Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان doi: 10.3791/56430 Published: August 3, 2017
* These authors contributed equally

Summary

بروتوكول بسيط ل أوفيركسريسيون وتنقية من كودون الأمثل، رابطة الدول المستقلة الإنسان -prenyltransferase، في ظل ظروف عدم تغيير طبيعة، من إشريشيا القولونية ، جنبا إلى جنب مع فحص النشاط الأنزيمي. هذا البروتوكول يمكن تعميمها لإنتاج البروتينات الأخرى prenyltransferase cis- في كمية ونوعية مناسبة للدراسات الميكانيكية.

Abstract

برينيلترانزفيراسيس (بت) هي مجموعة من الانزيمات التي تحفز استطالة سلسلة من ثنائي فوسفات اليليك باستخدام إيسوبنتينيل ثنائي الفوسفات (إيب) عن طريق تفاعلات التكثيف متعددة. ددس (ديهيدرودوليتشيل ثنائي فسفات سينثيز) هو سلالة طويلة الأجل حقيقية سيس -PT (تشكيل رابطة الدول المستقلة رابطة مزدوجة من رد فعل التكثيف) الذي يحفز استطالة سلسلة من ثنائي فوسيل فارنيسيل (فب، ثنائي فوسفات الألييك) عن طريق التكثيف متعددة مع ثنائي إيسوبنتنيل ثنائي الفوسفات (إيب). ددس هي ذات أهمية طبية حيوية، كما طفرة غير متحفظة (K42E) في الإنزيم يؤدي إلى التهاب الشبكية الصباغي ، مما يؤدي في النهاية إلى العمى. ولذلك، تم تطوير هذا البروتوكول من أجل الحصول على كميات كبيرة من ددس تنقيته، ومناسبة للدراسات الميكانيكية. هنا، تم استخدام استخدام الانصهار البروتين، وتحسين ظروف الثقافة وكودون الأمثل للسماح أوفيركسريسيون وتنقية دسدز الإنسان نشط وظيفيا في سيس -PT بين الأنواع المختلفة تشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على غيرها من رابطة الدول المستقلة حقيقية النواة -PT كذلك، مثل تلك المشاركة في تركيب المطاط الطبيعي.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

برينيلترانزفيراسيس هي مجموعة من الانزيمات التي تحفز استطالة سلسلة من ثنائي فوسفات اليليك باستخدام إيسوبنتينيل ثنائي الفوسفات (إيب) عن طريق التفاعلات التكثيف متعددة 1 ، 2 . إنزيمات Z- نوع تحفيز تشكيل رابطة الدول المستقلة رابطة مزدوجة من رد فعل التكثيف، في حين أن E- نوع الإنزيمات تحفيز تشكيل رابطة مزدوجة عبر 3 . رابطة الدول المستقلة -Prenyltransferases (-PT رابطة الدول المستقلة، Z-نوع الإنزيمات) وكلاسيكي تصنف وفقا لطول سلسلة منتجاتها إلى قصيرة السلسلة (C 15)، متوسطة سلسلة (C 50-55)، وسلسلة طويلة (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl ثنائي فسفات سينسيز) هي حقيقية النواة سلسلة طويلة من رابطة الدول المستقلة -PT أن يحفز سلسلة من استطالة ثنائي فسفات farnesyl (FPP، وهو ثنائي فسفات allylic) عن طريق تكثفات متعددة مع ثنائي فسفات isopentenyl (IPP) 1، 5 ، 6 . وهذا يؤدي إلى تشكيل ديهيدرودوليتشيل ثنائي الفوسفات، و C 55-100 ثنائي فوسفات البولي بروبيلين بمثابة مقدمة ل دوليشيلبيروفوسفات، جليكوسيل الناقل جزيء تشارك في N- ربط البروتين غليكوسيلاتيون 1 . بين اليهود الأشكناز، طفرة غير متحفظة (K42E) في نتائج ددس في راثي متنحية التهاب الشبكية الصباغي 7 ، 8 . لذلك، تم تطوير هذا البروتوكول من أجل الحصول على ددس تنقيته مناسبة للدراسات الميكانيكية.

يعتبر الإشريكية القولونية المضيف الأكثر ملاءمة وفعالة من حيث التكلفة للتعبير البروتين المؤتلف، وبالتالي هو أيضا المضيف الأكثر استخداما. ومع ذلك، عندما يحاول المرء البروتينات أوفيركسريس غير متجانسة في E. القولونية ، ينبغي أن تؤخذ الاعتبارات الخاصة بالبروتين. الحصول على مطوية بشكل صحيح، نشطe البروتينات المؤتلف من E. القولونية ، ليست مسألة بسيطة بسبب خصائص متميزة من البروتينات المختلفة. وقد وضعت نهج عديدة للتغلب على هذه العقبات. هنا، تم استخدام استخدام الانصهار البروتين، وتحسين ظروف الثقافة وكودون الأمثل للسماح أوفيركسريسيون وتنقية ددس البشري نشط وظيفيا في E. القولونية . من ملاحظة، كانت محاولة سابقة ل أوفيركسريس الخميرة رابطة الدول المستقلة -PT دون انصهار البروتين ناجحة بسبب عدم القابلية للذوبان كاملة حتى في وجود المنظفات 12 . بروتوكول وصفها هو بسيط، فعالة من حيث التكلفة، والوقت تجنيب ويسمح للمرء الحصول على الاستعدادات ددس مناسبة للدراسات الميكانيكية. ونظرا لتناظر سيس -PT بين الأنواع المختلفة، نقترح أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على غيرها من رابطة الدول المستقلة حقيقية النواة -PT كذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1 - استنساخ رابطة الدول المستقلة -PT ل أوفيركسريسيون في E. القولونية

  1. الحصول على ناقلات التعبير بيت-32b، والمصممة للاستنساخ والتعبير على مستوى عال من تسلسل البروتين تنصهر مع البروتين 109aa ثيوريدوكسين (تركس) 17 ، و E. القولونية كودون الأمثل 18 تسلسل الترميز كامل طول سيس -PT.
  2. احرص على أن يكون لTEV البروتيني (التبغ فيروس حفر البروتيني) الموقع الانقسام (ENLYFQ / G، حيث "/" يشير إلى نقطة الانقسام) 9 تليها رابط مرنة قصيرة (SGSGSG، لتعزيز موقع انشقاق الوصول) المنبع من رابطة الدول المستقلة تسلسل -PT ( الشكل 1 A ). أيضا، إضافة مناسبة 5 'و 3' مواقع تقييد للاستنساخ.
  3. استنساخ بناء الحمض النووي توليفها في ناقلات بيت-32b باستخدام تقنيات ربط القياسية 10 .

2 - Overexpreسسيون من ددس الإنسان في E. القولونية

  1. تحويل E. القولونية T7 التعبير عن الخلايا المختصة مع تركس الانصهار ددس بناء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. لوحة الخلايا المحولة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة على لب أجار تحت ظروف انتقائية الأمبيسلين (200 ملغ / لتر).
  3. تطعيم المستعمرات المختارة إلى 100 مل من وسط لب في 250 مل قوارير كاتب الثقافات مع 100 ملغم / لتر أمبيسيلين واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز المستمر في 200 دورة في الدقيقة.
  4. تطعيم 80 مل من الثقافة إلى اثنين من قوارير 5 L (40 مل لكل قارورة)، ولكل منها 1.5 لتر من 2X يت المتوسطة (16 جم / لتر تريبتون، 10 جم / لتر استخراج الخميرة، 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم) مع 100 ملغ / لامبيسيلين.
  5. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز المستمر في 180 دورة في الدقيقة حتى الوصول أود 600 نانومتر = 0.5.
  6. خفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية والحث على الخلايا عن طريق إضافة 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت). يستهلكتينو احتضان تحت نفس الحالة لمدة 16-20 ساعة لتعبير البروتين.
  7. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (10،000 x ز لمدة 10 دقيقة).
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا؛ يجب أن تبقى الخلايا بيليه في -80 درجة مئوية حتى تنقية.

3 - تنقية الإنسان ددس

  1. ريسوسبيند الخلايا في المخزن المؤقت A (25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100، 10 ملي β- ميركابتوثانول)، 1 ميكروغرام / مل دناز الأول، وخليط مثبط الأنزيم البروتيني.
  2. تجانس الخلايا باستخدام الزجاج-تفلون الخالط.
  3. تعطيل الخلايا باستخدام ميكروفليديزر أو ما يعادلها في 12،000 - 15،000 رطل 11 .
  4. أجهزة الطرد المركزي الخلية المحللة في 40،000 x ج لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية. استعادة طاف، التي تحتوي على جزء قابل للذوبان.
  5. تحميل طاف على 5 - 10 مل الكوبالت يجمد المعادن اللوني تقارب (كو 2 + -IMAC) 12 عمود مع 10مم إيميدازول، تليها غسل شامل مع العازلة A و 10 ملي إيميدازول للحد من البروتين غير محددة ملزمة.
  6. أزل البروتينات أوفيركسرسد مع العازلة ألف تستكمل مع 250 ملي إيميدازول.
  7. إزالة إيميدازول باستخدام 53 مل التحضير العمود تحلية موازنة مع العازلة A.
  8. إضافة 6xHis الموسومة تيف البروتيني (1 ملغ تيف البروتيني لكل 50 ملغ من البروتين) إلى البروتينات إلوتد لإزالة بهم 6XHis الموسومة تركس البروتين الانصهار في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  9. تحميل البروتينات المشقوق على كو 2 + عمود -IMAC، معايرتها مع العازلة A تستكمل مع 5 ملي إيميدازول، لإزالة المشقوق 6X له الموسومة تركس البروتين الانصهار وتيف البروتيني.
  10. جمع تدفق من خلال والتركيز على 3-4 مل باستخدام 30 كيلو دالتون الوزن الجزيئي مرشح الطرد المركزي قطع.
  11. تحميل البروتين المركزة على العمود اللوني سوبيرديكس-200 حجم الاستبعاد معايرتها مع العازلة A لتنقية النهائية. البروتين يوت كما ديمر (~ 76 كيلو دالتون). حدد الكسور ذات الصلة بمقارنة الملف الشخصي شطف لمنحنى معايرة العمود.
  12. تقييم نقاء إعداد باستخدام سدز-بادج.
  13. تحديد تركيز البروتين اللازمة للتجريب المصب وتجميد فلاش أليكوتس من البروتينات المنقى، وتتركز في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4 - التحليل التحليلي الاستبعاد اللوني (سيك)

  1. لضمان قدرة البروتين على تحمل دورات تجميد ذوبان الجليد، ذوبان الجليد قسامة من البروتينات المجمدة وأجهزة الطرد المركزي في 21،000 x ز لمدة 10 دقيقة لإزالة المجاميع غير قابلة للذوبان. جمع طاف.
  2. تحميل البروتينات على عمود تحليلي سوبيرديكس-200 قبل معايرة مع 25 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.02٪ تريتون X-100، 10 ملي β- ميركابتوثانول، وذلك باستخدام فائقة الأداء نظام اللوني السائل 13 ، 14 -
  3. رصد التربتوفان فلورسسينس (λ إكس = 280 نانومتر، λ إم = 350 نانومتر) للكشف عن الملف الشخصي شطف شطف البروتينات. تأكد من وجود منحنى معايرة صالحة لتقييم الوزن الجزيئي - مثل هذه المنحنيات المتاحة من خلال الشركات المصنعة العمود سيك.

5. إنزيم كينيتيكش - النشاط المعتمد على الوقت 15 ، 16 ، 17

  1. لضمان نشاط البروتين المنقى، مزيج 5 ميكرومتر من ددس المنقى مع 10 ميكرومتر فب و 50 ميكرومتر 14 C-إيب لبدء التفاعل في العازلة A مع 0.5 ملي مغكل 2 في 22-30 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تختلف ظروف التفاعل الدقيق مع استعدادات رابطة الدول المستقلة -PTs مختلفة من ددس. وعلاوة على ذلك، يعتمد نشاط ددز أيضا على درجة الحرارة و [مغ 2+ ].
    الحذر: 14 C-إيب هو مشع وينبغي أن تستخدم وفقا للوائح السلامة الإشعاعية المحلية. سحب 15 ميكرولتر عينات من رد فعل في 0 و 2 و 4 و 6 ح، بعد التبريد الفوري من رد فعل بإضافة 15 ميكرولتر العازلة ألف تستكمل 20 ملي إدتا (إلى تركيز النهائي من 10 ملي إدتا).
  2. إضافة 1 مل H 2 O المشبعة 1-بيوتانول ودوامة تماما لاستخراج منتجات التفاعل.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا والعينات يمكن أن تبقى للقراءة في وقت لاحق.
  3. إضافة كوكتيل التلألؤ إلى العينات، وذلك باستخدام عداد التلألؤ، ومنتجات التفاعل كوانتيتات في مرحلة بيوتانول تشمل 14 C، جنبا إلى جنب مع النشاط الإشعاعي من 15 ميكرولتر من خليط التفاعل، وهو ما يمثل النشاط الإشعاعي الكلي.
  4. طرح قراءات الخلفية تقاس باستخدام عينات 0 ساعة من كل نقطة زمنية وحساب نسبة 14 C-إيب المستخدمة.
  5. حساب صافي 14 C-إيب دمج في كل نقطة زمنية عن طريق حساب النسبة المئوية المستخدمة من المجموع 14 14 C-إيب مع الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتظهر نظرة عامة على البناء المستخدمة هنا وعملية التنقية في الشكل 1 . وتظهر العينات التي تم الحصول عليها في كل خطوة تنقية في الشكل 2 . ويظهر هذا التحليل سدز-بادج تنقية تدريجي من ددس، مما أدى إلى منتج عالي النقاء. ويبين الشكل 3 نتائج سيك التحليلية من الانزيم المنقى، وكشف عن أن البروتين لوحظ فقط باعتباره هوموديمر. ويبين الشكل 4 فحص النشاط تعتمد على الوقت ممثل. 14 C-إيب دمج بوضوح يزيد على 6 ساعة، والتحقق من أن الانزيم المنقى وظيفية.

شكل 1
الشكل 1: الإنسان استنساخ ددس والتنقية . ( ب ) الخطوط العريضة لبروتوكول التنمية البشرية ددس وصفها هنا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تنقية ددس الإنسان . تحليل سدز-بادج من الإنسان ددز تقارب خطوات تقارب. لين 1، الوزن الجزيئي علامة (كدا)؛ حارة 2، استخراج الخام؛ حارة 3، كو 2 + -IMAC تدفق من خلال. السهم يشير إلى البروتين الانصهار تركس-ددس. لين 4، كو 2+ -إيماك إلوات؛ حارة 5، بروتين-تيف خليط البروتياز بعد الحضانة بين عشية وضحاها. حارة 6، كو 2+ -IMAC تدفق من خلال التالية تيف الانقسام. حارة 7، كو 2+ - إيماك الشوط التالي تيف الانقسام. حارة 8، تنقيته الإنسان ددس (مؤشريتخذه سهم) بعد اللوني الاستبعاد الحجم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل (3): سيك التحليلية من دسدز البشرية المنقحة. تم رصد مضان التربتوفان كما هو موضح في البروتوكول. وفقا لمنحنى المعايرة من هذا العمود، ددس تشكل هوموديمر (77.4 كيلو دالتون). يشير السهم إلى حجم الفراغ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4 : تيلي تعتمد النشاط من دسدز البشري النقي. في النشاط المختبر من ددس الإنسان النقي في رد فعل مع 10 ميكرومتر فب و 50 ميكرومتر 14 C-إيب كما ركائز وأعرب عن دمج إيب لكل بروتين (مول / مول). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بروتوكول وصفها هنا لتنقية ددس البشري وظيفية في E. خلايا القولونية بسيطة وفعالة، والسماح لأحد أوفيركسريس وتنقية البروتين في 3 - 4 أيام مرة واحدة في بناء مناسب هو متاح. هذه البروتوكولات لتنقية البروتين ذات أهمية خاصة نظرا للاختراقات في تسلسل الجينوم، والتي قدمت مجموعة كبيرة من المعلومات المتعلقة بعلم الوراثة من العديد من الأمراض 18 ، مما يتطلب تطوير طرق الإنتاجية العالية لتوصيف آليات المسببة للأمراض على مستوى البروتين 19 .

للتغلب على المزالق المشتركة في غير متجانسة بروتين أوفيركسريسيون وتنقية، اتخذت عدة تدابير هنا، والتي تعتبر حاسمة للحصول على البروتينات القابلة للذوبان وظيفية بنجاح. أولا، كان أوفيركسرسد ددس كما تركس الانصهار. تركس يسهل البروتين الانصهار للطي ويزيد من الانصهار بروتين الانصهار، ومنع إدراج bتشكيل أودي 20 . المقبل، لزيادة غلة البروتين، وكان بناء الحمض النووي كودون الأمثل للتعبير في E. القولونية 21 . وأخيرا، للحد من مزيد من احتمال تشكيل الجسم تشكيل، كان يتسبب التعبير عن البروتين في 16 درجة مئوية لإبطاء معدل تخليق البروتين، على الأرجح مساعدة البروتين للطي 22 .

مع الأخذ بعين الاعتبار تماثل سيس -PT بين الأنواع المختلفة، نقترح أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على غيرها من رابطة الدول المستقلة حقيقية النواة -PT كذلك 1 . باستخدام البروتوكول الحالي كنقطة انطلاق، ونظرا للمبادئ التوجيهية العامة الحرجة للتعبير ددس، يمكن تعديل هذه الطريقة للتعبير الأمثل من مختلف سيس -PTs. على سبيل المثال، يمكن للمرء أن يحاول شركاء الانصهار مختلفة (مثل بروتين ملتوز ملزمة) أو زيادة تحسين ظروف الثقافة للبروتين محددة للدراسة.

<p كلاس = "jove_content"> مع أهمية بيوميديكال والتكنولوجيا الحيوية 1 ، 7 ، 8 ، الاستخدام المستقبلي للبروتوكول وصفها للحصول على كميات كبيرة من دسدس المنقى وظيفية، جنبا إلى جنب مع غيرها من رابطة الدول المستقلة -PT، مما يسمح للسعي من توصيفها الهيكلي والوظيفي . على سبيل المثال، سوف دراسات جزيئية أخرى من ددز حل الآليات الكامنة وراء دسدس المرتبطة التهاب الشبكية الصباغي ، مما يحتمل أن يؤدي إلى اكتشاف وتطوير نهج علاجية جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، كما تشارك في رابطة الدول المستقلة بروكاريوتيك -PTs في تخليق جدار البكتيريا، وهذه المجموعة من الإنزيمات يحتمل أن تشكل أهدافا جديدة لعوامل مضادة للجراثيم جديدة. في الواقع، وتوصيف دقيق للدراسات الإنزيمات حقيقية النواة وبدائية النواة قد يسمح بتطوير الرشيدة للأدوية المضادة للجراثيم انتقائية ل-PT رابطة الدول المستقلة بدائية النواة. وأخيرا، كما يتم تصنيعها المطاط الطبيعي بذ أعضاء من رابطة الدول المستقلة -PT الأسرة، والنهج الموصوفة هنا قد تجد استخدام في المستقبل في التركيب الصناعي المطاط الطبيعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مركز التميز العلمي في مؤسسة العلوم الإسرائيلية (I-كور) في علم الأحياء الخلوي الهيكلي (1775/12) ومؤسسة العلوم الإسرائيلية تمنح 1721/16 و 2338/16 (ي) و 825/14 (دك) ). إن الدعم الذي تقدمه مؤسسة أراضي الإقليم إلى جمهورية الكونغو الديمقراطية هو محل تقدير كبير. تم تنفيذ هذا العمل من قبل ايلان إدري وميشال غولدنبرغ في الوفاء الجزئي لمتطلبات أطروحة دكتوراه في الطب من كلية ساكلر الطب، جامعة تل أبيب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291, (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98, (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3, (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113, (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259, (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88, (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88, (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13, (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22, (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23, (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278, (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280, (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422, (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288, (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55, (1), 65-72 (2011).
أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).More

Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter