Summary
אנו מתארים שיטה עבור מיקום מונחה stereotactically, חשיפה, אבלציה של קליפת השמיעה אצל חולדות. הלוקליזציה של אבלציה מוערך באמצעות ניתוח. שלאחר המוות של המפה קואורדינטות.
Abstract
קליפת השמיעה עכברוש (AC) הופכת לפופולרית בקרב חוקרי מדעי המוח השמיעתית המעוניינים החוויה-התלות פלסטיות, תהליכים תפיסתיים שמיעתיים ושליטה קורטיקלית של צליל עיבוד שמיעתי גרעינים subcortical. לכתובת חדשה אתגרים, הליך לאתר במדויק, בניתוח וחושפים קליפת השמיעה היה לזרז את המאמץ המחקר הזה. נוירוכירורגיה סטיאוטטי משמש באופן שגרתי במחקרים קליניים בבעלי חיים כדי engraft של מחט או אלקטרודה במיקום מוגדר מראש בתוך קליפת המוח השמיעתית. בפרוטוקול הבא, אנו משתמשים בשיטות סטיאוטטי דרך מקורית. אנחנו מזהים ארבעה משולשים קואורדינטות על פני השטח את temporal bone של העכברוש להגדרת חלון זה, ברגע שנפתח, חושף במדויק הן הראשית (A1), cortices (העזוב, הגחוני /) משני של פס' השימוש בשיטה זו, ואז נבצע ניתוח אבלציה של AC. לאחר ולהשפיע מבוצע, זה הכרחי להעריך את לוקליזציה, בגודל סיומת של נגעים ב קליפת המוח. לפיכך, אנו גם מתארים שיטה לאתר בקלות את שלאחר המוות אבלציה AC באמצעות המפה קואורדינטות נבנה על ידי העברת את הגבולות cytoarchitectural של ה-AC אל פני השטח של המוח. השילוב של המיקום מונחה stereotactically אבלציה של AC עם הלוקליזציה של האזור הפגוע של ההנהלה המפה קואורדינטות מקלה על האימות של המידע שהתקבל מן החיה, ומוביל אל ניתוח טוב יותר, הבנה של הנתונים.
Introduction
העכברוש הוא אחד הדגמים בעלי חיים הנפוצים בשימוש במדעי המוח השמיעתית. החוסן של אופן הפעולה שלו עושה את זה מסוגל לעבוד במשך מאות ניסויים ליום. את הרגישות ואת ספקטרליות חדות שמיעה1,2, הארגון האנטומי ופונקציונליים של המערכת המרכזית שלה, להשוות יונקים אחרים3, ליצור העכברוש מודל בעלי חיים מתאימים לניתוח מגוון רחב של נושאי מחקר במדעי המוח השמיעתית. קליפת השמיעה עכברוש (AC), בפרט, היה הנושא של מספר מחקרים אנטומיים, פיזיולוגיים ניסו להבין את מבנה הארגון, תפקיד עיבוד קול3. כיום, ה-AC הפך פופולרי בקרב מדעני מוח מעוניין ניסיון-התלות פלסטיות, השמיעתיים, הבסיס סינפטית של הארגון שדה קלט, הפקד קורטיקלית של עיבוד צליל ב subcortical השמיעה הגרעינים4,5,6,7,8,9. כדי לטפל באתגרים אלה גישות חדשות להוות, שגרות אשר ניתן לאתר במדויק בניתוח לחשוף את המזגן יזרז את מאמצי המחקר. טכניקות סטיאוטטי מקלים להתאים לשפה אזורים ספציפיים בתוך המוח ללא בדיקה פיזיולוגיה. למרות גודל המוח משתנה מעט בין בעלי החיים, המיקום של כל אזור המוח יכול להיקבע באמצעות קואורדינטות סטיאוטטי להגדיר יעדים על הגולגולת של המוח חולדה.
אבלציה מוגבלת של AC הינו הליך כירורגי של האזור חושית של קליפת המוח הקשורים באופן ישיר עם שמיעה. לעומת שיטות אחרות ששימשו כדי לחסום את הפעילות של המזגן, כגון קירור מקומית או לידוקאין זריקות10,11,12, אבלציה ניתוח התוצאות AC לאובדן כרונית של הפונקציה. לפיכך, AC ablations מתאימים יותר עבור לימוד ההשפעות ארוכות הטווח של מניעת בקליפת המוח, כמו גם התופעה עוקבות של הנגע פלסטיות. השילוב של שיטות סטיאוטטי עם ablations כירורגית של AC שימש בהצלחה כדי לחקור את ההשפעות, התנהגותית, הפיזיולוגית של שליטה קורטיקלית מניעת13,14,15 ,16,17,18,19. לדוגמה, דגם עכברוש עם ablations AC הדו-צדדיים שימש לחקור את ההשפעות של אבלציה בקליפת המוח השמיעתית להבהיל רפלקס, גזע המוח תגובות (ABR)16. לאחרונה, אנחנו משווים את ההשפעות כך חד צדדית לעומת ablations דו צדדיים של התוצרת החקלאית עכברוש AC ב ABR ספי, amplitudes והשהיות ארוכות יותר בנקודות זמן שונות לאחר פציעה18. בנוסף, הדגם עכברוש של אבלציה AC מגבילות שימש גם ללמוד את האפקט של corticofugal מסלול ניוון של14,13,collicus נחות15 ו ה באוזן הפנימית17 ,19. לאחר ולהשפיע מתבצעת במוח, זה הכרחי להעריך את לוקליזציה, בגודל סיומת של נגעים ב קליפת המוח. למרות מאוד שימושי, המגבלה העיקרית של מפות tonotopic בהתבסס על תגובות עצביים20,21 הן טכניקות אלקטרופיזיולוגיות הדרושה כדי לאתר את השדות השמיעה במוח חולדה. מאז לא כל המעבדות יש את הציוד הנדרש ו/או התמחות לבצע הקלטות כאלו, אנחנו נבנה מפת קואורדינטות המבוססת על העברת גבולות cytoarchitectural המזגן על תמונה של פני השטח של המוח18. מפה זו יכול להיות מאוד שימושי לאתר את המזגן ללא בדיקה פיזיולוגיה.
בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה עבור מיקום stereotactically מודרכים, חשיפה כירורגי, אבלציה של AC בחולדות. היא גם מתארת כיצד להשתמש שלנו המפה קואורדינטות18 למקם בקלות את הסיומת של הנגע מעל תמונה של פני השטח של המוח ablated.
Protocol
מחקר זה בוצע בהתאמה קפדנית עם שתי תקנות ספרדי (רויאל צו 53/2013 - חוק 32/2007) הנחיות האיחוד האירופי (הוראה 2010 63 EU) על טיפול ועל השימוש בבעלי חיים במחקר ביו-
1. הכנה של העכברוש
הערה: ביצענו את הניסויים בחולדות זכר כדי למנוע שינויים הורמונליים-
- Anesthetize החיה באמצעות שילוב של קטמין הידרוכלוריד (30 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים הידרוכלוריד (5 מ"ג/ק"ג) מוזרק intramuscularly; עם מינון זה, העכברוש צריך להיות עמוק ומורדמת עבור בסביבות ה 1
- לצבוט את העכברוש ' s הבוהן; היעדרות נסיגה של רפלקס מציין כי החיה היא הכרה מלאה. אם העכבר מגיב בלחץ, נותנים הרדמה משלים שליש המינון הראשוני.
- לגלח את הקרקפת ולחטא את האזור הכירורגי עם povidone יוד.
- במקום החיה על כרית החימום כדי לשמור על חום של 38 מעלות צלזיוס ולייצב את החיה ' ראשו בתוך מסגרת stereotaxic באמצעות שני האוזן ברים ובר ביס. להשתמש בזהירות כדי למנוע את התוף עם מייצגי האוזן פירסינג.
- להגן על העיניים באמצעות החלת טיפת ג'ל עיניים או סרום תמיסת מלח על כל עין.
2. המיקום של ה-AC העצם הטמפורלית של העכברוש
- באמצעות אזמל, אעשה חתך לאורך הקו האמצעי כדי לחשוף את הגולגולת ומשכו קרום העצם המכסים את פני השטח של הגולגולת.
- השתמש טיפ כותנה סטרילי בעדינות ולהסיר את כל הדם המכסים את פני השטח של הגולגולת לדמיין bregma, למבדה, ו- 0 interaural לפי הרי האטלס Paxinos וווטסון של המוח עכברוש 22.
- לעשות חתך בשריר הטמפורלי ליד הכניסה הגבי שלה על הגולגולת עם אזמל. משוך את השריר החוצה באמצעות חומר ומחט תפירה, ולתקן את חומר תפרים למסגרת סטיאוטטי; זו תחשוף את העצם הטמפורלית. אם הדימום מתרחש, לשטוף עם סליין סטרילי קר.
- הצב מחט סטרילית ישר micromanipulator סטיאוטטי, מוודא כי היא מלאה מאובטחת.
- הורידו לאט את המחט עד שהיא ממש מעל פני השטח של הגולגולת, כך קצה המחט נקבע על interaural 0. הגדרת נקודה זו כאפס, ולקבוע קואורדינטות מנקודה זו.
- בהתאם לאזור המוח של עניין, משתנים הקואורדינטות סטיאוטטי. לקבוע את הקואורדינטות על ידי ניצול בהרי האטלס Paxinos וווטסון של המוח עכברוש 22. ברגע הקואורדינטות נקבעים, להזיז את המחט כדי להתאים את. הקואורדינטות האלו.
- לכוון את המזגן בעזרת הקואורדינטות של ארבע הנקודות הבאות: א ת / P =-5.8 מ מ, M/L = + /-6.4 מ מ; ב': A/P =-2.7 מ מ, M/L = + /-6.4 מ מ; C: A/P =-2.7 מ מ, M/L = + /-8.67 מ"מ; D: A/P =-5.8 מ מ, M/L = + /-8.67 מ"מ. הנמך את המחט ימין מעל העצם הטמפורלית כדי להמחיש כל אחת מהנקודות האלה ארבע. באמצעות עט מרקר, לסמן את הנקודות על העצם הטמפורלית ולחבר אותם כדי לצייר מלבן; המלבן ישמש מדריך לפתיחת של חלון בתוך העצם ( איור 1).
3. חשיפה כירורגי של AC
- פתח החלון באמצעות מקדחה חשמלית ותרגיל קטן נשך (0.6 מ מ Ø). תרגיל היקף המלבן ב- 8,000 סל"ד עד העצם מסגיר. מגניב השטח קידוח על ידי שטיפה עם סליין סטרילי קר כדי למנוע נזק למבנים subcortical. העצם נותנת דרך, ירידה ההתנגדות יכול להתגלות. יש להקפיד לא לקדוח במוח.
- כאשר הגבולות רופפים, תעלה את העצם כיסוי עם מלקחיים בסדר ואחסן אותו מלח סטרילית קר.
4. אבלציה של AC
- שימוש במיקרוסקופ כירורגי (10 X), בעדינות נחתך קרומי המוח המיקרוכירורגית ולהסיר אותם באמצעות מלקחיים שתי פינות פיין. אם הדימום מתרחש, לשטוף עם סליין סטרילי קר.
- תשאף בעדינות את המזגן באמצעות ניתוח שאיבה התקן (לחץ-0.24 בר) מצמידים מחט סטרילית של קצה קהה 20 גרם. נקודה זו היא קריטית וצריך להתבצע בזהירות רבה: האחות רק ששת השכבות קורטיקליים ו לא בחומר הלבן שמתחת.
- מחוק לגמרי עד העורקים המנקב לעצור את הדימום.
- השאיפה תסתיים, לכסות את האזור הפגוע העצם שהופרד ולהחיל על גזה hemostatic שנספג.
- תן בשריר הטמפורלי לשחזר למיקום המקורי ולאחר מכן תפר את העור באמצעות קליפים הפצע (9 מ מ). החלת אנטיביוטית (ראה את הטבלה של חומרים). להמשיך להחיל משחה על הפצע פעמיים ביום למשך שלושה ימים.
הערה: כל יישום מורכב משכבה דקה מוחל על הפצע. - . הבופרנורפין הכנס subcutaneously בחלק האחורי של העכברוש (0.05 מ"ג/ק"ג) וגם h 1 כאבים אחרי הניתוח, ואז כל 8 שעות במהלך ה 72
- להשאיר את החיה כרית החימום עד שהוא יתעורר, ולהחזיר אותה לכלוב שלה דיור לשחזר.
- חיות הבית בנפרד, כדי למנוע את הכלוב החברים לגעת באזור sutured, ולספק כמה פריטים העשרה. לשנות את הנסורת מדי יום כדי למנוע זיהום, בדוק כי החיה משחזרת כראוי, אינה מראה סימנים של אי נוחות.
5. אוסף רקמה
זהירות: בעת טיפול paraformaldehyde (PFA), מוצק וגם מימית, ללבוש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) ולהשתמש ארון בטיחות.
הערה: להכין 750 מ ל פורמלדהיד פתרון על ידי המסת 4% (w/v) כדורגלן 1 x הפתרון פוספט buffered (PBS) באמצעות חום (55 ° C). לסנן את הפתרון פורמלדהיד עם נייר סינון. להכין צלצולים יותר ' s פתרון על ידי המסת 8.5 גר' NaCl, 0.25 g של אשלגן ו- 0.2 גר' NaHCO 3 ב 1,000 מ ל מים (פתרון pH = 6.9).
- תן החיה לשרוד כל עוד הוא נחוץ לצורך המחקר. כאשר למחקר שמתבצע עם העכברוש ablated AC הושלם, סופני להרדים אותו באמצעות הזרקת הצפק התוך של 0.1 מ"ל של סודיום פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג). להעריך את עומק הרדמה על ידי צביטה הבוהן ואת העדר רפלקס הנסיגה.
- החיה עמוקות מרדימים, ביצוע של זלוף intracardiac 23 מתוך 125 מ של צלצולים יותר ' s פתרון ואחריו 750 מ של פורמלדהיד פתרון באמצעות לאמוד המחט של 1.8 מ מ בתוך קוטר.
- זלוף תסתיים, לערוף את העכברוש-החוליה צוואר הרחם הראשונה.
- להשתמש במספריים כדי להסיר את העור ושריר מהראש ולחשוף את הגולגולת. להשתמש במספריים כדי לחתוך ולפתוח את מגנום נקב להסיר האחורי של הגולגולת.
- הפוך מנוגדים לחתוך לתוך העצם מסלולית באמצעות מספריים ספנסר, ולהשתמש rongeurs לחתוך לאורך שולי העליון של הגולגולת כדי לחשוף את המוח. להיזהר לא לפגוע במוח.
- ברגע המוח חשוף, הסר בזהירות קרום הדורה באמצעות מלקחיים הארכית פיין. להשתמש באצבע כדי בעדינות סקופ תחת ולרומם את המוח. לגייס את המוח. ולחתוך את unt עצביםאיל זה בחינם. לטבול את המוח בפתרון פורמלדהיד ואחסן אותו ב 4 ° C עבור ה 24
6. לוקליזציה של נגעים AC
- לאחר קיבוע שאחרי, בזהירות המקום המוח לתוך מטריצה המוח עכברוש הסאגיטלי חשיפת פני השטח לרוחב של המוח-
- להציב מצלמה 21 ס מ מעל פני השטח קליפת המוח באמצעות בעל מצלמה, בחר " סופר מאקרו ירי ", ומצב לקחת תמונה של פני השטח במוח.
- למקם את המוח מטריצה המוח עכברוש הילתית לחשוף את המשטח הגבי של המוח, ולקחת עוד תמונה.
- באמצעות תוכנית עורך תמונה, לפתוח התמונות ולשנות את קנה המידה אותם למטה 50% כדי להקל על העבודה עמם. לזהות את bregma, למבדה, והפניות 0 interaural על התמונה לפי נקודות הציון של Paxinos וווטסון- 19, ולסמן את עמדתם בתמונות ( איור 2). לצייר את קווי המתאר של אבלציה מעל התמונה לרוחב של המוח. לחשב את ההיקף.
- ייבוא הקואורדינטה למפות ראשי (A1) ו משני מחוזות (העזוב, Cortices הגחוני) AC איפה ממוקם 18 לקובץ של עורך התוכנית שבה אתה עובד עם התמונות. לחץ על המפה וגרור אותו כדי להרכיב את זה לתמונה לרוחב של המוח ablated.
- למדא הפניות של המפה קואורדינטות מתנגשים עם ההפניות bregma, למדה לזהות בתמונה של המוח לרוחב ולבצע את bregma.
- השתמש של פיסורה rhinal כהפניה כדי להתאים את התמונה של המוח למפה, ולהפוך אותם חופפים ( איור 2B).
- חישוב אחוזי הנגע ביחס האזור שנכבש על ידי פס'
Representative Results
ביצענו מיקום stereotactically מודרכים, חשיפה כירורגי, ושם אבלציה חד צדדית של AC בחולדות Wistar שלוש. הלוקליזציה של הנגע אישר כי ablations הופיעה בשלושת חולדות לנגוס את המחוזות העיקריים של AC (ראשי הגבי, הגחון cortices), כללה מגוון של 80 עד 100% מכלל השטח AC (איור 2B).
כבר בעבר בשימוש בפרוטוקול המתוארים כאן כדי לבצע ablations AC מגבילות במעבדה שלנו ללמוד ההשפעות ארוכות הטווח של מניעת בקרה בקליפת המוח בגרעינים השמיעה subcortical, כמו גם התופעה עוקבות של פלסטיות. במחקרים אלה, פרוטוקול AC ablations אומתה על-ידי החלת פיזיולוגיים (ABR), התנהגותית (להבהיל תגובות, prepulse עיכוב; PPI), ואת מולקולרית (מיקרו-מערכים DNA qPCR, ווסטרן כתם) שיטות13,14,15,16,17,18,19. כאן, כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול שלנו, נתנו את החולדות AC ablated שלושה לשרוד במשך שבוע אחד, cochleae במהלך איסוף רקמת שנאספו צעד כדי ללמוד את השינויים בביטוי של subunits אמפא הרלוונטיים ביותר נוכח שבלול למבוגרים , GluA2, GluA3, על-ידי qPCR. ההשוואה בין התמלילים של AC ablated חולדות והראה חיות בקרת המזויפים שבו בוצעה כל תהליך הניתוח אך לא אבלציה קורטיקלית למטה-תקנה עבור GluA2 ו- up-תקנה עבור GluA3 ב הן cochleae (איור 3) , שבו הוא מסכים עם קודמים שלנו ללמוד19.
איור 1: תמונות של העצם הטמפורלית חולדה-שלושה צעדים כירורגיים שונים. (א) העברת הקואורדינטות stereotaxic של AC הרקה. הקואורדינטות של ארבע הנקודות הן: ת א/P =-5.8 מ מ, M/L = + /-6.4 מ מ; ב': A/P =-2.7 מ מ, M/L = + /-6.4 מ מ; C: A/P =-2.7 מ מ, M/L = + /-8.67 מ"מ; D: A/P =-5.8 מ מ, M/L = + /-8.67 מ"מ. (ב') הקואורדינטות משמשים כנקודת התייחסות כדי לצייר מלבן על פני השטח של העצם הטמפורלית אשר ידריך את הפתיחה של החלון. (ג) מראה נפתח החלון העצם לאחר קידוח. יכול להיות שנצפו קרומי המוח עם כלי הדם על פני השטח של המוח. R: rostral, d: הגבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נוהל לאיתור נגעים במוח עכברוש. (א) תצלום של המשטח הגבי של המוח AC ablated עם מחטים stereotactically מושתל למדא, Bregma (על פי Paxinos וווטסון קואורדינטות19). קווים מנוקדים לסמן את המיקום של Bregma ו- Interaural 0 9 ס מ x 9 ס מ ברשת, כמו גם כמו המשטח הגבי של המוח. את התמונה של פני השטח לרוחב של המוח ablated נקודות המגע המוצגים על המפה קואורדינטות של AC (B). היקף הנגע מסומן באדום בתמונה. היקף האזור AC מסומן בשחור במפה. בדוגמה זו, האחוז של AC אבלציה ביחס שטח כבוש על ידי ה-AC הוא 84.79%. AC: קליפת השמיעה, IA: אינטר שמיעתי, FR: פיסורה Rhinal. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שינויים ברמות ה-mRNA של אמפא קולטן subunits GluA2, GluA3 לאחר חד-צדדית AC ablations 7 ימים הנגע פוסט- התוצאות מוצגות כחלק הממוצע ± סטיית התקן של השינוי קיפול. שינויים עבור GluA2 תעתיקים מיוצגים בצבע כחול. שינויים עבור GluA3 תעתיקים מוצגים באדום. ירידה משמעותית GluA2 ועלייה GluA3 הוא ציין שני cochleae (ipsi - ו contralateral על אבלציה) ביחס המזויפים פקדים עם לא ablations קורטיקלית ב 7 ימים לאחר הניתוח; . זה מסכים עם תוצאות קודמות שלנו19... אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
ניתוח מוח מוצלחת צירים על שני גורמים: להשאיר את החיה בחיים במהלך ואחרי ההליך ואיתור במדויק את תחום העניין. להבטיח כי העכברוש הוא מורדם עמוקות במהלך הניתוח (בדיקה את רפלקס הנסיגה), ומקבל נאותה משככי כאבים, אנטיביוטיקה ototoxic אמור לעזור הישרדות. בנוסף, החולדה יש לשמור על כרית החימום עד שהוא מתעורר מן ההרדמה כדי למנוע היפותרמיה. תפירת יקטין את הרגישות לזיהום, טכניקה נכונה חיוני: חיות אבחר ב סרטוני הפצע שלהם, אז הם צריכים להיות מושתלים חזק מספיק כדי למנוע הסרה ללא הצבת המתח יותר מדי על הפצע.
כדי לאתר במדויק את המזגן (או כל אזור בקליפת המוח אחר), זה חשוב לקבוע את המיקום של bregma, למבדה, ו- 0 interaural להשתמש בהם גם הפניות כדי לחשב את הגבולות של האזור יישוב. כל טעות בחישוב הציון יגרום אבלציה חלקית של AC או שאיפה רצויה של אחרים שמסביבה. לפיכך, קצה המחט צריך רק לגעת בהם עצם interaural 0, ואז לתרגם את הקואורדינטות גישה antero-אחוריים ו medio-לרוחב לפי מה שמתואר פרוטוקול זה.
כתב יד זה, גם תארנו כיצד בניתוח לחשוף, ablate את המזגן. ישנם שלושה שלבים קריטיים: תהליך הקידוח, פתיחת והסרה של קרומי המוח, אבלציה על ידי השאיפה. קידוח צריכה להתבצע במהירות נמוכה עם לחץ מינימלי, כמו קידוח במהירות גבוהה יוצר חום שיכולים להשפיע על subcortical למבנים סמוכים. עם זאת, שמירה על מהירות נמוכה, לקרר את האזור קידוח עם מלח סטרילית קר צריך למנוע כל נזק. בנוסף, הלחץ המינימלי הוא חיוני כדי למנוע הפסקה פתאומית של הגולגולת, פציעה של קליפת המשמש כבסיס עוקבות. הפתיחה והסרה של קרומי המוח שמכסים את המזגן צריכה להתבצע בקפידה על מנת שלא לפגוע בכלי הדם. אם הדימום מתרחש, הפרוגנוזה מוקדם ומאוחר הוא בדרך כלל שלילי וזה בספק אם חיה כזו עונה על הקריטריונים הכללה של מחקר אמין. אנו ממליצים המתת חסד במקרה זה. בסופו של דבר, השאיפה (כנראה הכי קשה ההיבט בביצוע הנגע יעיל), חייב להיות מוגבל החומר האפור. ישנם שני אינדיקטורים שיכולים לעזור לזהות הנוכחות של החומר הלבן: (1) שינוי חדות הצבעים, כמו החומר הלבן הוא בהיר יותר החומר האפור; 2) הפסקת הדימום מ העורקים ניקוב.
לאחר כל מניפולציה שבוצעה במוח, זה הכרחי להעריך את לוקליזציה, בגודל הארכת ההליך עשוי בקליפת חשפה, האימות של נתונים המתקבלים החיה. כתב יד זה, אנחנו פירוט איך למקם אבלציה הופיעה קליפת המוח משתמש קואורדינטות במפת שתואר קודם לכן על ידי שלנו קבוצה18. מפה זו נבנה באמצעות הפניות אנטומי המתקבל סעיף טורי שחזורים של מקטעים היסטולוגית, בקורלציה עם הרי האטלס Paxinos וווטסון של המוח עכברוש22. בהתאם לכך, המפה מבחין בין ראשי (A1) cortices משני (העזוב, הגחוני /) של AC. היתרון העיקרי של המפה קואורדינטות הזו הוא שהיא מאפשרת לוקליזציה מהירה של הנגע על ידי superimposing תמונה שצולמה מהמשטח לרוחב של המוח ממוקמים במטריצה המוח הווריד. יתרון נוסף הוא כי מעבדות עם פחות ניסיון בתחום האנטומיה יכול להשתמש את המפה על ידי הסתגלות זה הדגמים בעלי חיים שלהם. יש רק צורך להגדיר את המרחקים בין bregma, למבדה, והפניות 0 interaural מוח שליטה perfused, ואת קנה המידה של המפה למעלה או למטה בהתאם. השתמש פיסורה Rhinal את התייחסות כדי להתאים את התמונה של המוח למפה. אין אפשרות לקבוע את העומק של אבלציה במפה זו קואורדינטות, אז זה צריך להיות נחוש בסעיפים היסטולוגית המוח.
השילוב של שיטות סטיאוטטי עם חשיפת ה-AC כירורגי הן שיטות בסיסיות זה יכול להתאים בקלות על ידי כל חוקר המבקש למקד את המזגן בחולדה. ייתכן ניסוי חריפה או אחד שדורש השרשה של מכשירים קבועים. יתר על כן, הטיפול הכירורגי של AC בעבר שימש כמודל לחקר השפעותיה של מחסור כרוני קורטיקלית בדיון. AC ablations יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות ablations AC חד-צדדי מפעילים אזורים קורטיקליים אחרים, או לשמש מודל של שבץ. לפיכך, עיצובים ניסיוניים המתוארים כאן הם שיטות שימושי שניתן להחיל בנפרד או בשילוב מגוון רחב של עיצובים מוטוריים.
Disclosures
המחברים מצהירים כי המחקר בוצע בהיעדר יחסים מסחריים או פיננסי שיכול להחשב בתור ניגוד אינטרסים פוטנציאליים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק של משרד הכלכלה של תחרותיות (MINECO) של ממשלת ספרד, SAF2016-78898-C2-2-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
| Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
| Heating pad | DAGA | ||
| Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
| Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
| Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
| Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
| Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
| Scalpel | Lawton | ||
| Povidone iodine | Meda | Betadine | |
| sterile saline serum | B.Braun | ||
| 20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
| Cotton tips | |||
| Suture material | B.Braun | ||
| Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough | ||
| Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
| Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
| Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.05 mg/kg |
| Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
| Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
| Rongeurs | Lawton | ||
| Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
| Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
| Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
| Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 60 mg/kg | |
| Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
| Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
| Canvas 12 | ACD Systems | ||
| needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
| Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
| GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
| GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
| GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
| GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |
References
- Talwar, S. K., Gerstein, G. L. Auditory frequency discrimination in the white rat. Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).
- Heffner, H. E., Heffner, R. S., Contos, C., Ott, T. Audiogram of the hooded Norway rat. Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).
- Malmierca, M. S., Merchán, M. A. Auditory System. The Rat Nervous System. , Academic Press. San Diego. 995-1080 (2004).
- Delano, P. H., Elgoyhen, A. B. Editorial: Auditory Efferent System: New Insights from Cortex to Cochlea. Front Syst Neurosci. 10, 1-2 (2016).
- Dinse, H. R. Sound Case for Enrichment. Focus on "Environmental Enrichment Improves Response Strength, Threshold, Selectivity, and Latency of auditory cortex Neurons.". J Neurophysiol. 92 (1), 36-37 (2004).
- Polley, D. B., Heiser, M. A., Blake, D. T., Schreiner, C. E., Merzenich, M. M. Associative learning shapes the neural code for stimulus magnitude in primary auditory cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (46), 16351-16356 (2004).
- Kaur, S. Intracortical Pathways Determine Breadth of Subthreshold Frequency Receptive Fields in Primary auditory cortex. J Neurophysiol. 91 (6), 2551-2567 (2004).
- Talwar, S. K., Musial, P. G., Gerstein, G. L. Role of mammalian auditory cortex in the perception of elementary sound properties. J Neurophysiol. 85 (6), 2350-2358 (2001).
- Tan, A. Y. Y., Atencio, C. A., Polley, D. B., Merzenich, M. M., Schreiner, C. E. Unbalanced synaptic inhibition can create intensity-tuned auditory cortex neurons. Neuroscience. 146 (1), 449-462 (2007).
- León, A., Elgueda, D., Silva, M. A., Hamamé, C. M., Delano, P. H. Auditory cortex basal activity modulates cochlear responses in chinchillas. PLOS ONE. 7 (4), e36203 (2012).
- Jager, K., Kossl, M. Corticofugal Modulation of DPOAEs in Gerbils. Hear Res. 332, 61-72 (2016).
- Dragicevic, C. D., et al. The Olivocochlear Reflex Strength and Cochlear Sensitivity are Independently Modulated by auditory cortex Microstimulation. J Assoc Res Otolaryngol. 16 (2), 223-240 (2015).
- Clarkson, C., Herrero-Turrión, M. J., Merchán, M. A. Cortical Auditory Deafferentation Induces Long-Term Plasticity in the Inferior Colliculus of Adult Rats: Microarray and qPCR Analysis. Front Neural Circuits. 6, 86 (2012).
- Clarkson, C., Juíz, J. M., Merch́an, M. A. Long-term regulation in calretinin staining in the rat inferior colliculus after unilateral auditory cortical ablation. J Comp Neurol. 518, 4261-4276 (2010).
- Clarkson, C., Juíz, J. M., Merchán, M. A. Transient down-regulation of sound-induced c-Fos protein expression in the inferior colliculus after ablation of the auditory cortex. Front Neuroanat. 4, 141 (2010).
- Hunter, K. P., Willott, J. F. Effects of bilateral lesions of auditory cortex in mice on the acoustic startle response. Physiol Behav. 54 (6), 1133-1139 (1993).
- Lamas, V., Arevalo, J. C., Juiz, J. M., Merchán, M. A. Acoustic input and efferent activity regulate the expression of molecules involved in cochlear micromechanics. Front Syst Neurosci. 8, 253 (2014).
- Lamas, V., Alvarado, J. C., Carro, J., Merchán, M. A. Long-term evolution of brainstem electrical evoked responses to sound after restricted ablation of the auditory cortex. PLOS ONE. 8 (9), e73585 (2013).
- Lamas, V., Juiz, J. M., Merchán, M. A. Ablation of the auditory cortex results in changes in the expression of neurotransmission-related mRNAs in the cochlea. Hear Res. 346, 71-80 (2017).
- Doron, N. N., Ledoux, J. E., Semple, M. N. Redefining the tonotopic core of rat auditory cortex: physiological evidence for a posterior field. J Comp Neurol. 453 (4), 345-360 (2002).
- Polley, D. B., Read, H. L., Storace, D. a, Merzenich, M. M. Multiparametric auditory receptive field organization across five cortical fields in the albino rat. J Neurophysiol. 97 (5), 3621-3638 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Sydney. (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
