Summary
Descreveremos um protocolo para gerar proliferando e quiescentes fibroblastos dérmicos humanos primários, taxas de decomposição de transcrição de monitoramento e identificação de genes diferencialmente em decomposição.
Abstract
Quiescência é um estado temporário, reversível, em que células cessaram a divisão celular, mas mantém a capacidade de proliferar. Vários estudos, incluindo a nossa, têm demonstrado que a quiescência está associada a generalizada alterações na expressão gênica. Algumas destas mudanças ocorrem através de alterações no nível ou atividade associada a proliferação de factores de transcrição, tais como E2F e MYC. Nós demonstramos que o decaimento do mRNA também pode contribuir para alterações na expressão gênica entre células proliferando e quiescentes. Neste protocolo, descrevemos o procedimento para estabelecer culturas quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos prepúcio dérmica. Em seguida, descrevemos os procedimentos para inibir nova transcrição em células proliferando e quiescentes com actinomicina D (ActD). ActD tratamento representa uma abordagem simples e reprodutível para desassociar nova transcrição do decaimento de transcrição. Uma desvantagem da fatura de tratamento é que o curso de tempo deve ser limitado a um curto espaço de tempo porque ActD afeta a viabilidade celular. Níveis de transcrição são monitorados ao longo do tempo para determinar as taxas de decomposição de transcrição. Este procedimento permite a identificação de genes e isoformas que apresentam deterioração diferencial em proliferando contra fibroblastos quiescentes.
Introduction
Níveis de estado estacionário de transcrições refletem a contribuição de decaimento de transcrição e síntese de transcrição. Regulamentada e coordenada transcrição decaimento é um importante mecanismo para controlar processos biológicos1,2,3,4. Por exemplo, taxas de decomposição de transcrição foram mostradas para contribuir para a série temporal de eventos após a ativação pela citoquina inflamatória fator de necrose tumoral5.
Mostramos anteriormente que a transição entre a proliferação e quiescência em fibroblastos humanos primários está associada a alterações dos níveis de transcrição de muitos genes6. Algumas destas mudanças refletem as diferenças na atividade de fatores de transcrição entre estes dois Estados.
Mudanças na taxa de decaimento de uma transcrição também podem contribuir para as alterações do nível de expressão de uma transcrição em dois Estados diferentes7,8. Baseado em nossos achados anteriores que a transição entre a proliferação e quiescência está associada a alterações nos níveis de vários microRNAs9, perguntamos se existe também uma contribuição do decaimento de transcrição diferencial nas alterações em expressão gênica em proliferando contra fibroblastos quiescentes.
A fim de monitorar a estabilidade de transcrição, determinamos a taxa de decaimento de transcrições todo o genoma em proliferando contra células quiescentes. Para conseguir isso, temos monitorado taxas de decaimento em proliferando contra fibroblastos quiescentes introduzindo um inibidor da nova transcrição e monitorar a taxa em que as transcrições individuais desapareceram ao longo do tempo. A vantagem dessa abordagem é que, em comparação com métodos que simplesmente monitorar geral expressão gênica, inibindo a síntese de transcrição novo, seremos capazes de determinar a taxa de decaimento para essas transcrições separadamente da taxa em que forem transcrito.
ActD tratamento para inibir a transcrição de nova e determinar taxas de decaimento de transcrição tem sido aplicado com sucesso em vários estudos anteriores. ActD tem sido usada para dissecar a importância da estabilidade de RNA nas mudanças na abundância de transcrição que resultam do tratamento com citocinas pró-inflamatórias5. Uma abordagem similar também tem sido utilizada para dissecar as diferenças na taxa de decaimento de transcrição em proliferando contra células diferenciadas de C2C12 como a adoptarem uma diferenciada músculo fenótipo10. Como outro exemplo, global mRNA meias-vidas também foram detectados em pluripotentes e tronco embrionárias diferenciadas do mouse células11. Nestes exemplos, decaimento do mRNA tem demonstrado ser importante para a regulação da abundância de transcrição e para a transição de células a célula diferentes Estados.
Aplicando os métodos descritos abaixo, descobrimos que mudanças nas taxas de decomposição de transcrição em aproximadamente 500 genes quando comparando os fibroblastos em proliferação e quiescente Estados12. Em particular, nós descobrimos que os destinos do microRNA miR-29, que é ativador nas células quiescentes, são estabilizados quando células de transição de quiescência. Aqui descrevemos a metodologia que usamos para determinar taxas de deterioração nas células proliferando e quiescentes. Esta metodologia é útil para comparar taxas de decaimento do mRNA global em duas distintas mas condições semelhantes quando é solicitada informação sobre decaindo rapidamente os genes. Ele também pode ser usado para abordar outras questões tais como o efeito das condições de cultura celular na decadência de transcrição, por exemplo, em duas dimensões contra três culturas dimensionais. Taxas de decomposição podem ser determinado genoma-largo com métodos como microarrays ou RNA-Seq. Alternativamente, em tempo real qPCR ou mancha do Norte pode ser usada para determinar as taxas de decomposição de forma gene-por-gene ou isoform-por-isoforma. Estas taxas podem ser usadas para calcular a meia-vida de cada gene monitorado e identificar genes com taxas de decomposição que são diferentes em duas condições.
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Protocol
Todos os experimentos descritos foram aprovados pelos conselhos de avaliação institucional na Universidade de Princeton e a Universidade da Califórnia, em Los Angeles.
1. prepare fibroblastos proliferando e inibida pelo contato para curso de tempo ActD
Nota: Este protocolo utiliza uma timecourse com quatro momentos. Três amostras biologicamente independentes podem ser coletadas por commit através da recolha de placas de cultura de tecidos diferentes em um experimento, ou o experimento pode ser repetido várias vezes com diferentes culturas de células. Em nossa experiência, um prato de cultura de tecido de 10 cm (diâmetro) (uma placa) fornece RNA suficiente para análise. Se necessário, vários pratos de cultura de tecido podem ser agrupados para cada amostra a aumentar o número de células em cada commit. Além disso, o mesmo experimento pode ser executado com fibroblastos isolados de diferentes indivíduos como Replica biológico verdadeiramente independente.
- Estabelece culturas quiescentes e proliferação de células para a análise de decomposição de transcrição. Para pilhas proliferating, separam as células a cada três dias enquanto as células inibidora de contato estão se tornando inibida pelo contato.
- Para as células de contato-inibida, mude o meio de cada 2 dias durante 7 dias. Dividi as pilhas proliferating 2 dias antes dos fibroblastos inibida pelo contato estão prontos para a coleção. Um exemplo de um esquema de cultura de células é mostrado na Figura 1. As etapas restantes nesta seção fornecem um protocolo detalhado para estabelecer e divisão das células.
- Isole os fibroblastos dérmicos primários da pele neonatal de acordo com protocolos estabelecidos13. Fibroblastos de passagem para garantir uma população homogênea.
Nota: Fibroblastos podem ser congelados e descongelados, se necessário. - Descongele ou replate fibroblastos, se necessário. Cresce fibroblastos em DMEM com 10% de soro sob condições estéreis em uma incubadora de cultura de tecidos em 37 ° C e 5% de CO2. Use os fibroblastos que foram produzidos para menos de 10 passagens. Fibroblastos devem ser < confluente de 80% no dia de dividir células tornar as populações proliferando e quiescentes.
- Para dividir um prato de cultura de tecido em várias placas, escaldar PBS, tripsina e meio com o soro em um banho de água de 37 ° C por 20 min.
- Aspirar ou usar uma pipeta para remover o meio de cada placa de cultura de tecidos com células para ser replated.
- Pipeta quente PBS em cada prato (10 mL da solução para uma placa de 150 mm, 5 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de 6 placa bem) e 1 mL para um poço de um prato bem 12.
- Aspirado ou pipeta para remover PBS de cada placa de cultura de tecido.
- Delicadamente, Pipetar 1 x Trypsin-EDTA em cada prato (8 mL de solução para uma placa de 150 mm, 3 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de um prato bem 6 e 1 mL para um poço de um prato bem 12).
Nota: Fazer 1 x Trypsin-EDTA diluindo estéril 10 x Trypsin-EDTA em PBS estéril. A solução final 1 x deve ser EDTA de tripsina e 0,02% 0,05%. - Incube a tripsina com células por 5 min.
- Bata levemente a placa para desalojar as células da placa.
- Pipetar para Ressuspender as células em suspensão uma única célula.
- Células em solução de tripsina de transferir para um tubo cônico, contendo o mesmo volume de DMEM com 10% de soro (8 mL de solução para uma placa de 150 mm, 3 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de um prato bem 6 e 1 mL para um poço de um 12 bem da placa).
- Spin para baixo as células a 4 ° C por 5 minutos a 1.000 x g para remover a tripsina.
- Ressuspender as células em um volume adequado do meio e contagem com um hemacytometer para determinar a concentração de células.
- Sementes de 5 x 105 células por placa de cultura de tecidos de 100 mm para se proliferando e células inibida pelo contato.
- Usando esse método, estabelece as amostras de proliferação e inibida pelo contato exigidas para análise (Figura 1).
2. ActD tempo curso
- Resuspenda ActD na concentração das ações de 1 mg/mL (para 1 mg de fatura, uso, 950 µ l de PBS estéril e 50 µ l de DMSO estéril).
Nota: Soluções estoque congeladas da fatura devem ser estáveis por um mês a-20 ° C. Soluções diluídas devem ser descartadas e não armazenadas de continuar a utilizar. - Adicionar ActD ao volume apropriado de escaldadas médio para toda a cultura biológica célula replicar as placas que foram definidas para 0, 120, 240 e 480 min momentos (Figura 2). Adicione ActD na concentração de 15 µ g / mL de meio. Misture bem, Aspire fora o antigo médio e adicionar ActD contendo meio para as células.
- Para um estoque de 1 mg/mL, adicionar 15 µ l fatura para cada mL do meio, por exemplo, para 10 mL de meio para uma placa de 100mm, adicione 150 µ l ActD.
- Para coletar a amostra de commit zero, aspire suavemente o ActD médio e pipetar pré-aquecido PBS para as células. Pipetar 10 mL de solução para uma placa de 150 mm, 5 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de um prato bem 6 e 1 mL para um poço de um prato bem 12.
- Aspire suavemente ou pipeta fora da PBS.
Nota: Todas as etapas que envolvem o isolamento do RNA devem ser realizadas com água livre de RNase, livre de RNase microcentrifuga tubos e pipetas RNase-livre. Luvas devem ser usadas e alteradas com frequência ao trabalhar com o RNA. - Adicione solução de isotiocianato de guanidina-fenol (1 mL/10-cm placa com 4 x 105 4 x 107 células) diretamente para a placa de cultura de tecidos.
Nota: Solução de isotiocianato de guanidina-fenol é uma solução de monofásico que mantém a qualidade do RNA enquanto lise de células e separando proteínas, DNA e RNA.
Cuidado: Isotiocianato de fenol e guanidina são corrosivos. Use proteção adequada. - Pipetar o fenol-guanidina isotiocianato solução-célula a mistura acima e para baixo várias vezes para fazer uma mistura homogênea.
Nota: A solução de isotiocianato de guanidina-fenol lisada pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite ou a-20 ° C por até um ano. - Recolha a cada ponto do tempo decorrido a quantidade adequada de tempo usando o método descrito em etapas 2.3-2.6.
3. isolamento do RNA Total da solução de isotiocianato de guanidina-fenol lisado
- Incube as amostras à temperatura ambiente por 5 min garantir a completa dissolução de complexos de RNA-proteína.
Nota: Os passos do protocolo de solução de isotiocianato de guanidina-fenol podem ser executados à temperatura ambiente a menos que indicado o contrário. - Introduza as transcrições de pico-no controle que podem ser detectadas com a metodologia utilizada.
Nota: O externo RNA controle consórcio (ERCC) pico-no controle mistura14 foi desenvolvida especificamente como um pico no controle para RNA-Seq Ele também pode ser usado para os borrões do Norte ou em tempo real qPCR. Pico-no controles projetados especificamente para microarray tecnologias também estão disponíveis (ver Tabela de materiais).
Nota: Após a rodada inicial, a amostra deve separar em 3 camadas - uma camada orgânica vermelha na parte inferior, uma interfase branco/rosa no meio e uma camada aquosa clara na parte superior (Figura 3).
Nota: Tenha cuidado para não perturbar a intérfase durante este processo. É okey deixar algum da fração aquosa. É melhor deixar um pouco da fração aquosa do que para também incluir algumas das camadas da interfase, como incluindo a interfase camada poderia contaminar o RNA com DNA. A camada aquosa será aproximadamente metade do volume inicial, então cerca de 0,9 mL se a mistura de clorofórmio/solução de isotiocianato de guanidina-fenol foi de 1,8 mL.
Nota: Isto irá resultar em uma pelota densa, sólida que é fácil de monitorar após as etapas de centrifugação que seguem.
Nota: A ponta da pipeta solto realizada na mão pode ser usada para remover o excesso etanol. Se a pelota do RNA é perturbada, mas não descartada, o investigador pode repetir a girar e remover o sobrenadante novamente. Evite descartando a pelota como isto exigirá o investigador para repetir todo o procedimento.
Nota: A pelota do RNA é menos compacta neste passo e tende a subir. Cuidado ao manusear a pelota neste momento para evitar a perda do RNA.
4. análise da abundância de transcrição
- Verificar RNA pureza usando um espectrofotômetro e quantificar o RNA.
Nota: A relação da absorvência em 260 nm a 280 nm deve ser aproximadamente 2.0 para o RNA. - Analise RNA com um gel de agarose a 1% ou uma tecnologia equivalente para visualizar a extensão da degradação.
Nota: Duas claras bandas representando 18S e rRNA 28S deve ser claramente visíveis (Figura 4). Se essas bandas não são visíveis, o RNA pode ser degradado. Dicas de tiro problemas para degradação do RNA são fornecidas na discussão. - Abundância de transcrição monitor nas alíquotas recolhidas do RNA em comparação com o cravado no padrão interno usando microarrays15, RNA-Seq16, em tempo real qPCR17, ou norte borrões18.
- Determine a abundância para cada transcrição em cada ponto de tempo em comparação com um controle cravado em abundância conhecida.
Nota: Para microarrays, os valores serão as intensidades de fluorescência. Para os borrões do Norte, bandas do filme de raios-x podem ser quantificadas. Para qPCR em tempo real, a abundância de transcrição pode ser determinada por comparação com padrões conhecidos com o 2- σσCT método19. Para RNA-Seq, valores normalizados podem ser determinados como FPKM ou fragmentos por quilobase do exon por milhão leituras mapeado. Para taxas de decaimento isoforma específica, RNA-Seq dados podem ser analisados utilizando metodologias isoform reconhecem como DEXSeq20. Taxas de decaimento isoforma específica melhor são determinadas com RNA-Seq Se eles são determinadas com dados de microarray, os dados devem ser analisados em uma base de sonda-por-sonda ao invés de uma base de gene-gene-por. O analista deve ter cuidado ao interpretar a informação de um número limitado de sondas. Por exemplo, pode haver 5 ou menos sondas que são informativas sobre uma isoforma específica. Neste caso, o analista precisará determinar se o comportamento de tais sondas é suficientemente consistente para que os resultados são confiáveis.
- Determine a abundância para cada transcrição em cada ponto de tempo em comparação com um controle cravado em abundância conhecida.
- Execute em tempo real qPCR na RNA isolado17 nas amostras coletadas para analisar genes rapidamente em decomposição, como c-Myc e um gene lentamente decadente como GAPDH, ganhar confiança essa decadência de transcrição taxas foram detectadas com precisão.
Nota: Para confirmação, sondas isoform-específicos em tempo real qPCR podem ser desenvolvidas e usadas para monitorar a abundância de isoformas específicas ao longo do tempo21.
5.Determinação constante de decaimento taxa
- Para cada commit, log-transformar os valores de abundância para cada transcrição (gene-específico ou isoforma específicos).
Nota: Log-transformando os valores irão converter as curvas de decaimento exponencial para linhas que podem ser cabidas com um decaimento linear modelo22. - Se encaixa no perfil de expressão para cada transcrição (gene-específico ou isoforma específicos) para um modelo linear de decadência. A fórmula para esse modelo é f (t) = C - r * t. Nesta equação, C é uma constante que representa o montante inicial de uma transcrição, r é a taxa de declínio e t é o tempo desde o início do experimento. Desta equação, determinar a taxa de deterioração, como r*ln(10) (ver referência11).
Nota: O pacote de software maSigPro é uma abordagem baseada em regressão, projetada para detectar diferenças de perfil de expressão de gene significativo no tempo curso dados23. Resultados para maSigPro e código de exemplo estão disponíveis em: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - Filtre os genes que não conseguem encaixar um modelo log-linear de decadência. Isso pode ser feito com um teste F ANOVA.
Nota: O teste F é baseado na estatística F, que é definida como a variação entre os meios de amostra divididos pela variação dentro de amostras. Corrigi os valores de p para comparações múltiplas aplicando o linear Step-up Benjamini e Hochberg falsa descoberta procedimento24. Um q-valor maior que 0,05 com o F-teste pode ser usado como um limite para os genes que não conseguem encaixar um modelo log-linear de decadência. - Executar um teste F ANOVA para determinar as transcrições com um termo de interação significativa entre uma condição categórica de ciclo celular e o tempo (taxa falsa da descoberta, FDR < 0,05).
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Representative Results
Nós já relatado os resultados das análises de microarray de taxas de decaimento de transcrição em proliferação e inibida por contato primários fibroblastos humanos ao longo de um curso de 8 horas12. É fornecida uma lista de genes com uma mudança significativa na estabilidade de transcrição comparando fibroblastos proliferando e inibida pelo contato em complementar a tabela 1. As intensidades de fluorescência no tempo zero e um longo tempo após o tratamento ActD são fornecidas. Os genes foram incluídos na lista determinando os genes que têm pistas significativamente diferentes em condições de proliferação e inibida pelo contato usando um teste F ANOVA. Exemplos de genes com taxas de decaimento diferente em quiescentes e proliferação de fibroblastos são mostrados na Figura 5.
Figura 1 : Esquemático do protocolo para o estabelecimento de proliferação e inibida pelo contato placas para análise de curso de tempo ActD. É fornecida uma descrição do dia-a-dia das etapas necessárias para estabelecer culturas de células para tratamento de fatura, assumindo quatro momentos serão usados para o curso do tempo. Para simplificar, uma placa é mostrada por Commit, mas placas adicionais podem ser adicionadas para gerar repetições biológicas. O protocolo também pode ser ajustado para adicionar mais placas de células, se mais de quatro momentos são desejados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Esquema ActD tempo claro e decaimento taxa cálculos em quiescente em comparação com a proliferação de fibroblastos humanos. A fração esperada de mRNAs permaneçam ao longo do tempo para uma hipotética transcrição após tratamento com um inibidor transcricional é mostrado. Abaixo, parcelas de amostra da fração de mRNA restante ao longo do tempo são fornecidas para os genes que são mais estáveis em quiescente do que pilhas proliferating e os genes que são mais estáveis na proliferação de células quiescentes. Para cada datapoint, apenas um único valor é mostrado para maior clareza. O protocolo real, haverá três datapoints para cada commit. Esta figura foi modificada da tese de doutorado de Elizabeth Pender Johnson com o consentimento dela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Fotografias da mistura reagente de isotiocianato de guanidina-fenol e clorofórmio antes e após centrifugação. A mistura é mostrada quando o reagente de isotiocianato de guanidina-fenol e clorofórmio são inicialmente combinados, após a mistura e após a centrifugação. Depois que a mistura é centrifugada, a fase inferior, que é vermelha, é a fase orgânica. A interfase no meio é branco e nublado. A fase superior é a fase aquosa e é claro. O RNA é na fase aquosa, que deve ser recolhida com uma pipeta para a precipitação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Gel de amostra do RNA para monitorar a qualidade do RNA. Uma ilustração de um gel de RNA mostrando amostras com RNA intacto. RNA intacto tem bandas proeminentes para o rRNAs 28S e 18S. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Exemplos de genes com taxas de decaimento diferente em proliferando contra fibroblastos quiescentes. Intensidades de fluorescência (expressão gênica) ao longo do tempo são mostradas para quatro genes que decaem diferentemente em proliferando contra fibroblastos quiescentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementares tabela 1: as intensidades de fluorescência de Gene-específico em quiescentes e proliferação de fibroblastos. Dados são fibroblastos fornecidos por tempo zero e um longo tempo após o tratamento de fatura em proliferando e inibida pelo contato. Valores de P, q valores e taxas de detecção de falsas são fornecidas. Tabela é reproduzida a partir de sua publicação original em BMC Genomics12. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Quiescência pode ser induzida por sinais externos, incluindo a retirada de mitógenos ou soro, falta de aderência de célula e inibição de contato. Inibição de contato, um dos vários métodos possíveis para indução de quiescência, é um processo altamente evolutivamente conservado em que células sair do ciclo celular proliferativo em resposta ao contato célula a célula. Aqui focamos na inibição de contato como um exemplo de um método para induzir quiescência. Estudos anteriores relataram que contato célula-célula pode afetar microRNA biogênese25, assim, os resultados fornecem informações sobre um método de quiescência e estudos adicionais são necessários para determinar quais alterações estão associadas a quiescência por si.
Usamos o primários fibroblastos diploides humanos que estamos isolados da pele neonatal. Iniciamos estas experiências com fibroblastos que foram passadas a menos de 10 vezes. Estamos descartados mais tarde-passagem fibroblastos porque eles senesce. Enquanto este protocolo enfoca quiescentes e proliferação de fibroblastos dérmicos, procedimentos descritos podem ser usados para monitorar taxas de decaimento em diferentes tipos de células e sob diferentes condições.
Temos monitorado taxas genoma-largo da decadência do mRNA usando um curso de desligar o tempo de transcrição. Hora de desligar os cursos é o método mais utilizado para dissociar o decaimento do mRNA da transcrição de RNAm para calcular a meia-vida de mRNA1,26. No método descrito aqui, fatura, uma droga que complexos com o B-formulário de DNA para bloquear o alongamento da RNA polimerase II, é usado para prender a transcrição de mRNAs27. A taxa que as transcrições diminuem em abundância ao longo de um período de 8 horas de tempo pode ser determinada como taxa de decaimento da transcrição.
Uma limitação importante de fatura-abordagens para o monitoramento de decaimento de transcrição é que fatura impede a transcrição global, que afeta a viabilidade das células. Isto deve ser mantido em mente ao interpretar dados baseados em fatura, taxas de decomposição são sendo detectados em células que são mais estressadas do que seu estado nativo. Outra importante preocupação é que os efeitos de fatura podem ser diferentes para as células em diferentes Estados, incluindo proliferando contra fibroblastos inibida pelo contato. Uma abordagem para minimizar os efeitos colaterais do tratamento ActD é manter cursos de tempo curtos em duração. Por esta razão, nós selecionamos um curso de tempo de 8 h.
Existem métodos alternativos para fatura para monitoramento transcrição decadência taxas28,29. Cepas de leveduras com alelos II sensível à temperatura do RNA polimerase têm sido utilizadas para monitorar a transcrição decadência taxas30. Uma variação desta abordagem chamada "âncora-afastado" tem utilizou fermento conseguir a condicional depleção da RNA polimerase II, em resposta a rapamicina tratamento31,32. Também é possível acompanhar a decadência em células com transcrição ativa. Por exemplo, nucleotídeos uracil thio-substituídos podem ser introduzidos em células, incorporaram do mRNA e posteriormente detectados33,34,35. Com esta abordagem, a taxa na qual são sintetizadas transcrições diferentes pode ser determinada em células que continuam a sintetizar o mRNA. Tais abordagens tem uma vantagem significativa sobre tratamento de fatura, porque eles não são tóxicos. Em nossa experiência, no entanto, pode haver variabilidade na recuperação de transcrições com esses métodos. ActD tratamento é uma abordagem simples e reprodutível para monitoramento de decaimento de transcrição.
A poucos passos do protocolo fornecido são críticos para seu sucesso. Uma questão importante é evitar a degradação de RNA durante o isolamento de RNA. No passo 4.1, o RNA deve ser monitorado por degradação. Se o RNA não contiver dois picos claros para rRNAs 18S e 28S (Figura 4), isto é um sinal de que a degradação de transcrição ocorreu. Alguns instrumentos fornecem contagens do número de integridade do RNA (RIN) variando de 1 a 10. Amostras com golo de RIN na faixa de 7-10 são aceitáveis para uma análise mais aprofundada. Se o RNA se degrada, então é importante tomar mais precauções para prevenir a degradação de RNA, como garantir que soluções e sterileware são RNase-livre, e que as luvas são usadas quando o manipulação de pipetas para o RNA. Água pode ser pré-tratados com 0,1% pyrocarbonate de dietilo (DEPC), incubada durante pelo menos 2 h a 37 ° C, e autoclavadas durante pelo menos 15 min. nota que DEPC não pode ser usado com buffers de Tris-baseado. RNase descontaminação soluções também podem ser usadas para remover o RNase de reagentes que inibem RNases, centrífugas e pipetas e superfícies de trabalho pode ser adicionado para amostras.
Outro passo crítico é a separação das fases da solução de isotiocianato de guanidina-fenol. É importante garantir que apenas a fase superior é coletada para o RNA de processamento. Se o RNA resultante inclui fenol residual, a relação da absorvência no 230, 260 e 280 nm não será na proporção 1:2:1 conforme o esperado. Maior do que o esperado absorvância a 230 nm pode indicar contaminação fenol. Se isso ocorrer, o RNA pode ser etanol precipitada novamente e lavado várias vezes adicionais para remover qualquer fenol residual.
Finalmente, quando o RNA é peletizado e o sobrenadante é removido, o sedimento pode ser facilmente perturbado, fina e pegajosa. Neste ponto, é importante tomar cuidado em tirar o líquido. Pode ser importante Visualizar o tubo com boa iluminação para localizar a pelota e certifique-se de que não seja perturbado. Adicionado glicogênio pode ajudar a garantir que a pelota é visível neste ponto.
A seleção de pontos de tempo para o curso de tempo de decomposição é também uma questão importante a considerar. Enquanto os quatro momentos selecionados nos permitiram monitorar decadência para mais de 10.000 genes, alguns genes não decair significativamente durante o curso do tempo de 8 h. Se as transcrições de curta duração são de alta prioridade, os investigadores podem querer adicionar coleções de amostra adicional antes de 120 min, por exemplo, em 30 min. Para melhor avaliação de transcrições de longa duração, os investigadores podem querer adicionar coleções de amostra adicional em momentos posteriores.
Outro problema potencial pode resultar se as taxas de deterioração não seguem a distribuição esperada. Por exemplo, pode haver muitos ou poucos genes mostrando um decaimento log-linear de mais de 8 h. Neste caso, é útil monitorar as taxas de decomposição de genes que são conhecidos por serem de curta ou longa duração a fim de determinar se eles seguem o padrão esperado.Se os genes têm uma inclinação positiva, ao invés de negativo ao longo do tempo, eles podem ser excluídos posterior análise porque eles não demonstram uma taxa de decaimento log-linear. Uma última questão pode surgir se as células em duas condições a serem comparadas têm respostas muito diferentes para o ActD tal que muitos genes decaem mais rapidamente em uma condição. Neste caso, pode ser útil para se referir não só a diferença na taxa de decomposição entre os dois Estados, mas também para os controles de ponto-em que sugerimos incluindo antes da isolação do RNA para fornecer informações sobre as taxas de declínio absoluto nos dois Estados.
A capacidade de monitorar taxas de decaimento de transcrição entre células proliferando e quiescentes ou qualquer dois Estados semelhantes tem o potencial de fornecer mais insight sobre a importância da deterioração de transcrição na regulação mudanças fisiológicas. As aplicações incluem células com e sem ativação oncogênica, antes e depois da senescência ou infecção viral, com e sem a derrubada de um gene específico, ou em dois Estados diferentes de diferenciação. Os resultados podem ser acoplados com RNA-Seq para fornecer informações sobre alterações específicas isoform em taxas de decaimento de transcrição, que podem fornecer insights sobre as mudanças na expressão isoforma observada como as células passam por transições fisiológicas.
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Disclosures
Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.
Acknowledgments
HAC foi o estudioso Milton E. Cassel da Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabalho foi financiado por subsídios para HAC, do Instituto Nacional de ciências médicas de geral centro da concessão excelência GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, nacional Science Foundation Grant OCI-1047879 agosto de David, Instituto Nacional de General Medical Sciences R01 GM081686, Instituto Nacional de ciências médicas gerais R01 GM0866465, o Eli & Edythe Broad centro de medicina regenerativa & investigação em células estaminais, centro de saúde/UCLA CTSI NIH das mulheres Iris Cantor Grant UL1TR000124 e a leucemia linfoma sociedade. Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de câncer do institutos nacionais da saúde sob prêmio número P50CA092131. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. HAC é um membro do Eli & Edythe amplo centro de medicina regenerativa & investigação em células estaminais, o Instituto de Biologia Molecular de UCLA e o programa interdepartamental de bioinformática da UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
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