Summary
우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
정지는 임시, 가역 상태 셀 세포 분열을 중지 해야 하지만 증식 하는 능력을 유지. 우리를 포함 한 여러 연구 정지 관련 유전자 발현에 광범위 한 변화 된가 설명 했다. 이러한 변화 중 일부는 수준 또는 확산 관련 된 녹음 방송 요인 E2F MYC 등의 활동에 변화를 통해 발생합니다. 우리 mRNA 감퇴 확산 및 무부하 셀 사이의 유전자 발현에서 변화에도 기여할 수 있다 설명 했다. 이 프로토콜에서 우리 인간의 피부 포 피 섬유 아 세포의 증식 및 무부하 문화를 설정 하기 위한 절차를 설명 합니다. 우리는 다음 악티노마이신 d (ActD) 확산 및 무부하 셀에 새로운 전사를 억제 하는 절차를 설명 합니다. ActD 치료 성적 부패에서 새로운 전사 해리를 간단 하 고 재현성 접근을 나타냅니다. ActD 치료의 단점은 ActD 세포 생존 능력에 영향을 하기 때문에 시간 코스는 짧은 시간 프레임에 제한 되어야 한다입니다. 대 본 수준 사본 감소율을 확인 하려면 시간이 지남에 모니터링 된다. 이 절차는 유전자와 무부하 fibroblasts 대 확산에 차동 부패 하는 isoforms의 식별에 대 한 수 있습니다.
Introduction
성적 증명서의 정상 상태 수준 반영 성적 종합과 성적 부패의 기여. 규제 및 조정된 대 본 부패는 제어 생물 학적 과정1,2,,34중요 한 메커니즘입니다. 예를 들어 성적 감소율 염증 성 cytokine 종양 괴 사 인자5활성화 다음 이벤트의 시간 시리즈에 기여할 표시 되었습니다.
우리는 이전 확산 및 기본 인간 섬유 아 세포에 정지 사이 과도 많은 유전자6의 증명서 수준에 변화와 관련 된 나타났습니다. 이러한 변화 중 일부 녹음 방송 요인의 활동에 이러한 두 상태 사이의 차이 반영합니다.
녹취 록의 부패 속도 변화 또한 두 개의 서로 다른 상태7,8대 본 식 수준에 변화에 기여할 수 있다. 확산 및 정지 사이 과도 여러 microRNAs9의 수준에 변화와 관련 된 우리의 이전 연구 결과 바탕으로, 우리는 또한 변화에 차동 성적 부패에서 기여 여부 요청 무부하 fibroblasts 대 확산에 진 식입니다.
사본을 안정성을 모니터 하기 위해 우리는 성적 무부하 셀 대 확산에 게놈 넓은 감퇴의 속도 결정. 이를 위해, 우리는 새로운 전사의 억제제를 소개 하 고는 개별 성적표 사라진 시간이 지남에 속도 모니터링 하 여 무부하 fibroblasts 대 확산에 감소율 모니터링. 이 방법의 장점은, 단순히 새로운 사본 합성을 억제 함으로써 전체적인 유전자 발현을 모니터링 하는 방법에 비해 우리가 된다는 것에서 그들은 속도는 별도로이 성적에 대 한 부패 속도 확인할 수 복사할 수 있습니다.
새로운 전사를 억제 하 여 사본 감소율을 결정 ActD 치료 여러 이전의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. ActD 프로 염증 성 cytokines5치료에 기인 하는 사본 풍부에서에 RNA 안정성의 중요성을 해 부에 사용 되었습니다. 유사한 접근은 또한 그들은 차별화 된 근육 형10채택 차별화 된 C2C12 셀 대 확산 성적 부패 속도 차이 해 부하 사용 되었습니다. 또 다른 예로, 글로벌 mRNA 반감기 또한 만능에서 발견 된 하 고 차별화 된 마우스 배아 줄기 세포11. 이 예제에서 mRNA 감퇴 사본 풍부 규제에 대 한 및 다른 셀 상태를 셀의 변환에 대 한 중요 한 표시 되었습니다.
아래 설명 된 방법을 적용, 섬유 아 세포 확산 및 무부하 상태12에 비교할 때 약 500 유전자의 사본 감소율에 변화를 발견 우리. 특히, 우리는 예측에 관한 미르 29, downregulated 무부하 셀에는 대상 셀 전환 정지 때 안정화는 발견 했다. 여기 우리 확산 및 무부하 셀에 감소율을 결정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법론은 급속 하 게 부패 유전자에 대 한 정보는 때 두 비슷한 조건 하지만 뚜렷한 글로벌 mRNA 감퇴 속도 비교 유용 합니다. 그것은 또한 2 차원 3 차원 문화 대에서 성적 부패, 예를 들어, 셀 문화 조건의 효과 등 다른 질문을 해결 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 감소율 등 microarrays RNA 시퀀스 또는 실시간 정량 Pcr 방법 결정된 게놈 넓은 수 또는 북부 blotting 유전자, 유전자 또는 isoform에 의해 isoform 기준 감소율을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 요금은 각 모니터링된 유전자의 반감기를 계산 하 고 부패 속도 두 가지 조건에 다른 유전자를 식별 하 사용할 수 있습니다.
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Protocol
설명 하는 모든 실험은 프린스턴 대학, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다.
1. ActD 시간 코스에 대 한 확산 및 접촉 저해 Fibroblasts 준비
참고:이 프로토콜 사용 하는 timecourse 4 timepoints입니다. 3 생물학으로 독립적인 샘플 timepoint 당 1 개의 실험에서 다른 조직 문화 접시를 수집 하 여 수집 될 수 있습니다 또는 실험 세포의 서로 다른 문화를 여러 번 반복 될 수 있다. 우리의 경험에서 한 10 cm (직경) 조직 문화 접시 (1 접시) 분석에 대 한 충분 한 RNA를 제공합니다. 필요한 경우 각 timepoint에 셀의 수를 늘리기 위해 각 샘플에 대 한 여러 조직 문화 요리를 풀링된 수 있습니다. 또한, 진정으로 독립적인 생물 복제로 다른 개인에서 격리 하는 섬유 아 세포와 같은 실험을 수행할 수 있습니다.
- 대 본 부패 분석에 대 한 셀의 확산 및 무부하 문화를 설정 합니다. 확산 셀 분할 셀 마다 3 일 동안 접촉 저해 세포 접촉 저해 되 고 있다.
- 접촉 저해 셀에 대 한 매체를 7 일 동안 매 2 일 변경. 2 일 전에 접촉 저해 fibroblasts 컬렉션에 대 한 준비가 proliferating 셀을 분할 합니다. 셀 문화 체계의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 이 섹션의 나머지 단계는 설정 하 고 셀 분할에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.
- 13설립된 프로토콜 따르면 신생아 피부에서 기본 피부 섬유 아 세포를 격리 합니다. 균질 인구를 위해 통로 섬유 아 세포입니다.
참고: 섬유 아 세포 냉동 및 해 동, 필요한 경우 될 수 있습니다. - 해 동 또는 필요한 경우 섬유 아 세포, replate. 37 ° C, 5% CO2조직 문화 인큐베이터에서 무 균 조건 하에서 10% 세럼과 DMEM에 섬유 아 세포 성장. 10 미만 구절에 대 한 성장 된 섬유 아 세포를 사용 합니다. 섬유 아 세포 이어야 한다 < 80% 합칠 확산 및 무부하 인구 수 있도록 셀 분할의 날에.
- 조직 배양 접시를 여러 접시, prewarm PBS, 트립 신, 및 보통 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 혈 청으로 분할.
- 발음 또는 피펫으로 replated 될 세포와 각 조직 배양 접시에서 매체를 제거를 사용 하 여.
- 각 접시 (10 mL 150 m m, 100 m m 플레이트에 대 한 솔루션의 5 mL, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의) 12 잘 접시의 우물 1 mL에 피펫으로 따뜻한 PBS.
- Aspirate 또는 피펫으로 각 조직 배양 접시에서 PBS를 제거 하려면.
- 부드럽게 피펫으로 1 트립 신-EDTA 각 접시 (8 mL 150 mm 접시, 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의)에 x.
참고: 확인 1 살 균 10 diluting 하 여 트립 신-EDTA x 트립 신-EDTA 무 균 PBS에 x. 마지막 1 x 솔루션 0.05 %trypsin 및 0.02 %EDTA 이어야 한다. - 5 분에 대 한 셀과 트립 신을 품 어.
- 부드럽게 접시 꺼내 접시에서 셀을 누릅니다.
- 피펫으로 세포를 단일 세포 현 탁 액으로 resuspend.
- 10% 세럼 150 m m 플레이트, 100 mm 접시, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의 (8 mL과 DMEM의 동일한 볼륨을 포함 하는 원뿔 튜브 셀 trypsin 솔루션에 전송 그리고 12의 우물 1 mL 잘 접시).
- 트립 신을 제거 하려면 1000 x g 에서 5 분간 4 ° C에서 셀 아래로 회전 합니다.
- 매체와 카운트의 적절 한 볼륨에 셀 셀 농도 결정 하는 hemacytometer와 resuspend.
- 확산에 대 한 100 m m 조직 문화 접시 당 씨앗 5 x 105 세포와 접촉 저해 셀.
- 이 메서드를 사용 하 여 확산 하 고 접촉 저해 샘플 분석 (그림 1)에 필요한 설정 합니다.
2. ActD 시간 코스
- ActD 1 mg/mL (ActD, 살 균 PBS의 사용 950 µ L 및 살 균 DMSO의 50 µ L의에 대 한 1 밀리 그램)의 재고 농도에서 resuspend.
참고: ActD의 냉동된 재고 솔루션 안정 되어야 한 달-20 ° c.에 대 한 희석 솔루션은 무시 되 고 더 사용 하기 위해 저장 하지 해야 합니다. - 모든 생물 복제 세포 배양 접시를 위한 prewarmed 매체의 적절 한 볼륨 ActD 추가 0, 120, 240, 그리고 480 분 timepoints (그림 2) 설정 했다. ActD 매체의 mL 당 15 µ g의 농도에 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 오래 된 매체 떨어져 발음 ActD 포함 된 매체에 있는 셀에 추가.
- 1 mg/mL 주식에 대 한 추가 15 µ L 150 µ L을 추가 하는 매체, 예를 들어, 100 mm 접시에 대 한 매체의 10 ml의 각 ml ActD ActD.
- 제로 timepoint 샘플을 수집, 부드럽게 ActD 매체를 피펫으로 발음 하는 셀에 PBS를 prewarmed. 피펫으로 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 5 mL 150 mm 접시에 대 한 솔루션의 10 mL.
- 부드럽게 발음 또는 피펫으로 PBS에서.
참고: RNA 격리를 포함 하는 모든 단계는 RNase 무료 물, RNase 무료 microcentrifuge 튜브, RNase 무료 펫과 수행 되어야 한다. 장갑 착용 하 고 RNA와 함께 작업 하는 경우에 자주 변경 해야 합니다. - 조직 문화 접시에 직접 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 (1 mL/10-cm 플레이트 4 x 105 4 x 107 셀)을 추가 합니다.
참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션은 세포를 lysing 서로 다른 RNA, DNA, 그리고 단백질을 분리 하는 동안 RNA 품질을 유지 하는 monophasic 솔루션.
주의: 페 놀 및 guanidine isothiocyanate은 부식성. 적절 한 보호를 사용 합니다. - 피펫으로 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션-셀 혼합 균질 혼합물을 만들기 위해 여러 번 왔다 갔다.
참고: 또는 최대 1 년-20 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 lysate를 저장할 수 있습니다. - 후 적절 한 양의 시간 단계 2.3-2.6에 설명 된 방법을 사용 하 여 각 시간 포인트를 수집 합니다.
3. 페 놀 guanidine Isothiocyanate 솔루션 Lysate에서 총 RNA 격리
- RNA-단백질 복합물의 완전 한 해체를 위해 5 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.
참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 프로토콜의 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행할 수 있습니다. - 방법론 사용으로 검출 될 수 있는 제어 스파이크에 녹취 록을 소개 합니다.
참고: 외부 RNA 제어 컨소시엄 (ERCC) 스파이크 컨트롤 믹스14 특별히 설계 되었습니다 스파이크에서 컨트롤로 RNA-이 대 한 그것은 또한 북부 오 점 또는 실시간 정량에 대 한 사용할 수 있습니다. 스파이크에 컨트롤 microarray 기술을 위해 특별히 설계 된 제공 ( 테이블의 자료참조)도 있습니다.
참고: 초기 스핀 후 샘플 해야 별도 레이어로 3-상단 (그림 3)에 명확한 수성 층 그리고 바닥, 화이트/핑크 interphase, 중간에 빨간색 유기 층.
참고: 수이 과정 동안에 interphase를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 수 분수의 일부 떠날 괜찮습니다. 또한 interphase 레이어는 interphase 등의 일부를 포함 하도록 레이어 DNA와 RNA를 오염 시킬 것 보다는 수성 분수의 일부를 두고 하는 것이 낫다. 수성 층이 됩니다 약 절반 초기 볼륨, 그래서 약 0.9 mL의 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션/클로 프롬 혼합물은 1.8 mL.
참고:이 조밀 하 고, 단단한 펠 릿 스핀 단계 후 모니터링을 쉽게 발생 합니다.
참고: 초과 에탄올을 제거 하는 손잡고 개최 하는 느슨한 피펫으로 팁을 사용할 수 있습니다. RNA 펠 릿 방해 하지만 삭제 하지 탐정 스핀을 반복 하 고 다시는 상쾌한을 제거 수 있습니다. 이 전체 절차를 반복 조사를 요구할 것 이다으로 펠 릿을 삭제 하지 마십시오.
참고: RNA 펠 릿이이 단계에서 적은 소형 이며 이동 하는 경향이 있다. RNA를 손실 되지 않도록 하려면이 시점에서 펠 릿을 처리할 때 특별히 주의 해야 합니다.
4입니다. 성적 풍부의 분석
- RNA를 계량 하 고 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여에 대 한 RNA를 확인 합니다.
참고: 260에서 흡 광도의 비율 280 nm nm RNA에 대 한 약 2.0 이어야 한다. - 1 %agarose 젤 또는 저하의 정도 시각화 하는 해당 기술 RNA를 분석 합니다.
참고: 두 취소 18S를 대표 하는 밴드 그리고 28S rRNA 명확 하 게 보이는 (그림 4)를 해야 한다. 이러한 밴드 표시 되지 않는 경우 RNA 저하 될 수 있습니다. 문제 촬영 팁 RNA 저하에 대 한 토론에 제공 됩니다. - 모니터 대 본 풍부한 RNA의 수집된 aliquots에 비해 아군에 내부 표준 microarrays15, RNA-Seq16,17, 실시간 정량 Pcr 사용 하 여 또는 북부 몰아내고18.
- 알려진 풍요의 제어 아군에 비해 각 시간 지점에서 각 사본에 대 한 풍부를 결정 합니다.
참고: microarrays, 값 형광 강렬 될 것입니다. 북부 오 점, x 선 필름에 밴드를 측정할 수 있습니다. 실시간 정량 pcr, 2-σσCT 방법19알려진된 표준 비교해보면 사본 풍부를 확인할 수 있습니다. RNA-Seq에 대 한 정규화 된 값은 FPKM 또는 kilobase 백만 읽기 매핑된 당 exon의 당 조각으로 확인할 수 있습니다. Isoform 특정 감소율에 대 한 RNA-Seq 데이터 DEXSeq20같은 isoform 인식 방법론을 사용 하 여 분석 수 있습니다. Isoform 특정 감소율은 최고의 RNA이 결정 Microarray 데이터 결정 될 경우, 유전자에 의해 유전자 단위가 아닌 프로브, 프로브 기초 데이터를 분석 해야 합니다. 애 널 리스트는 감지기의 제한 된 수의 정보를 해석할 때 주의 해야 합니다. 예를 들어, 5 이하의 프로브 특정 isoform에 대해 유익 하지 않은 있을 수 있습니다. 이 경우에, 분석 결과 신뢰할 수 있는 이러한 프로브 동작 충분히 일관 되는지 확인 해야 합니다.
- 알려진 풍요의 제어 아군에 비해 각 시간 지점에서 각 사본에 대 한 풍부를 결정 합니다.
- C-Myc 및 자신감을 요금을 정확 하 게 감지 했다 그 성적 부패를 GAPDH 처럼 천천히 부패 유전자 처럼 급속 하 게 부패 유전자 분석에 수집 된 샘플에서 격리 된 RNA17 에 실시간 정량 Pcr을 수행 합니다.
참고: 추가 확인에 대 한 isoform 특정 실시간 정량 프로브 개발 고21동안 특정 isoforms의 풍부를 모니터링 하는 데 사용.
5입니다.감퇴 속도 상수 결정
- 각 timepoint에 대 한 로그-변환 (유전자 또는 isoform 특정) 각 사본에 대 한 풍부한 값입니다.
참고: 로그 변환 값으로 변환 됩니다 지 수 감퇴 곡선 선형 감퇴 모델22로 들어갈 수 있는 라인. - 각 대 본 (유전자 또는 isoform 특정) 선형 감퇴 모델에 대 한 식 프로 파일에 맞게. 이러한 모델에 대 한 공식은 f (t) = C-r * t. 이 방정식에 C는 녹취 록의 시작을 나타냅니다 상수, r의 감소, 속도 이며 t는 시간 실험의 처음부터. 이 방정식에서 r*ln(10)와 감퇴 속도 결정 (참조11참조).
참고: maSigPro 소프트웨어 패키지는 회귀 기반 접근 시간 코스 데이터23에 중요 한 유전자 식 프로필 차이 탐지 하도록 설계 되었습니다. 샘플 코드 및 maSigPro에 대 한 결과에 사용할 수 있습니다: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - 필터 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자를. 이 ANOVA F-검정을 수행할 수 있습니다.
참고: F 검정은 유사로 정의 되는 F-통계, 기반 샘플 의미 샘플 내에서 변이 나눈 사이. 선형 스텝 업 Benjamini 및 Hochberg 거짓 발견 절차24를 적용 하 여 여러 비교에 대 한 p 값을 수정 합니다. Q 값 F-검정 0.05 보다 큰 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자는 컷오프로 사용할 수 있습니다. - 여 지 없이 세포 주기 상태와 시간 사이 중요 한 상호 작용 기간 성적을 결정 하는 ANOVA F-검정을 수행 (틀린 발견 비율, 루즈벨트 < 0.05).
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Representative Results
우리 이전 8 시간 코스12통해 확산 및 접촉 저해 기본 인간 섬유 아 세포에서 사본 감소율의 microarray 분석의 결과 보고 있다. 확산 및 접촉 저해 fibroblasts 비교 성적 안정성에 중요 한 변화는 유전자 목록이 보충 표 1에 제공 됩니다. 형광 강도 ActD 치료 후 시간 코스 이상과 시간 0에 제공 됩니다. 유전자는 ANOVA F-검정을 사용 하 여 확산 하 고 접촉 저해 조건에서 크게 다른 슬로프를가지고 유전자를 확인 하 여 목록에 포함 되었다. 유전자를 확산 하 고 무부하 fibroblasts에 다른 감소율의 예는 그림 5에 나와 있습니다.
그림 1 : ActD 시간 코스 분석에 대 한 확산 및 접촉 저해 번호판을 설정 하기 위한 프로토콜의 도식. ActD 치료에 대 한 셀의 문화를 확립 하기 위해 필요한 조치의 하루--하루 설명, 4 개의 timepoints 시간 과정에 사용 됩니다 가정 제공 됩니다. 편의상 한 접시 timepoint, 당 표시 됩니다 하지만 추가 접시 생물 복제 생성에 추가할 수 있습니다. 프로토콜 추가 셀의 더 플레이트 4 개 이상 timepoints는을 조정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 회로도 ActD 시간 코스와 감퇴의 속도 계산에서 무부하 확산 인간의 섬유 아 세포에 비해. Transcriptional 억제 물 치료 표시 후 가상 사본에 대 한 시간이 지남에 남아 있는 mRNAs의 예상된 분수. 아래, 시간이 지남에 남아 있는 mRNA의 일부의 샘플 플롯에 더 안정적인 유전자 제공 됩니다 확산 셀 및 무부하 셀 보다 확산에 더 안정적인 유전자 보다 무부하. 각 datapoint 선명도 대 한 단일 값만 표시 됩니다. 실제 프로토콜에서 각 timepoint에 대 한 세 가지 방식이 있을 것입니다. 이 그림은 그녀의 동의 함께 엘리자베스 Pender 존슨의 박사 논문에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 혼합 페 놀 guanidine isothiocyanate 시 약 및 클로 프롬의 사진 전과 원심 분리 후. 혼합물 때 페 놀 guanidine isothiocyanate 시 약 및 클로 프롬은 처음 결합, 혼합 후와 원심 분리 후 표시 됩니다. 혼합물을 centrifuged 후 빨간색 이면 아래 단계 유기 단계가입니다. 중간에 interphase 흐린 흰색입니다. 최고 단계 수성 단계 이며, 그것은 분명 하다. RNA는 강수량에 대 한 피 펫을 수집 한다 수성 단계에서 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : RNA 품질 모니터링 샘플 RNA 젤. 보여주는 그대로 RNA와 RNA 젤의 그림. 그대로 RNA 28S와 18S rRNAs 저명한 밴드 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 무부하 fibroblasts 대 확산에 다른 감소율과 유전자의 예. 시간이 지남에 형광 강도 (유전자 발현) 무부하 fibroblasts 대 확산에 다르게 부패 4 개의 유전자에 대 한 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 1: 확산 및 무부하 섬유 아 세포에서 유전자 특정 형광 강렬. 데이터는 시간 0와 확산에 ActD 치료 후 시간 과정 제공 및 접촉 저해 섬유 아 세포. P 값, q 값, 및 틀린 발견 비율 제공 됩니다. 테이블은 BMC Genomics12에 그것의 원래 간행물에서 증 쇄. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
정지는 mitogens 또는 혈 청의 철수, 세포 접착 및 접촉 금지의 부족을 포함 하는 외부 신호에 의해 유도 될 수 있다. 접촉 금지, 정지, 유도 대 한 여러 가지 방법 중 하나는 세포 증식 세포 주기 세포 세포 접촉에 대 한 응답에서 종료 매우 진화론 보존된 과정 이다. 우리는 정지를 유도 하는 방법의 예를 들어 접촉 저해에 여기 초점. 이전 연구 보고가 셀 셀 문의 예측에 관한 속25에 영향을 미칠 수 있습니다, 따라서, 한 정지 방법에 정보를 제공 하는 결과 및 추가 연구는 결정 하는 데 필요한 변경 내용을 정지 와 관련 된 se 당.
우리는 우리가 신생아 피부에서 고립 된 주 인간의 2 중 fibroblasts 사용. 우리는 10 번 미만 passaged 했다 섬유 아 세포와 함께 이러한 실험을 시작. 우리 때문에 나중에 통과 fibroblasts 삭제 그들은 senesce. 이 프로토콜은 확산 및 무부하 피부 섬유 아 세포에 초점을 맞추고, 하는 동안 설명 하는 절차 다른 종류와 다른 조건에서 셀의 감소율을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 mRNA 감퇴 속도 게놈 넓은 전사 차단 시간 코스를 사용 하 여 모니터링. 차단 시간 코스는 mRNA 반감기1,26계산 하려면 mRNA 전사에서 mRNA 감퇴를 디 커플링에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법입니다. 여기서 설명한 방법에서 ActD, 마약 RNA 중 합 효소 II의 연신 율을 차단 하는 DNA의 B 형태와 단지 mRNAs27의 전사를 체포 하는 데 사용 됩니다. 대 본의 감퇴 율으로 성적표는 8 시간 동안 풍부 하 게에서 감소 하는 속도 결정할 수 있습니다.
ActD 기반 접근 모니터링 성적 부패의 중요 한 제한 ActD 방지 세포의 생존에 영향을 미칠 것입니다 세계 전사는 이다. 이 지켜져야 한다 마음에 ActD 기반 데이터를 해석할 때 감소율 셀의 기본 상태 보다 더 많은 스트레스에 결정 되 고 있다. 또 다른 중요 한 관심사는 ActD의 효과 셀 접촉 저해 fibroblasts 대 확산 등 다른 국가에 대 한 다를 수 있습니다. ActD 치료의 부작용을 최소화 하기 위한 한 가지 방법은 시간 과정 기간이 짧은 유지 하는. 이러한 이유로, 우리는 8 h 시간 코스를 선택.
성적 부패 속도28,29모니터링 ActD에 다른 접근이 있다. 온도 민감한 RNA 중 합 효소 II 대립 유전자와 효 모 종자 대 본 부패 속도30모니터링 하 사용 되었습니다. "앵커-멀리" 라는이 접근에 변이 RNA 중 합 효소 II rapamycin 치료31,32에 대 한 응답의 조건부 소모를 달성 하기 위해 효 모에 사용 되었습니다. 그것은 또한 활성 전사와 셀에 부패 모니터링 가능입니다. 예를 들어, thio 대체 uracil 뉴클레오티드, 세포로 소개 될 수 있다 mRNA에 통합 그리고 이후33,,3435를 감지. 이 방식으로는 다른 증명서는 합성 속도 계속 mRNA를 합성 하는 셀에 확인할 수 있습니다. 그들은 독성 때문에 이러한 접근 ActD 치료에 중요 한 이점이 있다. 그러나 우리의 경험에서는,, 있을 수 있습니다 가변성 이러한 방법으로 증명서의 복구. ActD 치료 성적 부패를 모니터링 하기 위한 간단 하 고 재현 가능한 접근 이다.
제공 하는 프로토콜의 몇 가지 단계는 그것의 성공을 위해 중요 합니다. 1 개의 중요 한 문제점은 RNA 격리 동안 RNA 저하를 방지 합니다. 4.1 단계에서 RNA는 저하에 대 한 모니터링 해야 합니다. RNA에는 18와 28S rRNAs (그림 4)에 대 한 두 개의 명확한 봉우리 포함 되어 있지 않으면,이 성적 저하 발생 했습니다 표시 이다. 일부 악기는 RNA 무결성 번호 (린) 점수를 1에서 10까지 제공 합니다. 7-10 범위에서 린 점수와 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다. RNA을 타락 하는 경우 그것은 RNA 저하, 보장 등 솔루션 및 sterileware는 RNase-무료, 그리고 때 RNA에 대 한 처리 펫 장갑 착용을 방지 하기 위해 더 많은 예방 조치를 취해야 하는 것이 중요. 물 0.1% diethyl pyrocarbonate (DEPC) 37 ° C에서 2 시간 이상에 대 한 인 큐베이 팅으로 pretreated 수 고 압력가 마로 소독 적어도 15 분 노트에 대 한 그 DEPC 트리 기반 버퍼와 함께 사용할 수 없습니다. RNase 오염을 솔루션 작업 표면, 원심 분리기, 펫, RNases를 억제 하는 약에서 RNase 제거를 또한 사용할 수 있는 샘플으로 추가할 수 있습니다.
또 다른 중요 한 단계 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션의 단계의 분리 이다. RNA에 대 한 상위 단계를 수집 확인 해야 처리. 경우 잔여 페 놀, 230, 260, 280에서 흡 광도의 비율을 포함 하는 결과 RNA nm 비율 1: 2에 됩니다: 1 예상 대로. 230에서 예상된 흡 광도 보다 높은 nm 페 놀 오염 나타낼 수 있습니다. 이 경우, RNA 에탄올 다시 침전 하 고 어떤 잔여 페 놀을 제거 하려면 추가 여러 번 씻어 수 있습니다.
마지막으로 때 RNA는 수송과 상쾌한 제거, 펠 릿은 끈 적, 얇은, 그리고 쉽게 방해 수 있습니다. 이 시점에서, 그것을 여분의 액체를 이륙에 중요 하다. 그것은 펠 릿을 찾아서는 방해 하지 있는지 확인 좋은 조명 튜브를 시각화 하는 것이 중요 수 있습니다. 추가 glycogen 펠 릿은이 시점에서 볼 수 있도록 도울 수 있다.
부패의 시간 과정에 대 한 시간 점 선택 고려해 야 할 중요 한 문제 이기도 합니다. 우리는 선택 하는 4 개의 timepoints 감퇴 10000 이상의 유전자에 대 한 모니터링을 허용, 일부 유전자 8 h 시간 과정 동안 크게 붕괴 하지 않았다. 단기 성적 우선 순위가 높은 경우에, 조사는 30 분 예를 들어 120 분 전에 추가 샘플 컬렉션을 추가 싶을 수도 있다. 수명이 긴 성적표의 더 나은 평가 대 한 조사는 나중 timepoints에서 추가 샘플 컬렉션을 추가 할 수 있습니다.
또 다른 잠재적인 문제는 감소율 예상된 분포를 따르지 않는 경우 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 너무 많은 있을 수 있습니다 또는 로그 선형 부패를 보여주는 몇 가지 유전자 이상 8 h 속도. 이 경우, 그들은 예상된 패턴에 따라 여부를 결정 하기 위해 짧은 또는 긴 것으로 알려진 유전자의 감소율을 모니터링 도움이 됩니다.유전자는 시간이 지남에 긍정 보다는 부정적인 기울기를가지고, 그들은 수 제외 추가 분석에서로 로그 선형 감퇴 율을 설명 하지 않습니다. 마지막 문제 있다면 비교 되는 두 가지 조건에서 세포는 ActD 매우 다른 응답 되도록 많은 유전자는 하나의 조건에 빨리 부패 발생할 수 있습니다. 이 경우 두 상태 사이의 부패 속도 차이 뿐만 아니라 RNA 격리 두 상태에서 절대 감소율에 정보를 제공 하기 전에 포함 하는 것이 좋습니다 하는 스파이크에 컨트롤에 참조 하는 데 도움이 수 있습니다.
확산 및 무부하 셀 또는 어떤 두 유사한 상태 사이 사본 감소율을 모니터링 하는 기능 추가 조절 하는 생리 적 변화에 대 본 부패의 중요성에 대 한 통찰력을 제공 하기 위해 잠재력이 있다. 응용 프로그램에는 세포와 종양 활성화, 노화 또는 바이러스 성 감염, 특정 유전자 또는 차별화의 두 개의 다른 국가에서 최저 없이 앞뒤 없이 포함 됩니다. 결과 RNA-Seq isoform 특정 변경 isoform 식 세포 생리 전환 받을 관찰에 변화에 대 한 통찰력을 제공할 수 있는 사본 감소율에 대 한 정보를 제공와 결합 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.
Acknowledgments
HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품 HAC 우수성 그랜트 P50 GM071508의 국립 연구소의 종합 의료 과학 센터에서 (탐정 데이비드 Botstein), PhRMA 재단 그랜트 2007RSGl9572, 국립 과학 재단 부여 OCI-1047879 데이비드 8 월에 교부 금에 의해 투자 되었다 일반 의료 과학 R01 GM081686, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli의 국립 연구소 & 재생 의학의 Edythe 넓은 센터 & 줄기 세포 연구, 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 그리고 백혈병 림프 종 사회입니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli의 멤버인 & Edythe 넓은 재생 의학 센터 & 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소와 UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
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