Summary
Se describe un protocolo para generar la proliferación y fibroblastos dérmicos humanos primarios quietos, seguimiento las tasas de decaimiento de transcripción y la identificación de genes diferencialmente decadentes.
Abstract
Quietud es un estado temporal, reversible en el que las células han dejado de división celular, pero conservan la capacidad de proliferar. Varios estudios, incluido el nuestro, han demostrado que la quietud se asocia con cambios generalizados en la expresión génica. Algunos de estos cambios se producen a través de cambios en el nivel o la actividad asociada a la proliferación de factores de transcripción, como E2F y MYC. Hemos demostrado que el decaimiento del mRNA también puede contribuir a cambios en la expresión génica entre células proliferantes y quietas. En este protocolo, se describe el procedimiento para el establecimiento de culturas quietas y proliferación de fibroblastos humanos de prepucio cutáneo. A continuación describimos los procedimientos para inhibir la nueva transcripción en las células proliferantes y quietas con actinomicina D (ActD). ActD tratamiento representa un enfoque sencillo y reproducible a disociar la nueva transcripción de la descomposición de la transcripción. Una desventaja del ActD tratamiento es que el curso del tiempo debe ser limitado a un corto plazo porque ActD afecta la viabilidad celular. Niveles de transcripción son monitoreados en el tiempo para determinar las tasas de decaimiento de transcripción. Este procedimiento permite la identificación de genes y de isoformas que exhiben decaimiento diferencial en proliferación contra fibroblastos quiescentes.
Introduction
Niveles de estado estacionario de transcripciones reflejan la contribución de síntesis transcripción y decaimiento de la transcripción. Regulado y coordinado de la transcripción es un importante mecanismo de control de procesos biológicos1,2,3,4. Por ejemplo, tasas de decaimiento de transcripción han demostrado para contribuir a la serie temporal de acontecimientos después de la activación por el factor de necrosis tumoral citoquinas inflamatorias del5.
Previamente hemos demostrado que la transición entre la proliferación y quietud en fibroblastos humanos primarios se asocia con cambios en los niveles de transcripción de muchos genes6. Algunos de estos cambios reflejan las diferencias en la actividad de factores de transcripción entre estos dos Estados.
Cambios en la tasa de decaimiento de una transcripción también pueden contribuir a cambios en el nivel de expresión de una transcripción en dos diferentes Estados7,8. Basado en los resultados anteriores que la transición entre la proliferación y la inactividad se asocia con cambios en los niveles de varios microRNAs9, le preguntamos si también hay una contribución de la descomposición de la transcripción diferencial de los cambios expresión génica en proliferación contra fibroblastos quiescentes.
Para monitorear la estabilidad de la transcripción, se determinó la tasa de decaimiento de las transcripciones genoma en proliferación versus células quiescentes. Para lograr esto, supervisamos las tasas de decaimiento en proliferación contra fibroblastos quiescentes introduciendo un inhibidor de la transcripción nueva y monitoreo de la tasa en que desaparecieron expedientes individuales con el tiempo. La ventaja de este enfoque es que, en comparación con los métodos que simplemente controlar la expresión génica global, por inhibición de la síntesis nueva de transcripción, seremos capaces de determinar la tasa de decaimiento de estas transcripciones por separado de la tasa a la que son transcrito.
ActD tratamiento para inhibir transcripción nueva y para determinar las tasas de decaimiento de transcripción se ha aplicado con éxito en múltiples estudios anteriores. ActD se ha utilizado para disecar la importancia de la estabilidad del RNA en los cambios en la abundancia de transcripción que resultan del tratamiento con citoquinas proinflamatorias5. Un enfoque similar también se ha utilizado para disecar las diferencias en la tasa de decaimiento de transcripción en proliferación versus células C2C12 diferenciadas como adoptan un fenotipo muscular diferenciado del10. Otro ejemplo, global mRNA vida media también se han detectado en pluripotentes y11de las células madre embrionarias de ratón distinguido. En estos ejemplos, decaimiento del mRNA se ha demostrado para ser importante para la regulación de la abundancia de transcripción y para la transición de células a células diferentes Estados.
Aplicación de los métodos descritos a continuación, descubrimos cambios en las tasas de decaimiento de la transcripción en aproximadamente 500 genes cuando se comparan los fibroblastos en proliferación y quieto Estados12. En particular, hemos descubierto que los objetivos del microRNA miR-29, que es regulada en células quiescentes, se estabilizan cuando las células de transición a la inactividad. Aquí describimos la metodología que se utilizó para determinar las tasas de decaimiento en las células proliferantes y quietas. Esta metodología es útil para comparar las tasas de decaimiento mRNA mundiales en dos distintos pero similares condiciones cuando se busca información sobre genes el decaerse rápidamente. También podría utilizarse para abordar otras cuestiones como el efecto de las condiciones de cultivo celular en decaimiento de la transcripción, por ejemplo, en dos dimensiones versus tres culturas dimensionales. Las tasas de decaimiento pueden ser genoma determinado con métodos tales como microarrays o RNA-seq. alternativamente, qPCR en tiempo real o el borrar norteño puede utilizarse para determinar las tasas de decaimiento en una base de gen por gen o isoforma de la isoforma. Estas tasas pueden utilizarse para calcular la vida media de cada gen supervisada y para identificar genes con índices de caries que son diferentes en dos condiciones.
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Protocol
Todos los experimentos descritos fueron aprobados por comités de revisión institucional en la Universidad de Princeton y la Universidad de California, Los Ángeles.
1. preparar los fibroblastos proliferantes y contacto-inhibido para ActD tiempo curso
Nota: Este protocolo usa una timecourse con cuatro puntos de tiempo. Pueden recogerse tres muestras biológicamente independientes por punto por la recogida de las placas de cultivo de tejidos diferentes en un experimento, o el experimento puede repetirse varias veces con diferentes culturas de las células. En nuestra experiencia, un plato de cultivo de tejidos de 10 cm (diámetro) (una placa) proporciona suficiente RNA para el análisis. Si es necesario, pueden combinarse múltiples platos de cultivo de tejidos para que cada muestra incrementar el número de células en cada punto. Además, se puede realizar el mismo experimento con fibroblastos aislados de diferentes individuos como Replica biológica verdaderamente independiente.
- Establecer culturas quietas y proliferación de células para el análisis de descomposición de la transcripción. Para las células proliferantes, dividir las células cada tres días mientras que las células inhibición de contacto están llegando a ser inhibida por el contacto.
- Para las células inhibición de contacto, cambiar el medio cada 2 días durante 7 días. Dividir las células proliferantes 2 días antes de los fibroblastos de la inhibición de contacto están listos para la colección. En la figura 1se muestra un ejemplo de un esquema de cultura de célula. Los pasos restantes de esta sección proporcionan un protocolo detallado para el establecimiento y división de las células.
- Fibroblastos dérmicos primarios aislados de la piel neonatal según protocolos establecidos13. Fibroblastos de pasaje para una población homogénea.
Nota: Fibroblastos pueden ser congelados y descongelados, si es necesario. - Descongelar o replate fibroblastos, si es necesario. Crecer fibroblastos en DMEM con 10% de suero bajo condiciones estériles en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% CO2. Utilice los fibroblastos que han crecido de menos de 10 pasos. Fibroblastos deben ser < 80% confluente en el día de la división de las células formando poblaciones proliferación y quietas.
- Para dividir una placa de cultivo de tejidos en múltiples placas, precalentamiento PBS, tripsina y medio con suero en un baño de agua de 37 ° C por 20 min.
- Aspirar o utilice una pipeta para extraer el medio de cada placa de cultivo de tejidos con células para ser replated.
- Pipeta PBS caliente en cada plato (10 mL de solución para una placa de 150 mm, 5 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa bien 6) y 1 mL para un pozo de una placa bien 12.
- Aspirado o pipeta para extraer PBS de cada placa de cultivo de tejidos.
- Suavemente la pipeta 1 x tripsina-EDTA en cada plato (8 mL de solución para una placa de 150 mm, 3 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa bien 6 y 1 mL para un pozo de una placa bien 12).
Nota: Hacer 1 x tripsina-EDTA diluyendo estéril 10 x tripsina-EDTA en PBS estéril. La solución final 1 x debe ser 0,05% 0,02% y tripsina EDTA. - Incubar tripsina con células durante 5 minutos.
- Golpear suavemente la placa para desalojar las células de la placa.
- Pipeta para resuspender las células en una suspensión unicelular.
- Transferencia de células en solución de tripsina a un tubo cónico que contiene el mismo volumen de DMEM con 10% de suero (8 mL de solución para una placa de 150 mm, 3 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa de la pozo 6 y 1 mL para un pozo de 12 bien la placa).
- Desactivación de las células a 4 ° C durante 5 minutos a 1.000 x g para eliminar tripsina.
- Resuspender las células en un volumen adecuado de medio y cuentan con un hemacitómetro para determinar la concentración de la célula.
- 5 x 105 células por placa de cultivo de tejidos de 100 mm para la proliferación y células inhibidas por el contacto de la semilla.
- Usando este método, establecer las muestras proliferación e inhibida de contacto requeridas para el análisis (figura 1).
2. ActD tiempo curso
- Resuspender ActD a una concentración stock de 1 mg/mL (1 mg de ActD, uso 950 μl de PBS estéril y 50 μl de DMSO estéril).
Nota: Soluciones congeladas del ActD deben ser estables durante un mes a-20 ° C. Soluciones diluidas deben ser descartadas y no almacenadas para su uso posterior. - Añadir ActD al volumen adecuado de medio precalentado para cultura biológica celular replicar todas las placas que fueron fijados por el 0, 120, 240 y 480 min horarios (figura 2). Añadir ActD a una concentración de 15 μg por mL de medio. Mezcla bien aspirar apagado el medio viejo y añadir medio ActD-que contiene a las células.
- Para un stock de 1 mg/mL, añadir 15 μl ActD por cada mL de medio, por ejemplo, para 10 mL de medio por placa de 100 mm, añadir 150 μL ActD.
- Para recolectar la muestra de punto cero, aspirar suavemente el medio ActD y pipeta precalentada PBS en las células. Pipeta 10 mL de solución para una placa de 150 mm, 5 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa bien 6 y 1 mL para un pozo de una placa bien 12.
- Aspirar suavemente o pipeta de PBS.
Nota: Todos los pasos que implica aislamiento de RNA deben realizarse con agua libre de ARNasa, libre de ARNasa tubos de microcentrífuga y pipetas libres de Rnasa. Guantes deben ser usados y cambiados con frecuencia cuando se trabaja con el ARN. - Añadir solución de isotiocianato de guanidina fenol (1 mL/10 cm placa con 4 x 105 a 4 x 107 células) directamente a la placa de cultivo de tejidos.
Nota: Solución de isotiocianato de guanidina fenol es una solución monofásica que mantiene la calidad del RNA durante la lisis de las células y separación de RNA, DNA y proteínas entre sí.
PRECAUCIÓN: El fenol con isotiocianato de guanidina son corrosivos. Usar protección adecuada. - Pipeta el fenol-guanidina isotiocianato solución celular la mezcla arriba y abajo varias veces para hacer una mezcla homogénea.
Nota: La solución de isotiocianato de guanidina fenol lisado puede guardarse a 4 ° C durante la noche o a-20 ° C por hasta un año. - Recoger cada momento transcurrido la cantidad apropiada de tiempo utilizando el método descrito en pasos 2.3-2.6.
3. aislamiento de ARN Total de isotiocianato de guanidina fenol solución lisado
- Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos asegurar la completa disolución de complejos RNA-proteína.
Nota: Los pasos del Protocolo de solución de isotiocianato de guanidina fenol pueden realizarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. - Introducir transcripciones de spike en el control que pueden ser detectadas con la metodología utilizada.
Nota: El externo RNA control consortium (ERCC) spike en control mix14 ha sido específicamente diseñado como un punto de control para RNA-seq. También puede usarse para Norte Blot o qPCR en tiempo real. Spike en controles diseñados específicamente para tecnologías de microarrays están también disponible (véase Tabla de materiales).
Nota: Después de la vuelta inicial, la muestra debe separar en 3 capas - una capa orgánica roja en la parte inferior, una interfase de blanco/color de rosa en el centro y una capa clara acuosa en la parte superior (figura 3).
Nota: Tenga cuidado de no alterar la interfase durante este proceso. Está bien dejar parte de la fracción acuosa. Es mejor dejar a parte de la fracción acuosa que para también incluir algunas de las capas de interfase, como la interfase capa contaminaría el ARN con el ADN. La capa acuosa será aproximadamente la mitad del volumen inicial, hasta cerca de 0,9 mL de la mezcla de solución/cloroformo isotiocianato de guanidina de fenol fue de 1,8 mL.
Nota: Esto resultará en un pellet denso, sólido que es fácil de controlar tras los pasos de la vuelta que seguirán.
Nota: Una punta de la pipeta sueltas sostenida en la mano se puede utilizar para quitar exceso etanol. Si el pellet de RNA está perturbado, pero no descarta, el investigador puede repetir la vuelta y quitar el sobrenadante nuevamente. Evitar desechar el precipitado como esto exigirá al investigador a repetir todo el procedimiento.
Nota: El pellet de RNA es menos compacto en este paso y tiende a moverse. Ser muy cuidadoso al manipular el diábolo en este punto para evitar perder el ARN.
4. Análisis de la abundancia de transcripción
- Cuantificar RNA y RNA busque pureza utilizando un espectrofotómetro.
Nota: La proporción de absorbancia a 260 nm y 280 nm debe ser aproximadamente de 2.0 para el ARN. - Análisis RNA con un gel de agarosa al 1% o una tecnología equivalente a visualizar el grado de degradación.
Nota: Dos claras bandas representando a 18S y 28S rRNA debe ser claramente visible (figura 4). Si estas bandas no son visibles, puede degradar el ARN. Consejos tiros problemas de degradación de RNA se encuentran en la discusión. - Monitor la abundancia de transcripción en las alícuotas recogidas de ARN en comparación con el tacon de estándar interno utilizando microarrays15, RNA-Seq16, qPCR en tiempo real17, o Northern blots18.
- Determinar la abundancia de cada transcripción en cada punto de tiempo en comparación con un tacon en el control de conocida abundancia.
Nota: Para microarrays, los valores serán intensidades de fluorescencia. Para lacras norte, bandas en la película de rayos x se pueden cuantificar. Para qPCR en tiempo real, abundancia de transcripción puede determinarse por comparación con estándares conocidos con el 2- σσCT método19. Para RNA-Seq, valores normalizados pueden determinarse como FPKM o fragmentos por kilobase del exón por millones Lee asignados. Para las tasas de decaimiento de la isoforma específica, datos de RNA-Seq pueden analizarse utilizando metodologías isoform-consciente como DEXSeq20. Las tasas de decaimiento de la isoforma específica se determinan mejor con RNA-seq. Si han de determinarse con los datos de microarray, los datos deben ser analizados en una punta de prueba en lugar de una base de gen por gen. El analista debe tener cuidado al interpretar la información de un número limitado de sondeos. Por ejemplo, pueden ser 5 o menos las puntas de prueba que son de caracter informativos sobre una determinada isoforma. En este caso, el analista tendrá que determinar si el comportamiento de estas sondas es lo suficientemente consistente para que los resultados son confiables.
- Determinar la abundancia de cada transcripción en cada punto de tiempo en comparación con un tacon en el control de conocida abundancia.
- Realizar en tiempo real qPCR el RNA aislado17 en las muestras recolectadas para analizar genes rápidamente que se decae, como c-Myc y un gen lentamente que se decae como GAPDH, ganar la confianza eso decaimiento de transcripción las tasas fueron detectadas con precisión.
Nota: Para más confirmación, sondas qPCR en tiempo real de la isoforma específica pueden ser desarrolladas y utilizadas para monitorear la abundancia de isoformas específicas por tiempo21.
5.Determinación del ritmo de decaimiento constante
- Para cada punto de tiempo, registro de transformación de los valores de abundancia de cada transcripción (gen-isoforma específica o).
Nota: Transformación de registro de los valores convertirá curvas de decaimiento exponencial en líneas que se pueden caber con un decaimiento lineal modelo22. - Encajan en el perfil de expresión de cada transcripción (gen-isoforma específica o) a un modelo de decaimiento lineal. La fórmula de este modelo es f (t) = C - r * t. En esta ecuación, C es una constante que representa la cantidad a partir de una transcripción, r es la tasa de disminución, y t es el tiempo desde el inicio del experimento. De esta ecuación, determinar la velocidad de descomposición como r*ln(10) (ver referencia11).
Nota: El paquete de software maSigPro es un enfoque de regresión diseñado para detectar diferencias de Perfil de expresión genética significativa en tiempo curso datos23. Resultados para maSigPro y código de ejemplo están disponibles en: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - Filtrar los genes que no ajustar un modelo log-lineal de la desintegración. Esto se puede lograr con una prueba F de ANOVA.
Nota: la prueba F se basa en el estadístico F, que se define como la variación entre medias de la muestra dividida por la variación dentro de las muestras. Corregir los valores de p para las comparaciones múltiples mediante la aplicación de la lineal elevador Benjamini y Hochberg false discovery procedimiento24. Un valor de q mayor que 0.05 con el F-test puede utilizarse como un atajo para los genes que no ajustar un modelo log-lineal de la desintegración. - Realizar una prueba F de ANOVA para determinar las transcripciones con un término de interacción significativa entre una condición categórica de ciclo celular y el tiempo (tasa de falso descubrimiento, FDR < 0.05).
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Representative Results
Hemos divulgado previamente los resultados de análisis de microarray de las tasas de decaimiento de transcripción en fibroblastos humanos primarios proliferación e inhibida por el contacto durante un tiempo de 8 horas curso12. Se proporciona una lista de genes con un cambio significativo en la estabilidad de la transcripción comparación de fibroblastos proliferantes y contacto-inhibida en la tabla adicional 1. Se proporcionan las intensidades de fluorescencia en tiempo cero y durante un tiempo después del tratamiento del ActD. Genes fueron incluidos en la lista mediante la determinación de los genes que tienen pendientes significativamente diferentes en condiciones de proliferación y contacto inhibido mediante una prueba F de ANOVA. En la figura 5se muestran ejemplos de genes con tipos diferentes de decaimiento en fibroblastos proliferantes y quietos.
Figura 1 : Esquema de protocolo para el establecimiento de placas proliferación y contacto-inhibido para análisis de curso ActD tiempo. Se proporciona una descripción día por día los pasos necesarios para establecer cultivos de células para el tratamiento del ActD, asumiendo cuatro puntos de tiempo se utilizará para el curso del tiempo. Por simplicidad, una placa se muestra por punto, pero pueden agregar placas adicionales para generar réplicas biológicas. El protocolo puede ajustarse también para añadir más placas de células si se desean más de cuatro puntos de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Esquema del curso del tiempo ActD y decaimiento tasa cálculos en reposo con respecto a la proliferación de fibroblastos humanos. La fracción esperada de mRNAs restantes en el tiempo para una hipotética transcripción después de tratamiento con un inhibidor transcripcional se muestra. A continuación, parcelas de muestra de la fracción de mRNA permanecen con el tiempo se proporcionan para genes que son más estables en reposo de células proliferantes y genes que son más estables en la proliferación de las células quiescentes. Para cada punto de datos, sólo un único valor se muestra para mayor claridad. En el protocolo real, habrá tres datapoints para cada punto. Esta figura ha sido modificada desde la tesis de Elizabeth Pender Johnson con su consentimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Fotografías de mezcla de reactivo de isotiocianato de guanidina fenol y cloroformo antes y después de la centrifugación. La mezcla se muestra cuando el reactivo de isotiocianato de guanidina fenol y cloroformo son inicialmente combinados, después de la mezcla y después de la centrifugación. Después se centrifuga la mezcla, la fase inferior, que es roja, es la fase orgánica. La interfase en el centro es blanco y turbio. La fase superior es la fase acuosa y es claro. El ARN se encuentra en la fase acuosa, que debe ser recogida con una pipeta para precipitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Gel de RNA de la muestra para controlar la calidad del RNA. Una ilustración de un gel de RNA mostrando muestras con ARN intacto. RNA intacto tiene bandas prominentes de los rRNAs 28S y 18S. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Ejemplos de genes con tipos diferentes de decaimiento en proliferando versus fibroblastos quiescentes. Intensidades de fluorescencia (genes) con el tiempo se muestran cuatro genes que decaen diferentemente en proliferación contra fibroblastos quiescentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Complementario tabla 1: intensidad de fluorescencia de Gene-específico en fibroblastos proliferantes y quietos. Los datos son proporcionados para el tiempo cero y durante un tiempo después del tratamiento del ActD en proliferación e inhibida por el contacto de fibroblastos. Se proporcionan valores de P, q valores y tasas de falso descubrimiento. Tabla es reimpreso desde su publicación original en BMC Genomics12. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Quietud puede ser inducida por señales externas, incluyendo retiro de mitógenos o suero, falta de adhesión celular y la inhibición de contacto. Inhibición de contacto, uno de varios posibles métodos para inducir la quietud, es un proceso altamente evolutionarily conservado en el que las células de salida ciclo celular proliferativo en respuesta a contacto de célula a célula. Nos centramos aquí en inhibición de contacto como un ejemplo de un método para inducir la quietud. Estudios previos han reportado que contacto célula-célula puede afectar microRNA biogénesis25, así, los resultados proporcionan información sobre un método de quietud y se requieren estudios adicionales para determinar que cambios se asocian con la quietud por sí.
Se utilizaron fibroblastos diploides humanos primarios que se aislaron de la piel neonatal. Iniciamos estos experimentos con fibroblastos que fueron pasados menos de 10 veces. Descartamos los fibroblastos de pasaje más adelante porque se marchitaron. Si bien este protocolo se centra en reposo y proliferación de fibroblastos dérmicos, los procedimientos descritos pueden utilizarse para controlar las tasas de decaimiento en diferentes tipos de células y en diferentes condiciones.
Supervisamos mRNA decay tarifas genoma mediante un curso de tiempo de apagado de la transcripción. Cursos tiempo de apagado están el método más ampliamente utilizado para desacoplar el decaimiento del mRNA de la transcripción de mRNA para calcular mRNA vida media1,26. En el método descrito aquí, ActD, una droga que complejos con la forma B de ADN al bloquear la elongación de la ARN polimerasa II, se utiliza para detener la transcripción mRNAs27. La tasa de transcripción disminuir en abundancia durante un período de tiempo de 8 horas puede ser determinada como tasa de atenuación de la transcripción.
Una importante limitación de los enfoques ActD para monitoreo de decaimiento de la transcripción es que ActD impide transcripción global, que afectará la viabilidad de las células. Esto debe tener en cuenta al interpretar los datos basados en ActD, como las tasas de decaimiento se se determinan en las células que más se destacó de su estado natal. Otra preocupación importante es que los efectos del ActD pueden ser diferentes para las células en los diferentes Estados, incluyendo proliferación contra fibroblastos inhibición de contacto. Un enfoque para reducir al mínimo los efectos secundarios del tratamiento del ActD es mantener cursos de tiempo cortos en duración. Por esta razón, hemos seleccionado un curso de tiempo de 8 h.
Hay alternativas para ActD para control de transcripción decaimiento tarifas28,29. Cepas de levadura con alelos de sensibles a la temperatura RNA polimerasa II se han utilizado para controlar la transcripción de las tasas de decaimiento30. Una variación de este enfoque denominado "anclaje alejado" se ha utilizado en la levadura para lograr depleción condicional de la ARN polimerasa II en respuesta a rapamicina tratamiento31,32. También es posible monitorizar decaimiento en células con activa transcripción. Por ejemplo, nucleótidos de uracilo thio-sustituido pueden introducirse en las células, incorporaron en mRNA y posteriormente detectaron33,34,35. Con este enfoque, se puede determinar la tasa a la cual se sintetizan diferentes transcripciones en las células que siguen para sintetizar mRNA. Estos enfoques tienen una ventaja significativa sobre el tratamiento del ActD porque no son tóxicos. En nuestra experiencia, sin embargo, puede haber variabilidad en la recuperación de las transcripciones con estos métodos. ActD tratamiento es un enfoque simple y reproducible para el monitoreo de caries de la transcripción.
Unos pasos en el protocolo siempre son críticos para su éxito. Una cuestión importante es prevenir la degradación del RNA durante el aislamiento de RNA. En el paso 4.1, el ARN debe ser supervisado para degradación. Si el ARN no contiene dos picos claros de 18S y 28S rRNAs (figura 4), esto es un signo que se ha producido la degradación de la transcripción. Algunos instrumentos proporcionan puntuaciones de RNA integridad número (RIN) que van desde 1 a 10. Las muestras con las cuentas RIN en el rango de 7-10 son aceptables para su posterior análisis. Si el ARN se degrada, es importante tomar más precauciones para evitar la degradación del RNA, como asegurando que soluciones y sterileware están libres de RNasa y guantes cuando manejo de pipetas para el ARN. Agua puede ser pretratado con 0.1% dietil pirocarbonato (DEPC), que se incubó durante al menos 2 h a 37 ° C, y esterilizado durante al menos 15 min Nota DEPC no puede utilizarse con base de Tris buffers. Rnasa soluciones descontaminante también pueden utilizarse para quitar la Rnasa de superficies de trabajo, centrífugas, pipetas y reactivos que inhiben la RNasas puede añadirse a las muestras.
Otro paso fundamental es la separación de las fases de la solución de isotiocianato de guanidina fenol. Es importante asegurarse de que sólo la fase superior se recoge para ARN de procesamiento. Si el ARN resultante incluye fenol residual, la proporción de absorbancia a 230, 260 y 280 nm no estará en la relación 1:2:1 como se esperaba. Superior a la esperada absorbancia a 230 nm puede indicar contaminación del fenol. Si esto ocurre, el RNA puede ser etanol precipitó otra vez y lavado varias veces más para eliminar cualquier fenol residual.
Finalmente, cuando el ARN es peleteado y se retira el sobrenadante, el sedimento puede ser pegajoso, fina y fácilmente perturbado. En este punto, es importante tener cuidado en sacar el líquido. Puede ser importante visualizar el tubo con una buena iluminación para ubicar la pelotilla y asegúrese de que no se disturbe. Agregado glucógeno puede ayudar a garantizar que la pelotilla es visible en este momento.
La selección de puntos del tiempo para el curso del tiempo de decaimiento es también un tema importante a considerar. Mientras que los cuatro puntos de tiempo que hemos seleccionado nos permitieron controlar decaimiento de más de 10.000 genes, algunos genes no se decayó significativamente durante el curso de tiempo de 8 h. Si de breve duración expedientes son una alta prioridad, los investigadores puede Agregar colecciones de muestra adicional antes de 120 min, por ejemplo en 30 minutos. Para la mejor evaluación de transcripciones de larga duración, los investigadores puede Agregar colecciones de muestras adicionales en los puntos de tiempo posteriores.
Otro posible problema puede resultar si las tasas de decaimiento no siguen la distribución esperada. Por ejemplo, puede haber demasiados o muy pocos genes que muestran un decaimiento log-lineal velocidad durante 8 h. Si esto sucede, es útil controlar las tasas de decaimiento de genes que son conocidos por ser corta o larga duración para determinar si sigue el patrón esperado.Si los genes tienen una pendiente positiva más que negativa en el tiempo, puede excluirse del análisis como no demuestran una tasa de decaimiento log-lineal. Una última cuestión podría presentarse si las células en las dos condiciones que se comparan tienen respuestas muy diferentes a la ActD tal que muchos genes decaen más rápidamente en una condición. En este caso, puede ser útil para referirse no sólo a la diferencia en la tasa de caries entre los dos Estados, sino también a los controles de spike en que proponemos como antes del aislamiento de RNA para proporcionar información sobre las tasas de decaimiento absoluto en los dos Estados.
La capacidad para monitorear las tasas de decaimiento de transcripción entre las células proliferantes y quietas o cualquier dos Estados similares tiene el potencial para proporcionar más información sobre la importancia de la decadencia de la transcripción en la regulación de los cambios fisiológicos. Las aplicaciones incluyen células con y sin activación oncogénica, antes y después de la senescencia o infección viral, con y sin la caída de un gen específico, o en dos diferentes Estados de diferenciación. Los resultados pueden ser juntados con RNA-Seq para proporcionar información específica de isoforma cambios en las tasas de decaimiento de transcripción, que pueden proporcionar la penetración en los cambios en la expresión de la isoforma observado como las células se someten a transiciones fisiológicas.
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Disclosures
Los autores tienen intereses que compiten a revelar.
Acknowledgments
HAC fue la Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabajo fue financiado por subvenciones para HAC (P.I. David Botstein), Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General del centro de la beca de excelencia P50 GM071508 PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, ciencia nacional Fundación beca OCI-1047879 David agosto, Nacional Institute of General Medical Ciencias R01 GM081686, Instituto Nacional de ciencias médicas General R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad Center de medicina regenerativa & investigación con células madre, centro de salud/UCLA CTSI NIH de la mujer Iris Cantor Grant UL1TR000124 y la sociedad de la leucemia linfoma. Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P50CA092131. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. HAC es un miembro del Eli & Edythe amplia centro de medicina regenerativa & investigación con células madre, el Instituto de Biología Molecular de la UCLA y el programa interdepartamental de Bioinformática de UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
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