Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Overekspression og oprensning af mennesket Published: August 3, 2017 doi: 10.3791/56430
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,3, 1,3, 2, 2,4, 2
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University
* These authors contributed equally

Summary

En simpel protokol til overekspression og oprensning af codonoptimeret human cis- phenyltransferase under ikke-denaturerende betingelser fra Escherichia Coli , er beskrevet sammen med et enzymatisk aktivitetsassay. Denne protokol kan generaliseres til fremstilling af andre cis- prenyltransferase proteiner i mængde og kvalitet egnet til mekanistiske undersøgelser.

Abstract

Prenyltransferaser (PT) er en gruppe enzymer, som katalyserer kædelængelse af allylicdiphosphat under anvendelse af isopentenyldiphosphat (IPP) via multiple kondensationsreaktioner. DHDDS (dehydrodolichyldiphosphatsyntase) er en eukaryotisk langkædede cis -PT (dannende cis- dobbeltbindinger fra kondensationsreaktionen), som katalyserer kædekonstruktion af farnesyldiphosphat (FPP, et allylicdiphosphat) via multiple kondensationer med isopentenyldiphosphat (IPP). DHDDS er af biomedicinsk betydning, da en ikke-konservativ mutation (K42E) i enzymet resulterer i retinitis pigmentosa , hvilket i sidste ende fører til blindhed. Derfor blev den nuværende protokol udviklet med henblik på at erhverve store mængder renset DHDDS, der er egnet til mekanistiske undersøgelser. Her blev brugen af ​​proteinfusion, optimerede kulturbetingelser og codonoptimering anvendt til at tillade overekspression og oprensning af funktionelt aktive humane DHDDS i cis -PT blandt forskellige arter antyder, at denne protokol kan anvendes til andre eukaryotiske cis -PT såvel som dem, der er involveret i syntetisk gummisyntese.

Introduction

Prenyltransferaser er en gruppe enzymer, der katalyserer kædeforlængelse af allylldifosfat under anvendelse af isopentenyldiphosphat (IPP) via multiple kondensationsreaktioner 1 , 2 . Z-type enzymer katalyserer dannelsen af cis- dobbeltbindinger fra kondensationsreaktionen, hvorimod E-type enzymer katalyserer trans- dobbeltbindingsdannelse 3 . cis -Prenyltransferases (cis -PT, Z-type enzymer) er klassisk klassificeres efter deres produkt kædelængde i kortkædede (C 15), medium-kæde (C 50-55), og langkædede (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyldiphosphatsyntase) er en eukaryotisk langkædede cis -PT, der katalyserer kædekonstruktion af farnesyldiphosphat (FPP, et allylldifosfat) via multiple kondensationer med isopentenyldiphosphat (IPP) 15 , 6 . Dette resulterer i dannelsen af ​​dehydrodolichyldiphosphat, et C 55-100 polyprenyldiphosphat, der tjener som en precursor for dolichylpyrophosphat, glycosylbærermolekylet involveret i N-koblet proteinglycosylering 1 . Blandt Ashkenazi-jøder resulterer en missens ikke-konservativ mutation (K42E) i DHDDS i autosomal recessiv retinitis pigmentosa 7 , 8 . Derfor blev den nuværende protokol udviklet med henblik på at erhverve renset DHDDS egnet til mekanistiske undersøgelser.

Escherichia coli betragtes som den mest hensigtsmæssige og omkostningseffektive vært til rekombinant proteinekspression og er derfor også den hyppigst anvendte vært. Men når man forsøger at heterologt overudtrykke proteiner i E. coli , bør der laves proteinspecifikke overvejelser. Fås korrekt foldet, aktivE rekombinante proteiner fra E. coli , er ikke et simpelt spørgsmål på grund af de forskellige egenskaber af forskellige proteiner. Talrige tilgange er blevet udviklet for at overvinde disse forhindringer. Her blev brugen af ​​proteinfusion, optimerede kulturbetingelser og codonoptimering anvendt til at tillade overekspression og oprensning af funktionelt aktive humane DHDDS i E. coli . Fremhæves, en tidligere forsøg på at overudtrykke gær cis -PT uden proteinfusion mislykkedes på grund af fuldstændig uopløselighed selv i nærvær af detergent 12. Den beskrevne protokol er enkel, omkostningseffektiv, tidsbesparende og giver en mulighed for at opnå DHDDS-præparater, der er egnede til mekanistiske undersøgelser. I betragtning af homologien af cis -PT blandt forskellige arter foreslår vi, at denne protokol også kan anvendes til anden eukaryot cis -PT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kloning af cis -PT til overekspression i E. coli

  1. Hent pET-32b ekspressionsvektor, der er designet til kloning og ekspression på højt niveau af proteinsekvenser fusioneret med 109aa thioredoxin (TRX) protein 17 og E. coli kodon-optimeret 18 kodende sekvens af cis -PT med fuld længde.
  2. Pas på at have et spaltningssted for TEV-protease (tobakse etchvirusprotease) (ENLYFQ / G, hvor "/" angiver spaltningspunktet) 9 efterfulgt af en kort fleksibel linker (SGSGSG, for at forbedre spaltningsstedets tilgængelighed) opstrøms for cis -PT-sekvensen ( figur 1 A ). Tilsæt også egnede 5'- og 3'-restriktionssteder til kloning.
  3. Klon den syntetiserede DNA-konstruktion i pET-32b vektoren under anvendelse af standardligationsteknikker 10 .

2. OverexpreSsion af human DHDDS i E. coli

  1. Transform E. coli T7 Express kompetente celler med TRX-fusion DHDDS konstruktionen i overensstemmelse med producentens anvisninger.
  2. Plad de transformerede celler i overensstemmelse med producentens instruktioner om LB-agar under ampicillinselektive tilstande (200 mg / L).
  3. Inokulere udvalgte kolonier i 100 ml LB-medium i 250 ml kolber starterkulturer med 100 mg / L ampicillin og inkuber natten over ved 37 ° C med konstant omrystning ved 200 omdr./min.
  4. Inokuler 80 ml af kulturen i to 5 liter kolber (40 ml pr. Kolbe), der hver indeholder 1,5 l 2x YT medium (16 g / l trypton, 10 g / l gærekstrakt, 5 g / l NaCl) med 100 mg / L ampicillin.
  5. Inkubér kulturen ved 37 ° C med konstant omrystning ved 180 omdr./min. Indtil OD 600 nm = 0,5.
  6. Sænk temperaturen til 16 ° C og inducer cellerne ved at tilsætte 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). conInkubere under den samme betingelse i 16-20 timer til proteinekspression.
  7. Høst cellerne ved centrifugering (10.000 x g i 10 minutter).
    Bemærk: Protokollen kan pauses her; Cellepelleten bør holdes ved -80 ° C indtil oprensning.

3. Oprensning af humane DHDDS

  1. Resuspender cellerne i buffer A (25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoethanol), 1 μg / ml DNase I og en proteaseinhibitorblanding.
  2. Homogeniser cellerne ved hjælp af en glas-Teflon-homogenisator.
  3. Forstyrre cellerne ved hjælp af en mikrofluidizer eller tilsvarende ved 12.000 - 15.000 psi 11 .
  4. Centrifuge cellelysatet ved 40.000 xg i 45 minutter ved 4 ° C. Genindvind supernatanten, der indeholder den opløselige fraktion.
  5. Last supernatanten på en 5 - 10 ml kobolt immobiliseret metal affinitetskromatografi (Co 2+ -IMAC) 12 søjle med 10MM imidazol efterfulgt af grundig vask med puffer A og 10 mM imidazol for at reducere uspecifik proteinbinding.
  6. Eluk de overudtrykte proteiner med puffer A suppleret med 250 mM imidazol.
  7. Fjern imidazol ved anvendelse af en 53 ml præparativ afsaltningskolonne ækvilibreret med buffer A.
  8. Tilsæt 6xHis-mærket TEV-protease (1 mg TEV-protease pr. 50 mg protein) til de eluerede proteiner for at fjerne deres 6xHis-mærket TRX-fusionsprotein ved 4 ° C natten over.
  9. Indlæs de spaltede proteiner på en Co 2+ -IMAC-søjle, ækvilibreret med buffer A suppleret med 5 mM imidazol for at fjerne det spaltede 6x His-mærket TRX-fusionsprotein og TEV-protease.
  10. Opsaml gennemstrømning og koncentrere til 3 - 4 ml ved anvendelse af et 30 kDa molekylvægt afskæringscentrifugalfilter.
  11. Indlæs det koncentrerede protein på en superdex-200 størrelseseksklusionskromatografikolonne ækvilibreret med buffer A til endelig oprensning. Proteinet eluerer som en dimer (~ 76 kDa). Vælg relevante fraktioner ved at sammenligne elueringsprofilen med en kolonnekalibreringskurve.
  12. Vurder præparatets renhed ved hjælp af SDS-PAGE.
  13. Bestem den proteinkoncentration, der er nødvendig til nedstrømsforsøg og flashfrys alikvoter af rensede koncentrerede proteiner i flydende nitrogen og opbevar ved -80 ° C indtil brug.

4. Analytisk størrelse-udelukkelseskromatografi (SEC)

  1. For at sikre proteinets evne til at udholde fryse-optø-ringscykler, optø en aliquot af de frosne proteiner og centrifuge ved 21.000 x g i 10 minutter for at fjerne uopløselige aggregater. Opsaml supernatanten.
  2. Indlæs proteinerne på en superdex-200 analytisk søjle, der er forækvilibreret med 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,02% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoethanol ved anvendelse af et ultrapræstationsvæskekromatografisystem 13 , 14 .
  3. Overvåg tryptophan fluorScence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) for at detektere proteinernes eluerende elueringsprofil. Sørg for at have en gyldig kalibreringskurve til vurdering af molekylvægt - sådanne kurver er tilgængelige via SEC-kolonneproducenterne.

5. Enzymkinetik - tidsafhængig aktivitet 15 , 16 , 17

  1. At sikre aktiviteten af det oprensede protein, bland 5 uM oprensede DHDDS med 10 uM FPP og 50 uM 14C-IPP at sætte reaktionen i buffer A med 0,5 mM MgCl2 ved 22 - 30 ° C.
    Bemærk: De nøjagtige reaktionsbetingelser kan variere med præparater af cis -PT'er, der er forskellige fra DHDDS. Desuden afhænger DHDDS 'aktivitet også af temperaturen og [Mg 2+ ].
    Forsigtig: 14 C-IPP er radioaktiv og skal anvendes i henhold til lokale strålingssikkerhedsbestemmelser. Opløs 15 μL prøver fra reaktionen ved 0, 2, 4 og 6 timer efter øjeblikkelig quenching af reaktionen ved tilsætning af 15 μl buffer A suppleret 20 mM EDTA (til en slutkoncentration på 10 mM EDTA).
  2. Tilsæt 1 ml H2O-mættet 1-butanol og vortex grundigt at udtrække reaktionsprodukterne.
    Bemærk: Protokollen kan stoppes her, og prøverne kan opbevares til senere læsning.
  3. Tilsæt scintillationscocktail til prøverne og ved anvendelse af en scintillationstæller kvantificere reaktionsprodukter i butanolfasen, der omfatter 14 ° C sammen med radioaktiviteten på 15 μl fra reaktionsblandingen, hvilket repræsenterer den totale radioaktivitet.
  4. Subtrahere baggrundsaflæsningerne målt ved hjælp af 0 h-prøverne fra hvert tidspunkt og beregne procenten af 14 C-IPP anvendt.
  5. Beregn netto 14 C-IPP-inkorporering på hvert tidspunkt ved at beregne den procentdel, der anvendes fra den samlede 14 14 C-IPP integration med tiden forventes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generel oversigt over konstruktionen anvendt her og rensningsprocessen er vist i figur 1 . Prøverne opnået ved hvert oprensningstrin er vist i figur 2 . Denne SDS-PAGE analyse viser trinvis oprensning af DHDDS, hvilket resulterer i et stærkt oprenset produkt. Figur 3 viser resultaterne af analytisk SEC af det oprensede enzym, hvilket afslører, at proteinet kun observeres som en homodimer. Figur 4 viser et repræsentativt tidsafhængigt aktivitetsassay. 14 C-IPP-inkorporering stiger tydeligt over 6 timer, hvilket verificerer, at det oprensede enzym er funktionelt.

figur 1
Figur 1: Human DHDDS-kloning og oprensning . ( B ) Oversigt over den humane DHDDS renseprotokol beskrevet her. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Oprensning af humane DHDDS . SDS-PAGE analyse af humane DHDDS affinitetsrensningstrin. Bane 1, molekylvægtmarkør (kDa); Bane 2, råekstrakt Bane 3, Co 2+ -IMAC gennemstrømning. Pil indikerer TRX-DHDDS-fusionsproteinet; Bane 4, Co2 + -IMAC-eluat; Bane 5, protein-TEV protease blanding efter overnight inkubation; Bane 6, Co 2+ -IMAC gennemstrømning efter TEV-spaltning; Bane 7, Co 2+ -IMAC-eluat efter TEV-spaltning; Bane 8, oprenset humant DHDDS (indicEfterfulgt af en pil) efter størrelseseksklusionskromatografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Analytisk SEC af oprenset human DHDDS. Tryptofanfluorescens blev overvåget som beskrevet i protokollen. Ifølge kalibreringskurven for denne kolonne danner DHDDS en homodimer (77,4 kDa). Pilen angiver tomrumsvolumen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4 : TiMigafhængig aktivitet af renset humant DHDDS. In vitro- aktivitet af oprenset humant DHDDS i reaktionen med 10 μM FPP og 50 μM 14 C-IPP som substrater udtrykkes som IPP-inkorporering pr. Protein (mol / mol). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her for rensning af funktionelle humane DHDDS i E. coli- celler er simpel og effektiv, hvilket tillader at man overudtrykker og renser proteinet i 3 - 4 dage, når en egnet konstruktion er tilgængelig. Sådanne protokoller til proteinrensning er af særlig betydning givet gennembrudene i genom-sekventering, hvilket tilvejebragte overflod af information vedrørende genetik hos mange sygdomme 18 , hvorved der kræves udvikling af høj-gennemstrømningsmetoder til karakterisering af patogene mekanismer på proteinniveauet 19 .

For at overvinde almindelige faldgruber i heterolog proteinoverekspression og oprensning blev der taget flere foranstaltninger her, hvilket er kritisk for succesfuldt at opnå opløselige og funktionelle proteiner. For det første blev DHDDS overudtrykt som en TRX-fusion. TRX letter fusionsproteinfoldningen og øger fusionsproteinopløseligheden, forhindrer inklusion bOdy formation 20 . Dernæst for at forøge proteinudbyttet blev DNA-konstruktionen optimeret til ekspression i E. coli 21 . Endelig for at yderligere reducere sandsynligheden for inklusionskropsdannelse induceredes proteinprotein ved 16 ° C for at nedsætte proteinsyntesen, sandsynligvis assisterende proteinfoldning 22 .

Under hensyntagen til homologien af cis -PT blandt forskellige arter, foreslår vi, at denne protokol kan anvendes til anden eukaryot cis -PT samt 1 . Ved anvendelse af den nuværende protokol som udgangspunkt og givet de generelle retningslinjer, der er kritiske for DHDDS-ekspression, kan denne metode modificeres for optimal ekspression af forskellige cis -PT'er. For eksempel kan man forsøge forskellige fusionspartnere (såsom maltose-bindende protein) eller yderligere optimere kulturbetingelserne for det specifikke protein, der skal studeres.

<P class = "jove_content"> Med deres biomedicinske og bioteknologiske betydning 1 , 7 , 8 , fremtidig anvendelse af den beskrevne protokol for at opnå store mængder renset funktionelle DHDDS sammen med andre cis -PT, hvilket tillader udøvelse af deres strukturelle og funktionelle karakterisering . For eksempel vil yderligere molekylære undersøgelser af DHDDS løse de mekanismer, der ligger til grund for DHDDS-relateret retinitis pigmentosa , hvilket potentielt fører til opdagelse og udvikling af nye terapeutiske fremgangsmåder. Derudover danner denne gruppe af enzymer potentielt nye mål for nye antibakterielle midler, da prokaryotiske cis -PT'er er involveret i bakterievægssyntese. Faktisk kan en grundig karakterisering af de eukaryote og prokaryote enzymer undersøgelser muliggøre den rationelle udvikling af antimikrobielle lægemidler selektive for prokaryotisk cis -PT. Endelig syntetiseres naturgummi bY medlemmer af cis -PT familien, kan den fremgangsmåde, der beskrives her, finde fremtiden i industriel syntese af naturgummi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Israels Videnskabsstiftelsens Center for Forskning Excellence (I-CORE) i Strukturel Cellbiologi (1775/12) og Israels Videnskabsstiftelse tildeler 1721/16 og 2338/16 (YH) og 825/14 (DK ). Støtten fra Fields Estate Foundation til DK er meget værdsat. Dette arbejde blev udført af Ilan Edri og Michal Goldenberg i delvis opfyldelse af MD-afhandlingskravene fra Sackler Fakultet for Medicin, Tel Aviv Universitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).

Tags

Immunologi udgave 126 kodonoptimering heterolog overekspression proteinrensning prenyltransferase dehydrodolichyldiphosphatsyntase polyprenyl
Overekspression og oprensning af mennesket<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Edri, I., Goldenberg, M.,… More

Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter