Summary
Descriviamo un protocollo per la generazione di proliferazione e fibroblasti cutanei umani primari quiescenti, monitoraggio tassi di decadimento di trascrizione e l'individuazione di geni differenzialmente decadente.
Abstract
Quiescenza è uno stato temporaneo, reversibile, in cui le cellule hanno cessato la divisione cellulare, ma conservano la capacità di proliferare. Gli studi multipli, compreso il nostro, hanno dimostrato che la quiescenza è associato con diffuse cambiamenti nell'espressione genica. Alcuni di questi cambiamenti si verificano attraverso i cambiamenti nel livello o attività di fattori di trascrizione associati a proliferazione, come E2F e MYC. Abbiamo dimostrato che la degradazione del mRNA può anche contribuire a cambiamenti nell'espressione genica tra cellule proliferanti e quiescenti. In questo protocollo, descriviamo la procedura per stabilire la proliferazione e quiescenti colture di fibroblasti cutanei umani del prepuzio. Descriviamo quindi le procedure per l'inibizione di nuova trascrizione nelle cellule proliferanti e quiescenti con actinomicina D (ActD). ActD trattamento rappresenta un approccio semplice e riproducibile per dissociare nuova trascrizione dal decadimento di trascrizione. Uno svantaggio di ActD trattamento è che il corso di tempo deve essere limitato a un breve lasso di tempo perché ActD colpisce la vitalità cellulare. Livelli della trascrizione sono monitorati nel tempo per determinare i tassi di decadimento di trascrizione. Questa procedura permette l'identificazione di geni e isoforme che presentano decadimento differenziale in proliferazione contro fibroblasti quiescenti.
Introduction
Livelli allo stato stazionario di trascrizioni riflettono il contributo di sintesi di trascrizione e di decadimento di trascrizione. Regolato e coordinato trascrizione decadimento è un importante meccanismo per il controllo dei processi biologici1,2,3,4. Ad esempio, tassi di decadimento di trascrizione hanno dimostrati di contribuire per la serie temporale di eventi che seguono l'attivazione dalla citochina infiammatoria fattore di necrosi tumorale5.
Precedentemente abbiamo indicato che la transizione tra proliferazione e quiescenza in fibroblasti umani primari è associata con i cambiamenti dei livelli di trascrizione di molti geni6. Alcuni di questi cambiamenti riflettono le differenze nell'attività dei fattori di trascrizione tra questi due Stati.
Cambiamenti nel tasso di decadimento di una trascrizione possono anche contribuire ai cambiamenti del livello di espressione di un trascritto in due diversi stati7,8. Basato sui nostri risultati precedenti che la transizione tra proliferazione e quiescenza è associata con i cambiamenti nei livelli di più microRNA9, abbiamo chiesto se c'è anche un contributo dal decadimento di differenziale trascrizione nei cambiamenti espressione genica in proliferazione contro fibroblasti quiescenti.
Al fine di monitorare la stabilità di trascrizione, abbiamo determinato il tasso di decadimento delle trascrizioni genoma in proliferazione contro cellule quiescenti. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo monitorato tassi di decadimento in proliferazione contro fibroblasti quiescenti introducendo un inibitore della trascrizione nuovo e monitoraggio della frequenza in cui singole trascrizioni scomparse nel tempo. Il vantaggio di questo approccio è che, rispetto ai metodi che consentono di monitorare semplicemente espressione genica globale, inibendo la sintesi di nuova trascrizione, saremo in grado di determinare il tasso di decadimento per queste trascrizioni separatamente dal prezzo al quale sono trascritti.
ActD trattamento per inibire la trascrizione di nuovo e determinare i tassi di decadimento di trascrizione è applicato con successo in molteplici studi precedenti. ActD è stato usato per sezionare l'importanza della stabilità di RNA nei cambiamenti in abbondanza di trascrizione che derivano dal trattamento con citochine pro-infiammatorie5. Un approccio simile è stato utilizzato anche per sezionare le differenze nel tasso di decadimento di trascrizione in proliferazione contro cellule C2C12 differenziate come essi adottano un muscolo differenziato fenotipo10. Come altro esempio, global mRNA emivite inoltre sono state rilevate in pluripotenti e cellule staminali embrionali del mouse differenziato11. In questi esempi, la degradazione del mRNA ha dimostrato di essere importante per la regolazione di abbondanza di trascrizione e per la transizione delle cellule agli Stati differenti delle cellule.
Applicare i metodi descritti di seguito, abbiamo scoperto le variazioni nei tassi di decadimento di trascrizione in circa 500 geni quando si confrontano i fibroblasti proliferanti e quiescenti stati12. In particolare, abbiamo scoperto che gli obiettivi del microRNA miR-29, che è downregulated in cellule quiescenti, sono stabilizzati quando le cellule di transizione di quiescenza. Qui descriviamo la metodologia che abbiamo usato per determinare i tassi di decadimento in cellule proliferanti e quiescenti. Questa metodologia è utile per confrontare i tassi di decadimento mRNA globali in due distinti ma simili condizioni quando sono cercati informazioni rapidamente decadente geni. Potrebbe essere utilizzato anche per affrontare altre questioni, quali l'effetto delle condizioni di coltura delle cellule sul decadimento di trascrizione, per esempio, in due dimensioni contro tre culture dimensionale. Tassi di decadimento possono essere determinato genoma con metodi come microarrays o RNA-seq. in alternativa, in tempo reale qPCR o Macchiarsi nordico può essere utilizzato per determinare i tassi di decadimento su base gene di gene o isoforma di isoforma. Queste tariffe quindi possono essere utilizzate per calcolare il tempo di dimezzamento di ciascun gene monitorato e per identificare geni con i tassi di decadimento che sono diversi in due condizioni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati da Institutional Review Boards presso la Princeton University e la University of California, Los Angeles.
1. preparare fibroblasti proliferanti e contatto-inibito ActD tempo corso
Nota: Questo protocollo utilizza un timecourse con quattro punti temporali. Tre campioni biologicamente indipendenti possono essere raccolti al timepoint raccogliendo le piastre di coltura di tessuti diversi in un esperimento, o l'esperimento può essere ripetuto più volte con diverse culture di cellule. Nella nostra esperienza, un piatto di coltura del tessuto di 10 cm (diametro) (una piastra) fornisce sufficiente RNA per l'analisi. Se necessario, più piatti di coltura del tessuto possono essere pool per ogni campione aumentare il numero delle cellule presso ogni timepoint. Inoltre, lo stesso esperimento può essere eseguito con fibroblasti isolati da diversi individui come replica biologico veramente indipendente.
- Stabilire proliferanti e quiescenti culture di cellule per l'analisi di decadimento di trascrizione. Per le cellule di proliferazione, dividere le celle ogni tre giorni mentre le cellule di contatto-inibito stanno diventando contatto-inibita.
- Per le cellule di contatto-inibito, cambiare il mezzo ogni 2 giorni per 7 giorni. Dividere le cellule proliferanti 2 giorni prima che i fibroblasti hanno inibito contatto sono pronti per il ritiro. Nella Figura 1è riportato un esempio di un sistema di coltura cellulare. I passaggi rimanenti in questa sezione forniscono un protocollo dettagliato per stabilire e spaccare le cellule.
- Isolare i fibroblasti cutanei primari da neonatale pelle secondo protocolli stabiliti13. Fibroblasti di passaggio per garantire una popolazione omogenea.
Nota: I fibroblasti possono essere congelati e scongelati, se necessario. - Scongelare o replate fibroblasti, se necessario. Crescere i fibroblasti in DMEM con 10% siero in condizioni sterili in una coltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Utilizzare fibroblasti che sono state coltivate per meno di 10 passaggi. Fibroblasti dovrebbero essere < 80% confluenti il giorno della scissione alle cellule di produrre popolazioni proliferanti e quiescenti.
- Per dividere una piastra di coltura del tessuto in piastre multiple, preriscaldare PBS, tripsina e mezzo con siero in bagnomaria a 37 ° C per 20 min.
- Aspirare o utilizzare una pipetta per rimuovere il mezzo da ciascuna piastra di coltura del tessuto con le cellule per essere replated.
- Dispensare caldo PBS su ogni piatto (10 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 5 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6) e 1 mL per un pozzetto di una piastra ben 12.
- Aspirato o una pipetta per rimuovere PBS da ciascuna piastra di coltura del tessuto.
- Delicatamente dispensare 1 x tripsina-EDTA su ogni piatto (8 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 3 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6 e 1 mL per un pozzetto di una piastra ben 12).
Nota: Fare 1 x tripsina-EDTA diluendo sterile 10 x tripsina-EDTA in PBS sterile. La soluzione finale 1 x dovrebbe essere 0.05% tripsina e 0,02% EDTA. - Incubare la tripsina con le cellule per 5 min.
- Picchiettare delicatamente la piastra per sloggiare le cellule dalla piastra.
- Pipetta per risospendere le cellule in sospensione unicellulare.
- Trasferire le cellule in soluzione di tripsina in una provetta conica contenente lo stesso volume di DMEM con 10% siero (8 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 3 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6 e 1 mL per un pozzo di un 12 ben piatto).
- Rotazione verso il basso le cellule a 4 ° C per 5 minuti a 1.000 x g per rimuovere tripsina.
- Risospendere le cellule in un volume adeguato di medie e totali con un emocitometro per calcolare la concentrazione cellulare.
- Seme 5x105 per piastra di coltura del tessuto di 100 mm per la proliferazione e ha inibito contatto cellule.
- Utilizzando questo metodo, stabilire i campioni proliferanti e inibito di contatto necessari per l'analisi (Figura 1).
2. ActD tempo corso
- Risospendere ActD in stock concentrazione di 1 mg/mL (per 1 mg di ActD, uso 950 µ l di PBS sterile e 50 µ l di DMSO sterile).
Nota: Soluzioni di riserva congelati di ActD dovrebbero essere stabile per un mese a-20 ° C. Soluzioni diluite dovrebbero essere scartati e non memorizzati per un ulteriore uso. - Aggiungere ActD il volume appropriato di mezzo preriscaldata per tutta la cultura biologica delle cellule replica piastre che per circa 0, 120, 240 e 480 min punti temporali (Figura 2). Aggiungere ActD ad una concentrazione di 15 µ g / mL di terreno. Mescolare bene, aspirate fuori il vecchio mezzo e aggiungere il terreno ActD-contenente le celle.
- Per un 1 mg/mL di brodo, aggiungere 15 µ l ActD per ogni mL di terreno, ad esempio, per 10 mL di terreno per un piatto di 100 mm, aggiungere 150 µ l ActD.
- Per raccogliere il campione di timepoint zero, delicatamente aspirate fuori ActD medio e dispensare preriscaldata PBS sulle celle. Pipettare 10 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 5 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6 e 1 mL per un pozzetto di una piastra ben 12.
- Aspirare delicatamente o una pipetta il PBS.
Nota: Tutti i passaggi che comportano isolamento del RNA devono essere eseguiti con acqua RNAsi-libera, RNAsi-libera per microcentrifuga e pipette RNAsi-libera. Guanti devono essere indossati e cambiati frequentemente quando si lavora con RNA. - Aggiungere soluzione di fenolo-guanidina isotiocianato (1 mL/10 cm piastra con 4 x 105 a 4 x 107 cellule) direttamente alla piastra di coltura del tessuto.
Nota: Fenolo-guanidina isotiocianato soluzione è una soluzione monofasica che mantiene la qualità di RNA durante la lisi di cellule e che separa il RNA, DNA e proteine da altro.
Attenzione: Fenolo e guanidina isotiocianato sono corrosivi. Utilizzare una protezione appropriata. - Miscela a dispensare il fenolo-guanidina isotiocianato soluzione-cella su e giù più volte per ottenere un impasto omogeneo.
Nota: Fenolo-guanidina isotiocianato soluzione lisato può essere conservata a 4 ° C durante la notte o a-20 ° C per fino a un anno. - Raccogliere ogni punto di tempo dopo la giusta quantità di tempo è passato usando il metodo descritto in passaggi 2.3-2.6.
3. isolamento di RNA totale da fenolo-guanidina isotiocianato soluzione lisato
- Incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 min garantire la completa dissoluzione dei complessi RNA-proteina.
Nota: Se non specificato diversamente, i passaggi del protocollo fenolo-guanidina isotiocianato soluzione possono essere eseguiti a temperatura ambiente. - Introdurre le trascrizioni di spike-a controllo che possono essere rilevate con la metodologia utilizzata.
Nota: L'esterno RNA controllo Consorzio (ERCC) spike-in controllo mix14 è stato specificamente progettato come un controllo di spike per RNA-seq. Può essere utilizzato anche per le macchie nordiche o qPCR in tempo reale. Spike-in controlli progettati specificamente per le tecnologie di microarray sono anche disponibili (Vedi Tabella materiali).
Nota: Dopo la rotazione iniziale, il campione dovrebbe separare in 3 strati - un strato organico rosso presso il fondo, un interfase bianco/rosa nel mezzo e uno strato acquoso limpida in alto a sinistra (Figura 3).
Nota: Fare attenzione a non disturbare l'interfase durante questo processo. Va bene a lasciare alcuni della frazione acquosa. È meglio lasciare alcuni della frazione acquosa che includendo anche alcuni degli strati interfase, come comprendente l'interfase strato sarebbe contaminare il RNA con il DNA. Lo strato acquoso sarà circa la metà del volume iniziale, così circa 0,9 mL se la miscela di soluzione/cloroformio fenolo-guanidina isotiocianato era 1,8 mL.
Nota: Questo si tradurrà in un pellet denso, tinta che è facile da monitorare dopo la procedura di selezione che seguono.
Nota: Un suggerimento di dispensare sciolto tenuto in mano può essere utilizzato per eliminare l'etanolo in eccesso. Se la pallina del RNA è disturbata, ma non eliminata, lo sperimentatore può ripetere lo spin e rimuovere il surnatante nuovamente. Evitare scartando il pellet come questo richiederà l'investigatore a ripetere l'intera procedura.
Nota: La pallina del RNA è meno compatta in questa fase e tende a spostarsi. Fate molta attenzione quando si maneggia il pellet a questo punto per evitare di perdere il RNA.
4. analisi dell'abbondanza di trascrizione
- Quantificare il RNA e verifica RNA per purezza utilizzando uno spettrofotometro.
Nota: Il rapporto di assorbanza a 260 nm a 280 nm dovrebbe essere circa 2.0 per RNA. - Analisi del RNA con un gel di agarosio all'1% o un'equivalente tecnologia per visualizzare la misura della degradazione.
Nota: Due chiari bande che rappresentano 18S e 28S rRNA dovrebbe essere chiaramente visibile (Figura 4). Se queste bande non sono visibili, il RNA potrebbe essere compromesse. Difficoltà tiro suggerimenti per degradazione del RNA sono forniti nella discussione. - Abbondanza di trascrizione di monitor nelle aliquote raccolte di RNA rispetto a spillo-in standard interno utilizzando microarrays15, RNA-Seq16, in tempo reale qPCR17, o Northern blots18.
- Determinare l'abbondanza per ogni trascrizione in ciascun punto di tempo rispetto a un controllo a spillo-in abbondanza noto.
Nota: Per i microarrays, i valori saranno intensità di fluorescenza. Per le macchie nordiche, bande sulla pellicola di raggi x possono essere quantificati. Per qPCR in tempo reale, abbondanza di trascrizione può essere determinato dal confronto con standard noti con il 2- σσCT metodo19. Per RNA-Seq, valori normalizzati possono essere determinati come FPKM o frammenti per kilobase dell'essone per milione letture mappato. Per i tassi di decadimento isoforma-specifici, RNA-Seq dati possono essere analizzati utilizzando metodologie isoforma-consapevole come DEXSeq20. I tassi di decadimento isoforma-specifici sono meglio determinati con RNA-seq. Se sono da determinarsi con dati di microarray, quindi i dati devono essere analizzati su una base di sonda, piuttosto che una base di gene di gene. L'analista deve essere attento quando si interpretano le informazioni da un numero limitato di sonde. Per esempio, ci possono essere 5 o meno sonde che sono ben informative su una particolare isoforma. In questo caso, l'analista sarà necessario determinare se il comportamento di queste sonde è sufficientemente coerenza in modo che i risultati sono affidabili.
- Determinare l'abbondanza per ogni trascrizione in ciascun punto di tempo rispetto a un controllo a spillo-in abbondanza noto.
- Eseguire in tempo reale qPCR il RNA isolato17 in campioni raccolti per analizzare i geni rapidamente decadente, come c-Myc e un gene lentamente decadente come GAPDH, conquistare la fiducia quello deperimento di trascrizione tariffe sono state rilevate con precisione.
Nota: Per ulteriore conferma, isoforma-specifici in tempo reale qPCR sonde possono essere sviluppati e utilizzati per monitorare l'abbondanza di isoforme specifiche nel tempo21.
5.Determinazione costante del tasso di decadimento
- Per ogni timepoint, registro-trasformare i valori di abbondanza per ogni trascrizione (gene-specifico o isoforma-specifici).
Nota: Log-trasformando i valori convertirà curve di decadimento esponenziale alle linee che possono essere in forma con un decadimento lineare modello22. - Misura il profilo di espressione per ogni trascrizione (gene-specifico o isoforma-specifici) per un modello di decadimento lineare. La formula di tale modello è f (t) = C - r * t. In questa equazione, C è una costante che rappresenta l'importo di partenza di una trascrizione, r è il tasso di declino e t è il tempo dall'inizio dell'esperimento. Da questa equazione, determinare il tasso di decadimento come r*ln(10) (Vedi riferimento11).
Nota: Il pacchetto di software di maSigPro è un approccio basato su regressione progettato per rilevare differenze di profilo di espressione gene significativo nel tempo corso dati23. Codice di esempio e i risultati per maSigPro sono disponibili presso: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - Filtrare i geni che non riescono a montare un modello log-lineare decadimento. Questa operazione può essere eseguita con un test ANOVA F.
Nota: il test F si basa sulla statistica F, che è definita come la variazione tra campioni si intende diviso per la variazione all'interno di campioni. Correggere i valori di p per i confronti multipli applicando il lineare step-up Benjamini e Hochberg falsi scoperta procedura24. Un q-valore maggiore di 0,05 con il F-test può essere utilizzato come un cut-off per i geni che non riescono a montare un modello log-lineare decadimento. - Eseguire un test ANOVA F per determinare le trascrizioni con un termine di interazione significativa tra una condizione di ciclo cellulare categorico e tempo (tasso di falsi scoperta, FDR < 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Precedentemente abbiamo riferito i risultati delle analisi di microarray dei tassi di decadimento di trascrizione in fibroblasti umani primari proliferanti e inibito a contatto sopra un corso di 8 ore tempo12. Una lista di geni con un significativo cambiamento nella stabilità di trascrizione confrontando fibroblasti proliferanti e contatto-inibito è fornita nella tabella supplementare 1. Le intensità di fluorescenza in tempo zero e sopra un corso di tempo dopo il trattamento ActD sono fornite. Geni sono stati inclusi sulla lista determinando i geni che hanno significativamente diverse piste in condizioni di proliferazione e ha inibito di contatto utilizzando un test ANOVA F. Esempi di geni con tassi di decadimento differenti nei fibroblasti proliferanti e quiescenti sono illustrati nella Figura 5.
Figura 1 : Schema di protocollo per stabilire piastre proliferanti e contatto-inibito per analisi in corso tempo ActD. Viene fornita una descrizione di giorno per giorno i passi necessari per stabilire colture di cellule per il trattamento di ActD, assumendo quattro punti temporali saranno utilizzati per il corso di tempo. Per semplicità, una piastra è mostrata al timepoint, ma piastre supplementari possono essere aggiunti per generare repliche biologiche. Il protocollo può essere regolato anche per aggiungere ulteriori piastre di cellule se sono voluti più di quattro punti temporali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Schema del corso di tempo ActD e decadimento tasso calcoli in quiescenza rispetto ai fibroblasti umani proliferanti. La frazione prevista dei mRNAs restanti nel tempo per un'ipotetica trascrizione dopo il trattamento con un inibitore trascrizionale è indicato. Qui di seguito, aree di saggio della frazione di mRNA rimanente nel corso del tempo sono forniti per geni che sono più stabili in quiescenza di proliferazione delle cellule e dei geni che sono più stabili nella proliferazione di cellule quiescenti. Per ogni datapoint, viene visualizzato un solo valore per chiarezza. Nel protocollo reale, ci saranno tre datapoints per ogni timepoint. Questa figura è stata modificata da tesi di dottorato di Elizabeth Pender Johnson con il suo consenso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Fotografie di miscelazione fenolo-guanidina isotiocianato reagente e cloroformio prima e dopo la centrifugazione. La miscela viene mostrata quando il fenolo-guanidina isotiocianato reagente e cloroformio sono inizialmente insieme dopo la miscelazione e dopo la centrifugazione. Dopo la miscela viene centrifugata, la fase di fondo, che è rossa, è la fase organica. L'interfase in mezzo è bianca e lattescente. Il top è la fase acquosa ed è chiaro. il RNA è nella fase acquosa, che dovrebbe essere raccolti con una pipetta per precipitazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Gel del RNA del campione per monitorare la qualità RNA. Un'illustrazione di un gel di RNA mostrando campioni con RNA intatto. RNA intatto ha bande prominenti per il rRNA 28S e 18S. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Esempi di geni con tassi di decadimento differenti in proliferazione contro fibroblasti quiescenti. Intensità di fluorescenza (espressione genica) nel corso del tempo sono mostrati per quattro geni che decadono in modo diverso in proliferazione contro fibroblasti quiescenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare tabella 1: intensità di fluorescenza di Gene-specific in fibroblasti proliferanti e quiescenti. I dati sono forniti per tempo zero e sopra un corso di tempo dopo il trattamento ActD in proliferazione e contatto-inibito fibroblasti. Vengono forniti i valori di P, q valori e tassi di falsi scoperta. Tabella è ristampato dalla sua pubblicazione originale in BMC Genomics12. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Quiescenza può essere indotta da segnali esterni, tra cui il ritiro di mitogeni o del siero, la mancanza di adesione cellulare e l'inibizione del contatto. Inibizione da contatto, uno dei più possibili metodi per indurre la quiescenza, è un processo altamente evolutivamente conservato in cui cellule uscire il ciclo proliferativo cellulare in risposta al contatto della cellula--cellula. Qui ci concentriamo sulla inibizione da contatto come un esempio di un metodo per indurre la quiescenza. Gli studi precedenti hanno segnalato che contatto cellula-cellula può influenzare microRNA biogenesi25, così, i risultati forniscono informazioni su un metodo di quiescenza e ulteriori studi sono richiesti di determinare quali modifiche sono associate con quiescenza per sé.
Abbiamo usato i fibroblasti diploidi umani primari che abbiamo isolato dalla pelle neonatale. Abbiamo iniziato questi esperimenti con i fibroblasti che sono state attraversate meno di 10 volte. Abbiamo scartato il successivo passaggio fibroblasti perché essi ratti senesce. Mentre questo protocollo si concentra sui fibroblasti cutanei proliferanti e quiescenti, le procedure descritte possono essere utilizzate per monitorare i tassi di decadimento in diversi tipi di cellule e in condizioni diverse.
Abbiamo monitorato mRNA decay tariffe genoma usando un corso di spegnimento di trascrizione. Ora di spegnimento corsi è il metodo più utilizzato per disaccoppiare la degradazione del mRNA da trascrizione di mRNA per calcolare mRNA emivite1,26. Nel metodo descritto qui, ActD, una droga che complessi con B-forma di DNA per bloccare l'allungamento del RNA polimerasi II, viene utilizzato per arrestare la trascrizione di mRNA27. Il tasso di diminuiscono di trascrizioni in abbondanza in un periodo di tempo di 8 ore può essere determinato come tasso di decadimento di trascrizione.
Una limitazione importante di approcci per il monitoraggio di decadimento di trascrizione ActD è che ActD previene la trascrizione globale, che interesserà la vitalità delle cellule. Questo dovrebbe essere tenuto a mente quando si interpretano i dati basati su ActD, come tassi di decadimento siano determinati in cellule che sono più stressate che loro stato nativo. Un altro problema importante è che gli effetti di ActD potrebbero essere diversi per le celle in diversi Stati, tra cui proliferano contro fibroblasti contatto-inibita. Un approccio per ridurre al minimo gli effetti collaterali del trattamento ActD è per tenere corsi di time breve durata. Per questo motivo, abbiamo selezionato un corso di tempo di 8 h.
Non ci sono approcci alternativi per ActD per monitoraggio trascrizione decadimento tariffe28,29. Ceppi di lievito con gli alleli termosensibile RNA polimerasi II sono stati utilizzati per monitorare la trascrizione decadimento tariffe30. Una variazione su questo approccio chiamato "anchor-away" è stata utilizzata nel lievito per raggiungere condizionale svuotamento della RNA polimerasi II in risposta alla rapamicina trattamento31,32. È anche possibile monitorare decadimento in cellule con trascrizione attivo. Per esempio, nucleotidi uridinici thio-sostituiti possono essere introdotto nelle cellule, integrare nel mRNA e successivamente rilevato33,34,35. Con questo approccio, può essere determinato il tasso al quale diverse trascrizioni sono sintetizzate nelle cellule che stanno continuando a sintetizzare mRNA. Tali approcci hanno un vantaggio significativo rispetto ActD trattamento perché non sono tossici. Nella nostra esperienza, tuttavia, ci può essere variabilità nel recupero delle trascrizioni con questi metodi. ActD trattamento è un approccio semplice e riproducibile per il monitoraggio di decadimento di trascrizione.
A pochi passi dal protocollo fornito sono fondamentali per il suo successo. Una questione importante è impedire la degradazione di RNA durante l'isolamento di RNA. Al punto 4.1, il RNA deve essere monitorato per la degradazione. Se il RNA non contiene due picchi chiari per rRNA 18S e 28S (Figura 4), questo è un segno che si è verificato degradazione di trascrizione. Alcuni strumenti forniscono punteggi di RNA integrità numero (RIN) che vanno da 1 a 10. I campioni con i punteggi RIN nell'intervallo 7-10 sono accettabili per ulteriori analisi. Se il RNA è degradato, quindi è importante prendere ulteriori precauzioni per evitare la degradazione di RNA, quale ad esempio garantire che soluzioni e sterileware sono privi di RNasi, e che sono indossare guanti quando gestione delle pipette per il RNA. Acqua può essere pretrattato con 0,1% dietil pirocarbonato (DEPC), incubata per almeno 2 ore a 37 ° C, e in autoclave per almeno 15 min Nota che DEPC non può essere utilizzato con buffer di Tris-basato. Soluzioni di decontaminazione possono essere utilizzati anche per rimuovere RNasi da superfici di lavoro, centrifughe, pipette e reagenti che inibiscono la RNasi RNasi possono essere aggiunti ai campioni.
Un altro passaggio fondamentale è la separazione delle fasi della soluzione fenolo-guanidina isotiocianato. È importante garantire che solo la fase superiore è raccolti per RNA processing. Se il RNA risultante include residua fenolo, il rapporto di assorbanza a 230, 260 e 280 nm non sarà in rapporto 1:2:1 come previsto. Superiore al previsto assorbanza a 230 nm può indicare la contaminazione di fenolo. In questo caso, il RNA può essere etanolo precipitata nuovamente e lavato più volte aggiuntive per rimuovere qualsiasi residuo fenolo.
Infine, quando il RNA è pellettato e il surnatante viene rimosso, il pellet può essere appiccicoso, sottili e facilmente disturbati. A questo punto, è importante prestare particolare attenzione a togliere il liquido. Può essere importante visualizzare il filmato con una buona illuminazione per individuare il pellet e assicurarsi che non è disturbato. Aggiunto glicogeno possa contribuire a garantire che il pellet è visibile a questo punto.
La selezione dei punti di tempo per il corso di tempo di decadimento è anche una questione importante da considerare. Mentre i quattro punti temporali che abbiamo scelto ci ha permesso di monitorare decadimento per oltre 10.000 geni, alcuni geni non ha fatto decadere significativamente durante il corso di tempo di 8 h. Se trascrizioni di breve durate sono una priorità alta, gli investigatori possono desidera aggiungere ulteriori campionari prima del 120 min, per esempio a 30 min. Per migliore valutazione delle trascrizioni longeve, gli investigatori possono desidera aggiungere ulteriori campionari timepoints successive.
Un altro potenziale problema potrebbe derivare se i tassi di decadimento non seguono la distribuzione prevista. Per esempio, ci possono essere troppi o troppo pochi geni mostrando un decadimento log-lineare tasso oltre 8 h. Se questo accade, è utile monitorare i tassi di decadimento di geni che sono noti per essere di breve o lunga durata al fine di determinare se essi seguono il modello previsto.Se i geni hanno una pendenza positiva anziché negativa nel corso del tempo, essi possono essere esclusi da ulteriori analisi poichè essi non dimostrano un tasso di decadimento log-lineare. Se le cellule nelle due condizioni confrontate hanno risposte molto differenti per il ActD tale che molti geni decadono velocemente in una condizione, potrebbe verificarsi un problema finale. In questo caso, può essere utile fare riferimento non solo per la differenza nel tasso di decadimento tra i due Stati, ma anche per i controlli di spike che suggeriamo compreso prima dell'isolamento di RNA per fornire informazioni sui tassi di decadimento assoluto nei due Stati.
La possibilità di monitorare i tassi di decadimento di trascrizione tra cellule proliferanti e quiescenti o qualsiasi due stati simili ha il potenziale per fornire ulteriore comprensione nell'importanza di deperimento di trascrizione nella regolazione cambiamenti fisiologici. Le applicazioni includono cellule con e senza attivazione oncogenica, prima e dopo la senescenza o infezione virale, con e senza atterramento di un gene specifico, o in due stati diversi di differenziazione. I risultati possono essere accoppiati con RNA-Seq per fornire informazioni su isoforma-specifici cambiamenti nei tassi di decadimento di trascrizione, che possono fornire la comprensione nei cambiamenti nell'espressione di isoforma osservato come le cellule subiscono fisiologiche transizioni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.
Acknowledgments
HAC fu lo studioso di Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni per HAC dal National Institute of General Medical Sciences centro della sovvenzione di eccellenza GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 ad agosto David, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Istituto nazionale di scienze mediche generali R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad centro di medicina rigenerativa & ricerca sulle cellule staminali, centro salute/UCLA CTSI NIH delle donne Iris Cantor Grant UL1TR000124 e alla Leukemia Lymphoma Society. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health, sotto Premio numero P50CA092131. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. HAC è un membro della Eli & Edythe Broad centro di medicina rigenerativa & Stem Cell Research, l'Istituto di biologia molecolare di UCLA e il programma interdipartimentale di bioinformatica di UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
