Summary
Мы описываем протокол для генерации пролиферирующих и покоя первичного кожного фибробластов, мониторинга Стенограмма распада ставки и выявления дифференциально распадаясь генов.
Abstract
Покоя является временной, реверсивные государство, в котором клетки перестали клеточного деления, но сохранить способность размножаться. Несколько исследований, в том числе наша, продемонстрировали, что покоя связан с широко распространенные изменения в экспрессии генов. Некоторые из этих изменений происходят через изменения в уровень или деятельности, связанных с распространением транскрипционных факторов, таких как E2F и MYC. Мы показали, что разрушение мРНК может также способствовать изменения в экспрессии генов между покоя и пролиферирующих клеток. В этом протоколе мы описываем порядок установления пролиферирующих и покоя культуры фибробластов человека дермального плоть. Мы затем Опишите процедуры для ингибирования новой транскрипции в клетках пролиферирующих и покоя с актиномицин Д (АСРТ). АСРТ лечения представляет собой простой и воспроизводимый подход к отделения новой транскрипции от гниения транскрипт. Недостатком АСРТ лечения является, что время курс должна быть ограничена короткого промежутка времени, потому что АСРТ влияет на жизнеспособность клеток. Стенограмма уровни контролируются со временем для определения ставок Стенограмма распада. Эта процедура позволяет для идентификации генов и изоформ, проявлять дифференцированный распада в пролиферирующих против покоя фибробластов.
Introduction
Стационарном уровнях стенограмм отражают вклад Стенограмма синтеза и распада Стенограмма. Регулируемые и скоординированных Стенограмма кариеса является важным механизмом для контроля биологических процессов1,2,3,4. К примеру Стенограмма распада ставки было показано вносить временные серии событий после активации воспалительных цитокинов фактор некроза опухоли5.
Ранее мы показали, что переход между распространением и покоя в первичной фибробластов связан с изменениями в уровнях Стенограмма многих генов6. Некоторые из этих изменений отражают различия в деятельности факторов транскрипции между этими двумя государствами.
Изменения в скорость распада стенограмма может также способствовать изменениям уровня выражения стенограммы в двух разных государствах7,8. Основываясь на наших предыдущих выводах, что переход между распространением и покоя связан с изменениями в уровнях несколько микроРНК9, мы спросили, есть ли также взнос от дифференциального Стенограмма распада в изменения в Экспрессия генов в пролиферирующих против покоя фибробластов.
Для того чтобы контролировать Стенограмма стабильности, мы определили скорость распада стенограммы генома общесистемной в пролиферирующих против покоя клетки. Для достижения этой цели, мы наблюдение распада ставки в пролиферирующих против покоя фибробластов, представляя ингибитор новой транскрипции и мониторинг частоты, на которой отдельные стенограммы исчез со временем. Преимуществом этого подхода является, что, по сравнению с методами, которые просто контролировать общий экспрессии генов, путем ингибирования синтеза новых стенограммы, мы сможем определить скорость распада для этих стенограмм отдельно от скорость, на которой они должны переписана.
Лечение АСРТ подавляют новой транскрипции и определить показатели распада Стенограмма успешно применялся в нескольких предыдущих исследований. АСРТ был использован для рассекать важность стабильности РНК в изменения в изобилии стенограмма, что результат от лечения с5провоспалительных цитокинов. Аналогичный подход используется также вскрыть различия в Стенограмма скорость распада в пролиферирующих против дифференцированных клеток C2C12, как они принимают дифференцированных мышечных фенотип10. В качестве другого примера глобальные полувыведения mRNA также были обнаружены в плюрипотентных и дифференцированной мыши эмбриональные стволовые клетки11. В этих примерах иметь важное значение для регулирования Стенограмма изобилия и переход клеток различных клеточных государствам было показано разрушение мРНК.
Применение методов, описанных ниже, мы обнаружили изменения темпов Стенограмма распада в приблизительно 500 генов при сравнении фибробластов в пролиферирующих и покоя государств12. В частности мы обнаружили, что цели микроРНК miR-29, который downregulated в неработающем клеток, стабилизируются, когда клетки переход к покоя. Здесь мы описываем методология, которую мы использовали для определения ставок распада в клетках пролиферирующих и покоя. Эта методология является полезным для сравнения глобальные показатели распада мРНК в двух отдельных, но аналогичные условия, когда запрашивается информация о быстро распадаться генов. Он может также использоваться для решения другие такие вопросы, как влияние условий культуры клеток на стенограмму распада, например, в двух измерениях против трех мерного культур. Распад ставки могут быть определены геном широкий с методами например microarrays или РНК-след альтернативно, ПЦР в реальном времени или Северный blotting может использоваться для определения ставок распада на основе гена в геном или изоформы по изоформы. Эти ставки затем может использоваться для вычисления half-life каждого наблюдаемого гена и выявления генов с показателями распада, которые отличаются в двух условий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты описал были одобрены институциональные наблюдательные советы на Принстонского университета и университета Калифорнии, Лос-Анджелес.
1. Подготовьте пролиферирующих и контакт мешают фибробластов АСРТ время конечно
Примечание: Этот протокол использует timecourse с четырьмя timepoints. Три независимых биологически образцы могут быть собраны за timepoint, собирая различные культуры ткани пластины в одном эксперименте, или эксперимент может повторяться несколько раз с различными культурами клеток. В нашем опыте один 10 см (диаметр) тканевой культуры блюдо (одна пластина) обеспечивает достаточную РНК для анализа. При необходимости, множественные тарелки культуры ткани могут объединяться для каждого образца увеличить количество клеток в каждом timepoint. Кроме того же эксперимент может выполняться с фибробластов, изолированы от разных людей, как подлинно независимым биологического реплицирует.
- Создание пролиферирующих и покоя культур клеток для анализа распада транскрипт. Для пролиферирующих клеток разбить ячейки каждые три дня, в то время как контакт тормозится клетки становятся контакт тормозится.
- Для контакта тормозится клеток измените носитель каждые 2 дня на 7 дней. Разделение пролиферирующих клеток 2 дней до контакт тормозится фибробластов готовы к коллекции. На рисунке 1показан пример схемы культуры клеток. Оставшиеся шаги в этом разделе предоставляют подробный протокол для установления и разбиение ячеек.
- Изолируйте первичного кожного фибробластов от новорожденных кожи в соответствии с установленными протоколами13. Проход фибробластов обеспечить однородное население.
Примечание: Фибробласты могут быть заморожены и таял, при необходимости. - Оттепель или replate фибробластов, если это необходимо. Растут фибробластов в среде DMEM с 10% сыворотки в стерильных условиях в инкубатор культуры ткани при 37 ° C и 5% CO2. Используйте фибробласты, которые были выросли за менее чем 10 ходов. Фибробласты должно быть < 80% притока в день разбиение ячеек для населения пролиферирующих и покоя.
- Чтобы разделить культуры ткани пластины на несколько пластин, prewarm PBS, трипсина и средних с сывороткой в ванну воды 37 ° C 20 мин.
- Аспирационная или использовать пипетки для удаления среды из каждой культуры ткани пластины с клетки, чтобы быть replated.
- Накапайте теплой PBS на каждой пластине (10 мл раствора для 150 мм, 5 мл раствора для 100 мм пластины, 2 мл для колодца 6 хорошо плиты) и 1 мл раствора для колодец 12 хорошо плиты.
- Аспирата или пипетки для удаления PBS из каждой культуры ткани пластины.
- Аккуратно накапайте 1 x трипсина-ЭДТА на каждой пластине (8 мл раствора для 150 мм пластины, 3 мл раствора для 100 мм, 2 мл для колодца 6 хорошо плиты и 1 мл раствора для колодец 12 хорошо плиты).
Примечание: Сделать 1 x трипсина-ЭДТА путем разбавления стерильные 10 x трипсина-ЭДТА в стерильных PBS. Решение окончательное 1 x должно быть 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. - Инкубируйте трипсина с клетки на 5 мин.
- Аккуратно нажмите пластину выбить клетки от пластины.
- Накапайте Ресуспензируйте ячеек в одну ячейку подвеска.
- Клетки в раствор трипсина перехода к конической трубка, содержащая такой же объем DMEM с 10% сыворотки (8 мл раствора для 150 мм пластины, 3 мл раствора для 100 мм пластины, 2 мл для колодца 6 хорошо плиты и 1 мл раствора для колодец 12 хорошо пластины).
- Спин вниз клетки на 4 ° C за 5 минут на 1000 x g для удаления трипсина.
- Ресуспензируйте клетки в соответствующий объем среднего и фото с hemacytometer для определения концентрации клеток.
- Семена 5 x 105 на 100 мм культуры ткани пластину для пролиферирующих и контакт тормозится ячейки.
- С помощью этого метода, устанавливают пролиферирующих и контакт тормозится образцов, необходимых для анализа (рис. 1).
2. АСРТ время курс
- Ресуспензируйте АСРТ на складе концентрации 1 мг/мл (в 1 мг АСРТ, 950 мкл использования стерильных PBS и 50 мкл стерильных ДМСО).
Примечание: Замороженные акций решения АСРТ должно быть стабильным за месяц-20 ° c. Растворы должны быть отброшен и не сохраняются для дальнейшего использования. - Добавить АСРТ соответствующий объем подогретую средний для всех биологических реплицировать клеточной культуры плиты, которые были установлены на 0, 120, 240 и 480 мин timepoints (рис. 2). Добавление АСРТ в концентрации 15 мкг / мл среды. Хорошо перемешайте, аспирационная от старой среды и добавить АСРТ содержащих среднего к клеткам.
- На складе 1 мг/мл, 15 мкл АСРТ для каждого мл среды, например, для 10 мл среды для плиты 100 мм, 150 мкл АСРТ.
- Для сбора нулевой образец timepoint, нежно аспирационная АСРТ среднего и пипетки подогретую PBS на клетки. Накапайте 10 мл раствора для 150 мм пластины, 5 мл раствора для 100 мм, 2 мл для колодца 6 хорошо плиты и 1 мл раствора для колодец 12 хорошо плиты.
- Аккуратно аспирационная или пипетки с PBS.
Примечание: Все шаги с участием РНК изоляции должны быть выполнены с РНКазы свободной воды, бесплатно РНКазы microcentrifuge трубы и бесплатно РНКазы пипетки. Перчатки следует носить и изменил часто при работе с РНК. - Фенол Гуанидин Изотиоцианаты решение (1 мл/10-см плита с 4 x 105 клеток 4 x 10-7 ) добавьте непосредственно на пластину культуры ткани.
Примечание: Фенол Гуанидин Изотиоцианаты решение является монофазных решение, которое сохраняет качество РНК лизировать клетки и отделяя РНК, ДНК и белка друг от друга.
Предупреждение: Фенол и гуанидина Изотиоцианаты коррозии. Используйте соответствующую защиту. - Накапайте фенол Гуанидин Изотиоцианаты решение клеточной смесь вверх и вниз несколько раз, чтобы сделать однородной смеси.
Примечание: Фенол Гуанидин Изотиоцианаты раствор lysate может храниться при температуре 4 ° C на ночь или при-20 ° C до одного года. - Соберите точки каждый раз после того, как соответствующее количество времени прошло с методом, описанным в шагах 2.3-2.6.
3. изоляция всего РНК от фенола Гуанидин Изотиоцианаты решения Lysate
- Проинкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 мин для обеспечения полного растворения РНК белковых комплексов.
Примечание: Шаги протокола раствор фенола Гуанидин Изотиоцианаты может производиться при комнатной температуре если не указано иное. - Ввести стенограммы Спайк в управления, которые могут быть обнаружены с используемой методологии.
Примечание: Спайк в управления сочетание внешних РНК управления консорциума (ERCC)14 был специально разработан как элемент Спайк для РНК-Seq. Он также может использоваться для северной части пятна или ПЦР в реальном времени. Спайк в элементы управления, специально предназначенные для технологии microarray являются также доступна (см. Таблицу материалы).
Примечание: После первоначального спина, образец следует разделить на 3 слоев - красный органический слой на дно, белый/розовый межфазной в середине и ясно водный слой на верхней части (рис. 3).
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не нарушить интерфаза во время этого процесса. Это нормально, чтобы оставить некоторые из водной фракции. Это лучше оставить некоторые из водной фракции, чем также включить некоторые из межфазного слоя, как включая интерфаза слой будет загрязнять РНК с ДНК. Водный слой будет примерно половину первоначального объема, так что около 0,9 мл если смесь раствора/хлороформ Изотиоцианаты фенола Гуанидин 1.8 мл.
Примечание: Это приведет к плотной, твердые гранулы, это легко контролировать после отжима шаги, которые следуют.
Примечание: Свободные накапайте наконечник, держал в руке может использоваться для удаления избыточных этанола. Если гранулы РНК нарушается, но не отбрасываются, следователь может повторить спин и снова удалить супернатант. Избегайте, отбрасывая гранулы, поскольку это потребует следователь повторить всю процедуру.
Примечание: Гранулы РНК менее компактный на этот шаг и стремится двигаться. Будьте осторожны при обработке гранул на данный момент, чтобы избежать потери РНК.
4. анализ Стенограмма изобилия
- Количественного определения РНК и проверьте РНК для чистоты, используя спектрофотометр.
Примечание: Отношение absorbance на 260 Нм до 280 Нм должно быть приблизительно 2.0 для РНК. - Анализировать РНК с эквивалентной технологией для визуализации степень деградации или гель агарозы 1%.
Примечание: Две четкие группы, представляющие 18S и 28S рРНК должно быть четко видно (рис. 4). Если эти группы не являются видимыми, РНК может снизиться. Проблемы съемки советы для деградации РНК предоставляются в ходе обсуждения. - Монитор Стенограмма изобилия в собранных аликвоты РНК по сравнению с шипами в внутреннего стандарта используя microarrays15, РНК-Seq16, ПЦР в реальном времени17, или Северной помарок18.
- Определите изобилие для каждого Стенограмма в каждый момент времени по сравнению с контролем шипами в известных изобилия.
Примечание: Для microarrays, значения будут интенсивностью флюоресценции. Для северной части пятна полосы на рентгеновской пленки могут быть количественно. Для ПЦР в реальном времени изобилие стенограмма может быть определена по сравнению с известных стандартов с 2- σσCT метод19. Для РНК-Seq нормализованные значения могут быть определены как FPKM или фрагментов на kilobase экзона за миллион читает сопоставлены. Для распада изоформы конкретных ставок РНК-Seq данные могут быть проанализированы с использованием методологии изоформы известно как DEXSeq20. Распад изоформы конкретных ставок лучше всего определяется с РНК-Seq. Если они должны быть определены с microarray данных, данные должны быть проанализированы на основе зонд, зонд, а не на основе гена в геном. Аналитик должны быть осторожны при интерпретации информации от ограниченное количество зондов. Например может быть 5 или меньше зондами, которые являются информативными о конкретной изоформы. В этом случае аналитик будет необходимо определить, является ли поведение этих датчиков достаточно последовательно, так что результаты являются надежными.
- Определите изобилие для каждого Стенограмма в каждый момент времени по сравнению с контролем шипами в известных изобилия.
- Выполняйте ПЦР в реальном времени на изолированные РНК17 в собранных образцов для анализа быстро распадаться генов, как c-Myc и медленно разлагающегося ген как GAPDH, чтобы получить уверенность, что стенограмма распада, что ставки точно были обнаружены.
Примечание: Для дальнейшего подтверждения, может быть разработана и используется для мониторинга обилие конкретных изоформ течение времени21зонды изоформы конкретного ПЦР в реальном времени.
5.Распад темпы постоянное определение
- Для каждого timepoint журнал преобразование изобилие значения для каждого Стенограмма (ген специфического или изоформы специфические).
Примечание: Преобразование журнала значения будет преобразовать экспоненциального распада кривых линий, которые могут поместиться с Модель линейного распада22. - Установите профиль выражение для каждого Стенограмма (ген специфического или изоформы специфические) для модели линейной распада. Формула для такой модели является f(t) = C - r * t. В этом уравнении C — константа, представляющая начальную сумму стенограмма, r – ставка упадка и t — время с момента начала эксперимента. Из этого уравнения, определить скорость распада как r*ln(10) (см. ссылку11).
Примечание: MaSigPro пакет программного обеспечения является подход, основанный на регрессии, предназначенное для обнаружения значительных ген выражение профиль различия в времени курс данных23. Пример кода и результаты для maSigPro доступны на: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - Фильтр из генов, которые не подходят модели журнала линейная распада. Это может быть достигнуто с ANOVA F-теста.
Примечание: F тест основан на F-статистики, которая определяется как разница между пример средства, деленное на вариацию образцы. Исправьте p значения для нескольких сравнений, применяя линейные step-up Benjamini и Хёхберг ложных обнаружения процедуры24. Q значение больше, чем 0,05 с F-тест может использоваться в качестве среза для генов, которые не подходят модели журнала линейная распада. - Выполните ANOVA F-тест для определения стенограммы с термином существенного взаимодействия между состоянием категориальной клеточного цикла и времени (ложное обнаружение ставка, Рузвельт < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы уже ранее сообщали результаты анализов microarray Стенограмма распада ставок в пролиферирующих и контакт тормозится первичной фибробластов за 8-часовой курс12. В дополнительной таблице 1предоставляется список генов с существенные изменения в стабильности стенограмма, сравнивая пролиферирующих и контакт мешают фибробластов. Интенсивностью флюоресценции в время ноль и течение времени после лечения АСРТ предоставляются. Гены были включены в список, определяя гены, которые существенно разных склонах в пролиферирующих и контакт тормозится условиях, с использованием дисперсионного анализа F-тест. На рисунке 5приведены примеры генов с распада различных ставок в пролиферирующих и покоя фибробластов.
Рисунок 1 : Схема протокола для установления пролиферирующих и контакт тормозится пластины для АСРТ время курс анализа. День за днем описание необходимые шаги по созданию культуры клеток для лечения АСРТ предоставляется, при условии, что четыре timepoints будет использоваться для время курс. Для простоты одна пластина проявляется в timepoint, но дополнительные пластины могут быть добавлены для создания биологических реплицирует. Протокол также может быть скорректирована добавить больше пластин клеток при желании более чем четыре timepoints. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схема АСРТ время курс и распада оценить расчеты в замкнутой цепи по сравнению с пролиферирующих фибробластов. Ожидаемые часть мРНК, оставшихся со временем для гипотетической Стенограмма после лечения с ингибитор transcriptional отображается. Ниже, для генов, которые являются более стабильными в предоставляются выборочные участки фракции мРНК, оставаясь со временем покоя чем пролиферирующих клеток и гены, которые являются более стабильными в пролиферирующих чем покоя клетки. Показано только одно значение для каждого datapoint, для ясности. В протокол будет три datapoints для каждого timepoint. Этот рисунок был изменен с Элизабет Пендер Джонсона кандидатской диссертации с ее согласия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Фотографии смешивания фенол Гуанидин Изотиоцианаты реагента и метилхлороформа до и после центрифугирования. Смесь показано когда фенол Гуанидин Изотиоцианаты реагента и хлороформе первоначально объединены, после смешивания и после центрифугирования. После того, как смесь центрифугируется, нижней этап, который горит красным, это органические фазы. Интерфаза в середине белые и облачность. Верхний этап водной фазе и ясно. РНК является в водной фазе, который должны собираться с пипетки для высыпания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Пример РНК гель для мониторинга качества РНК. Иллюстрация геля RNA, показаны образцы с нетронутыми РНК. Нетронутыми РНК имеет выдающиеся полосы для 28S и 18S теорией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Примеры генов с распада различных ставок в пролиферирующих против покоя фибробластов. Для четырех генов, которые по-разному гнить в пролиферирующих против покоя фибробластов указаны интенсивности флуоресценции (экспрессии генов) с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная таблица 1: ген специфического интенсивностью флюоресценции в пролиферирующих и покоя фибробласты. Данные, предоставленные время ноль и более раз курс после лечения АСРТ в пролиферирующих и контакт тормозится фибробластов. Также предоставляются значения P, q, а накладные обнаружения ставок. Таблица перепечатана из его исходной публикации в BMC геномики12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Покоя может быть вызвана внешних сигналов, включая вывод митогены или сыворотки, отсутствие клеточной адгезии и ингибирование контакт. Ингибирование контакта, один из нескольких возможных методов для стимулирования покоя, является весьма эволюционно сохранены процесс, в котором клетки выход пролиферативной клеточного цикла в ответ на контакт к ячейке. Мы сосредоточимся на ингибирование контакт как пример метода, позволяющего стимулировать покоя. Предыдущие исследования сообщали что ячеек контакт может повлиять на микроРНК биогенеза25, таким образом, результаты предоставляют информацию на одном методе покоя и необходимы дополнительные исследования для определения какие изменения связаны с покоя само по себе.
Мы использовали первичной диплоидных фибробластов продуктов, которые мы изолированы от новорожденных кожи. Мы инициировали эти эксперименты с фибробласты, которые были пассированной меньше, чем 10 раз. Мы отброшены позже проход фибробластов, потому что они senesce. Хотя этот протокол посвящен пролиферирующих и покоя фибробласты дермы, описанные может использоваться для мониторинга распад темпы в различных типах клеток и в различных условиях.
Мы мониторинг мРНК распада ставки генома всей с помощью транскрипции запорно курс. Отключение времени курсы являются наиболее широко используемым методом для развязки мРНК кариеса от мРНК транскрипции для того чтобы вычислить мРНК полураспада1,26. В методе описанных здесь, АСРТ, препарат что комплексы с B-формы ДНК, чтобы блокировать удлинение РНК-полимераза II, используется для ареста транскрипции mRNAs27. Скорость, с которой стенограммы снижение в изобилии за 8-часовой период может быть определена как скорость распада транскрипт.
Важное ограничение на основе АСРТ подходов для мониторинга Стенограмма распада является АСРТ предотвращает глобальной транскрипции, который будет влиять на жизнеспособность клеток. Это следует иметь в виду при интерпретации данных, на основе АСРТ, как распад ставки определяются в клетках, которые являются более подчеркнул, чем их родного государства. Еще одной важной проблемой является, что эффекты АСРТ может быть различным для клеток в разных государствах, в том числе пролиферирующих против контакт мешают фибробластов. Один из подходов к минимуму побочные эффекты лечения АСРТ должен держать время курсы короткие по продолжительности. По этой причине мы выбрали курс время 8 h.
Есть альтернативные подходы к АСРТ для мониторинга Стенограмма распада ставки28,29. Штаммов дрожжей с чувствительных к температуре РНК полимеразой II аллели были использованы для мониторинга Стенограмма распада цены30. Разновидность этого подхода под названием «якорь прочь» был использован в дрожжи для достижения условной истощение РНК-полимераза II в ответ на rapamycin лечения31,32. Это также возможно для мониторинга распада в клетках с активной транскрипции. К примеру Тио замещенных урацила нуклеотидов могут быть введены в клетки, включены в мРНК и впоследствии обнаружены33,34,35. С этим подходом можно определить уровень, на котором синтезированы различные стенограммы в клетках, которые продолжают синтезировать мРНК. Такие подходы имеют значительное преимущество над АСРТ лечения, потому что они не являются токсичными. Наш опыт показывает однако, может существовать изменчивости в восстановлении стенограммы с этими методами. АСРТ лечение является простым и воспроизводимый подход для мониторинга Стенограмма распада.
В нескольких шагах, в Протоколе предусмотрено имеют решающее значение для его успеха. Одним из важных вопросов предотвращение деградации РНК при изоляции РНК. На шаге 4.1 РНК должны контролироваться для деградации. Если РНК не содержит две четкие пики для 18S и 28S теорией (рис. 4), это знак, что произошла деградация транскрипт. Некоторые инструменты обеспечивают номер целостности РНК (Рин) баллы от 1 до 10. Образцы с Рин оценки в диапазоне 7-10 являются приемлемыми для дальнейшего анализа. Если РНК разлагается, то важно принимать дополнительные меры предосторожности для предотвращения деградации РНК, например, обеспечение того, что решения и sterileware РНКазы бесплатно, и что при обработке пипетки для РНК надеть перчатки. Вода может быть предварительно обработанных с 0,1% диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) инкубированы для по крайней мере 2 ч при 37 ° C, и газобетона для по крайней мере 15 минут Примечание что DEPC не может использоваться с трис основе буферов. Обеззараживание решения могут также использоваться для удаления РНКазы из рабочих поверхностей, центрифуги и пипетки и реагенты, которые тормозят полиадениновый РНКазы могут быть добавлены образцы.
Другим важным шагом является разделение фаз раствор фенола Гуанидин Изотиоцианаты. Важно обеспечить что для РНК собираются только верхний этап обработки. Если результирующее РНК включает остаточные фенола, коэффициент поглощения на 230, 260 и 280 Нм не будет в соотношении 1:2:1, как ожидалось. Выше, чем ожидаемое поглощение на 230 Нм можно указать фенола загрязнения. Если это происходит, РНК может быть этанола осаждают снова и промывают несколько дополнительных раз, чтобы удалить любые остаточные фенола.
Наконец когда гранулированных РНК и удаляется супернатанта, гранулы может быть липким, тонкой и легко нарушается. На данный момент важно проявлять особую осторожность, принимая жидкости. Это может быть важно для визуализации трубки с хорошим освещением для обнаружения гранулы и убедитесь, что она не нарушается. Добавлено гликогена может помочь обеспечить что гранулы является видимым в данный момент.
Выбор времени точек для курса время распада также является важным вопросом для рассмотрения. В то время как четыре timepoints, которую мы выбрали позволили нам следить за распад для более чем 10 000 генов, некоторые гены не сделал спада значительно в течение 8 ч время. Если недолго стенограммы высокий приоритет, следователи может потребоваться добавить дополнительные примеры коллекций до 120 мин, например в 30 мин. Для лучшей оценки долгоживущих стенограммы следователи может потребоваться добавить дополнительные примеры коллекций в более поздних timepoints.
Еще одна потенциальная проблема может привести, если распад ставки не следуют ожидаемое распределение. Например там может быть слишком много или слишком мало генов, показаны лог линейная распада оценить более 8 ч. Если это произойдет, это полезно для мониторинга распад темпы генов, которые, как известно, чтобы быть коротким или долгоживущих для того чтобы определить ли они следуют шаблону ожидаемых.Если гены имеют положительное, а не отрицательный склон с течением времени, они могут быть исключены из дальнейшего анализа как они не демонстрируют скорость лог линейная распада. Последний вопрос может возникнуть если клетки в двух сравниваемых условий имеют очень разные ответы на АСРТ таким образом, что многие гены распадаются быстрее в одном состоянии. В этом случае это может быть полезно сослаться не только с разницей в скорость распада между двумя государствами, но также для всплеска в элементы управления, которые мы предлагаем, включая до РНК изоляции представить информацию о показателях абсолютной распада в двух государствах.
Возможность контролировать Стенограмма распада ставки между покоя и пролиферирующих клеток или любые два аналогичных государств имеет потенциал обеспечить дальнейшее понимание важности Стенограмма распада в регуляции физиологических изменений. Приложения включают ячейки с и без онкогенных активации, до и после старения или вирусной инфекции, с и без нокдаун определенного гена, или в двух различных государствах дифференциации. Результаты могут сочетаться с РНК-Seq для предоставления информации о изоформы специфичных изменений Стенограмма распада ставок, которые может обеспечить понимание изменений в выражении изоформы наблюдали как клетки претерпевают физиологические переходы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не конкурирующие интересы раскрыть.
Acknowledgments
HAC был Милтон E. Cassel ученый Аллен фонда Рита (http://www.ritaallenfoundation.org). Эта работа финансировалась за счет грантов для HAC от национального института Генеральной медицинских наук центра передового опыта Грант Р50 GM071508 (David п.и. Ботштейн), Фонд PhRMA Грант 2007RSGl9572, национальной науки Фонд Грант OCI-1047879-Дэвид августа, Национальный институт Генеральной медицинских наук R01 GM081686, Национальный институт общих медицинских наук R01 GM0866465, Эли & Edythe широкой центр регенеративной медицины & исследования стволовых клеток, Iris Кантор женщин центр здоровья/UCLA CTSI низ Грант UL1TR000124 и лейкемии лимфомы общества. Исследования в этой публикации было поддержано национального института рака национальных институтов здоровья под награду номер P50CA092131. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. ВАК является членом Eli & Edythe Широкое центр восстановительной медицины & исследования стволовых клеток, Институт молекулярной биологии Калифорнийского университета и UCLA биоинформатики межведомственной программы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
