fusão avidina. O procedimento total pode ser realizado até 2 horas, enquanto transformação genética e seleção de clones positivos requer 2 a 3 meses de intervalo de tempo. Modificação da superfície não afeta a sobrevivência e o crescimento bacteriano. Bactérias decorado com antígeno substituto óvulos foram capazes de entregar o antígeno em via de apresentação de antígeno e induzida resposta imune específica in vivo, que foi avaliada por ensaios de citometria de fluxo, incluindo coloração de tetrâmero de MHC e citocinas intracelulares coloração (ICS). Mais importante, na vivo estudos mostraram claramente que as bactérias de superfície decorada foram capazes de induzir níveis semelhantes de resposta imune em relação ao BCG geneticamente semelhantes expressam antígenos.

Avidina biotina interação é a mais forte interação não-covalente conhecida na natureza com um Kd de 10−15 M13. Não é apenas uma ferramenta útil, comumente usada em pesquisas biológicas14, mas recentemente também foi mostrado para ser aplicável em câncer terapia15,16. Neste estudo, uma mutação tripla (N54A, W110K e N17I) foi aplicada a avidina selvagem-tipo para converter avidin tetramérica em uma forma de avidina monomérica que reduziu significativamente a afinidade de avidina-biotina (Kd= 10−7 M) e vincula reversivelmente a biotina. Este avidin monomérica foi usado para desenvolver um plasmídeo p17-Avi que é compatível com recombinação de Gateway clonagem (Invitrogen) para uma expressão de uma etapa rápida de uma proteína de interesse. Esta nova versão do avidin monomérico tem várias vantagens, incluindo a prevenção de grande moita bacteriana transitória/reversível e agregação bacteriana superfície exibição de proteínas de interesse. Portanto, uma vez ingerido pela célula hospedeira, proteínas da Avi-fusão podem desanexar da superfície da bactéria biotinilado e tráfego intracelular. Finalmente, as mutações convertem avidin em uma forma de não-glicosilados que poderia ser aplicável em levedura ou plantas transgénicas17,18 anos para a produção de grandes quantidades de proteínas da fusão avidin em sistemas eukaryotic. Esta forma de avidina monomérica foi escolhida em vez de uma versão do streptavidin monoméricos (mSA)19, que tem tanto streptavidin e rhizavidin sequências e tinha uma maior afinidade de ligação (Kd de 10−9 M) em comparação com mAvidin. Com testes preliminares, proteína de Quimera mSA tinha uma eficiência muito baixa ligação às bactérias biotinilado comparadas à proteína Quimera de mAvidin. Este estudo, portanto, baseou-se na mAvidin, mas streptavidin monomérica ou outras formas de estreptavidina/avidin também seria uma possibilidade para outras aplicações.

Sucesso da implementação dos protocolos descritos depende a qualidade da proteína de fusão gerado e eficiência do biotinylation superfície bacteriana. Proteína eluted Avi-com a tag deve ser de salgados e tampão trocadas em PBS usando o concentrador de proteína de peso molecular adequado. Precipitação pode ocorrer em fatores de alta concentração de algumas proteínas, portanto, fator de concentração deve ser testado e determinada pelo uso de pequenos volumes de proteína eluted à primeira, por exemplo, 0,5 a 1 mL de corpo de inclusão solubilizado diluído em 20 mL de PBS e concentrou-se em seguida. Também é importante manter a temperatura da proteína em torno de 4 ° C durante todo o processo para evitar a precipitação.

Para melhorar a eficiência de biotinylation superfície bacteriana, biotina Sulfo-NHS SS deve ser armazenada em seu recipiente original no escuro a 4 ° C. O reagente é extremamente umidade sensível; Portanto, os frascos contendo o reagente devem ser incubados à temperatura ambiente antes de abrir. Também, solução estoque de biotina (10 mM) deve ser feita imediatamente antes do uso como o moiety NHS-éster hidrolisa e se tornar não-reativo muito rapidamente. Solução-mãe de biotina não pode ser armazenada e reutilizada; um novo frasco de biotina é necessária para cada experimento biotinylation. Para melhores resultados, culturas frescas da BCG, novas mídias, bem como buffers de frescos são recomendadas. Como mencionado no protocolo, biotinilado e BCG revestido poderiam ser liofilizado e conservados durante pelo menos 30 dias sem afetar a qualidade da superfície. Isto é particularmente útil quando enviar ou transferir amostras de um local para outro ou ao realizar experimentos de longo curso.

Este método de decoração de superfície de BCG também oferece outras possibilidades excitantes para analisar e avaliar a imunogenicidade de candidatos vacinais recentemente desenvolvido de uma forma rápida e precisa. O objetivo principal da novela vacinas TB é induzir células do tipo TH1 como CD4+ e CD8+ T células aquele jogo de papéis importantes na proteção contra a TB. O sistema biotina-avidina desenvolvido neste estudo oferece uma ferramenta muito útil para avaliar as respostas destas células T. Esta nova tecnologia de exibir rapidamente proteínas recombinantes/antígenos na superfície de BCG representa uma ótima ferramenta para avaliar rapidamente e com precisão a eficácia protetora de muitas proteínas imunogênicas (p. ex., secretadas específicas M.tb as proteínas) e, portanto, pode ser traduzido para o desenvolvimento de vacinas eficazes.

Por ajuste e variando a concentração de proteínas da Avi-fusão na superfície bacteriana, outra vantagem desse método seria exibir simultaneamente diferentes antígenos de interesse na superfície bacteriana para maximizar a eficácia da vacina. Desde que estudos têm mostrado que a BCG interfere com funções de macrófagos importante como fagossoma maturação20,21 e apresentação de antígeno21, uma possibilidade para melhorar ainda mais o BCG pode ser decoração superfície de BCG com uma combinação de fatores conhecidos para acelerar a maturação do fagossoma juntamente com antígenos de interesse.

Algumas limitações desta tecnologia incluem a exigência de produção em larga escala de proteínas recombinantes, que pode ser desafiador e caro em áreas de baixa renda. Além disso, produzindo duro para purify proteínas exigiria otimização e solução de problemas. No entanto, essas limitações podem ser contornadas com a melhoria de tecnologias de produção de proteínas recombinantes. Outra limitação inclui a possibilidade de que, naturalmente, ocorrem anticorpos anti-avidin comuns no laboratório de animais e seres humanos22 podem dificultar o uso de avidina para fins terapêuticos. No entanto, outros laboratórios testaram a segurança e a eficácia da terapia de avidina e demonstraram que do avidin segurança e eficácia não foram significativamente afetados pela sua imunogenicidade23. Curiosamente, convertendo a avidina tetramérica selvagem-tipo uma forma monomérica significativamente diminuída sua imunogenicidade24.

Para resumir, esta nova tecnologia utiliza um sistema de avidina-biotina para melhorar a imunogenicidade do BCG, através de uma rápida e reprodutível não-bacteriana superfície modificação genética com proteínas de interesse com êxito pode substituir a tradicional transformação do BCG com plasmídeos codificação de antígeno. Além disso, este novo método pode não só facilitar a melhoria da vacina BCG atual, mas também pode fornecer uma nova plataforma para rápida avaliação de praticamente qualquer antígeno ou proteínas normalmente difícil de expressar geneticamente de BCG, com amplo potencial aplicações no desenvolvimento de vacinas de TB.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos o Dr. R Stokes para a cepa BCG Pasteur e r. Talal para suporte técnico. Agradecemos também o GenScript para obter ajuda com a síntese do gene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

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References

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