Summary
ويرد وصف بروتوكول للتحليل الهيكلي للسكريات بهلام التفريد (PACE)، استخدام المنان على سبيل مثال،.
Abstract
السكريات جدار الخلية النباتية، يصعب تحليلها، ومعظم الأساليب يتطلب معدات غالية الثمن والمشغلين المهرة، وكميات كبيرة من المواد النقية. وهنا، يمكننا وصف بسيط الأسلوب للحصول على مفصلة المعلومات السكاريد الهيكلية، بما في ذلك قرار ايزومرات الهيكلي. لتحليل السكاريد بالتفريد هلام (PACE)، هو تحلل المواد جدار الخلية النباتية مع hydrolases glycosyl محددة إلى السكاريد الفائدة (مثلاً، ماناناسيس المنان). ثم تستخدم تنسيق كبير polyacrylamide الهلام لفصل oligosaccharides المفرج عنهم، وقد وصفت فلوريسسينتلي. يمكن تصور الهلام مع هلام تعديل نظام التصوير (انظر الجدول للمواد). بصمة oligosaccharide الناتجة يمكن أما مقارنة نوعيا، أو مع النسخ المتماثل، كمياً. الربط والمعلومات التفريعي يمكن إنشاء باستخدام hydrolases glycosyl إضافية (مثل مانوسيداسيس وجالاكتوسيداسيس). بينما يصف هذا البروتوكول وسيلة لتحليل هيكل glucomannan، أنه يمكن تطبيقها على أي السكاريد التي تتسم جليكوسيل هيدرولاسيس موجودة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدامه لتميز hydrolases glycosyl رواية استخدام ركائز السكاريد محددة.
Introduction
تحليل السكاريد بالتفريد هلام (PACE) أسلوب لوصف مفصل للسكريات1،،من23. السكريات جدار الخلية النباتية، يصعب تحليلها، ومعظم الأساليب يتطلب معدات غالية الثمن والمشغلين المهرة، وكميات كبيرة من المواد النقية. وهنا، يمكننا وصف بسيط الأسلوب للحصول على مفصلة المعلومات السكاريد الهيكلية، بما في ذلك قرار ايزومرات الهيكلي.
فهم مصنع جدار الخلية السكاريد بنية ضروري لهؤلاء الباحثون استكشاف الحيوي جدار الخلية النباتية أو دور جدار الخلية النباتية في تطور النبات. في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، تكوين جدار الخلية النباتية أصبحت مثيرة للاهتمام لمجموعة أوسع نطاقا من الباحثين بسبب التركيز على استخدام الكتلة الحيوية النباتية (أساسا جدار الخلية) كمادة وسيطة لإنتاج الوقود الأحيائي وبيوشميكلس4. على سبيل مثال، يتطلب ساكتشاريفيكيشن الانزيمية كفاءة هذه المواد فهم مفصل لهياكل السكاريد، حتى يمكن الكوكتيل الانزيمية الأمثل المحدد5.
وتيرة مزايا عديدة على الطرق البديلة التي تجعله مثاليا للتحليل السريع للهياكل المعقدة جليكان. أولاً، أنها لا تتطلب تنقية السكاريد في السؤال، كما هو مطلوب لحل الدولة الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)6. وثانيا، يمكن حل وتيرة ايزومرات الهيكلي، على عكس الكتلي (مرض التصلب العصبي المتعدد، مثلاً، ساعد مصفوفة الليزر الامتزاز/التأين (استخدام) والتاين اليكتروسبراي (ESI))، التي يمكن أيضا أن يكون تحديا لتنفيذ بواسطة اللوني السائل (ش) 7-ثالثا، وتيرة حساس جداً، مع القرار منخفض-بيكومولي، على عكس كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) أو الفصل اللوني للورق. وأخيراً، أنها لا تتطلب معرفة المعدات أو أخصائي مكلفة، كما الحال لمرض التصلب العصبي المتعدد، والرنين المغناطيسي، و LC.
الأسلوب الخطي يعتمد على خصوصية جليكوسيل هيدرولاز (غ) الإنزيمات، التي تستهدف بعض الروابط glycosidic في خليط السكريات. عندما يعمل الإنزيم هرمون النمو على سلسلة السكاريد، فإنه يكشف عن وضع نهاية الحد الذي يمكن ثم يتم كيميائيا ديريفاتيزيد، في هذه الحالة مع تسمية فلورسنت. ولذلك أصبح الجزء أونهيدروليزيد من العينة لا يمكن الكشف عنها بهذا الأسلوب. ثم يتم فصل oligosaccharides المسمى في هلام اكريلاميد تنسيق كبير بالتفريد. وهذا يعطي القرار ممتاز لجزيئات مشابهة جداً، على سبيل المثال، سيكون تريساكتشاريديس الأخضر-رجل-رجل والأخضر-الرجل-الأخضر R مختلفةو.
وقد استخدمت على نطاق واسع وتيرة تميز الهياكل إكسيلان مختلفة عبر الأنواع النباتية8، لتحديد طفرات جليكوسيلترانسفيراسي في نبات6،،من910،11 لإجراء فحوصات جليكوسيلترانسفيراسي9وتميز رواية غ الأنشطة12،13. نحن أيضا في الآونة الأخيرة استخدامه لتوصيف المنان جدار خلية الخميرة (محبوبي ومورتيمر، في إعداد). هنا يصف لنا طريقة لوصف بنية glucomannan جدار الخلية النباتية، استناداً إلى التقارير السابقة11،14.
Protocol
1-"حصاد المواد النباتية"
- حصاد المواد النباتية الطازجة (~ 20 ملغ) وفورا تغرق في الإيثانول 96% (v/v)، واحتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ وهذا يلغي تنشيط أي خلية جدار اللاإنسانية هذه الإنزيمات. بالنسبة للمواد الجافة، ابدأ في الخطوة 2-
تنبيه: الإيثانول الاشتعال.
ملاحظة: ورقة واحدة الجذعية أو روزيت سوف توفر ما يكفي من المواد لتحليل. ومع ذلك، تنشأ أخطاء أقل إذا كان تجميع كمية أكبر من الأنسجة وتحليلها حيث أن هذه أسهل تزن والتعامل معها. - نوع الأنسجة بدقة سجل ومرحلة النمو، كهيكل السكاريد يختلف مع على حد سواء. على سبيل المثال، مع التمويل نبات (المستخدمة هنا)، مرحلة الأنسجة وفقا للأساليب من بويز et al. 15
ملاحظة: في هذا البروتوكول، وقد استخدمنا النصف السفلي من الساق نورات، حيث خردلة الأول هو ممدود تماما لكن لا اصفرار.
2-إعداد بقايا الكحول غير قابلة للذوبان (الهواء)
- تحضير الهواء، واتباع أسلوب مورتيمر et al. 9 أو طريقة مشابهة أخرى، بغية إنتاج مسحوق يفتقر السكريات قابل للذوبان، مثل السكروز والنشا.
3. اليقوتينج والمعالجة المسبقة للهواء
ملاحظة: الكمية المضبوطة من الهواء اللازمة لكل عينة سيتوقف على (أ) وفرة السكاريد اهتمام بهذه المواد و (ب) متوسط حجم oligosaccharides التي أصدرتها هرمون النمو. يضيف الأسلوب جزيء فلوري واحد إلى تخفيض نهاية كل oligosaccharide، حيث يحدد عدد oligosaccharides حساسية التجربة. كمبدأ توجيهي، glucomannan في نبات الجذعية يهضم مع GH5/GH26 (كما هو موضح)، 500 ميكروغرام يوصي 11، بينما يوصي 100 ميكروغرام إكسيلان في نبات الجذعية يهضم مع GH11، كما هو الحال في مورتيمر ' دراسة s 3-
- وزن الهواء (10-15 ملغ) في أنبوب الطرد 15 مل، وإضافة ح 2 س بتركيز نهائي 2 ملغ/مل. دوامة لتحقيق وقف حتى. إذا كانت هذه الإشكالية، ثم استخدم الخالطون زجاج للمساعدة في هذه العملية.
- اليكووت 500 ميكروغرام في [ميكروفوج] أنابيب. جاف مختبرين باستخدام أجهزة الطرد مركزي فراغ (انظر الجدول للمواد) بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
- قبل "علاج الهواء" مع هيدروكسيد الصوديوم م 1 (20 ميليلتر) ح 1 في درجة حرارة الغرفة؛ وهذا الشطب أسيتيلاتيس السكريات وتتضخم microfibrils السليلوز، يعطل بنية الكتلة الأحيائية والسماح بوصول هرمون النمو.
ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة للسكريات المنقاة. تنبيه – حمض/قاعدة قوية.- تشتمل قاسمة لعنصر تحكم جوي لا إنزيم (تعامل نفس العينات كل، باستثناء الخطوة 4، 1. يتم استبعاد).
- إضافة 200 ميليلتر من ح 2 س و 20 ميليلتر 1 M HCl لتحييد. اختبار أن الرقم الهيدروجيني هو ~ 6-7 عن طريق إزالة 1 ميليلتر واكتشاف ذلك على شرائح مؤشر الأس الهيدروجيني ورقة-
- إضافة 50 ميليلتر م 1 الأمونيوم اسيتات المخزن المؤقت، pH 6.0 (أو أيا كانت درجة الحموضة المناسبة للنظام المتوائم المستخدمة في الدراسة) وح 2 س لإعطاء إجمالي حجم 500 ميليلتر.
ملاحظة: يتم استخدام خلات الأمونيوم حيث أنها سوبليميس عند التجفيف، وحيث أنه لا يقوم بإضافة الملح إضافية للعينة. وجود فائض ملح يمكن أن تؤدي إلى الفرقة سيئة والقرار في جل خطي.
4. التحلل المائي للهواء مع Glycosyl Hydrolases (GHs)
ملاحظة: كما ورد في المناقشة، نقاء النظام المنسق عالمياً الحاسم. استخدام فقط وأعرب عن هيتيرولوجوسلي، تقارب تنقية الإنزيمات. عند استلام كل الكثير من الشركة المصنعة، يتحلل مختبرين محددة من الركازة (مثلاً 500 ميكروغرام الهواء) مع زيادة كميات من هرمون النمو بين عشية وضحاها (مثلاً، 0.5، 1، 2، 5، 10، 15، 20 ميليلتر) (3 وحدات/ميليلتر). عندما يكون هناك فائض من هرمون النمو، سوف تبدو بصمات الأصابع وتيرة مماثلة. وجود فائض إنزيم مطلوب تسليم نتيجة استنساخه لأنه يجب أن تتأكد من أن رد فعل التحلل يقترب من نقطة النهاية.
- إضافة كمية محددة سلفا (انظر أعلاه) ماناناسيس (GH5 و GH26 11) إلى مختبرين الهواء في المخزن المؤقت من الخطوة 3، 5، فضلا عن إيجابية (30 ميكروغرام من konjac glucomannan)، وعنصر التحكم لا الهواء سلبي (ميكس الإنزيم في أنبوب فارغ). ودوامه، وتدور ثم بإيجاز لجمع الخليط رد فعل في الجزء السفلي من الأنبوب.
- احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية (أو درجة الحرارة المناسبة لهرمون النمو الاختيار) مع الانفعالات لطيف (~ 100 لفة في الدقيقة)-
- وقف رد الفعل التي تفرخ في 95 درجة مئوية عن 20 دقيقة
ملاحظة: يمكن استخدام غطاء الإغلاق لختم أعلى الوجه [ميكروفوج] أنابيب.- الطرد المركزي باستخدام [ميكروفوج] أعلى هيئة بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق، والاحتفاظ بالمادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه في 250 ميليلتر ح 2 س، كما ذكر أعلاه، للطرد المركزي والاحتفاظ بالمادة طافية.
- الجمع بين كلا سوبيرناتانتس، وجاف في فراغ للطرد مركزي (انظر الجدول للمواد) في 30 درجة مئوية (ح ~ 3 أو بين عشية وضحاها دون تدفئة).
5. إعداد معايير Oligosaccharide
- الأسهم 1 مم تحضير الحلول في ح 2 س يطلق (رجل)، مانوبيوسي (رجل 2)، مانوتريوسي (رجل 3)، مانوتيتراوسي (رجل 4)، مانوبينتاوسي (رجل 5) و مانوهيكساوسي (رجل 6)، جميع β، 1-4 مرتبطة. قاسمة ومخزن في-20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
- إعداد 3 تركيزات مختلفة من رجل خليط 1-6 عن طريق الجمع بين 1 ميليلتر (S1 القياسية)، 2 ميليلتر (S2) أو 5 ميليلتر (S3) لكل ست.
- الجافة في فراغ للطرد مركزي (انظر الجدول للمواد) في 30 درجة مئوية (~ 1 ح)-
6. عن أوليجوساكتشاريديس
- تحضير حلاً أسهم من النمل 0.2 M (حمض 8-أمينونافثاليني-1,3,6-تريسولفونيك) في ح 2 س: حمض الخليك 17:3. الأسهم الحارة إلى 60 درجة مئوية تذوب تماما الصلبة. مخزن في-20 درجة مئوية، محمية من الضوء، لمدة 2-3 أشهر.
- تعد حلاً أسهم 0.2 M من برن 2-بيكوليني (2-الجريدة الرسمية) في [دمس]. هذه الغاية بلوري، ريسوسبيند ذلك على الفور جميع مسحوق عند استلام في [دمس]. قاسمة، ومخزن في-20 درجة مئوية لمدة 1-2 سنوات. ذوبان الجليد مختبرين المطلوبة (مخزن في 4 درجات مئوية لأسبوعين ومن ثم تجاهل).
- إعداد المخزن المؤقت derivatization ح 2 س: حمض الخليك: [دمس] في 17:03:20-
- لكل عينة، إضافة 5 ميليلتر من النمل، 5 ميليلتر من الجريدة الرسمية 2 و 10 ميليلتر من derivatization المخزن المؤقت. تدور بإيجاز لجمع في الجزء السفلي من الأنبوب، دوامة جيدا، وثم تدور بإيجاز مرة أخرى. انظر الشكل 1 لوصف رد فعل-
- عينات إينكوباتي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
- الجافة في فراغ للطرد مركزي (انظر الجدول للمواد) في 30 درجة مئوية (ح ~ 2)- عينات
- ريسوسبيند والموحدة في 100 ميليلتر م 3 اليوريا. مخزن في-20 درجة مئوية، محمية من الضوء حتى المطلوبة.
7. إعداد وتيرة الهلام
ملاحظة: الجمعية معدات صب جل سيتوقف على العلامة التجارية. وهنا، نحن يوسراج الدين نظام التفريد عمودي (انظر الجدول للمواد)، مجهزة بألواح الزجاج 18 × 24 سم و 1.5 ملم الفواصل.
- تجميع معدات صب جل الواحد الصانع ' تعليمات s-
- جعل 10 x وتيرة العازلة (1 م تريس-بورات، pH 8.2) على النحو التالي: إضافة ز 121.14 قاعدة تريس ~ 400 مل ح 2 س، ومزيج لحل. ضبط درجة الحموضة إلى 8.2 بإضافة الماء المقطر الصلبة (حوالي 60 غرام)، ومن ثم جعل حجم ما يصل إلى 1 ل.
- جعل أمونيوم 10% (w/v) الأوراق المالية فوق كبريتات (الجزائرية) في ح 2 قاسمة سين وتخزين في-20 درجة مئوية. ذوبان الجليد مختبرين مرة واحدة وتخزين في 4 درجات مئوية وتجاهل بعد أسابيع 2-
- جعل وصب جل حل. للمعدات المذكورة أعلاه، مساواة جل 1 إلى 50 مل. في أنبوب الطرد مركزي 50 مل، مزيج ح 2 س (20.2 مل)، مل 5 10 x وتيرة العازلة، 24.6 مل 40% الاكريلاميد/مكررا-اكريلاميد (acrylamide:Bis فيها). (تنبيه: السامة).
- إضافة 200 ميليلتر لوكالة الأنباء الجزائرية و 20 ميليلتر ن، ن، ن، N´-ميثيل-الإيثيلنديامين (تيميد). عكس برفق لخلط (لتجنب إدخال فقاعات الهواء). صب جل استخدام المصلية أو أخرى ماصة حجم كبير، إلى ~ 4 سم تحت الجزء العلوي من ألواح الزجاج. إيلاء الاهتمام لإمكانية الوقوع في فخ الهلام فقاعات الهواء. إذا أنها تفعل وقف صب والميل برنامج المساعدة التقنية للهلام الإفراج عنهم.
- تراكب الجل مع الايزوبروبانول (تنبيه : قابلة للاشتعال)، أو بعناية، مع السماح سين هلام بلمرة (20-30 دقيقة)، ثم من أجل إيقاف الطبقة العليا ح 2. إذا تم استخدام الكحول، ثم يغسل x 2 مع ح 2 الجاف سين أي سائل الزائدة باستخدام ورق نشاف. جعل
- وصب جل التراص. مزيج 6.8 مل ح 2 س، 1 مل 10 x سرعة العازلة، 2.8 مل الاكريلاميد/مكررا-مادة اكريلاميد (تنبيه: السامة)، ميليلتر 80 وكالة الأنباء الجزائرية، و 8 ميليلتر من تيميد في أنبوب الطرد مركزي 15 مل. عكس إلى المزيج، وتراكب على رأس جل حل مبلمرة. إدراج بلطف كومز، تجنب فقاعات الهواء الملائمة تحت أسنان المشط.
- السماح هلام بلمرة (20-30 دقيقة)، التفاف في الأنسجة الرطبة، ومن ثم في غلاف بلاستيكي، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة. مخزن مع الامشاط في مكان-
ملاحظة: وتيرة المواد الهلامية يمكن تخزينها لمدة أقصاها أسبوعان (على الرغم من أن أقل من 1 الأسبوع المثل الأعلى)، إذا كان يتم الاحتفاظ بها رطبة.
8. تشغيل بسرعة جل
- استخدام علامة دائمة لتسمية المناصب جيدا على الزجاج، التي سوف تساعد في اقتفاء أثر ترتيب التحميل، وفي تحديد أين الآبار بمجرد إزالة المشط. إزالة
- المشط. سد الآبار مع المخزن المؤقت لخطى س 1- استخدام
- ميكروسيرينجي 10 ميليلتر لتحميل 2 ميليلتر من المعايير وعينات في الآبار. تجنب استخدام الممرات الأبعد، التي تميل إلى تشغيل عينات سيئة-
- تجميع الدائرة العليا جهاز التشغيل هلام، والجل في خزان تبريد (~ 10 درجة مئوية) قيد تشغيل (10 درجة مئوية) الذي يحتوي على المخزن المؤقت لوتيرة x 1. شغل مجلس الشيوخ مع المخزن المؤقت لخطى س 1-
- تشغيل الطاقة، وتشغيل هلام 200 V (ثابت الخامس) لمدة 30 دقيقة، ومن ثم زيادة الجهد إلى 1000 الخامس 1h 40 دقيقة. حماية المواد الهلامية من الضوء (مثلاً، بالتفاف الدبابات في أكياس القمامة السوداء)-
ملاحظة: التحقق من المواد الهلامية ~ 5 دقائق بعد تشغيل التيار الكهربائي، وثم آخر 5 دقائق بعد زيادة الجهد V و 000 1. إذا كانت حزمة الطاقة غير قادر على الحفاظ على الجهد ثم يرجح أن هناك تسرب للمخزن مؤقت. إزالة الجل من الدبابة. إعادة تجميع الدائرة العليا، التحقق بعناية وضع جميع أطواق منع التسرب. قد تمنع شريحة كبيرة على الحافة العلوية من لوحة زجاج لوحة تشكيل ختم جيدة مع طوقا. وهذا يمكن عادة حل مؤقتاً بإضافة قطره من 5% (w/v) المنصهر [اغروس] إلى الجزء متكسرة من الزجاج، قبل إضافة مجلس الشيوخ.
9. تصور هلام خطي
ملاحظة: استخدم جل التصوير نظام مجهزة بمصابيح الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجه ترانسيلوميناتور، وعامل تصفية انبعاثات للكاميرا التي مناسبة فلوروفوري، هنا 530 نانومتر. وبدلاً من ذلك، ماسح ليزر يمكن أيضا استخدام، كما هو موضح في جوبيت 2-
- ضمان هلام نظام تصوير الغبار مجاناً بالمسح عليه مع الأنسجة رطبة خالية من الوبر.
- إزالة الجل من خزان خطي، وعرض بإيجاز في حين الجل لا يزال في ألواح الزجاج (< مللي 80) لتحديد ما إذا صبغ الجبهة لا تزال على الهلام.
- فتح الجل باستخدام أداة آسفين، وفي حين لا يزال على لوح زجاج واحد جل، استخدام قطع بيتزا لإزالة كلا هلام التراص، وإذا كان صبغ الجبهة لا تزال على الهلام، الجزء السفلي من الجل.
- ~ 5 مل ح 2 س على السطح من ترانسيلوميناتور، وثم نقل الهلام مباشرة على ترانسيلوميناتور. تعيين عامل التصفية إلى 605 الأشعة فوق البنفسجية، وقم بتشغيل ترانسيلوميناتور خارج الأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول للمواد) باستخدام البرمجيات-
ملاحظة: قد فلوروفوري النمل المستخدمة هنا إثارة/انبعاث 353/520 نانومتر. - تأخذ عدة صور في أوقات مختلفة من التعرض (مثلاً 100 مللي ثانية إلى 10 s). تأكد من تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين الصور عن طريق النقر فوق الزر ضوء الأشعة فوق البنفسجية (لإيقاف تشغيله) لتجنب اللاإنسانية الأسفار. ضمان أن يكون على الأقل 2 الصور لا عصابات المشبعة (جل برامج التصوير سيشير هذا)-
- حفظ الملفات كصور عالية-resolution.tif-
ملاحظة: يمكن تحليل الصور باستخدام البرامج المتوفرة مع هلام نظام التصوير، أو باستخدام برنامج تحليل الصور متاحة بحرية، مثل إيماجيج (https://imagej.nih.gov/ij/). راجع المقطع النتائج لمناقشة كوانتيتيشن.
Representative Results
هنا، نحن إظهار جل خطي مثال تشغيل كل البروتوكول، جنبا إلى جنب مع وصف للمساعدة على تفسير البيانات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، ويعقب ذلك دليل عام لنجاح وتيرة جل تفسير13،16. هلام ممثل بسرعة قياسية تحليل محتويات الخلية جدار المنان ويرد في الشكل 2، ويوصف بلين بلين.
المعايير
حارات 1، 2 و 3 إظهار سلم oligosaccharides التي تم شراؤها تجارياً (رجل1-رجل6) في 5 (S1) و 10 (S2) و 50 تركيز pmol (S3). عند تلقي جديدة الكثير من oligosaccharide التجارية، من المهم أن تحقق النقاء في هلام. العديد من oligosaccharides، لا سيما تيتراساكتششاريديس ويمكن أن يكون أطول وتلوث كبير مع أوليجوساكتشاريديس الأخرى درجة بلمرة (DPs)، كما هو موضح هنا للرجل6 (علامة *). بينما كوانتيتاتينج هلام، من المهم أن يكون على الأقل 3 تركيزات للمعايير، حيث أنها ضرورية لحساب المنحنى القياسي. كما يمكن حساب المنحنى القياسي مفيدة للتأكد من أن رد فعل derivatization أساسا في الإنجاز. معايير لتركيزات معروفة تسمح بإجراء مقارنات بين المواد الهلامية، وهي عنصر تحكم مفيدة لفصل جودة ونوعية derivatization.
مراقبة إيجابية
4 لين يظهر هضم ماناناسي konjac glucomannan. Konjac glucomannan متوفرة تجارياً، وفي حين أنه ليس لديها نفس الهيكل الذي، على سبيل المثال، وجدت في نبات، فإنه يخدم غرضين. أولاً، عنصر هام لهضم الانزيمية. ينبغي وضع الباحث ما يشبه ركيزة تجارية يهضم مع النظام المتوائم على الاختيار عند هضمها للإنجاز (أي فائض شاسعة من هرمون النمو هو إضافة إلى رد الفعل). إذا في المستقبل تجارب النمط التغييرات، وهذا يمكن أن تشير إلى فقدان النشاط أو تلوث المخزون هرمون النمو. وثانيا، هو بمثابة عنصر تحكم لرد فعل derivatization حضور الأملاح الإنزيم والمخزن المؤقت. إذا كانت المعايير التي تبدو جيدة، ولكن عنصر التحكم الإيجابي الفقراء، ثم قد يشير هذا إلى أن عنصر من رد فعل التحلل المائي لا المثبطة derivatization.
نبات البرية نوع (WT) الجذعية الجوي + ماناناسي كوكتيل (GH5 + GH26)
5 لين يظهر بصمة خطي من ساق نبات WT (مقارنة مع المراجع11،14).
csla9 نبات الجذعية الجوي + ماناناسي كوكتيل (GH5 + GH26)
6 لين يظهر يظهر بصمة وتيرة تنبع من نبات النباتية التي تفتقر إلى الرئيسية وقف المنان synthase11. مقارنة لوزن والمراقبة السلبية بصمات الأصابع. بينما غالبية المنان غائب في هذا المصنع، وتظل كمية صغيرة، كما يتضح من كثافة الفرقة مخفضة لجميع oligosaccharides المستمدة من ماناناسي وهذا يتم تصنيعه حسب المنان إضافية سينثاسيس (CSLA2، 3)11.
السلبية تحكم-إنزيم فقط
8 لين يظهر العصابات في جل ليست محددة مستمدة من الملوثات في ماناناسي كوكتيل، وينبغي أن تستبعد من التحليل (ملحوظ مع *).
السلبية تحكم-"وزن الهواء" فقط
9 لين يظهر العصابات في الجل غير محددة، وينبغي أن تستبعد من التحليل (علامة *).
مراقبة سلبية- csla9 الهواء فقط
10 لين يظهر العصابات في الجل غير محددة، وينبغي أن تستبعد من التحليل (علامة *).
باين الخشب الهواء + ماناناسي كوكتيل (GH5 + GH26)
7 لين يظهر بصمة خطي من خشب الصنوبر، الذي يحتوي على جالاكتوجلوكومانان. هذا بوضوح نمطاً مختلفاً من oligosaccharides المفرج عنهم إلى نبات، بسبب هيكلها مختلفة.
السلبية تحكم-"الصنوبر الجوي" فقط
11 لين يبين الفرق على الهلام غير محددة، وينبغي أن تستبعد من التحليل (علامة *).
تفسير هلام خطي بسيط نسبيا، ولكن يتطلب الوعي بالنقاط التالية. لبيانات قوية، من المستحسن القيام بسرعة على الأقل 3 التي نمت بشكل مستقل البيولوجية يتطابق، ويوصي بإجراء replicates التقنية 2 على الأقل في كل تكرار البيولوجية. الضوابط المذكورة حاسمة بالنسبة للترجمة الشفوية، عصابات غير محددة بحاجة استبعاد. كما نوصي بتحميل عينات في ترتيب مختلف عن تكرار المواد الهلامية، استبعاد الآثار التي تنجم عن الإضاءة متفاوتة قبل ترانسيلوميناتور. التفسير الدقيق يتطلب تحليلاً للعصابات التي هي غير المشبعة. حيث قد تحتوي بعض بصمات oligosaccharide كلا السكريات وفرة عالية ومنخفضة جداً، نحن نوصي بتحليل التعرض لأخطار متعددة من جل نفسه. يمكن استخدام المعايير لتطبيع بين صور مختلفة.
لبعض أنواع التجارب، قد يكون من المستصوب تحديد مقدار السكاريد في إعداد الهواء. في حين أنه من الممكن تحديدها كمياً من جل خطي، فإنه يتطلب معرفة هوية الجزيئي الدقيق لكل oligosaccharide الصادرة عن النظام المتوائم وحيث أنه يقع على الوتيرة هلام. هذا هو حاليا ليست تماما معروفة المنان، ولكن ثبت لسائر السكريات مثل زيلان3. المعايير التي توفر وسيلة لتطبيع بين المواد الهلامية، حتى عندما لا يتم إجراء كوانتيتيشن، وذلك سيساعد في أي التحليل النوعي أو الكمي شبه.
تحديد هيكل oligosaccharides الفردية يمكن تحقيقه باستخدام زجاجات من النظام المتوائم. تسلسلي إضافة مزيد من النظام المنسق عالمياً يمكن أن تكشف عن تفاصيل حول الروابط وبدائل من oligosaccharides المفرج عنهم (مثلاً، إضافة لبيتا-1، 4- جلوكوسيداسي التي سوف تكشف عن أفعال في نهاية الحد من غير التي أوليجوساكتشاريديس في الخليط يحتوي على هذه الميزة). وتشمل الإنزيمات متاحة جالاكتوسيداسيس، جلوكورونيداسيس وجلوكوسيداسيس (انظر قاعدة بيانات كازي16 للحصول على معلومات إضافية)؛ انظر هوغ، دال- et al. 17 على سبيل مثال.
يمكن استخدام البروتوكول أعلاه لتميز النشاط غير معروف عالمياً. في هذه الحالة، ينبغي استخدام طاقة الكتلة الأحيائية محددة، مثل نبات الجذعية أو konjac glucomannan، شاشة النظام المتوائم غير معروف13.
الشكل 1 : وهذا يدل على مخطط derivatization نيون من oligosaccharides مع النمل. تعديل من جوبيت2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : هلام "خطي الممثل" تظهر بصمات الأصابع المنان من نبات والصنوبر والمسخ نبات (csla9) الذي أعاق الحيوي منان. كان تحلل AlR مع ماناناسي كوكتيل، و oligosaccharides المفرج عنهم كانوا ديريفاتيزيد مع فلوروفوري. تم فصل في oligosaccharides بالتفريد جل على أساس الحجم والشكل، ورسوم. سلم من مانو-oligosaccharides (Man1-6) للمساعدة في تحديد موبيليتيس النسبي من oligosaccharides المفرج عنهم، والتحلل منان المنقي (مشتقة من konjac) يظهر كعنصر إيجابي. * = عصابات غير محددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وتيرة أسلوب مباشر لوصف بنية السكاريد. ويمكن تطبيقها لأي السكاريد التي معروفة هناك النظام المتوائم مع النشاط تتسم، راجع أمثلة عديدة في الأدب1،،من69،11. ترينيداد وتوباغو وطبق أيضا وصف رواية النظام المتوائم12،،من1318 وجليكوسيلترانسفيراسيس9، بجعل استخدام ركائز السكاريد المعرفة ومتقبلون.
النتائج استنساخه، والتفسير التي تعتمد على ثلاث خطوات رئيسية. أولاً، ينبغي أن يكون النظام المتوائم المستخدمة خالية من تلويث الأنشطة. وهذا أفضل يتحقق عن طريق استخدام فقط أعربت عن هيتيرولوجوسلي، تقارب تنقية الإنزيمات. ثانيا، لمعظم التجارب، من المهم أن التحلل المائي الأنزيمي لركائز إنجاز. وهذا يضمن أن يعطي نفس الكتلة الأحيائية تحلل مع هرمون النمو نفس بصمات الأصابع نفسها في كل تجربة. أخيرا، ينبغي أن يكون هناك فائض في فلوروفوري في رد فعل derivatization. وهذا ما يضمن أن ينتهي الحد المتاحة هي المسمى في ما يقرب من 100%. وهذا سيؤدي إلى إمكانية تكرار نتائج عالية من النتائج، فضلا عن البيانات الكمية.
هلام وكاشف نوعية ذات الأهمية الحاسمة لضمان البيانات استنساخه. المخازن المؤقتة رديئة النوعية، خاصة بالنسبة لدرجة الحموضة غير صحيحة، الهواء فقاعات في الهلام، وعينات مع وجود فائض ملح يمكن أن تؤثر على جميع القرار والاحتفاظ بعامل من oligosaccharides. ومع ذلك، سيمكن إدراج عناصر التحكم الموصى بها الموضحة في قسم البروتوكول و النتائج استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
وتيرة يحد من قدرته على تحديد أوليجوساكتشاريديس. لبعض التجارب، وبصمات الأصابع بسيط هو كل ما ضروري. مع ذلك، حقاً قوانتيتاتي مبلغ glucomannan في عينة هواء، على سبيل المثال، هوية جميع oligosaccharides تم إصدارها المطلوب، وهي عملية تستغرق وقتاً طويلاً. وهذا أكثر وضوحاً لأقل السكريات المعقدة مثل زيلان3. أن هناك معايير oligosaccharide القليلة المتاحة تجارياً، قد لا دائماً يكون ممكناً أو مرغوباً فيه للتعرف على جميع النطاقات. في هذه الحالة، يمكن أن توفر سرعة بيانات مجانية جداً إلى الطيف الكتلي (أي استخدام--سيد9 أو أي إس أي--مايكروسوفت7، والرنين المغناطيسي النووي6). لهذه الأساليب، يكون من المفيد عادة القيام إعداد كبيرة، وفصل بحجم الاستبعاد اللوني، وثم تحليل كل جزء من كلا خطي قبل مرض التصلب العصبي المتعدد أو الرنين المغناطيسي النووي. بينما أفيد أن العصابات يمكن اقتطعت وتحديدها باستخدام--سيد، في الممارسة وقد وجدنا أن هذا انخفاض معدل النجاح (ربما بسبب التفاعلات oligosaccharides المسمى مع هلام الاكريلاميد عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية).
هو الحد الرئيسية الأخرى من وتيرة الإنتاجية. بنوعية جيدة، والمواد الهلامية التفسير مع الضوابط المناسبة، وسوف يكون كل جل فقط ~ 10 عينات تجريبية، وباحث يمكن أن نتوقع أن تشغيل ~ 4 وتيرة الجل يوميا. إصدار من وتيرة استخدام التفريد الشعرية (CE) في الآونة الأخيرة نمواً19، الذي يسمح إعداد العينات في لوحات 96-جيدا. أنها استخدمت بنجاح لوصف نشاطات الإنزيم جليكوسيلترانسفيراسي والسكاريد هياكل6،19، على الرغم من أنه يتطلب الوصول إلى جهاز CE، والتي يمكن أن تكون مكلفة شراء وصيانة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وضعت طريقة خطي والأمثل من قبل مختلف أعضاء الفريق دوبري (جامعة كامبريدج، المملكة المتحدة) على مر السنين، ونحن نقدر جميع مساهماتها. تم تمويل هذا العمل كجزء من معهد الطاقة الحيوية المشترك الكيان التشغيلي المعين (http://www.jbei.org) تدعمها وزارة الطاقة الأمريكية، ومكتب العلوم ومكتب البيولوجية والبحوث البيئية، عن طريق عقد دي-AC02-05CH11231 بين لورانس مختبر بيركلي الوطني ووزارة الطاقة الأمريكية. ونشكر أيضا اختيار ثيا والمنظمات Vy للمساعدة في إعداد العينات csla9 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligosaccaharide Standards | |||
| Mannose | Sigma-Aldrich | CAS 3458-28-4 | |
| Mannobiose | Megazyme | CAS: 14417-51-7 | |
| Mannotriose | Megazyme | CAS: 28173-52-6 | |
| Mannotetraose | Megazyme | CAS: 51327-76-5 | |
| Mannopentaose | Megazyme | CAS: 70281-35-5 | |
| Mannhexaose | Megazyme | CAS: 70281-36-6 | |
| Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) | Megazyme | P-GLCML | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other specialty chemicals | |||
| 8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid | (Molecular probes) Thermo | A350 | |
| 2-picoline borane | TCI | B3018 | |
| 40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) | Bio-rad | 1610146 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialty Equipment | |||
| Gel casting kit | Hoefer | SE660 kit | 18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers |
| Cooling recirculating water bath | Hoefer | RCB20-plus 115v | Needs to be able to maintain temperature at ~10 C |
| G:Box Chemi XRQ Imaging System | Syngene | 05-GBOX-CHEMI-XRQ | Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs |
| High Voltage Power Pack | Thermo | EC1000XL | 1000V |
| Vacuum centrifuge(Speedvac) | Savant | SPD131 | |
| Vertical Gel electrophoresis system | Hoefer | SE660 | |
| Glycosyl hydrolases | |||
| These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab supplies | |||
| 15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-918 | |
| 50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-951 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gel imaging software ( Genesys) | Syngene |
References
- Barton, C. J., et al. Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Planta. 224 (1), 163-174 (2006).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).
- Mortimer, J. C. Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE. Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).
- Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage. Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).
- Mortimer, J. C., et al. An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14. Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).
- Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).
- Busse-Wicher, M., et al. Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose. Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).
- Mortimer, J., et al. Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).
- Anders, N., et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses. Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).
- Goubet, F., et al. Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis. Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).
- Rogowski, A., et al. Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility. J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).
- Rogowski, A., et al. Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine. Nat Commun. 6, 7481 (2015).
- Handford, M. G., et al. Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana. Planta. 218 (1), 27-36 (2003).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).
- The Carbohydrate Active Enzyme Database. , www.cazy.org (2017).
- Hogg, D., et al. The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation. Biochem J. 371, (Pt 3) 1027-1043 (2003).
- Brennan, Y., et al. Unusual microbial xylanases from insect guts. Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).
- Li, X., et al. Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes. Biotechnol Biofuels. 6, (2013).
