Summary
Протокол для структурного анализа полисахаридов электрофорезом геля (ПАСЕ), используя в качестве примера, маннан описан.
Abstract
Полисахариды клеточной стенки растений сложно анализировать, и большинство методов требуют дорогостоящего оборудования, квалифицированных операторов и больших объемов очищенного материала. Здесь мы опишем простой метод для получения подробной полисахарид структурную информацию, включая резолюцию структурных изомеров. Для анализа полисахаридный гель-электрофорез (ПАСЕ) завод клеточной стенки Материал гидролизуется с glycosyl гидролаз, специфичные для полисахарид интерес (например, mannanases для Маннан). Большой формат полиакриламидных гелей затем используются для разделения выпустила олигосахариды, которые были дневно помечены. Гели могут быть визуализированы с модифицированных гель системы (см. Таблицу материалы). Результате олигосахарида отпечатков можно либо сравнить качественно или с репликацией, количественно. Связь и ветвления информации могут создаваться с помощью дополнительных glycosyl гидролазы (например, mannosidases и galactosidases). Хотя этот протокол описывает метод для анализа структуры глюкоманнан, он может применяться к любой полисахарид, для которого характерны glycosyl гидролазы существуют. Кроме того она может использоваться для характеристики Роман glycosyl гидролаз, используя определенные полисахариды субстратов.
Introduction
Анализ полисахарид электрофорезом геля (ПАСЕ) — это метод для подробного описания полисахаридов1,2,3. Полисахариды клеточной стенки растений сложно анализировать, и большинство методов требуют дорогостоящего оборудования, квалифицированных операторов и больших объемов очищенного материала. Здесь мы опишем простой метод для получения подробной полисахарид структурную информацию, включая резолюцию структурных изомеров.
Структура полисахарид клеточной стенки завода понимание является необходимым для этих исследователей, изучение биосинтеза завод клеточной стенки или роль стены клетки растений в развитии растений. Недавно однако, завод клеточной стенки композиция стала интересным для более широкой группы исследователей из-за внимание на использовании биомассы растений (по существу клеточной стенки) в качестве сырья для производства биотоплива и биохимикаты4. Как, например эффективной ферментативные осахаривания этого материала требует, подробное понимание структур полисахарид, так что оптимизированный ферментативные коктейли могут быть выбранных5.
ПАСЕ имеет ряд преимуществ над альтернативных методов, которые делают его идеальным для быстрого анализа сложных glycan структур. Во-первых он не требует очистки полисахаридов, в вопросе, как это требуется для решения государства ядерного магнитного резонанса (ЯМР)6. Во-вторых, ПАСЕ может решить структурные изомеры, в отличие от масс-спектрометрия (МС, например, при содействии матрицы лазерная десорбция/ионизации (MALDI) и электроспрей ионизации (ESI)), который также может быть сложной задачей для выполнения жидкостной хроматографии (LC) 7. в-третьих, темпы очень чувствительна, с низким picomole резолюции, в отличие от тонкослойной хроматографии (ТСХ) или бумажной хроматографии. Наконец она не требует дорогостоящих оборудования или специалиста знания, как в случае для MS, ЯМР и LC.
ПАСЕ метод основывается на специфичности glycosyl гидролазы (GH) ферментов, которые нацелены на определенные гликосидные в смесь полисахаридов. Когда GH фермент действует на полисахаридные цепочки, она показывает уменьшение конец, который может затем быть химически дериватные, в этом случае с помощью флуоресцентные метки. Unhydrolyzed часть образца поэтому обрабатывается обнаружить этот метод. Приклеенные этикетку олигосахариды затем разделяются в гель акриламида большого формата электрофорезом. Это дает превосходное разрешение очень похожи молекул, например, Трисахариды Glc-человек-человек и Glc-человек-Glc будет иметь различные Rf.
ПАСЕ широко используется для характеристики различных xylan структур различных видов растений8, для выявления гликозилтрансферазы мутантов Arabidopsis6,9,10,11 , для выполнения анализов гликозилтрансферазы9и характеризовать Роман GH деятельности12,13. Мы также недавно использовали его для характеризуют Маннан клеточной стенки дрожжей (Mahboubi и Мортимер, в рамках подготовки). Здесь мы описываем метод характеризующих завод клеточной стенки глюкоманнан структура, на основе предыдущих докладов11,14.
Protocol
1. заготовки растительного материала
- урожай свежего растительного сырья (~ 20 мг) и сразу погружаться в 96% (v/v) этанола и Инкубируйте на 70 ° C за 30 мин; это отключает любой клеточной стенки, унижающего достоинство ферменты настоящего. Для сухого материала, начать с шага 2.
Предупреждение: Этанол является легковоспламеняемым.
Примечание: Один стебель или розетка листьев будет предоставлять достаточно материала для анализа. Однако, меньше ошибок возникают, если объединяются и проанализированы, поскольку это легче весят и обрабатывать большее количество ткани. - Тщательно записывать ткани типа и стадии развития, как полисахарида структура изменяется с обоими. Например с Arabidopsis thaliana (используется здесь), этап ткани согласно методы из Бойс и др. 15
Примечание: В настоящем Протоколе, мы использовали в нижней части стебля соцветия, где первый стручок полностью вытянута но не желтеет.
2. Подготовка спирт нерастворимых остатков (воздуха)
- подготовка воздуха, следующий после метода Мортимер и др. 9 или другого аналогичного метода, для того чтобы произвести порошок не хватает растворимых сахаров, например сахароза и крахмал.
3. Aliquoting и предварительной очистки воздуха
Примечание: точное количество воздуха, необходимого для каждого образца будет зависеть () обилие полисахарид интерес в материале и (b) средний размер олигосахариды, выпущенное GH. Метод добавляет одной молекулы флуоресцентные в уменьшение конец каждого олигосахариды, поэтому количество олигосахариды определяет чувствительность эксперимента. В качестве ориентира, glucomannan в стволовых Arabidopsis, переваривается с GH5/GH26 (как описано), 500 мкг рекомендуется 11, тогда как для xylan в стволовых Arabidopsis, переваривается с GH11, 100 мкг рекомендуется как Мортимер ' s исследования 3.
- весят воздух (10-15 мг) в 15 мл пластиковых пробирок и добавить H 2 O конечная концентрация 2 мг/мл. Вортекс для достижения даже подвеска. Если это создает проблему, затем использовать стекло гомогенизатор для содействия этому процессу. Трубы
- аликвота 500 мкг в отцентрифугировать. Сухие аликвоты, с помощью вакуума центрифуги (см. Таблицу материалов) всю ночь на 30 ° C.
- Воздух предварительно лечить с 1 M NaOH (20 мкл) за 1 ч при комнатной температуре; это де acetylates полисахаридов и набухает целлюлозы microfibrils, нарушая структуру биомассы и доступа GH.
Примечание: Этот шаг может быть пропущен для очищенных полисахаридов. ОСТОРОЖНО – сильная кислота/base.- Включают Алиготе для управления воздушным без фермента (обрабатывается так же, как все образцы, за исключением шага 4.1. исключается).
- Добавить 200 мкл H 2 O и 20 мкл 1 М HCl для нейтрализации. Тест, что pH ~ 6-7, удалив 1 мкл и кровянистые выделения его на полоски бумаги рН показатель.
- Добавьте 50 мкл 1 M аммония ацетат буфера, pH 6.0 (или какой рН подходит для используемых в исследовании СГС) и H 2 O дать общий объем 500 мкл.
Примечание: Ацетат аммония используется, поскольку она отсняты при высыхании, и поэтому он не добавляет дополнительные соли для образца. Избыток соли может привести к плохой группы форма и резолюции ПАСЕ гель.
4. Гидролиз воздуха с Glycosyl гидролазы (СГС)
Примечание: как уже упоминалось в ходе обсуждения, чистоту СГС имеет решающее значение. Использовать только участием выразил, близость очищенного ферментов. После получения каждой партии от производителя, гидролизуют определенных аликвоты субстрата (например, 500 мкг воздуха) с увеличением количества GH на ночь (например, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 мкл) (3 единицы/мкл). Когда есть избыток GH, ПАСЕ отпечатков будет выглядеть одинаково. Избыток фермент требуется доставить воспроизводимость результатов, потому что он должен быть уверен, что реакция гидролиза приближается к конечной точки.
- Добавить заранее определенной суммы (см. выше) mannanases ( 11 GH5 и GH26) на аликвоты воздуха в буфер из шага 3.5, а также позитивного управления (30 мкг Конжак глюкоманнан) и без-AIR негативные (фермент смесь в пустая трубка). Вихрь и затем спина кратко для сбора реакционной смеси в нижней части трубки.
- На ночь Инкубируйте на 37 ° C (или соответствующей температуры для GH выбор) с нежным агитации (~ 100 об/мин).
- Остановка реакции инкубации на 95 ° C в течение 20 мин
Примечание: Закрытие крышки может использоваться для уплотнения трубок флип топ отцентрифугировать.- Центрифуга с помощью топ отцентрифугировать скамейке на максимальной скорости на 10 мин и сохранить супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле в 250 мкл H 2 O, центрифуги, как указано выше и сохраните супернатант.
- Объединить оба supernatants и сушат в центрифугу вакуум (см. Таблицу материалов) при 30 ° C (~ 3 h или на ночь без нагрева).
5. Подготовка стандартов олигосахарида
- подготовить 1 приклад решения H 2 O маннозы (Man), mannobiose (2 человек), mannotriose (3 человек), mannotetraose (4 человек), mannopentaose (5 человек) и mannohexaose (6 человек), все β, 1-4 связаны. Алиготе и хранить при температуре-20 ° C до тех пор, пока требуется.
- Подготовить 3 разных концентрациях мужчина смесь 1-6, объединив 1 мкл (стандарт S1), 2 мкл (S2) или 5 мкл (S3) всех шести.
- Сухой в центрифугу вакуум (см. Таблицу материалов) при 30 ° C (~ 1 h).
6. Олигосахариды ввода
- подготовить раствор 0,2 М муравьев (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic кислота) в H 2 O: уксусная кислота 17:3. Теплый склад до 60 ° C до полного растворения твердых. Хранить при-20 ° C, 2-3 месяцев, защищенном от света,.
- Подготовить раствор 0,2 М запасов Бороводороды 2-picoline (2-PB) в ДМСО. Это крайне гигроскопична, так сразу Ресуспензируйте все порошок по получении в ДМСО. Алиготе и хранить при-20 ° C для 1-2 лет. Оттепель аликвоты как требуется (хранить при 4 ° C на 2 недели, а затем отменить).
- Подготовить деривации буфера H 2 O: уксусной кислоты: ДМСО 17:3:20.
- Для каждого образца, добавить 5 мкл муравьев, 5 мкл 2-PB и 10 мкл буфера деривации. Спин кратко для сбора в нижней части трубки, вихревой тщательно и затем спина кратко. Смотрите Рисунок 1 для описания реакции.
- Образцы инкубировать на ночь при 37 ° C, защищать от света.
- Сухой в центрифугу вакуум (см. Таблицу материалов) при 30 ° C (~ 2 h). Образцы
- Ресуспензируйте и стандарт 100 мкл 3 M мочевины. Хранить при температуре-20 ° C, защищенный от света до тех пор, пока требуется.
7. Подготовка ПАСЕ гели
Примечание: монтаж оборудования литья гель будет зависеть от бренда. Здесь мы uсистема вертикального электрофореза SE (см. Таблицу материалы), оборудованная с пластинами стекла 18 x 24 см и 1,5 мм распорки.
- Собрать гель заливочное оборудование за производителя ' s инструкции.
- Сделать 10 x ПАСЕ буфера (1 М трис-Борат, рН 8,2) следующим образом: добавить 121.14 g трис-базы ~ 400 мл H 2 O, и смеси растворить. Отрегулируйте пэ-аш 8.2 добавлением твердых борной кислоты (примерно 60 g), а затем сделать объем до 1 л
- Сделать 10% (w/v) Аммония пероксодисульфат (APS) фондовая H 2 O. Алиготе и хранить при-20 ° C. оттепель аликвоты раз, хранить при 4 ° C и отменить после 2 недель.
- Делать и залить разрешая гель. Для вышеуказанного оборудования 1 лари приравнивается к 50 мл. Смешайте в 50 мл трубки центрифуги, H 2 O (20.2 мл), 5 мл 10 x буфер ПАСЕ, 24,6 мл 40% акриламида/Bis акриламида (29: 1 acrylamide:Bis). (Предупреждение: токсичные).
- Добавить APS 200 мкл и 20 мкл N, N, N, N´-тетраметилсвинца Этилендиамин (TEMED). Инвертируйте осторожно смешать (чтобы избежать воздушных пузырей). Залейте гель с помощью серологических или другой большой объем пипетки, ~ 4 см ниже верхней части стеклянной пластины. Обратите внимание на возможность пузырьки воздуха, получать оказавшихся в геле. Если они делают, остановить заливки и наклон/ПТП гель для их освобождения.
- Наложение гель с изопропиловый спирт (легковоспламеняющиеся осторожно :) или, тщательно, H 2 O. разрешить гель полимеризоваться (20-30 минут), а затем слить верхний слой. Если используется изопропиловый спирт, затем смывают 2 x с H 2 O. сухим любой избыток жидкости с помощью промокательной бумаги.
- Сделать и залить штабелируя гель. Смесь 6,8 mL H 2 O, 1 мл 10 x ПАСЕ буфера, 2,8 мл акриламида/Bis акриламида (осторожностью: токсичных), 80 мкл APS и TEMED 8 мкл в пластиковых пробирок 15мл. Инвертировать смешивать и наложение поверх полимеризованной разрешая гель. Аккуратно вставьте Расчески, избегая захвата воздушных пузырей под гребнем зубов.
- Разрешить гель для полимеризации (20-30 мин), оберните влажной ткани, а затем в полиэтиленовую пленку и хранить при 4 ° C до тех пор, пока требуется. Магазин с расчески на месте.
Примечание: ПАСЕ гели могут храниться максимум на 2 недели (хотя меньше чем 1 неделя идеально), если они хранятся влажные.
8. Запуск в темпе гель
- использовать перманентный маркер на этикетке также позиции на стекле, которая будет оказывать помощь в отслеживании порядок загрузки, и в выявлении где скважины после удаления гребень.
- Снимите гребень. Заполнить скважин с 1 x ПАСЕ буфера.
- Использовать 10 мкл microsyringe для загрузки 2 мкл образцов и стандартов в скважины. Избегайте использования внешней полосы, которые, как правило, для запуска образцов плохо.
- Сборка верхней палаты гель работает аппарат и поместите гель в запущенных танк охлажденным (~ 10 ° C) (10 ° C), содержащий 1 x ПАСЕ буфера. Заполните верхней палаты с 1 x ПАСЕ буфера.
- Поворот на власть и запустить геля на 200 V (Постоянная V) для 30 минут, а затем увеличение напряжения до 1000 V 1 ч 40 мин. Защищать Гели от света (например, заключив танков в черные мусорные мешки).
Примечание: Проверка на гелях ~ 5 мин после включения напряжения и затем еще 5 минут после увеличения напряжения до 1000 В. Если блок питания не в состоянии поддерживать напряжение, то есть скорее всего буфера утечки. Удалите гель из бака. Соберите верхняя палата, тщательно проверять размещение всех прокладки. Большая микросхема на верхнем краю стеклянной пластины могут помешать пластины, образуя хорошее уплотнение с уплотнением. Это может обычно временно решена путем добавления капли расплавленного агарозы 5% (w/v) части сколы стекла, перед добавлением в верхней палате.
9. Визуализация ПАСЕ гель
Примечание: используйте гель визуализации система с длинн развевайте УФ лампы в transilluminator и выбросов фильтр для камеры, которая подходит для Флюорофор, здесь 530 Нм. Кроме того, лазерный сканер может также использоваться, как описано в Goubet 2.
- Обеспечивает гель системы пыли, протереть влажной безворсовой ткани.
- Удалить гель из бака ПАСЕ и просмотр кратко гель находится все еще в стеклянные пластины (< 80 мс) для определения того, является ли краска фронт еще на геле.
- Открыть с помощью инструмента клин гель и в то время как гель еще на одной стеклянной пластины, использовать нож для пиццы для удаления обоих штабелируя гель и, если еще на геле, в нижней части геля краситель фронт.
- Положить на поверхность transilluminator ~ 5 mL H 2 O, а затем перенесите гель непосредственно на transilluminator. Установите фильтр для УФ 605 и включите длинноволнового УФ transilluminator (см. Таблицу материалы) с использованием программного обеспечения.
Примечание: МУРАВЬИ Флюорофор, используемый здесь имеет возбуждение/излучение 353/520 Нм. - Занять несколько изображений в разное время экспозиции (например, 100 мс до 10 s). Убедитесь, что УФ свет выключен между изображениями, нажав кнопку УФ света (чтобы отключить) чтобы избежать унижающего достоинство флуоресценции. Убедитесь, что по крайней мере 2 изображения имеют не насыщенных полос (гель обработки изображений программное обеспечение будет указывать это).
- Сохранять файлы как изображения высокой resolution.tif.
Примечание: Изображения могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения, поставляемого с гелем изображений системы, или с помощью программного обеспечения для анализа свободно доступных изображений, таких как ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). В разделе результаты для обсуждения quantitation.
Representative Results
Здесь мы покажем пример ПАСЕ гель в протокол, а также описания для оказания помощи в интерпретации данных и устранения неполадок, и это сопровождается общее руководство для успешных ПАСЕ гель интерпретации13,16. Представитель гель стандартной ПАСЕ пробирного клеточной стенки Маннан содержание показано на рисунке 2и описано Лейн, пер.
Стандарты
Дорожки 1, 2 и 3 показывают лестница коммерчески приобретенных олигосахариды (человек1-6человек) на 5 (S1), 10 (S2) и 50 концентрации пмоль (S3). При получении новой много коммерческих олигосахариды, важно проверить чистоту на геле. Многие олигосахариды, особенно tetrasacccharides и дольше, могут иметь значительные загрязнения с олигосахариды других степеней полимеризации (DPs), как показано ниже для6 человек (отмеченные *). При quantitating гель, важно иметь по крайней мере 3 концентрации стандартов, так как он необходим для расчета калибровочной кривой. Расчет стандартной кривой также может быть полезно для обеспечения того, чтобы деривации реакцию по существу на завершение. Стандарты известных концентрациях позволяют сравнивать гели и являются полезным управления для деривации качественных и разделения.
Положительный контроль
Переулок 4 показывает mannanase пищеварение Конжак глюкоманнан. Конжак глюкоманнан доступен коммерчески, и хотя он не имеет ту же структуру, что и, например, в проростках Arabidopsis, он служит двум целям. Во-первых это важный элемент для ферментативного пищеварения. Исследователь следует установить, что коммерческие субстрата, переваривается с их СГС выбора выглядит как когда усваивается до завершения (то есть, когда подавляющее избыток GH добавляется к реакции). Если в будущем эксперименты шаблон изменения, это может указывать либо потеря активности или загрязнение запасов GH. Во-вторых она служит элемент управления для деривации реакции в присутствии солей фермента и буфера. Если стандарты выглядеть хорошо, но положительный контроль бедных, то это может означать, что компонент реакции гидролиза ингибирующее для деривации.
Арабидопсис дикого типа (WT) штока воздуха + mannanase коктейль (GH5 + GH26)
Лэйн 5 показывает темпы отпечатков пальцев WT Arabidopsis стебля (Сравните с ссылки11,14).
csla9 Арабидопсис штока воздуха + mannanase коктейль (GH5 + GH26)
Переулок 6 показывает, что показывает темпы отпечатков пальцев проистекают из Arabidopsis растений не хватает основных штока Маннан синтазы11. Сравните с WT и отрицательного контроля отпечатков пальцев. Хотя большинство Маннан отсутствует в этом растении, остается небольшое количество, о чем свидетельствует уменьшение полосы света для всех mannanase производные олигосахариды, это синтезируется дополнительных Маннан synthases (CSLA2, 3)11.
Отрицательный контроль - фермента только
Лэйн 8 показывает полос на геле, не конкретные, которые являются производными от загрязняющих веществ в mannanase коктейль и должны быть исключены из анализа (отмеченные *).
Отрицательный контроль - WT воздуха только
Лейн 9 показывает полос на гель, который не являются конкретными и должны быть исключены из анализа (отмеченные *).
Отрицательный контроль- csla9 Только для AIR
Лейн 10 показывает полос на гель, который не являются конкретными и должны быть исключены из анализа (отмеченные *).
Сосновая древесина воздуха + mannanase коктейль (GH5 + GH26)
Переулок 7 показывает темпы отпечатков пальцев из соснового дерева, которое содержит galactoglucomannan. Это явно имеет другой шаблон выпустила олигосахариды в проростках Arabidopsis, из-за его различные структуры.
Отрицательный контроль - хвойный воздух только
Лэйн 11 показывает полос на гель, который не являются конкретными и должны быть исключены из анализа (отмеченные *).
Интерпретация гель ПАСЕ относительно проста, но требует осведомленности о следующие моменты. Для надежных данных рекомендуется выполнять реплицирует ПАСЕ на по крайней мере 3 самостоятельно выращенные биологическим, и рекомендуется выполнять по крайней мере 2 технических реплицирует на каждом биологических реплицировать. Описанные элементы управления имеют решающее значение для толкования, как неспецифичных должны быть исключены. Мы также рекомендуем загрузки образцов в другом порядке на репликацию гели, чтобы исключить последствия, являющиеся результатом неравномерного освещения transilluminator. Точная интерпретация требует анализа групп, которые не насыщен. Поскольку некоторые олигосахарида отпечатки пальцев могут содержать оба очень высокие и низкие изобилии полисахаридов, мы рекомендуем, анализируя несколько экспозиций же геля. Стандарты могут использоваться для нормализации между различными изображениями.
Для некоторых типов экспериментов может быть желательно, чтобы подсчитать количество полисахаридов в подготовке воздуха. Хотя это можно подсчитать из ПАСЕ гель, это требует знания точные молекулярные личность каждого олигосахариды, выпущенная СГС и где он расположен на темпы гель. Это в настоящее время не известно полностью для Маннан, но было определено для других полисахаридов например xylan3. Стандарты обеспечивают способ нормализации между гели, даже когда количественный не выполняется и поэтому будет оказывать помощь в любом качественного и полуколичественного анализа.
Выявление структуры отдельных олигосахариды может быть достигнуто с помощью коктейли из СГС. последовательная добавлением дальнейших СГС может раскрыть сведения о связи и замены выпустила олигосахариды (например, Добавление β - 1,4 - глюкозидазы, который действует на конце-уменьшение покажет какие олигосахариды в смеси содержат эту функцию). Доступные ферменты включают galactosidases, glucuronidases и глюкозидазы (см. в CAZy базы данных16 для получения дополнительной информации); увидеть Хогг, D. et al. 17 в качестве примера.
Выше протокол может использоваться для характеризовать деятельность неизвестных СГС. В этом случае определенные биомассы, например стволовых или Конжак глюкоманнан Arabidopsis, должны использоваться для экран неизвестного СГС13.
Рисунок 1 : Это показывает схему для флуоресцентных деривации олигосахаридов с МУРАВЬЯМИ. Изменение от Goubet2.
Рисунок 2 : Гель представитель ПАСЕ Показываю Маннан отпечатков пальцев от Arabidopsis, сосна и мутантов Arabidopsis (csla9) ограничивает биосинтез Маннан. AlR был гидролизуется с mannanase коктейль, и выпущенные олигосахариды были дериватные с Флюорофор. Олигосахариды были отделены электрофорезом геля на основе размер, форму и заряд. Лестница Манно олигосахариды (Man1-6) показано для оказания помощи в определении относительной подвижности выпустила олигосахариды, и гидролиза очищенный Маннан (производный от Аморфофаллус коньяк) отображается как позитивный элемент управления. * = неспецифичных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
ПАСЕ — это простой метод характеризующих полисахарид структуры. Он может быть применен к любой полисахарид, для которого известны СГС с характеризуется активностью, увидеть многочисленные примеры в литературе1,6,9,11. TT также был применен к характеристике Роман СГС12,13,18 и гликозидазы9, путем использования определенных полисахарид субстратов и акцепторов.
Воспроизводимость, интерпретируемых результатов зависит от трех ключевых шагов. Во-первых используемые СГС должны быть свободны от загрязняющих видов деятельности. Это лучше всего достигается только с помощью участием выраженной, сходства очищенные ферменты. Во-вторых для большинства экспериментов, важно что ферментативного гидролиза субстратов на завершение. Это будет гарантировать, что же биомассы, гидролизуется с же GH дает же отпечатков пальцев в каждом эксперименте. Наконец должно быть избыток Флюорофор в реакции деривации. Это гарантирует, что доступные сокращения концы обозначены на близка к 100%. Это приведет к высокой воспроизводимости результатов, а также количественные данные.
Гель и реагента качества имеют решающее значение для обеспечения воспроизводимости данных. Низкое качество буферов, особенно неправильной рН, воздушные пузыри в геле, и образцы с избытком соли можно все влияние резолюции и удержания фактор олигосахариды. Однако включение рекомендуемых элементов управления, описанных в разделе протокол и результаты позволят устранение неполадок.
ПАСЕ ограничивается ее способность идентификации олигосахаридов. Для некоторых экспериментов простой отпечатков пальцев-это все, что нужно. Однако, чтобы действительно quantitate количество глюкоманнан в пробе воздуха, например, личность всех выпущенных олигосахариды требуется, который является длительным процессом. Это гораздо проще для менее сложных полисахаридов например xylan3. Поскольку существует несколько стандартов олигосахарида коммерчески доступных, не всегда возможно возможным или желательным для выявления всех полос. В этом случае ПАСЕ может обеспечить очень лестно данных масс-спектрометрия (т.е., MALDI-CID9 или уни-MS7и ЯМР6). Для этих методов это часто полезно делать широкомасштабной подготовки, отделить, размер-гель-проникающей хроматографии и затем проанализировать каждую долю обоих темпами до MS или ЯМР. Хотя сообщалось, что полосы могут быть вырезан и выявленные MALDI-CID, на практике мы нашли, что это имеет низкий уровень успеха (возможно, из-за взаимодействия помечены олигосахаридов с гель акриламида при воздействии УФ света).
Другим основным ограничением ПАСЕ является пропускная способность. Иметь хорошее качество, интерпретируемых гели с соответствующие элементы управления, каждый гель будет только ~ 10 экспериментальных образцов, и исследователь может ожидать, чтобы запустить гели темп ~ 4 в день. Недавно версия ПАСЕ с помощью капиллярного электрофореза (CE) был развитых19, который позволяет подготовка проб в 96-луночных пластины. Она успешно использовался для характеристики гликозилтрансферазы ферментативной активности и полисахаридной структуры6,19, хотя она требует доступа к CE машина, которая может быть дорогим, чтобы приобрести и поддерживать.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
ПАСЕ метод был разработан и оптимизированный различными членами группы Дюпре (Кембриджский университет, Великобритания) с годами, и мы ценим их вклад. Эта работа финансировалась в рамках Объединенного института Доу по биоэнергии (http://www.jbei.org) поддержке Департамента энергетики США, управление науки, Отделение биологических и экологических исследований, через контракт де-AC02-05CH11231 между Лоуренс Беркли национальной лаборатории и Департамента энергетики США. Мы также благодарим Thea подбора и Vy НПО за помощь в подготовке csla9 образцов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligosaccaharide Standards | |||
| Mannose | Sigma-Aldrich | CAS 3458-28-4 | |
| Mannobiose | Megazyme | CAS: 14417-51-7 | |
| Mannotriose | Megazyme | CAS: 28173-52-6 | |
| Mannotetraose | Megazyme | CAS: 51327-76-5 | |
| Mannopentaose | Megazyme | CAS: 70281-35-5 | |
| Mannhexaose | Megazyme | CAS: 70281-36-6 | |
| Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) | Megazyme | P-GLCML | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other specialty chemicals | |||
| 8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid | (Molecular probes) Thermo | A350 | |
| 2-picoline borane | TCI | B3018 | |
| 40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) | Bio-rad | 1610146 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialty Equipment | |||
| Gel casting kit | Hoefer | SE660 kit | 18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers |
| Cooling recirculating water bath | Hoefer | RCB20-plus 115v | Needs to be able to maintain temperature at ~10 C |
| G:Box Chemi XRQ Imaging System | Syngene | 05-GBOX-CHEMI-XRQ | Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs |
| High Voltage Power Pack | Thermo | EC1000XL | 1000V |
| Vacuum centrifuge(Speedvac) | Savant | SPD131 | |
| Vertical Gel electrophoresis system | Hoefer | SE660 | |
| Glycosyl hydrolases | |||
| These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab supplies | |||
| 15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-918 | |
| 50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-951 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gel imaging software ( Genesys) | Syngene |
References
- Barton, C. J., et al. Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Planta. 224 (1), 163-174 (2006).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).
- Mortimer, J. C. Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE. Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).
- Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage. Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).
- Mortimer, J. C., et al. An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14. Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).
- Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).
- Busse-Wicher, M., et al. Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose. Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).
- Mortimer, J., et al. Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).
- Anders, N., et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses. Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).
- Goubet, F., et al. Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis. Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).
- Rogowski, A., et al. Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility. J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).
- Rogowski, A., et al. Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine. Nat Commun. 6, 7481 (2015).
- Handford, M. G., et al. Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana. Planta. 218 (1), 27-36 (2003).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).
- The Carbohydrate Active Enzyme Database. , www.cazy.org (2017).
- Hogg, D., et al. The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation. Biochem J. 371, (Pt 3) 1027-1043 (2003).
- Brennan, Y., et al. Unusual microbial xylanases from insect guts. Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).
- Li, X., et al. Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes. Biotechnol Biofuels. 6, (2013).
