Summary
We beschrijven een protocol voor genereren prolifererende en zwakke primaire menselijke dermale fibroblasten, monitoring transcript verval tarieven en differentieel rottend genen te identificeren.
Abstract
Onbeweeglijkheid is een tijdelijke, omkeerbare staat in die cellen hebben opgehouden celdeling, maar behouden de capaciteit te verspreiden. Meerdere studies, met inbegrip van ons, hebben aangetoond dat onbeweeglijkheid geassocieerd met grootschalige wijzigingen in genexpressie wordt. Sommige van deze veranderingen ontstaan door veranderingen in het niveau of de activiteit van proliferatie-geassocieerde transcriptiefactoren, zoals E2F en MYC. We hebben aangetoond dat mRNA verval ook aan wijzigingen in genexpressie tussen delende en zwakke cellen bijdragen kan. In dit protocol beschrijven we de procedure voor de vaststelling van delende en rustige culturen van menselijke dermale voorhuid fibroblasten. Vervolgens beschrijven we de procedures voor het remmen van nieuwe transcriptie in delende en zwakke cellen met Actinomycin D (ActD). ActD behandeling vertegenwoordigt een ongecompliceerd en reproduceerbare aanpak te distantiëren van nieuwe transcriptie van transcript verval. Een nadeel van de ActD behandeling is dat het tijdsverloop beperkt blijven tot een kort tijdsbestek moet omdat ActD heeft invloed op de levensvatbaarheid van de cellen. Transcript niveaus worden gecontroleerd na verloop van tijd om te bepalen van transcript verval tarieven. Deze procedure maakt de identificatie van genen en isoforms dat differentiële verval in prolifererende versus zwakke fibroblasten vertonen.
Introduction
Steady state niveaus van afschriften weerspiegelen de bijdrage van zowel transcript synthese en transcript verval. Geregeld en gecoördineerd transcript verval is een belangrijk mechanisme voor de controle op biologische processen1,,2,,3,4. Bijvoorbeeld, is transcript verval tarieven gebleken om bij te dragen aan de temporele reeks van gebeurtenissen na activering door de inflammatoire cytokine tumor necrosis factor5.
Wij hebben eerder aangetoond dat de overgang tussen proliferatie en onbeweeglijkheid in primaire menselijke fibroblasten geassocieerd met veranderingen in het transcript niveaus van veel genen6 wordt. Sommige van deze veranderingen weerspiegelen verschillen in de activiteit van transcriptiefactoren tussen deze twee landen.
Wijzigingen in een transcript van verval tarief kunnen ook bijdragen tot veranderingen in het niveau van de expressie van een transcript in twee verschillende staten7,8. Gebaseerd op onze eerdere bevindingen dat de overgang tussen proliferatie en onbeweeglijkheid geassocieerd met veranderingen in de niveaus van meerdere microRNAs9 wordt, we gevraagd of er ook een bijdrage van differentiële transcript verval in de veranderingen in genexpressie in prolifererende versus zwakke fibroblasten.
Wij vastbesloten om te controleren transcript stabiliteit, het tarief van verval van afschriften genoom-brede in prolifererende versus zwakke cellen. Om dit te bereiken, gecontroleerd we verval tarieven in prolifererende versus zwakke fibroblasten door de invoering van een inhibitor van de omwenteling van nieuwe transcriptie en controle op het tarief waartegen afzonderlijke afschriften na verloop van tijd verdwenen. Het voordeel van deze aanpak is dat, in vergelijking met de methoden die gewoon algemene genexpressie, volgen door remming van de nieuwe transcript synthese, wij zullen kunnen bepalen van het verval tarief voor deze afschriften afzonderlijk van het tarief waartegen ze zijn getranscribeerd.
ActD behandeling bepalen transcript verval tarieven te remmen van nieuwe transcriptie is succesvol toegepast in meerdere Eerdere studies. ActD is gebruikt om het belang van RNA stabiliteit in de wijzigingen in afschrift overvloed die voortvloeien uit behandeling met pro-inflammatoire cytokines5ontleden. Een soortgelijke aanpak is ook gebruikt om de verschillen in afschrift verval tarief in prolifererende versus gedifferentieerde C2C12 cellen als zij vaststellen dat een gedifferentieerde spier fenotype10ontleden. Een ander voorbeeld: global mRNA halfwaardetijd pluripotente ook zijn gevonden en gedifferentieerde muis embryonale stamcellen cellen11. In deze voorbeelden, is mRNA verval aangetoond dat het belangrijk voor de regulering van transcript overvloed en voor de overgang van cellen andere cel toe.
Toepassing van de methoden die hieronder worden beschreven, ontdekt we veranderingen in afschrift verval tarieven in ongeveer 500 genen bij het vergelijken van fibroblasten in delende en zwakke staten12. In het bijzonder, ontdekt hebben we dat de doelstellingen van de microRNA miR-29, die werden in rustige cellen, is gestabiliseerd wanneer cellen overgang naar onbeweeglijkheid. Hier beschrijven we de methodologie die we gebruikt om te bepalen van verval tarieven in delende en zwakke cellen. Deze methode is handig voor het vergelijken van global mRNA verval tarieven in twee verschillende maar vergelijkbare omstandigheden wanneer informatie over snel rottend genen wordt aangevraagd. Het kan ook worden gebruikt om aan te pakken van de andere kwesties, zoals het effect van cel kweekomstandigheden op transcript verval, bijvoorbeeld in twee dimensionale versus drie dimensionale culturen. Verval tarieven kunnen bepaalde genoom-brede met methoden, zoals microarrays of RNA-Seq. alternatief, real-time qPCR of het noordelijke bevlekken kan worden gebruikt om te bepalen van verval tarieven op basis van gen-door-gen of isovorm-door-isovorm. Deze tarieven kunnen vervolgens worden gebruikt voor het berekenen van de halfwaardetijd van elke gecontroleerde gen en om genen te identificeren met de verval-tarieven die in twee voorwaarden verschillen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten beschreven werden goedgekeurd door institutionele evaluatie Boards op Princeton University en de University of California, Los Angeles.
1. Prepareer delende en Contact-geremd fibroblasten ActD tijdsverloop
Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van een timecourse met vier timepoints. Drie biologisch onafhankelijke monsters kunnen worden verzameld per timepoint door het verzamelen van verschillende weefselkweek platen in één experiment, of het experiment kan worden herhaald meerdere malen met verschillende culturen van cellen. In onze ervaring voorziet een 10 cm (diameter) van weefselkweek schotel (één plaat) voldoende RNA analyse. Indien nodig, kunnen meerdere weefselkweek gerechten voor elk monster te verhogen van het aantal cellen in elke timepoint worden samengevoegd. Bovendien kan hetzelfde experiment worden uitgevoerd met fibroblasten geïsoleerd uit verschillende individuen zoals werkelijk onafhankelijke biologische repliceert.
- Stand delende en rustige culturen van cellen voor de analyse van de verval transcript. Voor delende cellen, de cellen splitsen om de drie dagen terwijl de contact-geremd cellen steeds contact-geremd.
- Voor de cellen van de contact-geremd, wijzigen het medium om de 2 dagen voor 7 dagen. Splits de delende cellen 2 dagen voordat de contact-geremd fibroblasten klaar staan. Een voorbeeld van een cel cultuur regeling is weergegeven in Figuur 1. De overige stappen in deze sectie bieden een gedetailleerd protocol voor de vaststelling en de cellen splitsen.
- Isoleren van primaire dermale fibroblasten van neonatale huid volgens vaste protocollen13. Passage fibroblasten om een homogene populatie.
Opmerking: Fibroblasten kunnen worden ingevroren en ontdooid, indien nodig. - Ontdooien of replate fibroblasten, indien nodig. Fibroblasten in DMEM met 10% serum onder steriele omstandigheden in een incubator weefselkweek bij 37 ° C en 5% CO2groeien. Fibroblasten die geteeld voor minder dan 10 passages zijn gebruiken. Fibroblasten moet < 80% heuvels op de dag van het splitsen van cellen te maken delende en zwakke bevolkingsgroepen.
- Prewarm om te splitsen een plaat van weefselkweek in meerdere platen, PBS, trypsine en medium met serum in een waterbad 37 ° C gedurende 20 minuten.
- Gecombineerd of gebruik een pipet om het medium van elke plaat weefselkweek met cellen die moeten worden replated.
- Pipetteer warme PBS op elk bord (10 mL van oplossing voor een 150 mm plaat, 5 mL van oplossing voor een 100 mm plaat, 2 mL voor een putje van een 6 goed plaat), en 1 mL voor een putje van een 12 goed plaat.
- Aspirate of Pipetteer PBS uit elke weefselkweek plaat te verwijderen.
- Pipet zachtjes 1 x trypsine-EDTA op elk bord (8 mL van oplossing voor een 150 mm plaat, 3 mL van oplossing voor een 100 mm plaat, 2 mL voor een putje van een 6 goed plaat en 1 mL voor een putje van een 12 goed plaat).
Opmerking: Controleer 1 x trypsine-EDTA door verder verdunnen van steriele 10 x trypsine-EDTA in steriele PBS. De laatste 1 x oplossing moet de trypsine en 0,02% EDTA 0,05%. - Incubeer trypsine met cellen voor 5 min.
- Tik zachtjes op de plaat om te verjagen van de cellen van de plaat.
- Pipetteer aan resuspendeer de cellen in de schorsing van een enkele cel.
- Cellen in trypsine oplossing overbrengen in een conische buis met dezelfde hoeveelheid DMEM met 10% serum (8 mL van oplossing voor een 150 mm plaat, 3 mL van oplossing voor een 100 mm plaat, 2 mL voor een putje van een 6 goed plaat en 1 mL voor een putje van een 12 goed plaat).
- Spin down cellen bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij 1.000 x g trypsine verwijderen.
- Resuspendeer de cellen in een passende omvang van medium en graaf met een hemacytometer om te bepalen van de concentratie van de cel.
- Zaad 5 x 105 cellen per 100 mm weefselkweek plaat voor prolifererende en contact-geremd cellen.
- Met behulp van deze methode, stellen de delende en contact-geremd monsters voor analyse (Figuur 1).
2. ActD tijdsverloop
- Resuspendeer ActD op een voorraad concentratie van 1 mg/mL (voor 1 mg van ActD, de 950 µL gebruik van steriele PBS en 50 µL van steriele DMSO).
Opmerking: Bevroren voorraadoplossingen van ActD moet stabiel voor een maand bij-20 ° C. Verdunde oplossingen moeten worden verwijderd en niet opgeslagen voor verder gebruik. - Toevoegen van ActD aan het juiste volume van voorverwarmde medium voor alle biologische repliceren celkweek die platen waren ingesteld voor de 0, 120, 240 en 480 min timepoints (Figuur 2). ActD op een concentratie van 15 µg per mL medium toevoegen. Meng goed, gecombineerd uit het oude medium en medium ActD-bevattende toevoegen aan de cellen.
- Voor een voorraad van 1 mg/mL, voeg 15 µL ActD voor elke mL van medium, bijvoorbeeldvoor 10 mL medium voor een 100 mm plaat, Voeg 150 µL ActD.
- De nul timepoint monster verzameld, zachtjes gecombineerd uit de ActD gemiddeld en Pipetteer voorverwarmde PBS op de cellen. Pipetteer 10 mL van oplossing voor een 150 mm plaat, 5 mL van oplossing voor een 100 mm plaat, 2 mL voor een putje van een 6 goed plaat en 1 mL voor een putje van een 12 goed plaat.
- Zachtjes gecombineerd of Pipetteer af de PBS.
Opmerking: Alle stappen waarbij RNA isolatie moeten worden uitgevoerd met RNase-gratis water, RNase-vrije microcentrifuge buizen en RNase-vrije pipetten. Handschoenen moeten worden gedragen en vaak bij het werken met RNA veranderd. - Fenol-guanidine isothiocyanaat oplossing (1 mL/10-cm plaat met 4 x 10,5 tot en met 4 x 107 cellen) rechtstreeks toevoegen aan de plaat weefselkweek.
Opmerking: Fenol-guanidine isothiocyanaat oplossing is een monofasische oplossing die RNA kwaliteit handhaaft terwijl het lysing van cellen en RNA, DNA en eiwit scheiden van elkaar.
Let op: Fenol en guanidine isothiocyanaat zijn bijtende. Juiste bescherming te gebruiken. - Pipetteer de fenol-guanidine isothiocyanaat oplossing-cel mengsel op en neer meerdere malen om een homogeen mengsel.
Opmerking: Fenol-guanidine isothiocyanaat oplossing lysate kan worden bewaard bij 4 ° C's nachts of bij-20 ° C voor maximaal een jaar. - Verzamelen elk tijdstip, nadat de juiste hoeveelheid tijd is verstreken, volgens de methode in stap 2.3-2.6.
3. isolatie van in totaal RNA van fenol-guanidine isothiocyanaat oplossing Lysate
- Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten om de volledige ontbinding van RNA-eiwitcomplexen.
Opmerking: De stappen van het protocol van fenol-guanidine isothiocyanaat oplossing kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. - Afschriften van de spike-controle die kunnen worden gedetecteerd door de gebruikte methodiek te introduceren.
Opmerking: De externe RNA controle consortium (ERCC) spike-controle mix14 is speciaal ontworpen als een spike-controle voor RNA-Seq. Het kan ook gebruikt worden voor noordelijke blots of real-time qPCR. Spike-in besturingselementen speciaal ontworpen voor microarray technologieën zijn ook beschikbaar (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Na de eerste spin, het monster moet scheiden in 3 lagen - een rode organische laag op de bodem, een wit/roze interfase in het midden, en een heldere waterige laag op de top (Figuur 3).
Opmerking: Wees voorzichtig niet te verstoren de interfase tijdens dit proces. It's okay to laat een aantal van de waterige breuk. Het is beter om te vertrekken enkele van de waterige breuk dan om ook enkele van de interfase lagen, met inbegrip van de interfase laag de RNA met DNA besmetten zou. De waterige laag zullen ongeveer de helft van het oorspronkelijke volume, dus ongeveer 0,9 mL als het fenol-guanidine isothiocyanaat oplossing/chloroform mengsel 1.8 mL was.
Opmerking: Dit zal resulteren in een dichte, solide pellet die gemakkelijk te controleren na de stappen van de spin die volgen.
Opmerking: Een tip van de losse pipet in de hand gehouden kan worden gebruikt voor het verwijderen van overtollige ethanol. Als de RNA-pellet is verstoord, maar niet verwijderd, kan de onderzoeker Herhaal de spin en het supernatant weer verwijderen. Vermijd de pellet te verwijderen als dit vergt de onderzoeker de hele procedure herhalen.
Opmerking: De RNA-pellet is minder compact bij deze stap en heeft de neiging om te bewegen. Wees extra voorzichtig bij het verwerken van de pellet op dit punt om te voorkomen dat verliezen van het RNA.
4. analyse van Transcript overvloed
- RNA te kwantificeren en controleren van RNA op zuiverheid met behulp van een spectrofotometer.
Opmerking: De verhouding tussen de absorptie bij 260 nm tot 280 nm moet ongeveer 2.0 voor RNA. - Het analyseren van RNA met een 1% agarose gel of een gelijkwaardige technologie om te visualiseren van de mate van aantasting.
Opmerking: Twee duidelijke banden voor 18S en 28 rRNA moet duidelijk zichtbaar (Figuur 4). Als deze banden niet zichtbaar zijn, kan het RNA worden afgebroken. Problemen schieten tips voor RNA afbraak vindt u in de discussie. - Monitor transcript overvloed in de verzamelde aliquots van RNA vergeleken met de spiked-in interne standaard met behulp van microarrays15, RNA-Seq16, real-time qPCR17, of Noord vlekken18.
- Bepaal de overvloed voor elke transcript op elk punt van de tijd in vergelijking met een puntige-controle van bekende overvloed.
Opmerking: Voor microarrays zullen de waarden fluorescentie intensiteiten. Voor noordelijke vlekken, kunnen banden op de X-ray film worden gekwantificeerd. Voor real-time qPCR, kan transcript overvloed worden bepaald ten opzichte van bekende normen met de 2- σσCT methode19. Voor RNA-Seq, kan genormaliseerde waarde worden bepaald als FPKM of fragmenten per kilobase van exon per miljoen leest toegewezen. Voor isovorm-specifieke verval tarieven, kan RNA-Seq gegevens worden geanalyseerd met behulp van isovorm-aware methodologieën zoals DEXSeq20. Isovorm-specifieke verval tarieven worden best bepaald met RNA-Seq. Als ze dienen te worden vastgesteld met microarray gegevens, moeten dan de gegevens worden geanalyseerd op basis van de sonde-door-probe in plaats van op basis van gen-door-gen. De analist moet voorzichtig met het interpreteren van informatie uit een beperkt aantal sondes. Bijvoorbeeld, kan er 5 of minder sondes die informatief over een bepaald isovorm. De analist moet zich in dit geval om te bepalen of het gedrag van deze sondes voldoende overeenstemming is, zodat de resultaten betrouwbaar zijn.
- Bepaal de overvloed voor elke transcript op elk punt van de tijd in vergelijking met een puntige-controle van bekende overvloed.
- Real-time qPCR uitvoeren op de geïsoleerde RNA-17 in de verzamelde monsters te analyseren snel rottend genen, zoals c-Myc en een langzaam rottend gen zoals GAPDH, om vertrouwen te winnen dat afschrift verval tarieven waren correct gedetecteerd.
Opmerking: Voor verdere bevestiging, isovorm-specifieke real-time qPCR sondes kunnen worden ontwikkeld en gebruikt voor het bewaken van de overvloed aan specifieke isoforms over tijd21.
5.Constante bepalen van verval
- Voor elke timepoint, log-transformatie de overvloed waarden voor elke transcript (gen-specifieke of isovorm-specifieke).
Opmerking: Log-transformeren de waarden zal omzetten in exponentiële afname curven lijnen die worden met een lineaire verval model22 passen kunnen. - Past het profiel van de expressie voor elke transcript (gen-specifieke of isovorm-specifieke) naar het model van een lineaire verval. De formule voor een dergelijk model is f(t) = C - r * t. In deze vergelijking, C is een constante die het beginbedrag van een afschrift aangeeft, r is de snelheid van achteruitgang en t is de tijd sinds het begin van het experiment. Uit deze vergelijking, bepalen de verval-tarief als r*ln(10) (zie referentie11).
Opmerking: Het maSigPro softwarepakket is een regressie gebaseerde benadering ontworpen voor het opsporen van belangrijke gen expressie profiel verschillen in tijd cursus data23. Voorbeeldcode en resultaten voor de maSigPro zijn beschikbaar op: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - Genen die niet aan een log-lineaire verval model uitfilteren. Dit kan worden bereikt met een ANOVA F-toets.
Opmerking: de F-test is gebaseerd op de F-statistiek, die is gedefinieerd als de variatie tussen steekproefgemiddelden aangeeft gedeeld door de variatie binnen monsters. Corrigeer de p-waarden voor meerdere vergelijkingen door de lineaire step-up Benjamini en Hochberg valse ontdekking procedure24toe te passen. Een q-waarde die groter is dan 0,05 met de F-toets kan worden gebruikt als een cutoff voor de genen die niet aan een log-lineaire verval-model. - Uitvoeren van een ANOVA F-test om te bepalen van chat-kopieën met de termijn van een belangrijke interactie tussen een categorische celcyclus voorwaarde en de tijd (valse ontdekking tarief, FDR < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerder hebben we de resultaten van microarray analyses van transcript verval tarieven in delende en contact-geremd primaire menselijke fibroblasten gemeld over een tijd van de 8-uurs cursus12. Een lijst van genen met een significante verandering in afschrift stabiliteit vergelijken delende en contact-geremd fibroblasten wordt gegeven in de aanvullende tabel 1. De intensiteit van de fluorescentie op moment nul en in een tijdsverloop na de ActD behandeling worden geleverd. Genen werden opgenomen op de lijst door het bepalen van de genen die hebben aanzienlijk verschillende hellingen in delende en contact-geremd voorwaarden met behulp van een ANOVA F-test. Voorbeelden van genen met verschillende verval tarieven in delende en rustige fibroblasten zijn afgebeeld in Figuur 5.
Figuur 1 : Schematische van protocol voor de vaststelling van delende en contact-geremd platen voor ActD time cursus analyse. Een beschrijving van de day-by-day van de nodige maatregelen om culturen van cellen voor ActD behandeling wordt gegeven, uitgaande van vier timepoints zal worden gebruikt voor het tijdsverloop. Voor eenvoud, één plaat wordt weergegeven per timepoint, maar extra platen kunnen worden toegevoegd aan het genereren van biologische wordt gerepliceerd. Het protocol kan ook worden aangepast om meer platen van cellen toevoegen als zijn meer dan vier timepoints gewenst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Schematische voorstelling van het tijdsverloop van de ActD en verval stem berekeningen in rustige t.o.v. delende menselijke fibroblasten. De verwachte Fractie van mRNAs resterende na verloop van tijd voor een hypothetische transcript na behandeling met een transcriptionele remmer is getoond. Hieronder, monster percelen van de Fractie van mRNA resterende na verloop van tijd worden geleverd voor de genen die zijn stabieler in rustige dan delende cellen en genen die zijn stabieler in prolifererende dan zwakke cellen. Voor elke datapoint, wordt slechts een enkele waarde weergegeven voor de duidelijkheid. In het werkelijke protocol, zal er drie datapoints voor elke timepoint. Dit cijfer is gewijzigd van Elizabeth Pender Johnsons doctoraatsthesis met haar toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Foto's van het mengen van fenol-guanidine isothiocyanaat reagens en chloroform vóór en na het centrifugeren. Het mengsel wordt weergegeven wanneer de fenol-guanidine isothiocyanaat reagens en chloroform zijn aanvankelijk gecombineerd, na het mengen en na het centrifugeren. Nadat het mengsel wordt gecentrifugeerd, is de onderste fase, die rood is, de organische fase. De interfase in het midden is wit en bewolkt. De bovenste fase is de waterige fase en het is duidelijk. RNA is in de waterige fase, die moet worden verzameld met een pipet voor neerslag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Monster RNA gel te waken over de kwaliteit RNA. Een illustratie van een RNA-gel tonen monsters met intact RNA. Intact RNA heeft prominente bands voor de 28 en 18S rRNAs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Voorbeelden van genen met verschillende verval tarieven in prolifererende versus zwakke fibroblasten. Fluorescentie intensiteiten (genexpressie) na verloop van tijd worden weergegeven voor vier genen die anders verval in prolifererende versus zwakke fibroblasten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende tabel 1: gen-specifieke fluorescentie intensiteiten in delende en rustige fibroblasten. Gegevens zijn verstrekt voor tijd nul en in een tijdsverloop na de ActD behandeling in prolifererende en contact-geremd fibroblasten. P-waarden, q waarden en valse ontdekking tarieven worden geleverd. Tabel is overgenomen uit de oorspronkelijke publicatie in BMC Genomics12. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onbeweeglijkheid kan worden opgewekt door externe signalen, met inbegrip van intrekking van mitogenen of serum, gebrek aan cel adhesie en remming van de contactpersoon. Contact remming, een van meerdere mogelijke methoden voor inducerende onbeweeglijkheid, is een zeer evolutionair geconserveerde proces waarin cellen de proliferatieve celcyclus in reactie op cel-naar-cel contact sluiten. Hier richten we ons op remming van het contact als een voorbeeld van een methode voor het opwekken van onbeweeglijkheid. Eerdere studies hebben gemeld dat cel contact kan invloed hebben op microRNA biogenese25, dus de resultaten informatie één onbeweeglijkheid-methode verstrekken en bijkomende studies zijn nodig om te bepalen welke wijzigingen geassocieerd met onbeweeglijkheid worden per se.
We gebruikten de primaire menselijke diploïde fibroblasten die we geïsoleerd van neonatale huid. Wij begonnen deze experimenten met fibroblasten die minder dan 10 keer waren gepasseerd. We later-passage fibroblasten verwijderd, omdat ze senesce. Terwijl dit protocol is gericht op delende en rustige dermale fibroblasten, kunnen de beschreven procedures worden gebruikt om te controleren van verval tarieven in verschillende soorten cellen en onder verschillende omstandigheden.
Wij gecontroleerd mRNA verval tarieven genoom-brede met behulp van een transcriptie uitschakeling tijdsverloop. Uitschakeling tijdsverloop zijn de meest gebruikte methode voor ontkoppeling van mRNA verval van de transcriptie van mRNA om te berekenen van mRNA halfwaardetijd1,26. In de methode die hier worden beschreven, ActD, een medicijn dat complexen met het B-formulier van DNA te blokkeren rek van RNA Polymerase II, tot arrestatie van de transcriptie van mRNAs27wordt gebruikt. Het tarief dat afschriften in overvloed over een periode van 8 uur verlagen kan worden bepaald als van het transcript verval tarief.
Een belangrijke beperking van ActD gebaseerde benaderingen voor het toezicht op transcript verval is dat ActD voorkomt dat globale transcriptie, die zal van invloed zijn op de levensvatbaarheid van de cellen. Dit moet in mening worden gehouden bij de interpretatie van de ActD gebaseerde gegevens, zoals verval tarieven worden vastgesteld in cellen die meer dan hun geboortestaat benadrukt zijn. Een ander belangrijk aandachtspunt is dat de gevolgen van ActD voor cellen in verschillende Staten, waaronder prolifererende versus contact-geremd fibroblasten kunnen afwijken. Een benadering voor het minimaliseren van de bijwerkingen van de behandeling van de ActD is te houden van korte duur tijdsverloop. Om deze reden, wij hebben gekozen een tijdsverloop 8 h.
Er zijn alternatieve benaderingen van ActD voor het toezicht op transcript verval tarieven28,29. Giststammen met temperatuurgevoelige RNA polymerase II allelen zijn gebruikt om te controleren transcript verval tarieven30. Een variatie op deze aanpak genaamd "anker-weg" hanteert voor het bereiken van voorwaardelijke uitputting van RNA polymerase II in reactie op rapamycin behandeling31,32in gist. Het is ook mogelijk om te controleren van verval in cellen met actieve transcriptie. Bijvoorbeeld, thio-gesubstitueerde uracil nucleotiden kunnen worden ingevoerd in de cellen opgenomen in mRNA en later ontdekt33,34,35. Met deze aanpak kan het tarief waartegen verschillende afschriften worden gesynthetiseerd worden bepaald in cellen die zijn voortzetting voor het synthetiseren van mRNA. Dergelijke benaderingen hebben een aanzienlijk voordeel ten opzichte van ActD behandeling, omdat ze niet giftig zijn. In onze ervaring, echter kunnen er variabiliteit in het herstel van de chat-kopieën met deze methoden. ActD behandeling is een eenvoudig en reproduceerbare benadering voor het toezicht op transcript verval.
Een paar stappen in het protocol geboden zijn cruciaal voor het succes ervan. Een belangrijke kwestie is het voorkomen van RNA afbraak tijdens RNA isolatie. Bij stap 4.1, moet RNA worden gecontroleerd voor afbraak. Als de RNA bevat geen twee duidelijke pieken voor 18S en 28 rRNAs (Figuur 4), is dit een teken dat de aantasting van het transcript heeft plaatsgevonden. Sommige instrumenten bieden RNA Integrity nummer (RIN) scores variërend van 1 tot 10. Monsters met RIN scores in het bereik van 7-10 zijn aanvaardbaar voor verdere analyse. Als de RNA is aangetast, dan is het belangrijk om meer voorzorgsmaatregelen ter voorkoming van RNA afbraak, zoals ervoor te zorgen dat de oplossingen en sterileware RNase-vrij worden, en dat handschoenen worden gedragen wanneer behandeling pipettes voor RNA te nemen. Water kan worden voorbehandeld met 0,1% diethyl pyrocarbonate (DEPC), gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd en gesteriliseerde met autoclaaf gedurende ten minste 15 minuten opmerking dat DEPC kan niet worden gebruikt met Tris gebaseerde buffers. RNase decontaminatie oplossingen ook gebruikt worden kunnen RNase verwijderen uit werkoppervlakten, centrifuges, en pipetten en reagentia die een remmende werking van de RNases kan worden toegevoegd aan de monsters.
Een andere belangrijke stap is de scheiding van de fasen van de fenol-guanidine isothiocyanaat oplossing. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat alleen de bovenste fase wordt verzameld voor RNA verwerking. Als de resulterende RNA residuele fenol, de verhouding van de absorptie bij 230 260 en 280 bevat nm zullen niet in de verhouding 1:2:1 zoals verwacht. Hoger dan verwachte absorptie bij 230 nm fenol besmetting kunt aangeven. Als dit gebeurt, kunnen de RNA ethanol opnieuw neergeslagen en gewassen aanvullende meermaals te verwijderen van alle resterende fenol.
Tot slot, wanneer het RNA is Ingehuld en het supernatant wordt verwijderd, kunnen de pellet kleverige, dun en gemakkelijk verstoord zijn. Op dit punt, is het belangrijk om extra zorg in het opstijgen van de vloeistof. Het is wellicht belangrijk om te visualiseren van de buis met goede verlichting te vinden van de pellet en zorg ervoor dat het niet wordt verstoord. Toegevoegde glycogeen kan helpen om ervoor te zorgen dat de pellet is zichtbaar op dit punt.
De selectie van de tijdstippen voor de tijdsverloop van verval is ook een belangrijke kwestie te overwegen. Terwijl de vier timepoints die we geselecteerd we controleren van verval voor meer dan 10.000 genen konden, deed sommige genen niet aanzienlijk verval in de loop van de tijd 8 h. Als kortstondige transcripten een hoge prioriteit zijn, kunnen de onderzoekers wilt toevoegen extra monstercollecties voorafgaand aan 120 min, bijvoorbeeld op 30 min. Voor betere evaluatie van langlevende afschriften, kunnen de onderzoekers wil graag extra monstercollecties op latere timepoints.
Een ander potentieel probleem kan leiden tot als de verval-tarieven u niet de verwachte verdeling voert. Bijvoorbeeld, er mogelijk te veel of te weinig genen tonen een log-lineaire verval stem op meer dan 8 h. Als dit gebeurt, is het handig om te controleren de verval-tarieven van genen waarvan bekend is dat korte of langlevende worden om te bepalen of ze het verwachte patroon volgen.Indien de genen hebben een positieve in plaats van een negatieve helling na verloop van tijd, kunnen ze worden uitgesloten van verdere analyse als ze doen een log-lineaire verval-tarief niet aantonen. Een laatste probleem kan zich voordoen als de cellen in de twee voorwaarden worden vergeleken zeer verschillende reacties op de ActD zodat vele genen verval sneller in één voorwaarde. In dit geval is het wellicht nuttig om te verwijzen naar het verschil in verval tarief tussen de twee staten, maar ook naar de piek-in besturingselementen die wij suggereren met inbegrip van vóór RNA isolatie informatie te verstrekken over absolute verval tarieven in de twee staten.
De mogelijkheid om te controleren transcript verval tarieven tussen delende en zwakke cellen of twee soortgelijke landen heeft de potentie om meer inzicht in het belang van transcript verval bij het reguleren van fysiologische veranderingen. Toepassingen zijn onder andere cellen met en zonder oncogene activering, voor en na senescentie of virale infectie, met en zonder knockdown van een specifiek gen, of in twee verschillende staten van differentiatie. De bevindingen kunnen gepaard gaan met RNA-Seq informatie te verstrekken over isovorm-specifieke veranderingen in afschrift verval tarieven, die geven in de veranderingen in de isovorm expressie waargenomen inzicht kunnen zoals cellen ondergaan fysiologische overgangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende belangen openbaar te maken.
Acknowledgments
HAC was de Milton E. Cassel geleerde van de Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dit werk werd gefinancierd door subsidies voor HAC van het National Institute of General Medical Sciences Center van Excellence subsidie P50 GM071508 (P.I. David Botstein), PhRMA Stichting subsidie 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 tot en met augustus van David, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Rijksinstituut voor algemene medische wetenschappen R01 GM0866465, de Eli & jongevrouw brede centrum van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek, de Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, en de maatschappij van de leukemie lymfoom. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer P50CA092131. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. HAC deel uitmaakt van de Eli & jongevrouw brede Center van regeneratieve geneeskunde & stamcelonderzoek, de UCLA moleculaire biologie-instituut, en het UCLA Bioinformatics interdepartementale programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
