Summary
Vi beskriver en protokol til generere prolifererende og inaktiv primære human dermal fibroblaster, overvågning udskrift henfald priser, og at identificere varierende rådnende gener.
Abstract
Udbrudsfronten er en midlertidig, vendbar tilstand, hvor celler er ophørt celledeling, men bevarer evnen til at formere. Flere undersøgelser, herunder vores, har vist, at udbrudsfronten er forbundet med omfattende ændringer i genekspression. Nogle af disse ændringer ske gennem ændringer i niveauet eller aktivitet af spredning-associerede transskriptionsfaktorer, såsom E2F og MYC. Vi har demonstreret, at mRNA i tænderne kan også bidrage til ændringer i genekspression mellem prolifererende og inaktiv celler. I denne protokol beskrive vi proceduren for etablering af prolifererende og inaktiv kulturer af human dermal forhuden fibroblaster. Vi derefter beskrive procedurer for hæmme nye transskription i prolifererende og inaktiv celler med Actinomycin D (ActD). ActD behandling repræsenterer en ligetil og reproducerbar metode til miljøomkostningerne nye transskription fra udskrift forfald. En ulempe ved ActD behandling er, at tid kurset skal være begrænset til en kort tidsramme, fordi ActD påvirker cellernes levedygtighed. Udskrift niveauer overvåges over tid til at bestemme udskrift henfald priser. Denne procedure giver mulighed for identifikation af gener og isoformer, der udviser differential forfald i prolifererende versus inaktiv fibroblaster.
Introduction
Steady state niveauer af udskrifter afspejler både udskrift syntese og udskrift henfald bidrag. Reguleret og koordineret udskrift henfald er en vigtig mekanisme til at kontrollere biologiske processer1,2,3,4. For eksempel, har udskrift henfald priser vist sig at bidrage til den tidsmæssige serie af begivenhederne efter aktivering af inflammatorisk cytokin tumor nekrose faktor5.
Vi har tidligere vist, at overgangen mellem spredning og ubevægelighed i primære humane fibroblaster er forbundet med ændringer i afskriften niveauer af mange gener6. Nogle af disse ændringer afspejler forskelle i aktiviteten af transkriptionsfaktorer mellem disse to stater.
Ændringer i en udskrift henfaldet kan også bidrage til ændringer i niveauet udtryk af en udskrift i to forskellige stater7,8. Baseret på vores tidligere resultater, at overgangen mellem spredning og ubevægelighed er forbundet med ændringer i niveauet af flere MicroRNA9, spurgte vi, om der er også et bidrag fra differential udskrift forfald i ændringer i genekspression i prolifererende versus inaktiv fibroblaster.
For at overvåge udskrift stabilitet, bestemt vi sats henfald af udskrifter genome-wide i prolifererende versus inaktiv celler. For at opnå dette, overvåges vi henfald priser i prolifererende versus inaktiv fibroblaster ved at indføre en hæmmer af nye transskription og overvåge den sats som enkelte afskrifter forsvandt over tid. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at vi i forhold til metoder, der blot overvåger samlede Gen-ekspression, ved at hæmme ny udskrift syntese, vil kunne bestemme henfaldet for disse udskrifter adskilt fra den hastighed, hvormed de er transskriberet.
ActD behandling at hæmme nye transskription og bestemme udskrift henfald priser har været anvendt med succes i flere tidligere undersøgelser. ActD har været brugt til at dissekere betydningen af RNA stabilitet i ændringerne i afskriften overflod, som følge af behandling med pro-inflammatoriske cytokiner5. En lignende fremgangsmåde er også blevet brugt til at dissekere forskelle i afskriften henfaldet i prolifererende versus differentierede C2C12 celler, som de vedtager en differentieret muskel fænotype10. Som et andet eksempel, globale mRNA halveringstider er også blevet påvist i pluripotente og differentieret mus embryonale stamceller-celler11. I disse eksempler, har mRNA forfald vist sig at være vigtigt for at regulere udskrift overflod og for overgang af celler til forskellige celle stater.
Anvende de nedenfor beskrevne metoder, opdagede vi ændringer i afskriften henfald priser i ca 500 gener, når man sammenligner fibroblaster i prolifererende og inaktiv stater12. Navnlig, opdagede vi, at mål de microRNA, miR-29, som er downregulated i inaktiv celler, er stabiliseret når celler overgang til ubevægelighed. Vi beskriver her metoden til at bestemme henfald priser i prolifererende og inaktiv celler. Denne metode er nyttig til sammenligning globale mRNA henfald priser i to særskilte men lignende betingelser, når der anmodes om oplysninger om hastigt rådnende gener. Det kunne også bruges til at behandle andre spørgsmål såsom virkningen af celle kultur betingelser på udskrift henfald, for eksempel, i to dimensionelle versus tre dimensionelle kulturer. Henfald priser kan være beslutsom genome-wide med metoder som microarrays eller RNA-FF. Alternativt, real-time qPCR eller nordlige blotting kan bruges til at bestemme henfald satser på grundlag af genet af genet eller isoform af isoform. Disse satser kan derefter bruges til at beregne halveringstiden for hver overvåget gen og at identificere gener med forfald satser, der er forskellige i de to betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg beskrives blev godkendt af institutionelle Review bestyrelserne på Princeton University og University of California, Los Angeles.
1. Forbered prolifererende og kontakt-inhiberet fibroblaster for ActD tidsforløb
Bemærk: Denne protokol bruger en timecourse med fire timepoints. Tre biologisk uafhængige prøver kan indsamles pr. tidspunkt ved at indsamle forskellige vævskultur plader i et eksperiment, eller eksperimentet kan gentages flere gange med forskellige kulturer af celler. Vores erfaring giver et 10 cm (diameter) vævskultur parabol (én plade) tilstrækkelig RNA til analyse. Hvis det er nødvendigt, kan flere vævskultur retter samles for hver prøve at øge antallet af celler på hvert tidspunkt. Derudover kan det samme eksperiment udføres med fibroblaster isoleret fra forskellige personer, som virkelig uafhængig biologiske replikater.
- Etablere prolifererende og inaktiv kulturer af celler for udskrift henfald analyse. For prolifererende celler, opdele celler hver tre dage mens de kontakt-inhiberet celler bliver kontakt-hæmmede.
- For de kontakt-inhiberet celler, ændre mediet hver 2 dage i 7 dage. Opdel i prolifererende celler 2 dage før de kontakt-inhiberet fibroblaster er klar til afhentning. Et eksempel på en celle kultur ordningen er vist i figur 1. De resterende trin i dette afsnit indeholder en detaljeret protokol for oprettelse og deling af celler.
- Isolere primære dermal fibroblaster fra neonatal hud efter fastlagte protokoller13. Passage fibroblaster til at sikre en homogen population.
Bemærk: Fibroblaster kan være frosset og optøet, hvis nødvendigt. - Tø eller replate fibroblaster, hvis nødvendigt. Vokse fibroblaster i DMEM med 10% serum under sterile forhold i en vævskultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Bruge fibroblaster, der har været dyrket for færre end 10 passager. Fibroblaster bør være < 80% sammenflydende dag at opdele celler til at gøre prolifererende og inaktiv populationer.
- Opdele en vævskultur plade i flere plader, prewarm PBS, trypsin og medium med serum i et 37 ° C vandbad i 20 min.
- Opsug eller bruge en pipette til at fjerne mediet fra hver vævskultur plade med celler til at være replated.
- Med pipette overfoeres varm PBS på hver tallerken (10 mL af opløsning for en 150 mm plade, 5 mL af oploesningen til en 100 mm plade, 2 mL for et godt af en 6 godt plade) og 1 mL for et godt af en 12 godt plade.
- Aspirat eller pipette til at fjerne PBS fra hver vævskultur plade.
- Forsigtigt afpipetteres 1 x Trypsin-EDTA på hver tallerken (8 mL af opløsning for en 150 mm plade, 3 mL af oploesningen til en 100 mm plade, 2 mL for et godt af en 6 godt plade og 1 mL for et godt af en 12 godt plade).
Bemærk: Sørg 1 x Trypsin-EDTA ved fortynding sterile 10 x Trypsin-EDTA i steril PBS. Den sidste 1 x løsning bør være 0,05% trypsin og 0,02% EDTA. - Inkuber trypsin med celler i 5 min.
- Tryk forsigtigt på pladen for at løsne celler fra pladen.
- Med pipette overfoeres til resuspend celler ind i en enkelt cellesuspension.
- Overfør celler i trypsin løsning til et koniske rør, der indeholder den samme mængde af DMEM med 10% serum (8 mL af opløsning for en 150 mm plade, 3 mL af oploesningen til en 100 mm plade, 2 mL for et godt af en 6 godt plade og 1 mL for et godt af en 12 godt plade).
- Spin ned celler ved 4 ° C i 5 minutter ved 1.000 x g fjerne trypsin.
- Resuspend celler i et passende volumen af medium og tæller med en hemacytometer til bestemmelse af celle koncentration.
- Frø 5 x 105 celler pr. 100 mm vævskultur plade for prolifererende og kontakt-inhiberet celler.
- Brug denne metode, etablere prolifererende og kontakt-inhiberet prøverne kræves til analyse (figur 1).
2. ActD tidsforløb
- Resuspend ActD i en lager koncentration på 1 mg/mL (For 1 mg af ActD, brug 950 µL sterilt PBS og 50 µL sterilt DMSO).
Bemærk: Frosne stamopløsninger af ActD skal være stabil i en måned ved-20 ° C. Fortyndede opløsninger skal kasseres og ikke gemt til yderligere brug. - Tilføj ActD til den passende mængde af forvarmet medium for alle biologiske Repliker cellekultur plader der blev sat til 0, 120, 240 og 480 min timepoints (figur 2). Tilføje ActD i en koncentration på 15 µg pr. mL af medium. Bland godt, Aspirér off de gamle medium, og tilføje ActD-holdige medium til cellerne.
- Efter en 1 mg/mL bestand, tilføje 15 µL ActD for hver mL medium, fx10 ml af medium for en 100 mm plade, Tilføj 150 µL ActD.
- At indsamle nul tidspunkt prøven, forsigtigt Aspirér off ActD medium og afpipetteres forvarmet PBS på cellerne. Afpipetteres 10 mL af opløsning for en 150 mm plade, 5 mL af oploesningen til en 100 mm plade, 2 mL for et godt af en 6 godt plade og 1 mL for et godt af en 12 godt plade.
- Forsigtigt Aspirér eller pipette fra PBS.
Bemærk: Alle skridt involverer RNA isolering bør udføres med RNase-fri vand, RNase-fri microcentrifuge rør og RNase-fri pipetter. Handsker skal bæres og ændret ofte når du arbejder med RNA. - Tilføje phenol-guanidin isothiocyanat løsning (1 mL/10-cm plade med 4 x 105 til 4 x 107 celler) direkte til vævskultur plade.
Bemærk: Phenol-guanidin isothiocyanat løsning er en monofasiske løsning, som fastholder RNA kvalitet samtidig med lysing celler og adskille RNA, DNA og protein fra hinanden.
Forsigtig: Phenol og guanidin isothiocyanat er ætsende. Bruge passende beskyttelse. - Med pipette overfoeres phenol-guanidin isothiocyanat løsning-celle blanding op og ned flere gange for at gøre en homogen blanding.
Bemærk: Phenol-guanidin isothiocyanat løsning lysate kan opbevares ved 4 ° C natten over eller ved-20 ° C i op til et år. - Saml hvert tidspunkt, efter at den passende mængde tid har bestået ved hjælp af metoden beskrevet i trin 2,3-2,6.
3. isolering af Total RNA fra Phenol-guanidin isothiocyanat løsning Lysate
- Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 5 min at sikre fuldstændig opløsning af RNA-protein komplekser.
Bemærk: Trin af phenol-guanidin isothiocyanat løsning protokol kan udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. - Indføre spike-objektet udskrifter, der kan detekteres med den anvendte metode.
Bemærk: Den eksterne RNA kontrol consortium (ERCC) spike-objektet mix14 er specifikt udformet som en spike-objektet for RNA-FF. Det kan også bruges til nordlige blotting eller real-time qPCR. Spike-i kontrolelementer specielt designet til microarray teknologi er også tilgængelige (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Efter den indledende spin, prøven bør adskille i 3 lag - en rød organiske lag på bunden, en hvid/pink interfase i midten og en klar vandige lag på toppen (figur 3).
Bemærk: Pas på ikke at forstyrre interphase under denne proces. Det er okay at lade nogle af de vandige brøkdel. Det er bedre at lade nogle af den vandige del end til også for at omfatte nogle af interphase lag, som herunder interphase lag vil forurene RNA med DNA. Den vandige lag bliver ca halvdelen af den oprindelige mængde, så omkring 0.9 mL hvis phenol-guanidin isothiocyanat løsning/chloroform blandingen var 1,8 mL.
Bemærk: Dette vil resultere i en tæt, solid pellet, der er let at følge efter trinene spin, der følger.
Bemærk: En løs afpipetteres tip holdt i hånd kan bruges til at fjerne overskydende ethanol. Hvis RNA pellet er forstyrret, men ikke kasseres, kan investigator gentage spin og Fjern supernatanten igen. Undgå genudsætning pellet, da dette vil kræve investigator at gentage hele proceduren.
Bemærk: RNA pellet er mindre kompakt på dette trin og har tendens til at flytte. Være ekstra forsigtig, når du håndterer pellet på dette tidspunkt for at undgå at miste RNA.
4. analyse af udskrift overflod
- Kvantificere RNA og kontrollere RNA for renhed ved hjælp af et spektrofotometer.
Bemærk: Forholdet mellem absorbans på 260 nm til 280 nm skal være cirka 2,0 til RNA. - Analysere RNA med en 1%-agarosegel eller en tilsvarende teknologi til at visualisere omfanget af nedbrydning.
Bemærk: To klare bands der repræsenterer 18S og 28S rRNA bør være klart synlig (figur 4). Hvis disse bands ikke er synlig, kan være nedbrudt RNA. Trouble shooting tips til RNA nedbrydning leveres i diskussionen. - Monitor udskrift overflod i de indsamles delprøver af RNA sammenlignet med den spidse i intern standard bruger microarrays15, RNA-Seq16, real-time qPCR17, eller nordlige blotting18.
- Bestemme overfloden for hver udskrift på hvert tidspunkt, sammenlignet med en spidse i kontrol af kendte overflod.
Bemærk: For microarrays, værdierne vil være fluorescens intensiteter. Til nordlige blots, kan bands på X-ray film kvantificeres. For real-time qPCR, kan udskrift overflod bestemmes ved sammenligning med kendte standarder med 2- σσCT metode19. For RNA-FF., kan normaliserede værdier bestemmes som FPKM eller fragmenter pr. kilobase af exon pr. million læser kortlagt. For isoform-specifikke henfald satser, kan RNA-Seq data analyseres ved hjælp af isoform-aware metoder, DEXSeq20. Isoform-specifikke henfald satser er bedst afgøres med RNA-FF. Hvis de skal bestemmes med microarray data, skal så dataene, der analyseres på grundlag af sonde af sonden snarere end et gen af gen grundlag. Analytikeren skal være tilbageholdende med at fortolke oplysninger fra et begrænset antal sonder. For eksempel kan der være 5 eller færre sonder, der er informativ om en bestemt isoform. I dette tilfælde bliver analytikeren nødt til at finde ud af, om funktionen af disse sonder er tilstrækkeligt konsekvent, så resultaterne er pålidelige.
- Bestemme overfloden for hver udskrift på hvert tidspunkt, sammenlignet med en spidse i kontrol af kendte overflod.
- Udfør real-time qPCR på isolerede RNA17 i de indsamlede prøver at analysere hastigt rådnende gener, som c-Myc og et langsomt rådnende gen som GAPDH, at vinde tillid at udskrift henfald priser blev nøjagtigt registreret.
NOTE: For yderligere bekræftelse, isoform-specifikke real-time qPCR sonder kan udvikles og anvendes til at overvåge overfloden af specifikke isoformer over tid21.
5.Henfald sats konstant bestemmelse
- For hver tidspunkt, log-transform overflod værdier for hver udskrift (gen-specifikke eller isoform-specifik).
Bemærk: Log-omdanne værdierne, der vil konvertere eksponentiel henfald kurver til linjer, der kan passe med en lineær henfald model22. - Passe profilen udtryk for hver udskrift (gen-specifikke eller isoform-specifik) til en lineær henfald model. Formlen for denne model er f(v) = C - r * t. I denne ligning, C er en konstant, der repræsenterer grundbeløbet for en udskrift, r er antallet af tilbagegang og t er tiden siden begyndelsen af eksperimentet. Fra denne ligning, bestemme henfaldet som r*ln(10) (Se reference11).
Bemærk: MaSigPro softwarepakke er en regression-baseret tilgang udviklet til at registrere betydelig gene expression profil forskelle i gang kursus data23. Eksempelkode og resultater for maSigPro findes på: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - Filtrer de gener, der undlader at passe en log-lineære henfald model. Dette kan opnås med en ANOVA F-test.
Bemærk: F-test er baseret på F-stikprøvefunktionen, der er defineret som variationen mellem stikprøvers middelværdi divideret med variation inden for prøver. Rette p-værdier for flere sammenligninger ved at anvende den lineære step-up Benjamini og Hochberg falsk opdagelse procedure24. En q-værdi større end 0,05 med F-test kan bruges som en cutoff for gener, der undlader at passe en log-lineære henfald model. - Udføre en ANOVA F-test for at afgøre udskrifter med en betydelig interaktion mellem en kategorisk cellecyklus tilstand og tid (falsk opdagelse sats, FDR < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere rapporteret microarray analyseresultater af udskrift henfald priser i prolifererende og kontakt-inhiberet primære humane fibroblaster over en 8-timers kursus12. En liste over gener med en betydelig ændring i afskriften stabilitet sammenligne prolifererende og kontakt-inhiberet fibroblaster er fastsat i supplerende tabel 1. Fluorescens intensiteter på tidspunktet nul og over et tidsforløb efter ActD behandling er til rådighed. Gener var medtaget på listen ved at bestemme de gener, der har væsentligt forskellige skråninger i prolifererende og kontakt-inhiberet betingelser ved hjælp af en ANOVA F-test. Eksempler på gener med forskellige henfald priser i prolifererende og inaktiv fibroblaster er vist i figur 5.
Figur 1 : Skematisk af protokollen til oprettelse af prolifererende og kontakt-inhiberet plader til ActD tid kursus analyse. En dag-til-dag beskrivelse af de nødvendige skridt til at etablere kulturer af celler til ActD behandling er fastsat, under forudsætning af fire timepoints vil blive brugt til tid kurset. For overskuelighedens skyld en plade er vist pr. tidspunkt, men ekstra plader kan føjes til at generere biologiske replikater. Protokollen kan også indstilles til at tilføje flere plader af celler, hvis mere end fire timepoints er ønsket. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skematisk ActD tidsforløb og henfald Vurder beregninger i inaktiv i forhold til prolifererende humane fibroblaster. Den forventede brøkdel af mRNAs resterende over tid for en hypotetisk udskrift efter behandling med en transcriptional inhibitoren er vist. Nedenfor, prøve parceller på brøkdel af mRNA resterende over tid er fastsat gener, der er mere stabil i inaktiv end prolifererende celler og gener, der er mere stabil i prolifererende end inaktiv celler. For hver datapoint, er kun en enkelt værdi angivet for klarhed. I selve protokollen, vil der være tre datapoints for hvert tidspunkt. Dette tal er blevet ændret fra Elizabeth Pender Johnson's Ph.D.-afhandling med hendes samtykke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Fotografier af blanding af phenol-guanidin isothiocyanat reagens og chloroform før og efter centrifugering. Blandingen er vist, hvornår phenol-guanidin isothiocyanat reagens og chloroform er i første omgang kombineret, efter blanding og efter centrifugering. Efter blandingen centrifugeres, er den nederste fase, som er rød, den organiske fase. Interphase i midten er hvid og overskyet. Den øverste fase er den vandige fase, og det er klart. RNA er i den vandige fase, som skal indsamles med en pipette fældningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Prøve RNA gel til at overvåge RNA kvalitet. En illustration af en RNA gel viser prøver med intakt RNA. Intakt RNA har prominente bands til 28S og 18S rRNAs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Eksempler på gener med forskellige henfald priser i prolifererende versus inaktiv fibroblaster. Fluorescens intensiteter (genekspression) over tid er vist for fire gener, at henfald forskelligt i prolifererende versus inaktiv fibroblaster. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende tabel 1: gen-specifikke fluorescens intensiteter i prolifererende og inaktiv fibroblaster. Data er leveret til tiden nul og over et tidsforløb efter ActD behandling i prolifererende og kontakt-inhiberet fibroblaster. P værdier, q værdier og falsk opdagelse takster stilles. Tabel er genoptrykt fra dens oprindelige udgivelse i BMC genomforskning12. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ubevægelighed kan være fremkaldt af eksterne signaler, herunder inddragelse af mitogens eller serum, manglende celle vedhæftning og kontakt hæmning. Kontakt hæmning, en af flere mulige metoder for at fremkalde ubevægelighed, er en yderst evolutionært bevarede proces hvor celler frakørsel proliferativ cellecyklus i svar til celle til celle kontakt. Her fokuserer vi på kontakt hæmning som et eksempel på en metode til at fremkalde ubevægelighed. Tidligere undersøgelser har rapporteret at celle-celle kontakt kan påvirke mikroRNA Biogenese25, således resultaterne indeholder oplysninger om én ubevægelighed metode og yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, hvilke ændringer er forbundet med ubevægelighed i sig selv.
Vi brugte primære humane diploide fibroblaster, der vi isoleret fra neonatal hud. Vi indledte disse eksperimenter med fibroblaster, der var passaged færre end 10 gange. Vi kasseret senere passage fibroblaster, fordi de senesce. Mens denne protokol fokuserer på prolifererende og inaktiv dermal fibroblaster, kan procedurerne bruges til at overvåge henfald priser i forskellige typer af celler og under forskellige betingelser.
Vi overvågede mRNA henfald satser genom-plan ved hjælp af en transskription shut-off tid kursus. Shut-off tid kurser er den mest udbredte metode til afkobling mRNA forfald fra mRNA transskription for at beregne mRNA halveringstid1,26. I metoden beskrevet her, ActD, et stof, komplekser med B-form af DNA til at blokere brudforlængelse RNA Polymerase II, bruges til at arrestere transskription af mRNAs27. Den sats, som udskrifter fald i overflod i en 8-timers periode kan bestemmes som den udskrift henfaldet.
En vigtig begrænsning af ActD-baserede metoder til overvågning af udskrift henfald er, at ActD forhindrer globale transskription, som vil påvirke cellernes levedygtighed. Dette bør holdes for øje ved fortolkningen af ActD-baseret data, som tænderne satser bestemmes i celler, der er mere stressede end deres hjemstat. En anden vigtig bekymring er, at virkningerne af ActD kan være forskellige for celler i forskellige stater, herunder prolifererende versus kontakt-inhiberet fibroblaster. Én tilgang for at minimere bivirkninger af ActD behandling er at holde tid kurser korte varighed. Derfor har vi valgt en 8 h tidsforløb.
Der er alternative tilgange til ActD for at overvåge udskrift henfald satser28,29. Gærstammer med temperatur-følsomme RNA polymerase II alleler er blevet brugt til at overvåge udskrift henfald satser30. En variation over denne tilgang kaldes "anker-lager" er blevet brugt i gær for at opnå betinget nedbrydning af RNA polymerase II reaktion på rapamycin behandling31,32. Det er også muligt at overvåge forfald i celler med aktive transskription. For eksempel, thio-substitueret uracil nukleotider kan indføres i celler, indarbejdet i mRNA, og efterfølgende detekteres33,34,35. Med denne fremgangsmåde, kan hastigheden hvormed forskellige udskrifter er syntetiseret bestemmes i celler, der fortsætter med at syntetisere mRNA. Sådanne strategier har en betydelig fordel over ActD behandling, fordi de ikke er giftige. Vores erfaring, dog kan der variabilitet i forbindelse med inddrivelse af udskrifter med disse metoder. ActD behandling er en simpel og reproducerbar tilgang til overvågning udskrift forfald.
Et par skridt i protokollen i henhold er afgørende for dens succes. Et vigtigt spørgsmål forhindrer RNA nedbrydning under RNA isolering. På trin 4.1, bør RNA overvåges for nedbrydning. Hvis RNA ikke indeholder to tydelige toppe til 18S og 28S rRNAs (figur 4), er dette et tegn på at udskrift nedbrydning er opstået. Nogle instrumenter giver RNA integritet nummer (RIN) score spænder fra 1 til 10. Prøver med RIN scores i rækken 7-10 er acceptable for yderligere analyse. Hvis RNA er forringet, er det vigtigt at tage flere forholdsregler for at forhindre RNA nedbrydning, som sikrer, at løsninger og sterileware er RNase-fri, og at handsker er slidte når håndtering pipetter til RNA. Vand kan blive forbehandlet med 0,1% diethyletheren pyrocarbonate (DEPC), inkuberes i mindst 2 timer ved 37 ° C, og autoklaveres i mindst 15 min. Note at DEPC kan ikke bruges med Tris-baserede buffere. RNase dekontaminering løsninger kan også bruges til at fjerne RNase fra arbejde overflader, centrifuger og pipetter og reagenser, der hæmmer RNases kan føjes til prøver.
En anden kritisk trin er adskillelse af faserne af phenol-guanidin isothiocyanat løsning. Det er vigtigt at sikre, at kun den øverste fase er indsamlet for RNA forarbejdning. Hvis den resulterende RNA omfatter resterende phenol, forholdet mellem absorbans ved 230, 260 og 280 nm vil ikke være i forholdet 1:2:1 som forventet. Højere end forventet absorbans på 230 nm kan angive phenol forurening. Hvis dette sker, kan RNA ethanol udfældet igen og vasket flere ekstra gange for at fjerne enhver resterende phenol.
Endelig, når RNA er pelleted og supernatanten fjernes, pellet kan være klæbrig, tynd og let forstyrret. På dette tidspunkt, er det vigtigt at tage ekstra pleje i at tage af væsken. Det kan være vigtigt at visualisere rør med god belysning til at lokalisere pelleten og sørg for, at det ikke er forstyrret. Tilføjet glykogen kan bidrage til at sikre pelleten er synligt på dette punkt.
Udvælgelsen af tidspunkter for kurset tid henfald er også et vigtigt spørgsmål at overveje. Mens de fire timepoints vi valgt tillod os at overvåge forfald for over 10.000 gener, nogle gener ikke væsentligt henfald løbet i tiden 8 h. Hvis kortlivede udskrifter er en høj prioritet, eventuelt efterforskerne at tilføje ekstra prøve samlinger forud for 120 min, for eksempel på 30 min. Bedre vurdering af langlivede udskrifter, kan efterforskerne vil tilføje ekstra prøve samlinger på senere timepoints.
En anden potentiel spørgsmål kunne føre hvis henfald priser ikke følger den forventede fordeling. For eksempel, der kan være for mange eller for få gener viser en log-lineære forfald Vurder over 8 h. Hvis dette sker, er det nyttigt at overvåge henfald satser af gener, der er kendt for at være kort eller lang levetid for at afgøre, om de følger det forventede mønster.Hvis gener har en positiv end negativ hældning over tid, kan de være udelukket fra yderligere analyse som de ikke påvise en log-lineære henfaldet. Et sidste spørgsmål kan opstå hvis celler i de to betingelser der sammenlignes har meget forskellige svar på ActD sådan, at mange gener henfald hurtigere i én betingelse. I dette tilfælde kan det være nyttigt at henvise ikke kun til henfaldet forskellen mellem de to stater, men også til spike i kontrolelementer, som vi foreslår herunder før RNA isolering til at give oplysninger om absolutte henfald satser i de to stater.
Evnen til at overvåge udskrift henfald priser mellem prolifererende og inaktiv celler eller enhver to lignende stater har potentiale til at give yderligere indsigt i betydningen af udskrift forfald i reguleringen af fysiologiske forandringer. Applikationerne omfatter celler med og uden muterede aktivering, før og efter gulne eller viral infektion, med og uden knockdown af et bestemt gen, eller i to forskellige stater i differentiering. Resultaterne kan være kombineret med RNA-Seq at give oplysninger om isoform-specifikke ændringer i afskriften henfald satser, som kan give indblik i ændringerne i isoform udtryk observeret som celler gennemgå fysiologiske overgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at videregive.
Acknowledgments
HAC var Milton E. Cassel lærd af Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dette arbejde blev finansieret af tilskud til HAC fra National Institute of General Medical Sciences Center af Excellence grant P50 GM071508 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 til David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, National Institute of General Medical Sciences R01 GM0866465, at Eli & Edythe bred Center for regenerativ medicin & stamcelleforskning, Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, og leukæmi lymfom Society. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute af National Institutes of Health under Award nummer P50CA092131. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. HAC er medlem af Eli & Edythe bred Center for regenerativ medicin & stamcelleforskning, UCLA Molekylærbiologisk Institut og UCLA Bioinformatik mellemtjenstlig Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
