Summary
हम proliferating और quiescent प्राथमिक मानव चमड़े का fibroblasts पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, प्रतिलिपि क्षय दर की निगरानी, और विभेदक क्षय जीन की पहचान ।
Abstract
weak एक अस्थायी, प्रतिवर्ती अवस्था है जिसमें कोशिकाएं कोशिका विभाजन की स्थिति में रहती हैं, लेकिन पैदा की क्षमता को बनाए रखती हैं । हमारे सहित कई अध्ययनों, प्रदर्शन किया है कि weak जीन अभिव्यक्ति में व्यापक परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है । इनमें से कुछ परिवर्तन E2F और MYC जैसे प्रसार-संबद्ध प्रतिलेखन कारकों के स्तर या गतिविधि में परिवर्तन के माध्यम से होते हैं । हमने प्रदर्शन किया है कि mRNA क्षय भी proliferating और quiescent कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए योगदान कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम मानव चमड़े की चमड़ी fibroblasts की proliferating और quiescent संस्कृतियों की स्थापना के लिए प्रक्रिया का वर्णन । हम तो Actinomycin डी (ActD) के साथ proliferating और quiescent कोशिकाओं में नए प्रतिलेखन बाधा के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन । ActD उपचार प्रतिलिपि क्षय से dissociating नए प्रतिलेखन के लिए एक सीधा और प्रतिलिपि दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है । ActD उपचार का एक नुकसान यह है कि समय पाठ्यक्रम एक कम समय सीमा तक सीमित किया जाना चाहिए क्योंकि ActD कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित करता है । प्रतिलिपि स्तर समय पर नजर रखी है प्रतिलिपि क्षय दर निर्धारित करते हैं । इस प्रक्रिया जीन और isoforms कि proliferating बनाम quiescent fibroblasts में अंतर क्षय प्रदर्शन की पहचान के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
टेप के स्थिर राज्य स्तर दोनों प्रतिलिपि संश्लेषण और प्रतिलिपि क्षय के योगदान को प्रतिबिंबित । विनियमित और समन्वित प्रतिलिपि क्षय जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है1,2,3,4. उदाहरण के लिए, प्रतिलिपि क्षय दर भड़काऊ cytokine ट्यूमर परिगलन कारक द्वारा सक्रियण के बाद की घटनाओं के लौकिक श्रृंखला में योगदान करने के लिए दिखाया गया है5.
हम पहले से पता चला है कि प्रसार और प्राथमिक मानव fibroblasts में weak के बीच संक्रमण कई जीन6के प्रतिलिपि स्तर में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है । इन परिवर्तनों में से कुछ इन दोनों राज्यों के बीच प्रतिलेखन कारकों की गतिविधि में अंतर को प्रतिबिंबित ।
एक प्रतिलिपि क्षय की दर में परिवर्तन भी दो विभिंन राज्यों में एक प्रतिलिपि के अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन के लिए योगदान कर सकते है7,8। हमारे पहले के निष्कर्षों के आधार पर है कि प्रसार और weak के बीच संक्रमण के कई microRNAs के स्तर में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है9, हमने पूछा कि क्या वहां भी परिवर्तन में अंतर प्रतिलिपि क्षय से एक योगदान है जीन proliferating बनाम quiescent fibroblasts में अभिव्यक्ति.
आदेश में प्रतिलिपि स्थिरता की निगरानी के लिए, हम टेप जीनोम के क्षय की दर निर्धारित proliferating बनाम quiescent कोशिकाओं में व्यापक । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम proliferating बनाम quiescent fibroblasts में क्षय दर नए प्रतिलेखन के एक अवरोधक शुरू करने और दर जिस पर व्यक्तिगत टेप समय पर गायब हो निगरानी द्वारा मॉनिटर । इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि, के रूप में तरीके कि बस समग्र जीन अभिव्यक्ति की निगरानी की तुलना में, नई प्रतिलिपि संश्लेषण बाधा से, हम इन टेप के लिए क्षय दर निर्धारित करने में सक्षम होंगे दर से अलग है जिस पर वे कर रहे है लिखित.
ActD उपचार के लिए नए प्रतिलेखन को बाधित और प्रतिलिपि क्षय दर निर्धारित सफलतापूर्वक कई पिछले अध्ययन में लागू किया गया है । ActD की प्रतिलिपि में परिवर्तन में आरएनए स्थिरता का महत्व टुकड़े के लिए इस्तेमाल किया गया है कि समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के साथ उपचार से परिणाम5. एक समान दृष्टिकोण भी proliferating बनाम विभेदित C2C12 कोशिकाओं में प्रतिलिपि क्षय दर में मतभेद टुकड़े इस्तेमाल किया गया है के रूप में वे एक विभेदित मांसपेशियों phenotype10। एक अंय उदाहरण के रूप में, ग्लोबल mRNA आधा जीवन भी pluripotent और विभेदित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं11में पाया गया है । इन उदाहरणों में, mRNA क्षय के लिए प्रलेखित बहुतायत विनियमन और कोशिकाओं के विभिंन सेल राज्यों के संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है ।
तरीकों को लागू करने के नीचे वर्णित है, हम लगभग ५०० जीन में प्रतिलिपि क्षय दर में परिवर्तन की खोज की जब proliferating और quiescent राज्यों में fibroblasts की तुलना12। विशेष रूप से, हमें पता चला कि microRNA मीर-29, जो quiescent कोशिकाओं में downregulated है के लक्ष्यों को स्थिर कर रहे है जब weak के लिए कोशिकाओं को संक्रमण । हम यहां पद्धति का वर्णन हम proliferating और quiescent कोशिकाओं में क्षय दर निर्धारित किया करते थे । यह पद्धति वैश्विक mRNA क्षय दर दो अलग लेकिन समान स्थितियों में तुलना के लिए उपयोगी है जब तेजी से क्षय जीन के बारे में जानकारी मांगी है । यह भी ऐसे प्रतिलिपि क्षय पर सेल संस्कृति की स्थिति के प्रभाव के रूप में अंय सवालों के समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, दो आयामी बनाम तीन आयामी संस्कृतियों में । क्षय दर microarrays या आरएनए-Seq जैसे तरीकों के साथ जीनोम-वाइड निर्धारित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, वास्तविक समय qPCR या उत्तरी सोख्ता एक जीन द्वारा-जीन या isoform-by-isoform आधार पर क्षय दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन दरों में तो प्रत्येक मॉनिटर जीन के आधे जीवन की गणना करने के लिए और क्षय की दर है कि दो स्थितियों में अलग है के साथ जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Protocol
सभी प्रयोगों के प्रिंसटन विश्वविद्यालय और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में संस्थागत समीक्षा बोर्डों द्वारा अनुमोदित किए गए थे ।
1. ActD समय पाठ्यक्रम के लिए Proliferating और संपर्क-बाधित Fibroblasts तैयार करना
नोट: यह प्रोटोकॉल एक timecourse चार timepoints के साथ उपयोग करता है । तीन जैविक रूप से स्वतंत्र नमूने एक प्रयोग में विभिंन ऊतक संस्कृति प्लेटों का संग्रह करके प्रति timepoint एकत्र किया जा सकता है, या प्रयोग कोशिकाओं की विभिंन संस्कृतियों के साथ कई बार दोहराया जा सकता है । हमारे अनुभव में, १ १० सेमी (व्यास) टिशू कल्चर डिश (एक प्लेट) विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए प्रदान करता है । यदि आवश्यक हो, एकाधिक ऊतक संस्कृति व्यंजन प्रत्येक timepoint पर कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए परित किया जा सकता है । इसके अलावा, एक ही प्रयोग fibroblasts के साथ किया जा सकता है सही मायने में स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति के रूप में विभिंन व्यक्तियों से पृथक ।
- स्थापना proliferating और quiescent कोशिकाओं की प्रतिलिपि क्षय विश्लेषण के लिए संस्कृतियों । proliferating कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को हर तीन दिन विभाजित करते हुए संपर्क बाधित कोशिकाओं संपर्क-बाधित होते जा रहे हैं ।
- संपर्क-बाधित कोशिकाओं के लिए, मध्यम हर 2 दिन के लिए 7 दिनों के लिए बदल जाते हैं । संपर्क-बाधित fibroblasts संग्रह के लिए तैयार है करने से पहले 2 दिन proliferating कक्षों को विभाजित करें । किसी कक्ष culture योजना का एक उदाहरण आरेख 1में दिखाया जाता है । इस अनुभाग में बचे हुए चरण कक्षों को स्थापित करने और विभाजित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
- नवजात त्वचा से प्राथमिक चमड़े का fibroblasts अलग स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार13। पारित fibroblasts एक सजातीय जनसंख्या सुनिश्चित करने के लिए ।
नोट: यदि जरूरत हो तो Fibroblasts जम और गल सकता है । - गल या फिर प्लेट fibroblasts, अगर जरूरत हो तो । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह में एक ऊतक संस्कृति मशीन में बाँझ शर्तों के तहत 10% सीरम के साथ DMEM में fibroblasts हो जाना2. fibroblasts का प्रयोग करें कि 10 से कम मार्ग के लिए बड़े हो गए हैं । Fibroblasts होना चाहिए & #60; ८०% बंटवारे के दिन पर धाराप्रवाह कोशिकाओं proliferating और quiescent आबादी बनाने के लिए ।
- एक ऊतक संस्कृति प्लेट को कई प्लेटों, गर्म पंजाबियों, trypsin, और सीरम के साथ एक ३७ ° c पानी के स्नान में 20 मिनट के लिए विभाजित करने के लिए ।
- महाप्राण या एक प्लास्टिक का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं के साथ एक टिशू कल्चर प्लेट से मध्यम को हटाने के लिए reप्लेटेड हो ।
- प्रत्येक प्लेट पर प्लास्टिक गर्म पंजाबियों (एक १५० मिमी प्लेट के लिए समाधान के 10 मिलीलीटर, एक १०० मिमी प्लेट के लिए समाधान के 5 मिलीलीटर, एक अच्छी तरह से एक 6 अच्छी थाली के लिए 2 मिलीलीटर, और एक अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली के लिए 1 मिलीलीटर) ।
- प्रत्येक टिशू कल्चर प्लेट से पंजाबियों को हटाने के लिए महाप्राण या प्लास्टिक ।
- धीरे प्लास्टिक 1x Trypsin-प्रत्येक प्लेट पर EDTA (एक १५० mm प्लेट के लिए समाधान के 8 मिलीलीटर, एक १०० मिमी प्लेट के लिए समाधान के 3 मिलीलीटर, एक अच्छी तरह से एक 6 अच्छी थाली के लिए 2 मिलीलीटर, और एक अच्छी तरह से एक के लिए 1 मिलीलीटर 12 अच्छी तरह से थाली) ।
नोट: बाँझ पंजाबन में कमजोर बाँझ 10x Trypsin-EDTA द्वारा 1x Trypsin-EDTA बनाओ. अंतिम 1x समाधान ०.०५% trypsin और ०.०२% EDTA होना चाहिए । - 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ trypsin की मशीन ।
- धीरे थाली से कोशिकाओं को उखाड़ फेंक करने के लिए प्लेट नल ।
- प्लास्टिक एक सेल निलंबन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए ।
- trypsin में स्थानांतरण कोशिकाओं एक शंकु ट्यूब के साथ DMEM की एक ही मात्रा में 10% सीरम (समाधान के एक १५० मिमी प्लेट के लिए 8 मिलीलीटर, एक १०० मिमी प्लेट के लिए समाधान के 3 मिलीलीटर, एक अच्छी तरह से एक के लिए 2 मिलीलीटर से युक्त एक कुआं प्लेट , और एक अच्छी तरह से 12 प्लेट के लिए 1 मिलीलीटर) ।
- trypsin हटाने के लिए १,००० x g पर 5 मिनट के लिए 4 ° c पर कक्षों को नीचे स्पिन करें ।
- सेल एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक hemacytometer के साथ मध्यम और गिनती के एक उचित मात्रा में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित ।
- बीज 5 x 105 कोशिकाओं प्रति १०० mm टिशू कल्चर प्लेट proliferating और संपर्क-बाधित कोशिकाओं के लिए ।
- इस विधि का उपयोग करते हुए, विश्लेषण के लिए आवश्यक proliferating और संपर्क-बाधित नमूनों की स्थापना (चित्र 1) ।
2. ActD टाइम कोर्स
- 1 मिलीग्राम/एमएल के एक शेयर एकाग्रता पर ActD reसस्पेंड (के लिए ActD के 1 मिलीग्राम, उपयोग ९५० बाँझ पंजाबियों के µ एल और ५० बाँझ DMSO के µ l).
नोट: ActD के जमे हुए स्टॉक समाधान-20 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए स्थिर होना चाहिए । पतला समाधान छोड़ दिया जाना चाहिए और आगे उपयोग के लिए संग्रहीत नहीं है । - सभी जैविक दोहराने सेल कल्चर प्लेटों कि 0, १२०, २४०, और ४८० मिनट timepoints (चित्रा 2) के लिए स्थापित किया गया था के लिए गर्म मध्यम के उचित मात्रा में ActD जोड़ें । मध्यम की मिलीलीटर प्रति 15 µ जी की एकाग्रता पर ActD जोड़ें । अच्छे से मिलाएं, पुराने माध्यम से महाप्राण, और ActD-युक्त मध्यम से कोशिकाओं को जोड़ें ।
- एक 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक के लिए, मध्यम के प्रत्येक मिलीलीटर के लिए 15 µ l ActD जोड़ें, उदा, १०० mm प्लेट के लिए मध्यम के 10 मिलीलीटर के लिए, १५० µ l ActD जोड़ें ।
- शूंय timepoint नमूना इकट्ठा करने के लिए, धीरे से ActD माध्यम से महाप्राण, और कोशिकाओं पर प्लास्टिक गरम पंजाब । प्लास्टिक एक १५० mm प्लेट के लिए समाधान के 10 मिलीलीटर, एक १०० मिमी प्लेट के लिए समाधान के 5 मिलीलीटर, एक अच्छी तरह से एक 6 अच्छी थाली के लिए 2 मिलीलीटर, और एक अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली के लिए 1 मिलीलीटर ।
- धीरे महाप्राण या प्लास्टिक बंद करा.
नोट: आरएनए अलगाव को शामिल सभी कदम RNase के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए-मुफ्त पानी, RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूबों, और RNase मुक्त पिपेट. दस्ताने पहना और अक्सर आरएनए के साथ काम करते समय बदल दिया जाना चाहिए । - phenol जोड़ें-guanidine isothiocyanate समाधान (1 मिलीलीटर/10-सेमी प्लेट 4 एक्स 105 से 4 एक्स 107 कोशिकाओं के साथ) सीधे ऊतक संस्कृति की थाली के लिए ।
नोट: Phenol-guanidine isothiocyanate समाधान एक monophasic समाधान है कि आरएनए गुणवत्ता का कहना है, जबकि lysing कोशिकाओं और एक दूसरे से आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन को अलग ।
सावधानी: Phenol और guanidine isothiocyanate राक हैं । उपयुक्त सुरक्षा का उपयोग करें । - प्लास्टिक phenol-guanidine isothiocyanate समाधान-सेल मिश्रण ऊपर और नीचे कई बार एक सजातीय मिश्रण बनाने के लिए ।
नोट: Phenol-guanidine isothiocyanate समाधान lysate एक वर्ष तक के लिए 4 ° c रातोंरात या पर-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । - प्रत्येक समय बिंदु उपयुक्त मात्रा समय 2.3-2.6 चरणों में वर्णित विधि का उपयोग कर दिया गया है के बाद ले लीजिए ।
3. Phenol से कुल आरएनए का अलगाव-guanidine Isothiocyanate समाधान Lysate
- आरएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने की मशीन ।
नोट: phenol-guanidine isothiocyanate समाधान प्रोटोकॉल के चरणों कमरे के तापमान पर किया जा सकता है जब तक अंयथा नोट । - परिचय स्पाइक नियंत्रण टेप है कि इस्तेमाल किया पद्धति के साथ पता लगाया जा सकता है ।
नोट: बाहरी आरएनए नियंत्रण कंसोर्टियम (ERCC) स्पाइक नियंत्रण मिश्रण14 विशेष रूप से आरएनए-Seq के लिए एक स्पाइक नियंत्रण के रूप में बनाया गया है । यह भी उत्तरी दाग या वास्तविक समय qPCR के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । microarray प्रौद्योगिकियों के लिए विशेष रूप से डिजाइन में स्पाइक-नियंत्रण भी उपलब्ध हैं ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
नोट: प्रारंभिक स्पिन के बाद, नमूना 3 परतों में अलग होना चाहिए-नीचे, मध्य में एक सफेद/गुलाबी चरण में एक लाल कार्बनिक परत, और शीर्ष पर एक स्पष्ट जलीय परत (चित्रा 3) ।
नोट: इस प्रक्रिया के दौरान इस चरण को परेशान करने के लिए सावधान रहें । यह जलीय अंश के कुछ छोड़ ठीक है । यह भी एक चरण परतों के कुछ शामिल करने के लिए से जलीय अंश के कुछ छोड़ने के लिए बेहतर है, के रूप में चरण परत डीएनए के साथ आरएनए दूषित होता शामिल है । जलीय परत प्रारंभिक मात्रा के लगभग आधे हो जाएगा, तो के बारे में ०.९ मिलीलीटर अगर phenol-guanidine isothiocyanate समाधान/क्लोरोफॉर्म मिश्रण १.८ मिलीलीटर था ।
नोट: यह एक घने, ठोस गोली है कि स्पिन कदम है कि पालन के बाद निगरानी करने के लिए आसान है में परिणाम होगा ।
नोट: एक ढीला प्लास्टिक हाथ में आयोजित टिप अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आरएनए गोली परेशान है, लेकिन खारिज नहीं कर दिया, तो जांचकर्ता स्पिन को दोहराने और supernatant फिर से हटा सकते हैं । इस के रूप में इस अन्वेषक पूरी प्रक्रिया को दोहराने की आवश्यकता होगी गोली त्यागने से बचें ।
नोट: आरएनए गोली इस कदम पर कम कॉम्पैक्ट है और आगे बढ़ने के लिए जाता है । आरएनए खोने से बचने के लिए इस बिंदु पर गोली हैंडलिंग जब अतिरिक्त सावधान रहना.
4. प्रतिलिपि बहुतायत का विश्लेषण
- एक spectrophotometer का उपयोग कर पवित्रता के लिए आरएनए और जांच आरएनए ।
नोट: २६० एनएम के लिए २८० एनएम में अवशोषक के अनुपात आरएनए के लिए लगभग २.० होना चाहिए । - 1% agarose जेल या एक समकक्ष प्रौद्योगिकी के साथ आरएनए का विश्लेषण करने के लिए क्षरण की हद तक कल्पना ।
नोट: दो स्पष्ट बैंड 18S और 28S rRNA का प्रतिनिधित्व स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए (चित्रा 4) । यदि ये बैंड दिखाई नहीं दे रहे हैं, आरएनए नीचा किया जा सकता है । मुसीबत आरएनए क्षरण के लिए शूटिंग युक्तियां चर्चा में प्रदान की जाती हैं । - microarrays15, आरएनए-Seq16, वास्तविक समय qPCR17, या उत्तरी दाग18का उपयोग कर नुकीला-आंतरिक मानक के साथ तुलना में आरएनए के एकत्र aliquots में प्रतिलिपि बहुतायत मॉनिटर ।
- प्रत्येक प्रतिलिपि के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर एक नुकीला-ज्ञात बहुतायत के नियंत्रण में के साथ तुलना में बहुतायत का निर्धारण ।
नोट: microarrays के लिए, मानों प्रतिदीप्ति तीव्रता होगी । उत्तरी दाग के लिए, एक्स-रे फिल्म पर बैंड मात्रा जा सकता है । वास्तविक समय qPCR के लिए, प्रतिलिपि बहुतायत 2-σσCटी विधि19के साथ ज्ञात मानकों के साथ तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । आरएनए-Seq के लिए, सामान्यीकृत मान FPKM के रूप में निर्धारित किया जा सकता है या प्रति दस लाख पढ़ता एक्सॉन के kilobase प्रति अंशों. isoform-विशिष्ट क्षय दर के लिए, आरएनए-Seq डेटा DEXSeq20के रूप में isoform सजग तरीके का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । Isoform-विशिष्ट क्षय दर सबसे अच्छा आरएनए-Seq के साथ निर्धारित कर रहे हैं । यदि वे microarray डेटा के साथ निर्धारित किए जाने हैं, तो डेटा की जांच-जांच के आधार पर एक जीन द्वारा जीन आधार के बजाय विश्लेषण किया जाना चाहिए । विश्लेषक जांच की एक सीमित संख्या से जानकारी की व्याख्या करते समय सावधान रहना चाहिए । उदाहरण के लिए, वहां 5 या कम जांच है कि एक विशेष isoform के बारे में जानकारीपूर्ण रहे है हो सकता है । इस मामले में, विश्लेषक यह निर्धारित करने की आवश्यकता होगी कि क्या इन जांचों का व्यवहार पर्याप्त रूप से संगत है ताकि परिणाम विश्वसनीय हों ।
- प्रत्येक प्रतिलिपि के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर एक नुकीला-ज्ञात बहुतायत के नियंत्रण में के साथ तुलना में बहुतायत का निर्धारण ।
- एकत्र नमूनों में अलग आरएनए17 पर वास्तविक समय qPCR प्रदर्शन तेजी से क्षय जीन का विश्लेषण करने के लिए, सी-Myc और GAPDH तरह एक धीरे क्षय जीन की तरह, विश्वास है कि प्रतिलिपि क्षय दरों सही पाया गया था लाभ ।
नोट: आगे की पुष्टि के लिए, isoform-विशिष्ट वास्तविक समय qPCR जांच विकसित किया जा सकता है और समय के साथ विशिष्ट isoforms की बहुतायत पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया21.
5.क्षय दर निरंतर दृढ़ संकल्प
- प्रत्येक timepoint के लिए, लॉग-प्रत्येक प्रतिलिपि (जीन विशिष्ट या isoform-विशिष्ट) के लिए बहुतायत मूल्यों रूपांतरण ।
नोट: लॉग-मूल्यों बदलने घातीय क्षय घटता लाइनों है कि एक रैखिक क्षय मॉडल के साथ फिट किया जा सकता है करने के लिए बदल जाएगा22। - प्रत्येक प्रतिलिपि के लिए अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल फ़िट (जीन विशिष्ट या isoform-विशिष्ट) एक रैखिक क्षय मॉडल के लिए । इस तरह के एक मॉडल के लिए फार्मूला एफ (टी) = सी-आर * टी है । इस समीकरण में, सी एक निरंतर है कि एक प्रतिलिपि की शुरूआती राशि का प्रतिनिधित्व करता है, आर गिरावट की दर है, और टी प्रयोग की शुरुआत के बाद से समय है । इस समीकरण से, के रूप में क्षय दर का निर्धारण r * ln (10) (संदर्भ11देखें) ।
नोट: maSigPro सॉफ्टवेयर पैकेज समय पाठ्यक्रम डेटा23में महत्वपूर्ण जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल अंतर का पता लगाने के लिए बनाया गया एक प्रतिगमन आधारित दृष्टिकोण है । नमूना कोड और maSigPro के लिए परिणाम पर उपलब्ध हैं: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf । - एक लॉग-रेखीय क्षय मॉडल फिट करने के लिए असफल जीन बाहर फिल्टर. यह एक ANOVA एफ परीक्षण के साथ पूरा किया जा सकता है ।
नोट: एफ परीक्षण नमूने के भीतर भिन्नता से विभाजित नमूना साधन के बीच भिन्नता के रूप में परिभाषित किया गया है, जो एफ-आँकड़ों पर आधारित है. p-मानों को एक से अधिक तुलना के लिए सही रेखीय step-up Benjamini और Hochberg गलत खोज प्रक्रिया24लागू कर रहा है । एक q-F-परीक्षण के साथ ०.०५ से अधिक मूल्य जीन है कि एक लॉग रेखीय क्षय मॉडल फिट करने के लिए असफल के लिए एक कटऑफ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । - एक स्पष्ट सेल चक्र की स्थिति और समय के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत शब्द के साथ टेप निर्धारित करने के लिए एक ANOVA एफ परीक्षण प्रदर्शन (झूठी डिस्कवरी दर, एफडीआर & #60; ०.०५) ।
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Representative Results
हम पहले proliferating और संपर्क में प्रतिलिपि क्षय दर के microarray विश्लेषण के परिणामों की सूचना दी है एक 8 घंटे का समय पाठ्यक्रम12पर प्राथमिक मानव fibroblasts बाधित । प्रतिलिपि में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ जीन की एक सूची proliferating और संपर्क की तुलना स्थिरता-बाधित fibroblasts अनुपूरक तालिका 1में प्रदान की जाती है । प्रतिदीप्ति समय शूंय पर और ActD उपचार के बाद एक समय पाठ्यक्रम पर तीव्रता प्रदान की जाती हैं । जीन proliferating और संपर्क में काफी अलग ढलान है कि जीन का निर्धारण करके सूची में शामिल किया गया एक ANOVA एफ परीक्षण का उपयोग कर स्थितियों को बाधित । proliferating और quiescent fibroblasts में विभिन्न क्षय दर के साथ जीन के उदाहरण चित्रा 5में दिखाए जाते हैं.
चित्र 1 : ActD समय पाठ्यक्रम विश्लेषण के लिए proliferating और संपर्क-बाधित प्लेटों की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । ActD उपचार के लिए कक्षों की संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए आवश्यक चरणों का दिन-दर-दिन वर्णन प्रदान किया गया है, यह मानते हुए चार timepoints का समय पाठ्यक्रम के लिए उपयोग किया जाएगा. सादगी के लिए, एक थाली प्रति timepoint दिखाया गया है, लेकिन अतिरिक्त प्लेटें जैविक प्रतिकृति उत्पन्न करने के लिए जोड़ा जा सकता है । यदि चार से अधिक timepoints वांछित हैं तो प्रोटोकॉल को कक्षों की अधिक प्लेटों को जोड़ने के लिए भी समायोजित किया जा सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : योजनाबद्ध ActD समय पाठ्यक्रम और quiescent में क्षय दर गणना proliferating मानव fibroblasts की तुलना में. mRNAs के एक transcriptional अवरोध करनेवाला के साथ उपचार के बाद एक काल्पनिक प्रतिलिपि के लिए समय पर शेष की उंमीद अंश दिखाया गया है । नीचे, समय के साथ शेष mRNA के अंश का नमूना भूखंड जीन है कि proliferating कोशिकाओं की तुलना में अधिक quiescent में स्थिर है के लिए प्रदान की जाती हैं, और जीन है कि quiescent कोशिकाओं की तुलना में proliferating में अधिक स्थिर हैं । प्रत्येक datapoint के लिए, केवल एक ही मान स्पष्टता के लिए दिखाया गया है । वास्तविक प्रोटोकॉल में, प्रत्येक timepoint के लिए तीन datapoints होगा । यह आंकड़ा एलिजाबेथ Pender जॉनसन की उसकी सहमति से पीएच. थीसिस से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : मिश्रण phenol के फोटोग्राफ-guanidine isothiocyanate रिएजेंट और क्लोरोफॉर्म से पहले और बाद के केंद्रापसारक । मिश्रण जब phenol-guanidine isothiocyanate रिएजेंट और क्लोरोफॉर्म शुरू में संयुक्त कर रहे हैं, मिश्रण के बाद और केंद्रापसारक के बाद दिखाया गया है । के बाद मिश्रण केंद्रापसारक है, नीचे चरण, जो लाल है, कार्बनिक चरण है । बीच में एक चरण सफेद और बादल है । शीर्ष चरण जलीय चरण है और यह स्पष्ट है । आरएनए जलीय चरण में है, जो वर्षण के लिए एक पिपेट के साथ एकत्र किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : आरएनए गुणवत्ता की निगरानी के लिए नमूना आरएनए जेल । एक आरएनए बरकरार आरएनए के साथ नमूने दिखा जेल का एक उदाहरण । अक्षुण्ण आरएनए 28S और 18S rRNAs के लिए प्रमुख बैंड है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5 : proliferating बनाम quiescent fibroblasts में विभिन्न क्षय दरों के साथ जीन के उदाहरण. प्रतिदीप्ति तीव्रता (जीन अभिव्यक्ति) समय के साथ चार जीन है कि proliferating बनाम quiescent fibroblasts में अलग क्षय के लिए दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
अनुपूरक तालिका 1: जीन-विशिष्ट प्रतिदीप्ति proliferating और quiescent fibroblasts में तीव्रता। डेटा समय शूंय के लिए और proliferating और संपर्क में ActD उपचार के बाद एक समय पाठ्यक्रम पर प्रदान की जाती है-बाधित fibroblasts । P मान, q मान, और गलत खोज दर प्रदान किए गए हैं । तालिका BMC जीनोमिक्स12में अपने मूल प्रकाशन से पुनर्मुद्रित है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
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Discussion
weak mitogens या सीरम, सेल आसंजन की कमी, और संपर्क निषेध की वापसी सहित बाहरी संकेतों से प्रेरित किया जा सकता है । संपर्क निषेध, weak उत्प्रेरण के लिए एक से अधिक संभव तरीकों में से एक, सेल के लिए सेल संपर्क के जवाब में कोशिकाओं प्रफलन सेल चक्र से बाहर निकलने के लिए एक अत्यधिक evolutionarily संरक्षित प्रक्रिया है । हम weak प्रेरित करने के लिए एक विधि का एक उदाहरण के रूप में संपर्क निषेध पर यहां ध्यान केंद्रित । पिछले अध्ययनों ने बताया है कि सेल-सेल संपर्क microRNA उत्पत्ति25को प्रभावित कर सकता है, इस प्रकार, परिणाम एक weak विधि पर जानकारी प्रदान करते हैं और अतिरिक्त अध्ययनों से यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक है कि कौन-से परिवर्तन weak से जुड़े हैं प्रति se।
हम प्राथमिक मानव द्विगुणित fibroblasts कि हम नवजात त्वचा से अलग किया करते थे । हमने fibroblasts के साथ इन प्रयोगों को शुरू किया था जो 10 बार से कम समय बीतने वाले थे । हम बाद में त्याग-गद्यांश fibroblasts क्योंकि वे senesce. हालांकि इस प्रोटोकॉल proliferating और quiescent अधययन fibroblasts पर केंद्रित है, वर्णित प्रक्रियाओं कोशिकाओं के विभिंन प्रकार में और विभिंन परिस्थितियों में क्षय दर की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
हम निगरानी mRNA क्षय दर जीनोम-व्यापक एक प्रतिलेखन बंद समय पाठ्यक्रम का उपयोग कर । बंद समय पाठ्यक्रम mRNA प्रतिलेखन से mRNA क्षय युग्मन के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि है क्रम में mRNA आधा जीवन1,26की गणना करने के लिए । विधि में यहां वर्णित है, ActD, एक दवा है कि बी के साथ परिसरों-आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय के बढ़ाव ब्लॉक करने के लिए डीएनए के रूप, mRNAs के प्रतिलेखन को गिरफ्तार करने के लिए प्रयोग किया जाता है27। दर है कि एक 8 घंटे के समय अवधि में बहुतायत में कमी की है प्रतिलिपि क्षय दर के रूप में निर्धारित किया जा सकता है ।
प्रतिलिपि की निगरानी के लिए ActD आधारित दृष्टिकोण की एक महत्वपूर्ण सीमा है कि ActD वैश्विक प्रतिलेखन, जो ' कोशिकाओं व्यवहार्यता को प्रभावित करेगा रोकता है । यह ध्यान में रखा जाना चाहिए जब ActD आधारित डेटा की व्याख्या, क्षय दरों के रूप में निर्धारित किया जा रहा है कोशिकाओं है कि अधिक अपने पैतृक राज्य की तुलना में जोर दिया जा रहा है । एक अंय महत्वपूर्ण चिंता यह है कि ActD के प्रभाव विभिंन राज्यों में कोशिकाओं के लिए अलग हो सकता है, proliferating बनाम संपर्क-बाधित fibroblasts सहित । ActD उपचार के दुष्प्रभाव को कम करने के लिए एक दृष्टिकोण अवधि में कम समय पाठ्यक्रमों रखने के लिए है । इस कारण से, हम एक 8 ज समय पाठ्यक्रम का चयन किया ।
वहां की निगरानी के लिए ActD के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण है प्रतिलेखन क्षय दर28,29। तापमान के साथ खमीर उपभेदों-संवेदनशील आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय alleles के लिए प्रतिलेखन क्षय की दर पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है30. इस दृष्टिकोण पर एक भिंनता बुलाया "लंगर दूर" खमीर में इस्तेमाल किया गया है rapamycin उपचार के जवाब में आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय की सशर्त कमी को प्राप्त करने के लिए31,३२। यह भी सक्रिय प्रतिलेखन के साथ कोशिकाओं में क्षय की निगरानी संभव है । उदाहरण के लिए, thio-प्रतिस्थापित uracil न्यूक्लियोटाइड कोशिकाओं में पेश किया जा सकता है, mRNA में शामिल है, और बाद में३३,३४,३५का पता लगाया । इस दृष्टिकोण के साथ, दर जिस पर अलग टेप संश्लेषित कर रहे है कोशिकाओं है कि mRNA संश्लेषित करने के लिए जारी कर रहे है में निर्धारित किया जा सकता है । इस तरह के दृष्टिकोण ActD उपचार पर एक महत्वपूर्ण लाभ है क्योंकि वे विषाक्त नहीं कर रहे हैं । हमारे अनुभव में, तथापि, वहां इन तरीकों के साथ टेप की वसूली में परिवर्तनशीलता हो सकता है । ActD उपचार प्रतिलिपि क्षय की निगरानी के लिए एक सीधा और प्रतिलिपि दृष्टिकोण है ।
प्रदान की प्रोटोकॉल में कुछ कदम इसकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । एक महत्वपूर्ण मुद्दा शाही सेना अलगाव के दौरान आरएनए क्षरण को रोकने है । ४.१ कदम पर, आरएनए गिरावट के लिए निगरानी की जानी चाहिए । यदि आरएनए 18S और 28S rRNAs (चित्रा 4) के लिए दो स्पष्ट चोटियों शामिल नहीं है, यह एक संकेत है कि प्रतिलिपि क्षरण हुआ है । कुछ उपकरणों 1 से 10 तक लेकर आरएनए अखंडता संख्या (रिण) स्कोर प्रदान करते हैं. 7-10 रेंज में रिण स्कोर के साथ नमूने आगे विश्लेषण के लिए स्वीकार्य हैं । यदि आरएनए नीचा है, तो आरएनए क्षरण को रोकने के लिए अधिक सावधानी बरतना ज़रूरी है, जैसे कि यह सुनिश्चित करना कि समाधान और sterileware RNase-फ़्री हैं और आरएनए के लिए पिपेट हैंडलिंग करते समय दस्ताने पहने जाते हैं । पानी ०.१% diethyl pyrocarbonate (DEPC) के साथ इलाज किया जा सकता है, ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 2 ज के लिए मशीन, और कम से 15 मिनट के लिए autoclaved. नोट DEPC-आधारित बफ़र्स के साथ Tris उपयोग नहीं किया जा सकता । RNase प्रदूषित समाधान भी काम सतहों, केंद्रापसारक, और पिपेट से RNase को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और reएजेंट है कि बाधित RNases नमूनों को जोड़ा जा सकता है ।
एक और महत्वपूर्ण कदम phenol-guanidine isothiocyanate समाधान के चरणों की जुदाई है । यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि केवल शीर्ष चरण आरएनए प्रसंस्करण के लिए एकत्र किया जाता है । यदि परिणामी आरएनए अवशिष्ट phenol शामिल है, २३०, २६०, और २८० एनएम पर अवशोषित का अनुपात 1:2:1 अनुपात में अपेक्षा के अनुरूप नहीं होगा । २३० एनएम पर उंमीद अवशोषक से अधिक phenol संदूषण का संकेत कर सकते हैं । यदि ऐसा होता है, आरएनए इथेनॉल फिर से उपजी और किसी भी अवशिष्ट phenol को दूर करने के लिए कई अतिरिक्त समय धोया जा सकता है ।
अंत में, जब आरएनए गोली और supernatant हटा दिया जाता है, गोली चिपचिपा, पतली, और आसानी से परेशान किया जा सकता है । इस बिंदु पर, यह करने के लिए बंद तरल लेने में अतिरिक्त ध्यान रखना जरूरी है । यह अच्छा प्रकाश के साथ ट्यूब कल्पना करने के लिए गोली का पता लगाने और सुनिश्चित करें कि यह परेशान नहीं है महत्वपूर्ण हो सकता है । जोड़ा गया ग्लाइकोजन को सुनिश्चित करने के लिए गोली इस बिंदु पर दिखाई दे रहा है मदद कर सकते हैं ।
क्षय के समय पाठ्यक्रम के लिए समय बिंदुओं का चयन भी एक महत्वपूर्ण मुद्दा है विचार करना. जबकि चार timepoints हम चयनित हमें १०,००० से अधिक जीन के लिए क्षय की निगरानी के लिए अनुमति दी, कुछ जीन 8 घंटे के पाठ्यक्रम के दौरान काफी क्षय नहीं किया । यदि कम रहता है टेप एक उच्च प्राथमिकता है, जांचकर्ताओं को अतिरिक्त नमूना संग्रह जोड़ने के लिए चाहते हो सकता है १२० मिनट से पहले, उदाहरण के लिए 30 मिनट में । लंबे समय तक रहने वाले टेप के बेहतर आकलन के लिए, जांचकर्ताओं को बाद में timepoints अतिरिक्त नमूना संग्रह जोड़ने के लिए चाहते हो सकता है ।
एक अंय संभावित समस्या परिणाम हो सकता है यदि क्षय दर अपेक्षित वितरण का पालन नहीं है । उदाहरण के लिए, वहां भी कई या बहुत कुछ हो सकता है एक लॉग रैखिक क्षय दर 8 घंटे से अधिक दिखा जीन । यदि ऐसा होता है, यह जीन है कि कम या लंबे समय के लिए जाना जाता है की क्षय दरों पर नजर रखने में सहायक है क्रम में निर्धारित करने के लिए कि क्या वे अपेक्षित पैटर्न का पालन करें ।यदि जीन एक सकारात्मक बजाय समय के साथ नकारात्मक ढलान है, वे और विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है के रूप में वे एक लॉग-रेखीय क्षय दर प्रदर्शित नहीं करते । एक अंतिम मुद्दा पैदा अगर दो स्थितियों में कोशिकाओं की तुलना में किया जा रहा है बहुत अलग प्रतिक्रियाओं ActD ऐसी है कि कई जीन एक हालत में तेजी से क्षय हो सकता है । इस मामले में, यह न केवल दो राज्यों के बीच क्षय दर में अंतर को संदर्भित करने के लिए मददगार हो सकता है, लेकिन यह भी स्पाइक में नियंत्रण है कि हम आरएनए अलगाव से पहले सहित सुझाव है कि दो राज्यों में पूर्ण क्षय दर के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए ।
proliferating और quiescent कोशिकाओं या किसी भी दो समान राज्यों के बीच प्रतिलिपि क्षय दर की निगरानी करने की क्षमता शारीरिक परिवर्तन को विनियमित करने में प्रतिलिपि क्षय के महत्व में और अधिक जानकारी प्रदान करने के लिए क्षमता है । आवेदन के साथ और oncogenic सक्रियण, पहले और बाद वार्धक्य या वायरल संक्रमण के बिना, के साथ और एक विशिष्ट जीन के पछाड़ना के बिना, या भेदभाव के दो विभिंन राज्यों में कोशिकाओं को शामिल हैं । निष्कर्ष आरएनए-Seq के साथ युग्मित किया जा सकता है isoform के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए-प्रतिलिपि क्षय दरों में विशिष्ट परिवर्तन है, जो isoform अभिव्यक्ति में परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है के रूप में कोशिकाओं को शारीरिक संक्रमण से गुजरना ।
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Disclosures
लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी हितों का खुलासा नहीं है.
Acknowledgments
HAC रीता एलेन फाउंडेशन (http://www.ritaallenfoundation.org) के मिल्टन ई. Cassel विद्वान थे । इस काम के लिए अनुदान से HAC को राष्ट्रीय जनरल चिकित्सा विज्ञान केंद्र के उत्कृष्टता अनुदान P50 GM071508 (P.I. डेविड Botstein), PhRMA फाउंडेशन ग्रांट 2007RSGl9572, नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट ओसीआई-१०४७८७९ से दाऊद अगस्त, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM081686, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM0866465, द एली & #38; Edythe व्यापक केंद्र के पुनर्अपक्षय चिकित्सा & #38; स्टेम सेल अनुसंधान, आईरिस खिचड़ी भाषा महिला स्वास्थ्य केंद्र के UCLA CTSI NIH ग्रांट UL1TR000124, और ल्यूकेमिया लिंफोमा सोसायटी । इस प्रकाशन में दी गई अनुसंधान सूचना राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के पुरस्कार संख्या P50CA092131 के अंतर्गत समर्थित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । HAC का सदस्य है एली & #38; Edythe व्यापक केंद्र के पुनर्अपक्षय चिकित्सा & #38; स्टेम सेल अनुसंधान, ucla आणविक जीवविज्ञान संस्थान, और ucla Bioinformatics विभागीय कार्यक्रम ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
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