Summary
يصف لنا بروتوكول لتكاثر توليد وهادئة الليفية الجلدية البشرية الأولية، رصد معدلات تسوس نسخة، وتحديد الجينات الأثران المتحللة.
Abstract
التتابع هو حالة مؤقتة، وعكسها فيها الخلايا توقف انقسام الخلية، ولكن الاحتفاظ بقدرة على الانتشار. أظهرت دراسات متعددة، بما في ذلك بلدنا، أن التتابع يرتبط بالتغيرات الواسعة النطاق في التعبير الجيني. بعض هذه التغييرات التي تحدث من خلال أحداث تغييرات في مستوى أو النشاط من العوامل المرتبطة بانتشار النسخ، مثل E2F وحركة. لقد أظهرنا أن تسوس مرناً يمكن أن يسهم أيضا في التغييرات في التعبير الجيني بين الخلايا المتكاثرة وهادئة. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف الإجراء الخاص بإنشاء ثقافات الليفية القلفة الجلدي البشرية المتكاثرة وهادئة. ثم يصف لنا إجراءات تمنع النسخ الجديدة في الخلايا المتكاثرة وهادئة مع والاكيتنوميسين د (أكتد). العلاج ActD يمثل نهجاً واضحة واستنساخه إلى الناي بالنسخ الجديدة من تسوس نسخة. عيب أكتد في المعاملة أن مسار الوقت يجب أن تكون محدودة بفترة زمنية قصيرة لأن أكتد يؤثر على بقاء الخلية. يتم رصد مستويات نسخة على مر الزمن لتحديد معدلات تسوس نسخة. يسمح هذا الإجراء لتحديد الجينات و isoforms الذي يحمل تسوس التفاضلية في تكاثر مقابل الليفية هادئة.
Introduction
مستويات الدولة ثابت النصوص تعكس مساهمة توليف محاضر والانحلال نسخة. وينظم واضمحلال نص منسق إليه هامة للتحكم في العمليات البيولوجية1،2،،من34. على سبيل المثال، قد ثبت معدلات تسوس نسخة للمساهمة في سلسلة الأحداث التي أعقبت التنشيط الزمانية ب عامل نخر الورم سيتوكين التحريضية5.
وقد أظهرنا سابقا أن الانتقال بين الانتشار والتتابع في الخلايا الليفية البشرية الأساسي يرتبط بالتغيرات في مستويات العديد من الجينات6نسخة. بعض هذه التغييرات تعكس الاختلافات في نشاط عوامل النسخ بين هاتين الدولتين.
التغيرات في معدل الانحلال على نسخة يمكن أن يسهم أيضا في التغييرات في مستوى التعبير نسخة في دولتين مختلفتين هما7،8. استناداً إلى نتائج الدراسة السابقة أن الانتقال بين الانتشار والتتابع يرتبط ارتباطاً بالتغيرات في مستويات متعددة ميكرورناس9، سألنا عما إذا كانت هناك أيضا مساهمة من تسوس نسخة التفاضلية في التغيرات التي طرأت على التعبير الجيني في تكاثر مقابل الليفية هادئة.
من أجل مراقبة استقرار نسخة، عقدنا العزم معدل انحلال نصوص على نطاق الجينوم في تكاثر مقابل خلايا هادئة. لتحقيق هذا الهدف، علينا رصد معدلات تسوس في تكاثر مقابل الليفية هادئة بالأخذ المانع للنسخ الجديدة ورصد معدل الذي اختفى النصوص الفردية على مر الزمن. وميزة هذا النهج هو أنه، مقارنة بالأساليب التي ترصد عموما التعبير الجيني، ببساطة عن طريق تثبيط توليف نسخة جديدة، سوف نكون قادرين على تحديد معدل الانحلال لهذه النصوص بشكل منفصل عن المعدل الذي هم نسخها.
العلاج ActD تمنع النسخ الجديدة وتحديد معدلات تسوس نسخة طبق بنجاح في دراسات سابقة متعددة. وقد استخدمت ActD تشريح أهمية استقرار الجيش الملكي النيبالي في التغييرات في نسخة الوفرة التي تنجم عن المعاملة مع السيتوكينات الالتهابية برو5. وقد استخدمت أيضا نهجاً مماثلاً تشريح الفروق في معدل تسوس نسخة في تكاثر مقابل المتباينة C2C12 الخلايا كما أنها تعتمد على النمط الظاهري العضلات متمايزة10. وكمثال آخر، كما تم اكتشاف عالمي مرناً التنصيف في pluripotent والخلايا الجذعية الجنينية الماوس المختلفة11. في هذه الأمثلة، أظهرت مرناً تسوس هامة لتنظيم محضر وفرة وانتقال الخلايا إلى خلية مختلف الدول.
تطبيق الأساليب المذكورة أدناه، اكتشفنا التغيرات في معدلات تسوس نسخة في ما يقرب من 500 الجينات عند مقارنة الليفية في الدول المتكاثرة وهادئة12. على وجه الخصوص، فقد اكتشفنا أن الأهداف التي ميكرورنا مير-29، ودوونريجولاتيد في خلايا هادئة، استقرت عند انتقال الخلايا بالتتابع. يصف لنا هنا المنهجية التي نحن المستخدمة في تحديد معدلات تسوس في الخلايا المتكاثرة وهادئة. هذه المنهجية مفيدة لمقارنة العالمية معدلات تسوس مرناً في اثنين متميزة لكن ظروف مماثلة عند التماس معلومات عن سرعة المتحللة الجينات. ويمكن استخدامه أيضا لمعالجة مسائل أخرى مثل التأثير شروط ثقافة الخلية على اضمحلال نص، على سبيل المثال، في اثنين من الأبعاد مقابل الثقافات الأبعاد الثلاثة. معدلات تسوس يمكن أن تكون مصممة على نطاق الجينوم مع أساليب مثل [ميكروارس] أو ما يليها الحمض النووي الريبي "بدلاً من ذلك"، قبكر في الوقت الحقيقي أو النشاف شمال يمكن استخدامها لتحديد معدلات تسوس على أساس الجينات بالجينات أو إيسوفورم من إيسوفورم. ثم يمكن استخدام هذه المعدلات لحساب نصف عمر كل الجينات رصد وتحديد الجينات مع اضمحلال معدلات مختلفة في هذين الشرطين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافق جميع التجارب التي وصفت "مجالس المراجعة المؤسسية" في جامعة برنستون، وجامعة كاليفورنيا في لوس أنجليس.
1. إعداد الليفية المتكاثرة وتحول دون اتصال لوقت أكتد بالطبع
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول تيميكورسي مع تيميبوينتس الأربعة. يمكن جمع ثلاث عينات مستقلة بيولوجيا كل تيميبوينت بجمع لوحات زراعة الأنسجة المختلفة في تجربة واحدة، أو يمكن أن تتكرر هذه التجربة عدة مرات مع مختلف الثقافات من الخلايا. في تجربتنا، يوفر طبق استنبات الأنسجة 10 سم (قطر) واحد (لوحة واحدة) الحمض النووي الريبي كاف للتحليل. إذا لزم الأمر، يمكن تجميع أطباق زراعة الأنسجة متعددة لكل عينة لزيادة عدد الخلايا في كل تيميبوينت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤديها نفس التجربة مع الليفية المعزولة من مختلف الأفراد كما يتطابق البيولوجية مستقلة حقاً.
- إنشاء ثقافات المتكاثرة وهادئة للخلايا لتحليل تسوس نسخة. لتكاثر الخلايا، وتقسيم الخلايا كل ثلاثة أيام بينما الخلايا تحول دون الاتصال أصبحت تحول دون الاتصال.
- للخلايا التي تحول دون الاتصال، تغيير في المتوسط كل يومين لمدة 7 أيام. تقسيم الخلايا المتكاثرة 2 أيام قبل الليفية تحول دون الاتصال مستعدون لجمع. مثال لمخطط الثقافة خلية يرد في الشكل 1. توفير الخطوات المتبقية في هذا المقطع بروتوكول مفصل لإنشاء وتقسيم الخلايا.
- عزل الخلايا الليفية الجلدية الأولية من جلد الأطفال حديثي الولادة وفقا للبروتوكولات المعمول بها13. مرور الليفية لضمان مجموعة متجانسة من سكان.
ملاحظة: يمكن تجميد الخلايا الليفية ومذاب، إذا لزم الأمر. - ذوبان الجليد أو ريبلاتي الليفية، إذا لزم الأمر. تنمو الخلايا الليفية في دميم مع المصل 10% تحت ظروف معقمة في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. تستخدم الخلايا الليفية التي كانت تزرع لأقل من 10 مقاطع. يجب أن تكون الخلايا الليفية < روافد 80% اليوم من تقسيم الخلايا لجعل السكان المتكاثرة وهادئة.
- لتقسيم طبق استنبات الأنسجة إلى لوحات متعددة، بريوارم برنامج تلفزيوني، التربسين، والمتوسطة مع المصل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- نضح أو استخدام بيبيت لإزالة المتوسطة من كل لوحة زراعة الأنسجة بالخلايا تكون ريبلاتيد.
- بيبيت PBS الحارة على كل لوح (10 مل من محلول للوحة 150 مم، 5 مل من محلول للوحة 100 مم، 2 مل لبئر صفيحة جيدا 6)، و 1 مل لبئر 12 لوحة جيدا.
- أسبيراتي أو بيبيت لإزالة برنامج تلفزيوني من كل لوحة زراعة الأنسجة.
- بلطف بيبيت 1 × التربسين-يدتا على كل لوح (8 مل من محلول للوحة 150 مم، 3 مل من محلول للوحة 100 مم، 2 مل لبئر صفيحة جيدا 6، ومل 1 لبئر 12 لوحة جيدا).
ملاحظة: جعل 1 x التربسين-يدتا بتمييع العقيمة 10 x يدتا التربسين في برنامج تلفزيوني العقيمة. ينبغي أن يكون الحل النهائي x 1 0.05% يدتا التربسين و 0.02 في المائة. - احتضان التربسين مع خلايا لمدة 5 دقائق.
- اضغط برفق لوحة لإزاحة الخلايا من اللوحة.
- بيبيت ريسوسبيند الخلايا في تعليق خلية مفردة.
- نقل الخلايا في حل التربسين لأنبوب مخروطي الشكل يحتوي على نفس الحجم من دميم مع 10% مصل (8 مل من محلول للوحة 150 مم، 3 مل من محلول للوحة 100 مم، 2 مل لبئر صفيحة جيدا 6 ، و 1 مل لبئر 12 لوحة جيدا).
- تدور أسفل الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز لإزالة التربسين.
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في وحدة تخزين مناسبة المتوسطة والعد مع هيماسيتوميتير لتحديد تركيز الخلية.
- والبذور 5 × 105 خلايا كل 100 مم لوح زراعة الأنسجة لتكاثر الخلايا تحول دون الاتصال.
- باستخدام هذا الأسلوب، إنشاء العينات المنتشرة وتحول دون الاتصال اللازمة للتحليل (الشكل 1).
2-أكتد وقت الدورة
- ريسوسبيند أكتد بتركيز 1 ملغ/مل (ل 1 ملغ من أكتد، استخدام ميليلتر 950 من PBS العقيمة و 50 ميليلتر من العقيمة [دمس]) مخزون.
ملاحظة: الحلول الأرصدة المجمدة من أكتد ينبغي أن يكون ثابتاً لمدة شهر في-20 درجة مئوية. ينبغي تجاهل الحلول تمييع وعدم تخزينها لاستخدامها مرة أخرى. - إضافة أكتد إلى حجم متوسط بريوارميد المناسبة للثقافة البيولوجية خلية تكرار جميع اللوحات التي تم إعدادها ل 0، 120 و 240 و 480 دقيقة تيميبوينتس (الشكل 2). إضافة أكتد بتركيز 15 ميكروغرام كل مل متوسطة. مزيج جيد ونضح قبالة المتوسط القديمة، وإضافة المحتوية على أكتد المتوسطة للخلايا.
- بالنسبة لأسهم 1 ملغ/مل، إضافة 15 ميليلتر ActD لكل مل من المتوسطة، مثلاً، عن 10 مل متوسطة للوحة 100 مم، إضافة 150 ميليلتر ActD.
- لجمع العينة تيميبوينت صفر، نضح بلطف بعيداً عن أكتد المتوسطة، وبيبيت بريوارميد برنامج تلفزيوني على الخلايا. بيبيت 10 مل من محلول للوحة 150 مم، 5 مل من محلول للوحة 100 مم، 2 مل لبئر صفيحة جيدا 6، ومل 1 لبئر 12 لوحة جيدا.
- نضح بلطف أو بيبيت إيقاف برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات التي تنطوي على عزل الحمض النووي الريبي مع المياه خالية من رناسي وأنابيب ميكروسينتريفوجي رناسي خالية وخالية من رناسي الماصات. ينبغي ارتداء القفازات وتغيرت كثيرا عند العمل مع الجيش الملكي النيبالي. - إضافة الفينول-غوانيدين إيسوثيوسياناتي الحل (1 مل/10-سم لوحة، مع 4 × 105 إلى خلايا 4 × 107 ) مباشرة إلى لوحة زراعة الأنسجة.
ملاحظة: غوانيدين الفينول إيسوثيوسياناتي الحل هو حل أحادي الطور الذي يحافظ على نوعية الجيش الملكي النيبالي بينما ليسينج الخلايا وفصل الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي والبروتين من بعضها البعض.
تنبيه: إيسوثيوسياناتي الفينول وغوانيدين المسببة للتآكل. استخدام الحماية المناسبة. - بيبيت الفينول-غوانيدين isothiocyanate الحل-خلية خليط صعودا وهبوطاً عدة مرات لجعل خليط متجانس.
ملاحظة: يمكن تخزين غوانيدين الفينول isothiocyanate الحل ليساتي في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في-20 درجة مئوية لتصل إلى سنة. - جمع كل نقطة الوقت بعد اجتاز مقدار الوقت المناسب باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوات 2، 3-2.6.
3-عزل الجيش الملكي النيبالي إجمالي من الفينول-غوانيدين Isothiocyanate الحل ليستي
- احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لضمان حل كامل من الجيش الملكي النيبالي-البروتين المجمعات.
ملاحظة: يمكن إجراء خطوات بروتوكول حل isothiocyanate غوانيدين الفينول في درجة حرارة الغرفة إلا إذا ذكر خلاف ذلك. - إدخال النصوص سبايك في عنصر تحكم يمكن الكشف عنها مع المنهجية المستخدمة.
ملاحظة: الخارجية الجيش الملكي النيبالي التحكم كونسورتيوم (اركك) سبايك في مراقبة ميكس14 قد صممت خصيصا كعنصر تحكم سبايك لما يليها الحمض النووي الريبي يمكن استخدامه أيضا للبقع الشمالية أو qPCR في الوقت الحقيقي. سبايك في الضوابط المصممة خصيصا للتكنولوجيات ميكرواري أيضا (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: بعد وتدور الأولى، ينبغي فصل العينة إلى طبقات 3-طبقة عضوية أحمر في الجزء السفلي، ومن الطور البيني الأبيض/الوردي في الوسط، وطبقة مائية واضحة في الجزء العلوي (الشكل 3).
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال الطور البيني خلال هذه العملية. فلا بأس ترك بعض الكسر مائي. فمن الأفضل ترك بعض الكسر مائي مما تشمل أيضا بعض طبقات الطور البيني، كما بما في ذلك الطور البيني أن تلوث طبقة الجيش الملكي النيبالي مع الحمض النووي. الطبقة المائية سيكون حوالي نصف حجم الأولية، حتى حوالي 0.9 مل إذا كان المخلوط الحل/كلوروفورم isothiocyanate غوانيدين الفينول 1.8 مل.
ملاحظة: هذا سوف ينتج بيليه الصلبة الكثيفة، والتي من السهل رصد بعد تدور الخطوات التي تتبع.
ملاحظة: يمكن استخدام تلميح بيبيت فضفاضة عقد في متناول اليد لإزالة الزائدة الإيثانول. إذا كان بيليه الجيش الملكي النيبالي بالانزعاج، ولكن ليست مهملة، يمكن تكرار الدوران المحقق وإزالة المادة طافية مرة أخرى. تجنب إهمال بيليه كما سيتطلب هذا المحقق لتكرار الإجراء بأكمله.
ملاحظة: بيليه الجيش الملكي النيبالي هو أقل ضغط على هذه الخطوة ويميل إلى التحرك. أن تكون أكثر حذراً عند التعامل مع بيليه في هذه المرحلة لتجنب فقدان الجيش الملكي النيبالي.
4-تحليل لوفرة نسخة
- التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي والتحقق من الحمض النووي الريبي للنقاء باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
ملاحظة: نسبة امتصاص في 260 nm إلى 280 شمال البحر الأبيض المتوسط ينبغي أن يكون حوالي 2.0 للجيش الملكي النيبالي. - تحليل الحمض النووي الريبي مع 1% [اغروس] هلام أو عبارة عن تقنية مكافئة لتصور مدى تدهور.
ملاحظة: اثنين واضحة العصابات تمثل 18S و 28S الرنا الريباسي يجب أن تكون مرئية بوضوح (الشكل 4). إذا لم تظهر هذه العصابات، قد تدهورت في الجيش الملكي النيبالي. وتقدم نصائح إطلاق النار المتاعب لتدهور الجيش الملكي النيبالي في المناقشة. - رصد نسخة وفرة في مختبرين المجمعة من الحمض النووي الريبي مقارنة مع ارتفعت في الداخلية القياسية باستخدام [ميكروارس]15، تسلسل الحمض النووي الريبي16،17من قبكر في الوقت الحقيقي، أو اسطوانات الشمالية يقوم18.
- تحديد الوفرة لكل نسخة في كل مرة نقطة مقارنة مع عنصر تحكم ارتفعت في الوفرة معروفة.
ملاحظة: ل [ميكروارس]، سوف تكون القيم كثافات الأسفار. للبقع الشمالية، يمكن قياسها كمياً العصابات على فيلم الأشعة السينية. قبكر في الوقت الحقيقي، يمكن تحديد وفرة نسخة مقارنة بالمعايير المعروفة مع أسلوبتي -σσC219. للحمض النووي الريبي-Seq، يمكن تحديد قيم طبيعية فبكم أو الأجزاء في كل كيلوبس إكسون الواحدة مليون القراءات المعينة. لمعدلات تسوس isoform محددة، يمكن أن تحلل البيانات تسلسل الحمض النووي الريبي استخدام منهجيات علم isoform مثل ديكسسيق20. أفضل تحديد أسعار تسوس Isoform محددة مع ما يليها الحمض النووي الريبي إذا أريد لها أن تكون مصممة مع البيانات ميكرواري، ثم يجب تحليل البيانات على أساس التحقيق بالتحقيق بدلاً من أساس الجينات بالجينات. المحلل يجب أن تكون حذراً عند تفسير المعلومات من عدد محدود من تحقيقات. على سبيل المثال، قد يكون هناك تحقيقات 5 أو أقل التي غنية بالمعلومات حول isoform خاصة. في هذه الحالة، سوف تحتاج إلى المحلل تحديد ما إذا كان سلوك هذه المسابر متسقة بما فيه الكفاية حتى تكون النتائج موثوقة.
- تحديد الوفرة لكل نسخة في كل مرة نقطة مقارنة مع عنصر تحكم ارتفعت في الوفرة معروفة.
- أداء قبكر في الوقت الحقيقي على الحمض النووي الريبي المعزولة17 في العينات التي تم جمعها لتحليل الجينات سرعة المتحللة، مثل ج-حركة وجين المتحللة ببطء مثل جابده، لكسب ثقة هذا الاضمحلال نسخة معدلات تم الكشف عنها بدقة.
ملاحظة: لمزيد من التأكيد، تحقيقات محددة isoform قبكر في الوقت الحقيقي يمكن وضع والمستخدمة لرصد وفرة isoforms محددة مع مرور الوقت21.
5.تسوس معدل ثابت العزم
- لكل تيميبوينت، سجل تحويل القيم وفرة لكل نسخة (الخاصة بالجينات أو إيسوفورم على حدة).
ملاحظة: سجل تحويل القيم سيتم تحويل المنحنيات الأسية تسوس إلى الخطوط التي يمكن أن تناسب مع نموذج تسوس خطي22. - تناسب الشخصية التعبير لكل نسخة (الخاصة بالجينات أو محددة isoform) إلى نموذج خطي اضمحلال. صيغة لنموذج من هذا القبيل هو f(t) = C-r * t. في هذه المعادلة، C هو ثابت يمثل مبلغ بداية من نسخة r هو معدل الانخفاض وتي أن الوقت قد حان منذ بداية التجربة. من هذه المعادلة، تحديد معدل الانحلال ك r*ln(10) (انظر المرجع11).
ملاحظة: حزمة البرامج ماسيجبرو نهج يستند إلى الانحدار المصممة لكشف الفروق الشخصية التعبير الجيني الكبير في الوقت بالطبع البيانات23. يتوفر نموذج التعليمات البرمجية والنتائج ماسيجبرو في: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - تصفية الجينات التي لا تناسب نموذج تسوس سجل خطية. وهذا يمكن أن يتحقق مع اختبار ANOVA F.
ملاحظة: الاختبار و يستند إلى إحصاء F، التي تعرف بأنها التباين بين الوسائل العينة مقسوماً تباين داخل عينات. تصحيح فالقيم لمقارنات متعددة عن طريق تطبيق خطي step-up بينجاميني وهوشبيرغ اكتشاف كاذبة الداخلي24. فاء-قيمة أكبر من 0.05 مع اختبار F يمكن استخدامها كقطع للجينات التي لا تناسب نموذج سجل خطي تسوس. - إجراء اختبار ANOVA F لتحديد النصوص مع مصطلح تفاعل كبير بين شرط قاطع دورة الخلية والوقت (معدل اكتشاف كاذبة، فرانكلين روزفلت < 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أبلغنا سابقا نتائج التحاليل ميكرواري معدلات تسوس نسخة في الليفية البشرية الأولية المنتشرة وتحول دون الاتصال أكثر الطبع وقت 8 ساعة12. وترد قائمة الجينات مع تغير كبير في استقرار نسخة مقارنة الليفية المتكاثرة وتحول دون الاتصال التكميلية الجدول1. يتم توفير كثافات fluorescence صفر في الوقت، ومر وقت بعد العلاج أكتد. وأدرجت الجينات على القائمة بتحديد الجينات التي تحتوي على منحدرات مختلفة اختلافاً كبيرا في ظروف المتكاثرة وتحول دون اتصال باستخدام اختبار ANOVA F. وترد أمثلة للجينات مع معدلات تسوس مختلفة في الخلايا الليفية المتكاثرة وهادئة في الشكل 5.
الشكل 1 : التخطيطي لبروتوكول لإنشاء لوحات المتكاثرة وتحول دون اتصال لتحليل دورة الوقت ActD. ويرد وصف يوما بعد يوم للخطوات اللازمة لإقامة ثقافات خلايا للعلاج أكتد، افتراض سيتم استخدام أربع تيميبوينتس للوقت بالطبع. للبساطة، تظهر لوحة واحدة كل تيميبوينت، ولكن لوحات إضافية يمكن أن تضاف إلى توليد replicates البيولوجية. يمكن أيضا تعديل البروتوكول لإضافة المزيد من ألواح الخلايا إذا هي رغبت في تيميبوينتس أكثر من أربعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : معدل التخطيطي ActD وقت الدورة واضمحلال العمليات الحسابية في هادئة مقارنة بتكاثر الخلايا الليفية البشرية. كسر مرناس المتبقية على مر الزمن لنسخة افتراضية بعد العلاج مع مثبط النسخي يرد المتوقعة. وترد أدناه، عينة قطع جزء صغير مرناً الباقية على مر الزمن للجينات التي أكثر استقرارا في هادئة من تكاثر الخلايا والجينات التي أكثر استقرارا في التكاثر من خلايا هادئة. لكل داتابوينت، تظهر قيمة واحدة فقط للوضوح. في البروتوكول الفعلية، سيكون هناك ثلاثة داتابوينتس لكل تيميبوينت. لقد تم تعديل هذا الرقم من أطروحة الدكتوراه إليزابيث بندر جونسون برضاها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : صور فوتوغرافية لخلط الكاشف isothiocyanate غوانيدين الفينول وكلوروفورم قبل وبعد استخدام الطرد المركزي. ويرد الخليط عندما كاشف isothiocyanate غوانيدين الفينول وكلوروفورم في البداية الجمع، وبعد خلط وبعد الطرد المركزي. بعد أن يتم فصل الخليط، هو مرحلة القاع، وأحمر، المرحلة العضوية. الطور البيني في الوسط الأبيض والملبدة بالغيوم. مرحلة أعلى من المرحلة المائية وهذا واضح. الجيش الملكي النيبالي في المرحلة المائية، التي ينبغي أن تجمع مع ماصة لهطول الأمطار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : جل عينة الحمض النووي الريبي لرصد نوعية الحمض النووي الريبي. مثال لجل الجيش الملكي النيبالي عرض عينات مع الحمض النووي الريبي سليمة. وقد رنا سليمة العصابات بارزة ل rRNAs 28S و 18S. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : أمثلة من الجينات مع معدلات تسوس مختلفة في تكاثر مقابل الليفية هادئة. وترد كثافات الفلورية (التعبير الجيني) على مر الزمن للجينات الأربعة التي تسوس بشكل مختلف في تكاثر مقابل الليفية هادئة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الجدول 1: كثافات الأسفار الخاصة بالجينات في الخلايا الليفية المتكاثرة وهادئة. البيانات هي الليفية المقدمة للساعة الصفر ومر وقت بعد العلاج أكتد في التكاثر وتحول دون الاتصال. وترد القيم ف وقيم س، ومعدلات اكتشاف كاذبة. هو طبع الجدول من نشر الأصلي في علم الجينوم BMC12. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن يكون التتابع الناجم عن إشارات خارجية بما في ذلك الانسحاب من ميتوجينس أو مصل الدم، وعدم التصاق الخلايا، وتثبيط الاتصال. تثبيط الاتصال، واحدة من العديد من الأساليب الممكنة لحمل التتابع، هو عملية عالية تقحم حفظت فيها الخلايا إنهاء دورة الخلية التكاثري ردا على خلية لخلية الاتصال. نحن نركز هنا على تثبيط الاتصال كمثال على أسلوب للحث على التتابع. أفادت الدراسات السابقة أن خلية خلية الاتصال يمكن أن تؤثر على نشوء حيوي microRNA25، وبالتالي، النتائج معلومات بشأن أسلوب التتابع واحد ودراسات إضافية مطلوبة لتحديد التغييرات التي ترتبط بالتتابع في حد ذاته.
قمنا باستخدام الخلايا الليفية مثنوية البشرية الأساسية التي نحن معزولون عن جلد الأطفال حديثي الولادة. وبدأنا هذه التجارب مع الخلايا الليفية التي كانت باساجيد أقل من 10 مرات. يمكننا إهمالها الليفية بعد مرور بسبب أنهم سينيسسي. بينما يركز هذا البروتوكول على الليفية الجلدية المنتشرة وهادئة، يمكن استخدام الإجراءات المذكورة لرصد معدلات تسوس في أنواع مختلفة من الخلايا، وتحت ظروف مختلفة.
نحن رصد مرناً تسوس معدلات الجينوم على نطاق المنظومة باستخدام مسار إغلاق وقت نسخ. إغلاق الوقت دورات هي الطريقة الأكثر استعمالا لفصل تسوس مرناً من النسخ مرناً من أجل حساب مرناً إنصاف1،26. في الأسلوب الموصوفة هنا، أكتد، مخدرات أن المجمعات مع ب-شكل الحمض النووي لمنع استطالة "رنا بوليميراز" الثاني، يستخدم لاعتقال النسخ مرناس27. يمكن تحديد معدل أن النصوص انخفاض في وفرة على مدى فترة زمنية 8 ساعات كمعدل الانحلال في المحاضر.
قيداً هاما النهج المستندة إلى أكتد لرصد الاضمحلال نسخة هو أن أكتد يمنع النسخ العالمية، التي سوف تؤثر على بقاء الخلايا. هذا ينبغي أن يوضع في الاعتبار عند تفسير البيانات المستندة إلى أكتد، كما يجري تحديد أسعار الاضمحلال في الخلايا التي هي أكد أكثر من دولتهم الأصلية. شاغل هام آخر أن آثار ActD قد تكون مختلفة بالنسبة للخلايا في دول مختلفة، بما في ذلك تنتشر مقابل الليفية تحول دون الاتصال. نهج واحد للتقليل من الآثار الجانبية للعلاج أكتد هو الحفاظ على الوقت دورات قصيرة المدة. لهذا السبب، نحن تحديد مسار وقت ح 8.
وهناك نهج بديلة ل ActD لرصد محضر تسوس معدلات28،29. وقد استخدمت سلالات الخميرة مع حساسة للحرارة رنا بوليميراز الثاني الآليلات لرصد معدلات تسوس نسخة30. اختلاف على هذا النهج الذي يسمى "الارتساء بعيداً" قد استخدمت في الخميرة تحقيقا لاستنفاد الشرطي من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني استجابة للعلاج ربمسن31،32. من الممكن أيضا لرصد الاضمحلال في الخلايا مع النسخ النشطة. على سبيل المثال، اليوراسيل الايثير استبدال النيوكليوتيدات يمكن إدخالها في الخلايا، وإدماج مرناً، وبعد الكشف عن33،،من3435. مع هذا النهج، يمكن تحديد المعدل الذي يتم تصنيعه النصوص مختلفة في الخلايا التي هي استمرار لتوليف مرناً. وقد مثل هذا النهج ميزة كبيرة على العلاج أكتد لأنها ليست سامة. في تجربتنا، ومع ذلك، هناك يمكن تقلب في استرداد النصوص مع هذه الأساليب. علاج أكتد نهج واضحة واستنساخه لرصد الاضمحلال نسخة.
خطوات قليلة في البروتوكول المقدمة الحاسمة لنجاحها. مسألة هامة هي منع تدهور الجيش الملكي النيبالي خلال عزل الحمض النووي الريبي. في الخطوة 4، 1، ينبغي رصد الجيش الملكي النيبالي للتدهور. إذا لم يحتو الحمض النووي الريبي اثنين من قمم واضحة ل rRNAs 18S و 28S (الشكل 4)، وهذا علامة على حدوث تدهور نسخة. وتوفر بعض الصكوك عشرات عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) تتراوح من 1 إلى 10. مع عشرات رين في حدود 7-10 عينات مقبولة لمزيد من التحليل. إذا كان الجيش الملكي النيبالي المتدهورة، فمن المهم اتخاذ المزيد من الاحتياطات للحيلولة دون تدهور الجيش الملكي النيبالي، مثل ضمان أن الحلول وستيريليواري رناسي مجاناً، وأن يتم ارتداء قفازات عند التعامل مع ماصات للحمض النووي الريبي. يمكن أن يكون بريترياتيد المياه مع 0.1% ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)، المحتضنة لمالا يقل عن 2 ح في 37 درجة مئوية، ويعقم لمالا يقل عن 15 دقيقة علما أن ديبك لا يمكن استخدامها مع المخازن المؤقتة على أساس تريس. يمكن إضافة رناسي تطهيرها حلول يمكن استخدامها أيضا لإزالة رناسي من أسطح العمل وأجهزة الطرد المركزي، والماصات والكاشفات التي تحول دون رناسيس للعينات.
خطوة حاسمة أخرى هي الفصل بين مراحل الحل isothiocyanate غوانيدين الفينول. من المهم التأكد من أن يتم تجميعها فقط في المرحلة العليا للجيش الملكي النيبالي التجهيز. إذا كان الجيش الملكي النيبالي الناتجة عن ذلك يتضمن المتبقية الفينول، نسبة امتصاص في 230 و 260 و 280 نيوتن متر لن يكون بنسبة 1:2:1 كما هو متوقع. أعلى من المتوقع امتصاص في 230 نيوتن متر يمكن أن تشير إلى التلوث بالفينول. في حالة حدوث ذلك، يمكن أن يكون الجيش الملكي النيبالي الإيثانول عجلت مرة أخرى وتغسل عدة مرات إضافية لإزالة أي بقايا الفينول.
وأخيراً، عندما تتم إزالة المادة طافية، والجيش الملكي النيبالي هو القريبون بيليه يمكن لزجة، ورقيقة، والانزعاج بسهولة. في هذه المرحلة، من المهم اتخاذ المزيد من الحيطة في تقلع السائل. قد يكون من المهم لتصور الأنبوب مع إضاءة جيدة لتحديد موقع بيليه وتأكد من لا تشعر بالانزعاج. أضاف الجليكوجين يمكن أن يساعد على ضمان بيليه مرئياً في هذه المرحلة.
اختيار النقاط الزمنية لدورة الوقت تسوس مسألة هامة أيضا للنظر. لا إلى حد كبير بينما تيميبوينتس أربعة اخترنا يسمح لنا برصد الاضمحلال للجينات 10,000 أكثر، تسوس بعض الجينات أثناء الوقت ح 8. إذا كانت النصوص لم تدم طويلاً أولوية عالية، أن المحققين قد ترغب في إضافة مجموعات عينة إضافية قبل 120 دقيقة، على سبيل المثال في 30 دقيقة. للحصول على تقييم أفضل للنصوص المعمرة، المحققين قد تحتاج إلى إضافة مجموعات عينة إضافية في وقت لاحق تيميبوينتس.
يمكن أن تؤدي مشكلة محتملة أخرى إذا لا تتبع معدلات تسوس التوزيع المتوقع. على سبيل المثال، قد يكون هناك عدد كبير جداً من أو جينات قليلة جداً تظهر تسوس سجل خطي معدل أكثر من 8 ساعات. إذا حدث هذا، أنها مفيدة لرصد معدلات اضمحلال المورثات التي من المعروف أن تكون قصيرة أو طويلة الأمد من أجل تحديد ما إذا كان أنها تتبع النمط المتوقع.إذا كان لديك جينات منحدر الإيجابية بدلاً من السلبية مع مرور الوقت، يمكن يستبعدن من مزيد من التحليل كما أنها لم تدل بمعدل انحلال سجل خطية. مسألة أخيرة يمكن أن تنشأ إذا كانت الخلايا في الشرطين يجري مقارنة بردود مختلفة جداً أكتد أن العديد من الجينات تسوس أسرع في حالة واحدة. وفي هذه الحالة، قد يكون من المفيد الإشارة إلى الفرق في معدل تسوس بين الدولتين، بل أيضا إلى المصطلحات الخاصة في عناصر التحكم التي نقترح منها قبل عزل الحمض النووي الريبي تقديم معلومات عن معدلات الاضمحلال المطلق في الدولتين.
القدرة على رصد معدلات تسوس نسخة بين الخلايا المتكاثرة وهادئة أو أي من الدولتين مماثلة لديها القدرة على توفير مزيد من التبصر في أهمية تسوس نسخة في تنظيم التغيرات الفسيولوجية. وتشمل تطبيقات الخلايا مع أو بدون تفعيل النمطان، قبل وبعد الشيخوخة أو العدوى الفيروسية، مع أو بدون ضربة قاضية لجين معين، أو في دولتين مختلفتين من التمايز. يمكن أن يقترن النتائج التي توصل إليها بتسلسل الحمض النووي الريبي لتوفير معلومات حول التغييرات الخاصة isoform في معدلات تسوس نسخة، والتي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة التغييرات في التعبير isoform لاحظ كما تخضع التحولات الفسيولوجية للخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا المصالح المتنافسة الكشف.
Acknowledgments
وكان HAC الباحث ميلتون هاء كاسل مؤسسة ألن ريتا (http://www.ritaallenfoundation.org). تم تمويل هذا العمل بالمنح إلى HAC من مركز المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة لمنح الامتياز P50 GM071508 (ديفيد بي بوتستين)، مؤسسة PhRMA منحة 2007RSGl9572، مؤسسة وطنية العلم OCI منحة 1047879 لديفيد آب/أغسطس، المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم R01 GM081686، المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة R01 GM0866465، إيلي & أديت واسع مركز الطب التجديدي & بحوث الخلايا الجذعية، مركز الصحة/جامعة كاليفورنيا كتسي المعاهد الوطنية للصحة كانتور قزحية العين للمرأة منحة UL1TR000124، وجمعية اللوكيميا اللمفاوية. وأيد البحث عنها في هذا المنشور المعهد الوطني للسرطان من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم P50CA092131. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. HAC وعضو إيلي & "أديت مركز واسع للطب التجديدي" & بحوث الخلايا الجذعية ومعهد البيولوجيا الجزيئية في جامعة كاليفورنيا وجامعة كاليفورنيا المعلوماتية البرنامج المشترك بين الإدارات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
