Summary
Vi beskriver en protokoll for genererer voksende og quiescent primære menneskelig dermal fibroblaster, overvåking transkripsjon forfall priser og identifisere ulikt råtnende gener.
Abstract
Gågaten er en midlertidig, reversibel tilstand der cellene har opphørt celledeling, men beholde evnen til å spre seg. Flere studier, inkludert vår, har vist at gågaten er forbundet med omfattende endringer i genuttrykk. Noen av disse endringene skje gjennom endringer i nivå eller aktivitet av spredning-assosiert transkripsjonsfaktorer, som E2F og MYC. Vi har vist at mRNA forfall kan også bidra til endringer i genuttrykk mellom voksende og quiescent celler. I denne protokollen beskriver vi fremgangsmåten for å etablere voksende og quiescent kulturer av menneskelig dermal foreskin fibroblaster. Vi beskriver prosedyrene for å hemme nye transkripsjon i voksende og quiescent celler med Actinomycin D (ActD). ActD behandling representerer en grei og reproduserbar tilnærming til dissociating nye transkripsjon fra transkripsjon forfall. En ulempe for ActD behandling er at time course skal begrenses til kort tid fordi ActD påvirker celle levedyktighet. Transkripsjon nivåer overvåkes over tid å bestemme transkripsjon forfall priser. Denne prosedyren gir mulighet for identifisering av gener og isoformene som viser differensial forfall i voksende versus quiescent fibroblaster.
Introduction
Steady state nivåer av transkripsjoner gjenspeiler bidrag av både transkripsjon syntese og transkripsjon forfall. Regulert og koordinert transkripsjon forfallet er en viktig mekanisme for å kontrollere biologiske prosesser1,2,3,4. For eksempel har transkripsjon forfall priser blitt vist å bidra til den timelige rekken hendelser etter aktivering av inflammatoriske cytokin tumor nekrose faktor5.
Vi har tidligere vist at overgangen mellom spredning og gågaten i primære menneskelig fibroblaster er forbundet med endringer i transkripsjon nivåer av mange gener6. Noen av disse endringene gjenspeiler forskjeller i aktiviteten til transkripsjonsfaktorer mellom disse to landene.
Endringer i en transkripsjon forfallet rate kan også bidra til endringer i hvilket uttrykk med en utskrift i to forskjellige stater7,8. Basert på våre tidligere funn at overgangen mellom spredning og gågaten er knyttet til endringer i nivået av flere microRNAs9, spurte vi om det er også et bidrag fra differensial transkripsjon forfall i endringene i genuttrykk i voksende versus quiescent fibroblaster.
For å overvåke transkripsjon stabilitet, bestemt vi frekvensen av forfallet av transkripsjoner genomet hele i voksende versus quiescent celler. For å oppnå dette, overvåket vi forfall priser i voksende versus quiescent fibroblaster ved å innføre en inhibitor av nye transkripsjon og overvåking frekvens som individuelle transkripsjoner forsvant over tid. Fordelen med denne tilnærmingen er at i forhold til metoder som bare overvåke samlede genuttrykk, begrenser ny transkripsjon syntese, vil vi kunne bestemme forfallet rate for disse transkripsjonene separat fra sats som de er transkribert.
ActD behandling for å hemme nye transkripsjon og bestemme transkripsjon forfall priser har vært anvendt i flere tidligere studier. ActD er brukt til å analysere betydningen av RNA stabilitet i endringene i transkripsjon overflod som følge av behandling med pro-inflammatoriske cytokiner5. En lignende tilnærming er også brukt til å analysere forskjellene i transkripsjon forfallet rate i voksende versus differensierte C2C12 celler som de vedta en differensiert muskel fenotypen10. Eksempel global mRNA halv-liv har også blitt oppdaget i pluripotent og differensiert mus embryonale stamceller11. I disse eksemplene har mRNA decay vist seg å være viktig for å regulere transkripsjon overflod og for overgangen til cellene til ulike celle stater.
Bruke metodene som er beskrevet nedenfor, oppdaget vi endringer i transkripsjon forfall priser i ca 500 gener når sammenlignende fibroblaster i voksende og quiescent stater12. Spesielt oppdaget vi at målene for den microRNA miR-29, som er downregulated i quiescent celler, er stabilisert når celler overgang til gågaten. Her beskriver vi metodene vi pleide å bestemme forfall priser i voksende og quiescent celler. Denne metoden er nyttig for å sammenligne globale mRNA forfall priser i to forskjellige men lignende forhold når informasjonen om raskt råtnende gener er søkt. Det kan også brukes til å ta andre spørsmål som effekt av celle kultur på transkripsjon forfall, for eksempel i to dimensjonale versus tre dimensjonale kulturer. Forfall priser kan være bestemt genomet-wide med metoder som microarrays eller RNA-Seq. eventuelt sanntid qPCR eller nordlige blotting kan brukes til å bestemme forfall priser på gene-av-genet eller isoformen av isoformen basis. Disse prisene kan deretter brukes til å beregne halveringstiden av hver overvåkede genet og identifisere gener med forfall priser som er forskjellige i to betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter beskrevet ble godkjent av Institutional Review Boards ved Princeton University og University of California, Los Angeles.
1. klargjør voksende og kontakt-hemmet fibroblaster for ActD gang kurs
Merk: Denne protokollen bruker en timecourse med fire timepoints. Tre biologisk uavhengige utvalg kan samles per timepoint ved å samle ulike vev kultur plater i ett eksperiment eller eksperimentet kan gjentas flere ganger med ulike kulturer av celler. I vår erfaring gir en 10 cm (diameter) vev kultur rett (en plate) tilstrekkelig RNA for analyse. Eventuelt flere vev kultur retter kan samordnes for hver prøve å øke antall celler på hver timepoint. I tillegg kan samme eksperiment utføres med fibroblaster isolert fra ulike individer som virkelig uavhengige biologiske replikerer.
- Opprette voksende og quiescent kulturer av celler for transkripsjon forfall analyse. For voksende celler, dele cellene hver tre dager mens kontakt-hemmet cellene blir kontakt-hemmet.
- For kontakt-hemmet celler, endre mediet hver 2 dager i 7 dager. Delt voksende cellene 2 dager før de kontakt-hemmet fibroblaster er klar for innsamling. Et eksempel på en celle kultur ordningen er vist i figur 1. Resten av trinnene i denne delen gir en detaljert protokoll for å etablere og dele cellene.
- Isolere primære dermal fibroblaster fra neonatal huden etter etablerte protokoller13. Passasjen fibroblaster å sikre en homogen befolkning.
Merk: Fibroblaster kan være frosset og tint, hvis nødvendig. - Tine eller replate fibroblaster, hvis nødvendig. Vokse fibroblaster i DMEM med 10% serum under sterile forhold i en vev kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2. Bruk fibroblaster som har vært dyrket for færre enn 10 passasjer. Fibroblaster skal < 80% confluent ved deler celler gjøre voksende og quiescent bestander.
- Å dele en vev kultur plate i flere plater, prewarm PBS, trypsin og medium med serum i et vannbad 37 ° C for 20 min.
- Sug opp eller bruk en Pipetter for å fjerne mediet fra hver vev kultur plate med celler replated.
- Pipetter varm PBS på hver plate (10 mL av løsning for en 150 mm plate, 5 mL løsning for en 100 mm plate, 2 mL for et godt av en 6 godt plate) og 1 mL for et godt av en 12 godt plate.
- Leveringstanken eller Pipetter fjerne PBS fra hver vev kultur plate.
- Pipetter forsiktig 1 x Trypsin-EDTA på hver plate (8 mL løsning for en 150 mm plate, 3 mL løsning for en 100 mm plate, 2 mL for et godt av en 6 godt plate og 1 mL for et godt av en 12 godt plate).
Merk: Kontroller 1 x Trypsin-EDTA fortynne sterilt 10 x Trypsin-EDTA i sterilt PBS. Siste 1 x løsningen skal være 0,05% trypsin og 0.02% EDTA. - Inkuber trypsin med celler for 5 min.
- Slå lett på platen for å fjerne celler fra platen.
- Pipetter til resuspend celler i en enkeltcelle suspensjon.
- Overføre celler i trypsin løsning til en konisk rør som inneholder samme volum av DMEM med 10% serum (8 mL løsning for en 150 mm plate, 3 mL løsning for en 100 mm plate, 2 mL for et godt av en 6 godt plate og 1 mL for et godt en 12 vel tallerkenen).
- Nedspinning cellene på 4 ° C i 5 minutter ved 1000 x g fjerne trypsin.
- Resuspend celler i en passende mengde medium og teller med en hemacytometer til å bestemme cellen konsentrasjon.
- Frø 5 x 105 celler per 100 mm vev kultur plate for voksende og kontakt-hemmet celler.
- Bruk denne metoden til å opprette voksende og kontakt-hemmet prøvene kreves for analyse (figur 1).
2. ActD gang løpet
- Resuspend ActD på en lager konsentrasjon av 1 mg/mL (For 1 mg av ActD, bruk 950 µL av sterile PBS og 50 µL av sterile DMSO).
Merk: Frosne lager løsninger av ActD bør være stabile for en måned på 20 ° C. Fortynne løsninger bør ignoreres og ikke lagret for videre bruk. - Legg til ActD til riktig volum av prewarmed medium for alle biologiske Repliker cellekultur plater som ble definert for 0, 120, 240 og 480 min timepoints (figur 2). Legge til ActD i en konsentrasjon av 15 µg per mL av medium. Bland godt, Sug opp av gamle medium, og Legg ActD som inneholder mediet til cellene.
- For en 1 mg/mL lager, legge 15 µL ActD for hver mL medium, f.eksfor 10 mL av medium for en 100 mm tallerken, Legg til 150 µL ActD.
- Å samle null timepoint prøven, forsiktig Sug opp utenfor ActD mellomstore og Pipetter prewarmed PBS på cellene. Pipetter 10 mL løsning for en 150 mm plate, 5 mL løsning for en 100 mm plate, 2 mL for et godt av en 6 godt plate og 1 mL for et godt av en 12 godt plate.
- Forsiktig Sug opp eller Pipetter av PBS.
Merk: Alle foranstaltningene innvolvere RNA isolasjon skal utføres med RNase-fritt vann, RNase-fri microcentrifuge rør og RNase-fri pipetter. Hansker bør være slitt og endres ofte når du arbeider med RNA. - Legg fenol-guanidine isothiocyanate løsning (1 mL/10-cm plate med 4 x 105 på 4 x 107 celler) direkte til vev kultur plate.
Merk: Fenol-guanidine isothiocyanate løsningen er en monophasic løsning som opprettholder RNA kvalitet mens lysing cellene og skiller RNA og DNA protein fra hverandre.
Advarsel: Fenol og guanidine isothiocyanate er etsende. Bruk passende beskyttelse. - Pipetter fenol-guanidine isothiocyanate løsning-celle blanding opp og ned flere ganger for å få en homogen blanding.
Merk: Fenol-guanidine isothiocyanate løsning lysate kan lagres på 4 ° C over natten eller på 20 ° C for opp til ett år. - Samle hvert tidspunkt etter riktig mengde tid er passert ved hjelp av metoden beskrevet i trinnene 2.3-2.6.
3. isolering av totalt fra fenol-guanidine Isothiocyanate løsning Lysate
- Inkuber samples ved romtemperatur for 5 min å sikre fullstendig oppløsningen av RNA-protein komplekser.
Merk: Trinnene av fenol-guanidine isothiocyanate løsning protokollen kan utføres ved romtemperatur, med mindre annet er angitt. - Introdusere pigg i control transkripsjoner som kan oppdages med metodene som er brukt.
Merk: Den eksterne RNA kontroll consortium (ERCC) spike-tilleggskontroll blanding14 er spesielt designet som en spiker inn for RNA-Seq. Det kan også brukes for Nord blots eller sanntid qPCR. Spike i Kontroller spesielt utformet for microarray teknologi er også tilgjengelig (se Tabell for materiale).
Merk: Etter første spinn, prøven bør skille i 3 lag - en rød organisk lag på bunnen, en hvit/rosa interphase i midten, og et klart vandig lag på toppen (Figur 3).
Merk: Pass på ikke å forstyrre interphase under denne prosessen. Det er greit å la noen av vandig brøken. Det er bedre å la noen av vandig brøken enn å også omfatte noen av interphase lagene, som inkluderer interphase lag vil forurense RNA med DNA. Vandig laget vil være omtrent halvparten av den første volumet, så med 0.9 mL hvis fenol-guanidine isothiocyanate løsning/kloroform blandingen ble 1,8 mL.
Merk: Dette vil resultere i en tett, solid pellet som er lett å overvåke etter spinn trinnene som følger.
Merk: En løs Pipetter tips holdt i hånden kan brukes til å fjerne overflødig etanol. Hvis RNA pellets er forstyrret, men ikke forkastet kan etterforskeren gjenta spinn og fjerne nedbryting igjen. Unngå å fjerne pellet som dette vil kreve etterforskeren gjenta hele framgangsmåten.
Merk: RNA pellets er mindre kompakt på dette trinnet og fl yttes. Vær ekstra forsiktig når du håndterer pellet på dette punktet for å unngå å miste RNA.
4. analyse av transkripsjon overflod
- Kvantifisere RNA og sjekk RNA for renhet bruker et spektrofotometer.
Merk: Forholdet mellom absorbans ved 260 nm til 280 nm bør være ca 2.0 for RNA. - Analysere RNA med en 1% agarose gel eller en tilsvarende teknologi å visualisere omfanget av nedbrytning.
Merk: Fjern to band som representerer 18S og 28S rRNA skal tydelig (Figur 4). Hvis disse bandene ikke vises, kan RNA reduseres. Problemer med skyting tips til RNA fornedrelse tilbys i diskusjonen. - Skjermen utskrift overflod i de innsamlede dele RNA sammenlignet med piggete i interne standard bruker microarrays15, RNA-Seq16, sanntid qPCR17, eller Nord blotter18.
- Bestemme tettheten for hver transcript på hvert punkt sammenlignet med en spiked i kontroll av kjente overflod.
Merk: For microarrays, verdiene vil være fluorescens intensiteter. For Nord blots, kan band på X-ray film kvantifiseres. For sanntids qPCR, kan transkripsjon overflod bestemmes sammenliknet med kjente standarder med 2- σσCT metoden19. For RNA-Seq, kan normaliserte verdier bestemmes som FPKM eller fragmenter per kilobase av ekson per million leser tilordnet. For isoformen-spesifikke forfall priser, kan RNA-Seq data analyseres bruker isoformen-aware metoder som DEXSeq20. Isoformen-spesifikke forfall priser er best bestemmes med RNA-Seq. Hvis de skal fastsettes med microarray data, må dataene analyseres på sonden av sonden grunnlag i stedet for en gen-av-genet basis. Analytiker må være forsiktig når tolke informasjon fra et begrenset antall sonder. For eksempel kan det være 5 eller færre sonder som er informativ om en bestemt isoformen. I dette tilfellet må analytiker bestemme om oppførselen til disse sonder er tilstrekkelig konsekvent slik at resultatene er pålitelig.
- Bestemme tettheten for hver transcript på hvert punkt sammenlignet med en spiked i kontroll av kjente overflod.
- Utføre sanntid qPCR på de isolerte RNA17 i de innsamlede eksemplene analysere raskt råtnende gener, som c-Myc og en sakte råtnende genet som GAPDH, å få tillit til at transkripsjon forfall priser ble funnet.
Merk: Ytterligere bekreftelse, isoformen-spesifikke sanntid qPCR sonder kan utvikles og brukes til å overvåke overflod av bestemte isoformene over tid21.
5.Forfallet Rate konstant besluttsomhet
- For hver timepoint, Logg-transform overflod verdiene for hver transcript (Gen-spesifikke eller isoformen-spesifikke).
Merk: Logg-omforming verdiene konverteres eksponensiell decay kurver til linjer som kan passe med en lineær forfall modell22. - Passe profilen for expression for hver transcript (Gen-spesifikke eller isoformen-spesifikke) til en lineær forfall modell. Formelen for slik modell er f (t) = C - r * t. I denne likningen, C er en konstant som representerer startbeløpet for en transkripsjon, r er hastigheten av nedgangen, og t er tiden siden begynnelsen av eksperimentet. Fra denne ligningen, bestemme forfallet rate som r*ln(10) (se referanse11).
Merk: MaSigPro programvarepakken er en regresjon tilnærming utviklet for å oppdage betydelig genet uttrykk profil forskjeller i gang kurs data23. Eksempelkode og resultater for maSigPro finnes på: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - Filtrere ut gener som ikke passer en logg-lineær forfall modell. Dette kan gjøres med en ANOVA F-test.
Merk: F-testen er basert på F-statistikken, som er definert som variasjonen mellom utvalgsgjennomsnittene delt variasjonen i prøvene. Korrigere p-verdier for flere sammenligninger ved å bruke den lineære step-up Benjamini og Hochberg false oppdagelsen prosedyre24. En q-verdi større enn 0,05 med F-test kan brukes som et cut-off for gener som ikke passer en logg-lineær forfall modell. - Utføre en VARIANSANALYSE F-test for å fastslå utskrifter med en vesentlig grad av samhandling begrepet mellom kategoriske celle syklus tilstand og tid (false oppdagelsen rate, FDR < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere rapportert resultatene av microarray analyser av transkripsjon forfall priser i voksende og kontakt-hemmet primære menneskelig fibroblaster over en 8-timers kurs12. En liste over gener med en betydelig endring i transkripsjon stabilitet sammenligne voksende og kontakt-hemmet fibroblaster tilbys i supplerende tabell 1. Fluorescens intensiteten ved tidspunkt null og en gang løpet etter ActD behandling tilbys. Gener ble inkludert på listen ved å bestemme gener som har betydelig forskjellige bakkene i voksende og kontakt-hemmet vilkår bruker en ANOVA F-test. Eksempler på gener med forskjellige forfall priser i voksende og quiescent fibroblaster er vist i figur 5.
Figur 1 : Skjematisk av protokollen for å etablere voksende og kontakt-hemmet plater for ActD gang kurs analyse. En dag-for-dag beskrivelse av de nødvendige skritt for å etablere kulturer av celler for ActD behandling tilbys, forutsatt at fire timepoints skal brukes for time course. For enkelhet, en plate vises per timepoint, men flere plater kan legges til generere biologiske gjentak. Protokollen kan også justeres for å legge til flere plater med celler hvis mer enn fire timepoints er ønsket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Skjematisk ActD tid selvfølgelig og forfallet rate beregninger i quiescent sammenlignet med voksende menneskelig fibroblaster. Forventet brøkdel av mRNAs igjen over tid for en hypotetisk utskrift etter behandling med en transcriptional hemmer vises. Under eksempel tomter brøkdel av mRNA gjenværende over tid tilbys gener som er mer stabil i quiescent enn voksende celler og gener som er mer stabil i voksende enn quiescent celler. For hver datapoint vises bare én verdi for klarhet. I faktiske protokollen, vil det være tre datapunkt for hver timepoint. Dette tallet er endret fra Elizabeth Pender Johnsons doktorgrad avhandling med sitt samtykke. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Fotografier av fenol-guanidine isothiocyanate reagens og kloroform før og etter sentrifugering. Blandingen vises når fenol-guanidine isothiocyanate reagens og kloroform først kombineres, etter blanding og etter sentrifugering. Når blandingen er centrifuged, er den nederste fasen, som er rød, organisk fase. Interphase i midten er hvit og skyet. Det er klart den beste fasen er den vandige fasen. Det er RNA i den vandige fasen, som skal samles med en pipette for nedbør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Prøve RNA gel å overvåke RNA kvalitet. En illustrasjon av en RNA gel viser prøver med intakt RNA. Intakt RNA har fremtredende band for 28S og 18S rRNAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Eksempler på gener med forskjellige forfall priser i voksende versus quiescent fibroblaster. Fire gener som forfall annerledes på voksende versus quiescent fibroblaster vises fluorescens intensiteter (genuttrykk) over tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende tabell 1: Gene-spesifikke fluorescens bakgrunnsintensitetene i voksende og quiescent fibroblaster. Data er oppgitt for tiden null og en gang løpet etter ActD behandling i voksende og kontakt-hemmet fibroblaster. P-verdier, q verdier og false oppdagelsen priser tilbys. Tabellen er gjengitt fra den opprinnelige utgivelsen i BMC Genomics12. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gågaten kan indusert ved ekstern signaler inkludert tilbaketrekking av mitogens eller serum, mangel på celleadhesjon og kontakt hemming. Kontakt hemming, én av flere mulige metoder for å indusere gågaten, er en svært evolusjonært bevarte prosess der celler avslutte proliferativ celle syklusen svar til celle til celle kontakt. Vi fokuserer her på kontakt hemming som et eksempel på en metode for å indusere gågaten. Tidligere studier har rapportert at celle-celle kontakt kan påvirke microRNA biogenesis25, dermed resultatene gir informasjon om en gågaten metode og ytterligere studier er nødvendig for å avgjøre hvilke endringer er knyttet til gågaten sådan.
Vi brukte primære menneskelig diploide fibroblaster som vi isolert fra neonatal huden. Vi innledet disse eksperimenter med fibroblaster som var passaged mindre enn 10 ganger. Vi forkastet senere-passasjen fibroblaster fordi de senesce. Mens denne protokollen fokuserer på voksende og quiescent dermal fibroblaster, kan fremgangsmåtene brukes til å overvåke forfall priser i ulike typer celler og under ulike forhold.
Vi overvåket mRNA forfall priser genomet hele med en transkripsjon av tid kurs. Av tiden kurs er den mest brukte metoden for dekopling mRNA forfall fra mRNA transkripsjon for å beregne mRNA halveringstid1,26. I metoden beskrevet her, ActD, et stoff at komplekser med B-form av DNA å blokkere forlengelse av RNA Polymerase II, brukes til å arrestere transkripsjon av mRNAs27. Kursen som transkripsjoner nedgang i overflod over en periode på 8-timers kan beregnes som den transkripsjon forfallet rate.
En viktig begrensning av ActD tilnærminger for overvåking transkripsjon forfallet er at ActD hindrer globale transkripsjon, som vil påvirke cellenes levedyktighet. Dette bør holdes i bakhodet når tolke ActD-baserte data, som forfall priser fastsettes i celler som er mer stresset enn sin opprinnelige tilstand. En annen viktig bekymring er at effekten av ActD kan være forskjellig for celler i forskjellige stater, inkludert proliferating versus kontakt-hemmet fibroblaster. En tilnærming for å minimere bivirkningene av ActD behandling er å holde tiden kurs kortvarig. Derfor valgte vi en 8 h klokkeslett kurs.
Det finnes alternative tilnærminger til ActD for overvåking transkripsjon forfall priser28,29. Gjær påkjenningen med temperatur-sensitive RNA polymerase II alleler har blitt brukt til å overvåke transkripsjon forfall priser30. En variant av denne tilnærmingen kalles "anker-away" har blitt brukt i gjær for å oppnå betinget uttømming av RNA polymerase II svar på rapamycin behandling31,32. Det er også mulig å overvåke forfall i celler med aktive transkripsjon. For eksempel deg selv thio-substituert uracil nukleotider kan bli introdusert i celler, innlemmet i mRNA, og senere oppdaget33,34,35. Med denne tilnærmingen, kan hastigheten som ulike transkripsjoner er synthesized bestemmes i celler som fortsetter å syntetisere mRNA. Disse har en betydelig fordel over ActD behandling fordi de ikke er giftig. I vår erfaring, kan imidlertid variasjon i utvinningen av utskrifter med disse metodene. ActD behandling er en grei og reproduserbar tilnærming for overvåking transkripsjon forfall.
Noen skritt i protokollen gitt er avgjørende for suksessen. Ett viktig problem er forhindrer RNA fornedrelse under RNA isolasjon. På trinn 4.1, bør RNA overvåkes for degradering. Hvis RNA ikke inneholder to klare topper for 18S og 28S rRNAs (Figur 4), er et tegn på at det har oppstått transkripsjon degradering. Noen instrumenter gir RNA integritet nummer (RIN) score alt fra 1 til 10. Prøver med RIN score i 7-10 rekkevidden er akseptable for videre analyse. Hvis RNA er forringet, er det viktig å ta flere forholdsregler for å hindre RNA-fornedrelse, som sikrer at løsninger og sterileware er RNase-fri, og at hansker er slitt når håndtering Pipetter for RNA. Vann kan være forbehandlet med 0,1% diethyl pyrocarbonate (DEPC), ruges i minst 2 timer ved 37 ° C, og autoklaveres i minst 15 min. Merk at DEPC kan ikke brukes med Tris-baserte buffere. RNase decontaminating løsninger kan også brukes til å fjerne RNase fra arbeidsflater, sentrifuger, og Pipetter og reagenser som hemmer RNases kan legges til eksempler.
Et annet viktig skritt er separasjon av fasene av fenol-guanidine isothiocyanate løsning. Det er viktig å sikre at bare den øverste fasen samles for RNA behandling. Hvis den resulterende RNA inneholder gjenværende fenol, forholdet mellom absorbans ved 230, 260 og 280 nm vil ikke være i forhold 1:2:1 som forventet. Høyere enn forventet absorbans ved 230 nm kan angi fenol forurensning. Hvis dette skjer, kan RNA etanol igangsatte igjen og vasket flere ganger å fjerne eventuelle gjenværende fenol.
Til slutt, når RNA er pelleted og nedbryting er fjernet, pellet kan være klissete, tynn og lett forstyrret. På dette punktet, er det viktig å ta ekstra forsiktighet i å ta av væske. Det kan være viktig å visualisere røret med god belysning å finne pellet og kontroller at det ikke forstyrres. Lagt til glykogen kan bidra til å sikre pellet er synlig på dette punktet.
Valg av tidspunkt for time course of forfall er også en viktig sak å vurdere. Mens de fire timepoints vi valgte tillatt oss å decay for over 10 000 gener, ikke noen gener betydelig forfall i 8 h klokkeslett løpet. Hvis kortvarig transkripsjoner høy prioritet, kan etterforskerne du legge til ekstra prøvekolleksjoner før 120 min, for eksempel ved 30 min. For bedre vurdering av varige transkripsjoner, kan etterforskerne du legge til ekstra prøvekolleksjoner på senere timepoints.
Et annet potensielt problem kan resultere hvis forfall prisene ikke følger den forventede fordelingen. For eksempel kan det være for mange eller for få gener viser en logg-lineær forfallet rate over 8 h. Hvis dette skjer, er det nyttig å overvåke forfall utbredelsen av gener som er kjent for å være kort eller lang levetid for å avgjøre om de følger den forventede mønsteret.Hvis gener har en positiv i stedet for negative skråning over tid, kan de bli ekskludert fra videre analyse som de ikke vise en logg-lineær forfallet rate. En siste problemet kan oppstå hvis cellene i de to forholdene som sammenlignes har svært forskjellige svar til ActD slik at mange gener forfall raskere på en betingelse. I dette tilfellet kan det være nyttig å referere ikke bare til forskjellen i forfallet rate mellom de to landene, men også på spike kontrollene som vi foreslår inkludert før RNA isolasjon å gi informasjon om absolutt forfall priser i de to statene.
Evnen å dataskjerm transkripsjon forfall priser mellom voksende og quiescent celler eller noen to lignende stater har potensial til å gi ytterligere innsikt i betydningen av transkripsjon forfall i å regulere fysiologiske endringer. Programmer omfatter celler med og uten kreftfremkallende aktivisering, før og etter senescence eller virusinfeksjon, med og uten knockdown med et bestemt eller i to forskjellige stater av differensiering. Resultatene kan være kombinert med RNA-Seq å gi informasjon om isoformen-spesifikke endringer i transkripsjon forfall priser, som kan gi innsikt i endringene i isoformen uttrykk observert som celler gjennomgå fysiologiske overganger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
HAC var Milton E. Cassel forskeren Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd til HAC av National Institute of General Medical Sciences Excellence grant P50 GM071508 (pi David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 til David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, National Institute of generelle medisinske basalfag R01 GM0866465, Eli & Edythe bred Center for regenerativ medisin & stamcelleforskning, Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, og leukemi Lymphoma Society. Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute av National Institutes of Health under prisen nummer P50CA092131. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. HAC er medlem av den & Edythe bred Center for regenerativ medisin & stamcelleforskning, UCLA Molecular Biology Institutt og UCLA bioinformatikk interdepartemental programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
