Summary
Les auteurs décrivent un protocole pour générer la prolifération et quiescentes fibroblastes dermiques humains primaires, surveillance des taux de décomposition de transcription et d’identifier les gènes différentiellement en décomposition.
Abstract
Quiétude est un état temporaire, réversible dans lequel les cellules ont cessé la division cellulaire, mais conservent la capacité à proliférer. Plusieurs études, y compris la nôtre, ont démontré que la quiescence est associée aux changements répandus dans l’expression des gènes. Certains de ces changements se produisent à travers des changements dans le niveau ou l’activité des facteurs associés à la prolifération de transcription E2F et MYC. Nous avons démontré que carie ARNm peut également contribuer aux changements dans l’expression des gènes entre les cellules prolifèrent et repos. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour établir les cultures de fibroblastes humains par voie cutanée prépuce proliférantes et repos. Nous décrivons ensuite les procédures permettant d’inhiber la nouvelle transcription dans des cellules proliférantes et repos avec l’actinomycine D (ActD). ActD traitement représente une approche simple et reproductible de dissociant nouvelle transcription de désintégration de la transcription. Un inconvénient du traitement ActD, c’est que le cours du temps doit être limité à un court laps de temps parce que ActD affecte la viabilité des cellules. Les niveaux de transcription sont surveillés au fil du temps afin de déterminer le taux de décroissance de transcription. Cette procédure permet l’identification des gènes et des isoformes qui présentent une carie différentielle chez prolifèrent par rapport aux fibroblastes quiescentes.
Introduction
Niveaux de l’état stationnaire de transcriptions reflètent la contribution de synthèse de transcription et de désintégration de la transcription. Réglementé et décomposition de transcription coordonnée est un mécanisme important pour contrôler les processus biologiques1,2,3,4. Par exemple, la vitesse de décomposition transcription ont démontré à contribuer à la série temporelle des événements après l’activation par le facteur de nécrose tumorale de cytokines inflammatoires5.
Nous avons déjà montré que la transition entre la prolifération et de la quiétude dans les fibroblastes humains primaires est associée aux changements dans les niveaux de transcription de nombreux gènes6. Certains de ces changements reflètent des différences dans l’activité de facteurs de transcription entre ces deux États.
Changements dans les taux de décroissance de transcription peuvent également contribuer à des changements dans le niveau d’expression d’un transcrit dans deux États différents7,8. D’après nos constatations antérieures que la transition entre la prolifération et la quiescence est associée aux changements dans les niveaux de multiples microARN9, nous avons demandé s’il y a également une contribution de désintégration de transcription différentielle dans les changements expression des gènes chez prolifèrent par rapport aux fibroblastes quiescentes.
Afin de contrôler la stabilité de la transcription, nous avons déterminé le taux de décomposition des transcriptions Génome-large en proliférant versus cellules quiescentes. Pour ce faire, nous avons mesuré la vitesse de décomposition en proliférant versus quiescentes fibroblastes en introduisant un inhibiteur de la nouvelle transcription et surveillance de la fréquence à laquelle des relevés de notes individuels ont disparu au fil du temps. L’avantage de cette approche est que, comparativement aux méthodes qui surveillent tout simplement l’expression des gènes globale, en inhibant la synthèse nouvelle transcription, nous serons en mesure de déterminer la vitesse de décroissance de ces transcriptions indépendamment de la vitesse à laquelle ils doivent transcription de l’acte.
ActD traitement d’inhiber la nouvelle transcription et déterminer le taux de décroissance de transcription a été appliqué avec succès dans plusieurs études antérieures. ActD a été utilisé pour disséquer l’importance de la stabilité du RNA dans les changements dans l’abondance de transcription qui résultent d’un traitement par des cytokines pro-inflammatoires,5. Une approche similaire a également servie à disséquer les différences dans les taux de décroissance de transcription en multiplient par rapport aux cellules C2C12 différenciées qu’ils adoptent un muscle différenciée phénotype10. Comme autre exemple, global mRNA demi-vies ont également été détectés dans pluripotentes et11des cellules souches embryonnaires de souris différenciées. Dans ces exemples, dégradation de l’ARNm s’est avérée être important pour réglementer l’abondance de la transcription et la transition de cellules à cellules différents États.
Appliquant les méthodes décrites ci-dessous, nous avons découvert changements dans les taux de décroissance de transcription dans environ 500 gènes lorsque l'on compare les fibroblastes prolifèrent et quiescentes États12. En particulier, nous avons découvert que les cibles des miARN miR-29, qui est diminuée dans les cellules quiescentes, sont stabilisés lorsque des cellules de transition de quiescence. Nous décrivons ici la méthodologie que nous permet de déterminer la vitesse de décomposition dans les cellules prolifèrent et repos. Cette méthode est utile pour comparer global taux de décomposition des ARNm dans deux distincts mais comparables si l'on cherche des informations sur la décomposition rapide des gènes. Il pourrait également être utilisé pour traiter d’autres questions telles que l’effet des conditions de culture cellulaire sur la décomposition de transcription, par exemple, en deux dimensions par rapport à trois dimensions cultures. La vitesse de décomposition peut être déterminée Génome-large avec des méthodes telles que les puces ou RNA-Seq. alternativement, en temps réel qPCR ou Northern blot peut être utilisé pour déterminer le taux de décomposition sur une base de gène par gène ou isoform-par-isoforme. Ces taux permet ensuite de calculer la demi-vie de chaque gène surveillé et d’identifier les gènes avec des taux de décomposition qui sont différents dans les deux conditions.
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Protocol
Toutes les expériences décrites ont été approuvées par les comités de révision institutionnelle à l’Université de Princeton et l’Université de Californie, Los Angeles.
1. Préparez les fibroblastes prolifèrent et inhibées par Contact décours temporel ActD
Remarque : Ce protocole utilise un timecourse avec quatre points. Trois échantillons biologiquement indépendants peuvent être collectées par validant en recueillant des plaques de culture de tissus différents dans une expérience, ou l’expérience peut être répétée plusieurs fois avec différentes cultures de cellules. Dans notre expérience, un plat de culture de tissu de 10 cm (diamètre) (une plaque) fournit RNA suffisante pour l’analyse. Si nécessaire, plusieurs plats de culture de tissus peuvent être mis en commun pour chaque échantillon d’augmenter le nombre de cellules à chaque validant. En outre, la même expérience peut être effectuée avec fibroblastes isolées de différents individus comme réplique biologique réellement indépendante.
- Établir proliférantes et repos des cultures de cellules pour l’analyse de désintégration de transcription. Pour les cellules en prolifération, fractionner les cellules de tous les trois jours alors que les cellules inhibées par contact deviennent inhibées par contact.
- Pour les cellules inhibées par contact, changer le milieu tous les 2 jours pendant 7 jours. Fractionner les cellules en prolifération 2 jours avant que les fibroblastes contact inhibées sont prêts pour la collection. Un exemple d’un système de culture cellulaire est illustré à la Figure 1. Les étapes restantes de cette section fournissent un protocole détaillé pour l’établissement et la Division des cellules.
- Isoler des fibroblastes dermiques primaires de peau néonatale selon les protocoles établis,13. Fibroblastes de passage pour assurer une population homogène.
Remarque : Les fibroblastes peuvent être congelés et décongelés, si nécessaire. - Fondre ou replate des fibroblastes, si nécessaire. Cultiver des fibroblastes en DMEM avec 10 % de sérum dans des conditions stériles dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C et 5 % de CO2. Utilisez les fibroblastes qui ont été cultivés pour moins de 10 passages. Fibroblastes devraient être < confluente de 80 % le jour de fractionnement de cellules pour rendre les populations proliférantes et repos.
- Pour fractionner une plaque de culture tissulaire en plusieurs plaques, Préchauffer le PBS, la trypsine et support avec du sérum dans un bain-marie à 37 ° C pendant 20 min.
- Aspirer ou utilisez une pipette pour retirer le support de chaque plaque de culture tissulaire avec des cellules pour être replaquées.
- Pipette PBS chaude dans chaque assiette (10 mL de solution pour une plaque de 150 mm, de 5 mL de solution pour une plaque de 100 mm, de 2 mL pour un puits d’une 6 plaque puits) et 1 mL pour un puits d’une plaque bien 12.
- Aspirer ou pipette pour enlever les PBS de chaque plaque de culture de tissus.
- Doucement la pipette 1 x trypsine-EDTA sur chaque plaque (8 mL de solution pour une plaque de 150 mm, 3 mL de solution pour une plaque de 100 mm, 2 mL pour un puits d’une plaque 6 puits et 1 mL pour un puits d’une plaque bien 12).
Remarque : Veillez à 1 x trypsine-EDTA en diluant stérile 10 x la trypsine-EDTA dans du PBS stérile. La solution finale 1 x devrait être EDTA de trypsine et 0,02 % 0,05 %. - Incuber la trypsine avec cellules pendant 5 min.
- Tapoter légèrement la plaque pour déloger les cellules de la plaque.
- Pipette pour remettre en suspension les cellules en suspension monocellulaire.
- Transférer des cellules dans une solution de trypsine dans un tube conique contenant le même volume de DMEM avec 10 % de sérum (8 mL de solution pour une plaque de 150 mm, 3 mL de solution pour une plaque de 100 mm, 2 mL pour un puits d’une plaque 6 puits et bien sur plaque de 1 mL pour un puits de 12).
- Tournez les cellules à 4 ° C pendant 5 minutes à 1 000 g pour enlever la trypsine.
- Remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de médium et comptent avec un Hémacytomètre afin de déterminer la concentration cellulaire.
- Graines de 5 x 105 cellules par plaque de vitroplants de 100 mm pour proliférer et inhibées par contact des cellules.
- En utilisant cette méthode, établir les échantillons proliférantes et inhibées par contact requis pour l’analyse (Figure 1).
2. évolution temporelle de l’ActD
- Resuspendre ActD à une stock concentration de 1 mg/mL (pour 1 mg de ActD, utilisation 950 µL de PBS stérile et 50 µL de DMSO stérile).
Remarque : Les solutions mères congelées de ActD devraient être stables pendant un mois à-20 ° C. Solutions diluées doivent être jetées et pas stockées pour une utilisation ultérieure. - Ajouter ActD au volume approprié du milieu préchauffée pour la culture biologique cellulaire répétées toutes les plaques qui ont été mis en place pour le 0, 120, 240 et 480 min h (Figure 2). Ajouter ActD à une concentration de 15 µg / mL de milieu. Bien mélanger, aspirer hors milieu vieux et ajouter le milieu contenant ActD aux cellules.
- Pour un stock de 1 mg/mL, ajouter 15 µL ActD pour chaque mL de milieu, par exemple, pour 10 mL de milieu pour une plaque de 100 mm, ajouter 150 µL ActD.
- Pour recueillir l’échantillon de validant zéro, aspirez doucement hors l’ActD moyen et pipette préchauffé PBS sur les cellules. Pipette 10 mL de solution pour une plaque de 150 mm, 5 mL de solution pour une plaque de 100 mm, 2 mL pour un puits d’une plaque 6 puits et 1 mL pour un puits d’une plaque bien 12.
- Aspirer doucement ou pipette hors du PBS.
Remarque : Toutes les étapes impliquant les ARN devraient être effectuées avec eau exempte de RNase, tubes de microcentrifuge RNase-libre et exempte de RNase pipettes. Gants doivent être portés et changés fréquemment lorsque vous travaillez avec de l’ARN. - Ajouter solution de phénol-guanidine isothiocyanate (1 mL/10 cm plaque avec 4 x 10,5 , 4 x 107 cellules) directement sur la plaque de culture de tissus.
NOTE : Phénol-guanidine isothiocyanate solution est une solution de monophasique qui maintient la qualité de RNA tout en lysant des cellules et en séparant les ARN, ADN et protéines de l’autre.
ATTENTION : L’isothiocyanate de phénol et de guanidine sont corrosifs. Utilisez une protection appropriée. - Pipette le phénol-guanidine isothiocyanate solution-cellule mélange monter et descendre plusieurs fois de faire un mélange homogène.
NOTE : Solution d’isothiocyanate de phénol-guanidine lysate peut être conservée à 4 ° C durant la nuit ou à-20 ° C pendant un an. - Collecter chaque point dans le temps après que le laps de temps approprié est passé à l’aide de la méthode décrite dans les étapes 2,3-2,6.
3. l’isolement d’ARN Total de phénol-guanidine Isothiocyanate Solution lysat
- Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 5 min assurer la dissolution complète des complexes ARN-protéine.
Remarque : Les étapes du protocole solution phénol-guanidine isothiocyanate peuvent être effectuées à la température ambiante à moins d’indication contraire. - Introduire des transcriptions de spike-in de contrôle qui peuvent être décelées à la méthodologie utilisée.
Remarque : L’externe RNA control consortium (SCGDE) contrôle spike à mix14 a été spécialement conçu comme un contrôle du pic pour RNA-Seq. Il peut être également utilisé pour Northern blots ou qPCR en temps réel. Spike-dans les contrôles spécialement conçus pour microarray technologies sont également disponibles (voir la Table des matières).
Remarque : Après la rotation initiale, l’échantillon devrait séparer en 3 couches - une couche organique rouge au bas, une interphase blanc/rose au milieu et une couche aqueuse limpide sur la partie supérieure (Figure 3).
Remarque : Veillez à ne pas déranger l’interphase au cours de ce processus. C’est OK de laisser certains de la fraction aqueuse. Il est préférable de laisser certaines de la fraction aqueuse que pour inclure certains des couches interphase, comme notamment l’interphase couche contaminerait l’ARN à l’ADN. La couche aqueuse sera environ la moitié de son volume initial, donc environ 0,9 mL si le mélange de solution/chloroforme de l’isothiocyanate de phénol-guanidine était de 1,8 mL.
Remarque : Cela se traduira dans un culot dense et solid qui est facile à suivre après les étapes de spin qui suivent.
Remarque : Un embout de la pipette lâche qui s’est tenu dans la main peut être utilisé pour enlever l’excès d’éthanol. Si la pastille de RNA est perturbée, mais pas mis au rebut, l’enquêteur peut répéter le spin et éliminer le surnageant à nouveau. Éviter de jeter le culot qu’il faudra pour l’enquêteur de répéter l’ensemble de la procédure.
Remarque : Le culot de RNA est moins compact à cette étape et a tendance à bouger. Soyez très prudent lorsque vous manipulez le culot à ce stade pour éviter de perdre de l’ARN.
4. analyse de l’abondance de transcription
- Quantifier le RNA et vérifier la RNA pureté à l’aide d’un spectrophotomètre.
NOTE : Le rapport de l’absorbance à 260 nm à 280 nm devrait être approximativement 2.0 pour l’ARN. - Analyser les RNA avec un gel d’agarose à 1 % ou une technologie équivalente pour visualiser l’étendue de la dégradation.
Remarque : Deux efface bandes représentant 18 s et ARNr 28 s devrait être clairement visible (Figure 4). Si ces bandes ne sont pas visibles, l’ARN peut-être être altérée. Conseils de prise de vue trouble pour la dégradation de l’ARN sont fournis dans la Discussion. - Moniteur transcription abondance dans les aliquotes recueillies de l’ARN par rapport aux dopés dans étalon interne à l’aide de puces à15, RNA-Seq16, qPCR en temps réel17ou Northern blots18.
- Déterminer l’abondance pour chaque relevé de notes à chaque point dans le temps par rapport à un contrôle pointu d’abondance connue.
Remarque : Pour les puces, les valeurs seront intensités de fluorescence. Pour les taches du Nord, bandes sur la radiographie peuvent être quantifiés. Pour qPCR en temps réel, abondance de transcription peut être déterminée par comparaison avec des normes connues avec la méthode 2 duT - σσC19. Pour RNA-Seq, valeurs normalisées peuvent être déterminées comme FPKM ou fragments par kilobases de l’exon par million lectures mappé. Pour la vitesse de décomposition de l’isoforme spécifique, RNA-Seq données peuvent être analysées conformément aux méthodes prenant en charge isoform comme DEXSeq20. Taux de décroissance de l’isoforme spécifique sont mieux déterminées avec RNA-Seq. Si elles sont établies avec les données microarray, puis les données doivent être analysées sur une base de par-sonde plutôt que sur une base de gène par gène. L’analyste doit être prudent dans l’interprétation des informations provenant d’un nombre limité de sondes. Par exemple, il peut y avoir des sondes 5 ou moins qui ont un caractère informatifs sur une isoforme particulière. Dans ce cas, l’analyste devra déterminer si le comportement de ces sondes est une cohérence suffisante afin que les résultats sont fiables.
- Déterminer l’abondance pour chaque relevé de notes à chaque point dans le temps par rapport à un contrôle pointu d’abondance connue.
- Effectuer en temps réel qPCR RNA isolés17 dans les échantillons collectés pour analyser les gènes rapidement en décomposition, comme c-Myc et un gène lentement en décomposition comme GAPDH, gagner confiance cette désintégration de transcription taux ont été détectés avec précision.
Remarque : Pour une confirmation supplémentaire, isoforme spécifique en temps réel qPCR sondes peuvent être développés et utilisés pour surveiller l’abondance des isoformes spécifiques au fil du temps,21.
5.Détermination constante de désintégration taux
- Pour chaque validant, Journal-transformer les valeurs d’abondance pour chaque transcription (gène-spécifique ou isoforme spécifique).
NOTE : Log-transformer les valeurs convertira les courbes de décroissance exponentielle lignes qui peut être adapté avec une décroissance linéaire modèle22. - Correspondait au profil d’expression pour chaque relevé de notes (gène-spécifique ou isoforme spécifique) à un modèle de décroissance linéaire. La formule pour un tel modèle est f (t) = C - r * t. Dans cette équation, C est une constante qui représente le montant de départ d’une transcription, r est le taux de déclin, et t est le temps depuis le début de l’expérience. À partir de cette équation, déterminer la vitesse de décroissance comme r*ln(10) (voir référence11).
Remarque : Le logiciel maSigPro est une approche axée sur la régression visant à déceler des différences significatives gène expression profil temps cours données23. Exemples de code et de résultats pour maSigPro sont disponibles à : https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - Filtrer les gènes qui ne parviennent pas à s’adapter un modèle log-linéaire de décomposition. Ceci peut être accompli avec un test ANOVA F.
NOTE : le test F est basé sur la statistique F, qui est définie comme la variation entre la moyenne de l’échantillon divisée par la variation au sein d’échantillons. Corriger les valeurs de p pour les comparaisons multiples en appliquant le linéaire Step-Up Benjamini et Hochberg fausse découverte procédure24. Q-valeur supérieure à 0,05 avec le F-test peut être utilisé comme un seuil pour les gènes qui ne parviennent pas à s’adapter un modèle log-linéaire de décomposition. - Effectuer un test ANOVA F pour déterminer les transcriptions d’une durée d’une interaction significative entre une condition catégorique cycle cellulaire et l’heure (taux de fausse découverte, FDR < 0,05).
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Representative Results
Nous avons déjà rapporté les résultats d’analyses de microarray de taux de décroissance de transcription dans les fibroblastes humains primaires proliférantes et inhibées par contact sur un cours de 8 heures12. Une liste de gènes avec un changement important dans la stabilité de transcription en comparant les fibroblastes proliférants et inhibées par contact est fournie dans le Tableau complémentaire 1. Les intensités de fluorescence au temps zéro et sur un parcours de temps après le traitement ActD sont fournies. Gènes ont été inscrits sur la liste en déterminant les gènes qui ont significativement différentes pistes dans des conditions proliférantes et inhibées par contact à l’aide d’un test ANOVA F. Exemples de gènes avec des taux différents de décomposition dans les fibroblastes prolifèrent et repos sont indiquées à la Figure 5.
Figure 1 : Schéma du protocole pour l’établissement des plaques proliférantes et inhibées par contact pour analyse en cours temps ActD. Un jour après jour les mesures nécessaires pour mettre en place des cultures de cellules pour le traitement de l’ActD est décrit, en supposant que quatre points seront utilisés pour le cours du temps. Pour plus de simplicité, une plaque est montrée par validant, mais des plaques supplémentaires peuvent être ajoutés pour générer des réplicats biologiques. Le protocole peut également être ajusté pour ajouter plus de plaques de cellules si vous désirez plus de quatre points. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Représentation schématique du décours temporel ActD et désintégration taux calculs en repos par rapport à la prolifération des fibroblastes humains. La fraction prévue des ARNm restant au fil du temps pour une transcription hypothétique après que traitement avec un inhibiteur de la transcription est montré. En dessous, placettes de la fraction d’ADN messagère restant au fil du temps sont fournis pour les gènes qui sont plus stables en repos que les cellules en prolifération et les gènes qui sont plus stables dans la prolifération de cellules quiescentes. Chaque point de données, une seule valeur est prévue pour plus de clarté. Dans le protocole actuel, il y aura trois datapoints pour chaque validant. Ce chiffre a été modifié par la thèse de doctorat de Elizabeth Pender Johnson avec son consentement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Photographies de mélange phénol-guanidine isothiocyanate réactif et chloroforme avant et après centrifugation. Le mélange est indiqué lorsque le phénol-guanidine isothiocyanate réactif et le chloroforme sont initialement combinés, après le mélange et après centrifugation. Après que le mélange est centrifugé, la phase de bas, ce qui est rouge, est la phase organique. L’interphase au milieu est blanche et trouble. La phase supérieure est la phase aqueuse et c’est clair. L’ARN est dans la phase aqueuse, qui devrait être recueillie avec une pipette pour les précipitations. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Gel d’ARN de l’échantillon à contrôler la qualité de la RNA. Une illustration d’un gel d’ARN montrant des échantillons intacts ARN. RNA intact a des bandes pour l’ARNr 28 s et 18 s. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Exemples de gènes ayant des taux de désintégration différents en multiplient par rapport aux fibroblastes quiescents. Les intensités de fluorescence (expression des gènes) au fil du temps sont indiquées pour quatre gènes qui dégraderaient différemment en multiplient par rapport aux fibroblastes quiescentes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire tableau 1 : intensités de fluorescence de gène-spécifique dans les fibroblastes prolifèrent et repos. Les données sont des fibroblastes fournis pour temps zéro et sur un parcours de temps après un traitement ActD prolifèrent et inhibées par contact. Les valeurs de P, les valeurs de q et taux de fausse découverte sont fournis. Tableau est tiré de sa publication originale en BMC Genomics12. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Quiescence peut être induite par des signaux externes, y compris le retrait des mitogènes ou le sérum, le manque d’adhésion cellulaire et l’inhibition de contact. Inhibition de contact, un des plusieurs méthodes possibles pour induire la quiescence, est un processus hautement évolutives conservé dans lequel les cellules sortie prolifératif cycle cellulaire en réponse à un contact cellule-cellule. Nous nous concentrons ici sur l’inhibition de contact à titre d’exemple d’une méthode pour induire la quiescence. Des études antérieures ont rapporté que contact cellule-cellule peut affecter les microARN biogenèse25, donc, les résultats fournissent des informations sur une méthode de quiescence et des études supplémentaires sont nécessaires afin de déterminer quels changements sont associés à la quiescence soi.
Nous avons utilisé les fibroblastes diploïdes humains primaires que les auteurs ont isolé de peau néonatale. Nous avons entrepris ces expériences avec les fibroblastes qui ont été repiquées à moins de 10 fois. Nous écarter des fibroblastes de passage plus tard parce qu’ils vieillissent. Alors que ce protocole met l’accent sur des fibroblastes dermiques proliférantes et repos, les procédures décrites peuvent servir à surveiller les taux de décomposition dans différents types de cellules et dans des conditions différentes.
Nous avons suivi le mRNA decay tarifs Génome-large utilisant un cours arrêt temps de transcription. Cours de l’arrêt de temps sont la méthode la plus utilisée pour le découplage de dégradation des ARNm de la transcription de l’ARNm afin de calculer les ARNm demi-vie1,26. Dans la méthode décrite ici, ActD, un médicament que complexes avec la forme-B de l’ADN pour bloquer l’élongation de l’ARN polymérase II, sert à arrêter la transcription de l’ARNm27. Le taux qui diminuent les transcriptions en abondance sur une période de 8 heures peut être déterminé comme taux de décroissance de la transcription.
Une limitation importante des approches axées sur les ActD pour surveiller la désintégration de la transcription est que ActD empêche la transcription mondiale, qui aura une incidence sur la viabilité des cellules. Cela devrait garder à l’esprit lors de l’interprétation des données ActD, taux de carie étant établies dans les cellules qui sont plus stressés que leur état natif. Une autre préoccupation importante est que les effets de l’ActD peuvent être différentes pour les cellules de différents États, y compris les multiplient par rapport aux fibroblastes inhibées par contact. Une approche visant à minimiser les effets secondaires du traitement ActD consiste à garder la courte durée des cours à temps. Pour cette raison, nous avons choisi un cours de temps de 8 h.
Il y a des approches alternatives à ActD pour surveiller la transcription carie tarifs28,29. Les souches de levure avec thermosensibles RNA polymérase II des allèles ont été utilisés pour surveiller la transcription carie taux30. Une variante de cette approche, appelée « ancre-away » a été utilisée chez la levure pour atteindre l’épuisement conditionnel de l’ARN polymérase II en réponse à la rapamycine traitement31,32. Il est également possible de contrôler la carie dans les cellules avec transcription active. Par exemple, substitués thio uracile nucléotides peuvent être introduits dans les cellules, incorporé dans l’ARNm et détecté par la suite33,34,35. Avec cette approche, le taux au cours de laquelle sont synthétisées les transcriptions différentes peut être déterminé dans les cellules qui sont poursuivent à synthétiser des ARNm. Ces approches ont un avantage significatif sur ActD traitement parce qu’ils ne sont pas toxiques. Dans notre expérience, cependant, on peut la variabilité dans la récupération des transcriptions avec ces méthodes. ActD traitement est une approche simple et reproductible pour surveiller la désintégration de la transcription.
Quelques pas dans le protocole fourni sont critiques pour son succès. Une question importante empêche la dégradation de l’ARN au cours de l’ARN. Au point 4.1, l’ARN doit être surveillé pour la dégradation. Si l’ARN ne contient-elle pas deux pics clairs pour l’ARNr 18 s et 28 s (Figure 4), c’est un signe que la dégradation de la transcription s’est produite. Certains instruments fournissent des scores de RNA intégrité nombre (RIN) allant de 1 à 10. Échantillons avec des scores RIN dans la fourchette de 7 à 10 sont acceptables pour une analyse ultérieure. Si l’ARN se dégrade, il est important de prendre plus de précautions pour prévenir la dégradation de l’ARN, par exemple s’assurer que des solutions et sterileware sont exempts de RNase et que porter des gants lors de manipulation pipettes pour l’ARN. L’eau peut être prétraité avec 0,1 % diéthyl pyrocarbonate (CPDE), incubé pendant au moins 2 h à 37 ° C, et stérilisés à l’autoclave pendant au moins 15 min. Note que DEPC sont inutilisables avec tampons axée sur les Tris. RNase solutions de décontamination peuvent également servir à supprimer RNase des surfaces de travail, centrifugeuses, pipettes et réactifs qui inhibent les ribonucléases peut être ajouté aux échantillons.
Une autre étape critique est la séparation des phases de la solution de l’isothiocyanate de phénol-guanidine. Il est important de s’assurer que seule la phase supérieure est recueillie pour l’ARN de traitement. Si l’ARN qui en résulte comprend phénol résiduel, le rapport de l’absorbance à 230, 260 et 280 nm ne sera pas dans le rapport 1:2:1 comme prévu. Plus élevé que prévu absorbance à 230 nm peut indiquer la contamination de phénol. Dans ce cas, l’ARN peut être éthanol précipité à nouveau et lavé plusieurs fois pour enlever tout phénol résiduel.
Enfin, lorsque l’ARN est granulée et le surnageant est éliminé, le culot peut être collante, mince et facilement perturbés. À ce stade, il est important de prendre des précautions supplémentaires en décollant le liquide. Il peut être important de visualiser le tube avec un bon éclairage pour localiser le culot et assurez-vous qu’il n’est pas perturbé. Ajout de glycogène peut aider à garantir que la pastille est visible à ce stade.
La sélection des points dans le temps pour l’évolution de la carie est également une question importante à considérer. Alors que les quatre points, que nous avons choisi nous a permis de surveiller la désintégration de plus de 10 000 gènes, certains gènes carie pas significativement au cours de l’évolution temporelle de 8 h. Si éphémères transcriptions sont une priorité élevée, les enquêteurs pouvez ajouter des collections d’échantillons supplémentaires avant 120 min, par exemple à 30 min. Pour une meilleure évaluation des transcriptions de longue durée de vie, les enquêteurs pouvez ajouter des collections d’échantillons supplémentaires à intervalles plus tard.
Un autre problème potentiel pourrait entraîner si le taux de décomposition ne suivre pas la distribution attendue. Par exemple, il peut y avoir trop ou trop peu de gènes montrant une décroissance log-linéaire pose plus de 8 h. Dans ce cas, il est utile de surveiller le taux de décomposition des gènes qui sont connus pour être de courte ou longue durée de vie afin de déterminer si elles suivent le modèle attendu.Si les gènes ont une pente positive plutôt que négative au fil du temps, ils peuvent être exclus de l’analyse qu’ils ne démontrent pas une décroissance log-linéaire. Un dernier problème peut survenir si les cellules dans les deux conditions comparées ont des réponses très différentes à l’ActD telle que de nombreux gènes se désintègrent plus vite dans une condition. Dans ce cas, il peut être utile de se référer non seulement à la différence de taux de décroissance entre les deux Etats, mais aussi aux contrôles spike-en qui nous croyons y compris avant l’isolement du RNA pour fournir des informations sur les taux de décroissance absolue dans les deux États.
La capacité de surveiller les taux de décroissance de transcription entre cellules proliférantes et quiescentes ou n’importe quel deux États similaires a la possibilité d’approfondir l’aperçu de l’importance de la carie de la transcription dans la régulation des changements physiologiques. Les applications incluent avec et sans activation oncogène, avant et après la sénescence ou une infection virale, avec et sans précipitation d’un gène spécifique, ou dans deux États différents de la différenciation des cellules. Les conclusions pouvant être couplées à la RNA-Seq pour fournir des informations sur l’isoforme spécifique des changements dans les taux de décomposition de transcription, qui peuvent éclairer sur les changements dans l’expression de l’isoforme a observé que les cellules subissent des transitions physiologiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrentes de divulguer.
Acknowledgments
HAC était le savant Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Ce travail a été financé par des dons à la HAC from the National Institute of General Medical Sciences Centre bourse d’Excellence GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 à David août, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Institut National des Sciences médicales générales R01 GM0866465, l’Eli & Edythe Broad Centre de médecine régénératrice & Stem Cell Research, NIH Health Center/UCLA ILEC féminin Iris Cantor Grant UL1TR000124 et la leucémie Lymphoma Society. Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous attribution numéro P50CA092131. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. HAC est membre de l’Eli & Edythe large Centre de médecine régénératrice & Stem Cell Research, l’Institut de biologie moléculaire de UCLA et le programme interministériel de bioinformatique de UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
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