Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Overexpression וטיהור האדם Published: August 3, 2017 doi: 10.3791/56430
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,3, 1,3, 2, 2,4, 2
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול פשוט overexpression וטיהור של קודון אופטימיזציה, CIS- perrenyltransferase אדם, בתנאים שאינם denaturing, מ Escherichia Coli , מתואר, יחד עם assay פעילות אנזימטית. פרוטוקול זה ניתן להכליל לייצור של חלבונים אחרים cis- prenyltransferase בכמות ואיכות מתאים ללימודי מכניסטית.

Abstract

Prenyltransferases (PT) הם קבוצה של אנזימים כי להאיץ שרשרת הארכה של diphosphate allylic באמצעות dophosphate isopentenyl (IPP) באמצעות תגובות עיבוי מרובים. DHDDS (synthase דיפוספט dehydrodolichyl) הוא -PT cis ארוכי שרשרת איקריוטיים (להרכיב קשרים כפולים cis מן תגובת דחיסה) המזרז התארכות שרשרת של דיפוספט farnesyl (FPP, גידול דיפוספט allylic) באמצעות condensations מרובים עם דיפוספט isopentenyl (IPP). DHDDS הוא בעל חשיבות ביו רפואית, כמו מוטציה לא שמרנית (K42E) בתוצאות האנזים ב רטיניטיס pigmentosa , ובסופו של דבר מוביל לעיוורון. לכן, פרוטוקול זה פותח על מנת לרכוש כמויות גדולות של DHDDS מטוהרים, מתאים ללימודי מכניסטית. כאן, השימוש של היתוך חלבון, אופטימיזציה התנאים התרבות אופטימיזציה קודון שימשו כדי לאפשר overexpression וטיהור של DHDDS האדם פעיל מבחינה תפקודית CIS -PT בין מינים שונים מצביעה על כך שפרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם עבור CIS- eukaryotic אחרים, כמו אלה, כגון אלה המעורבים בסינתזה של גומי טבעי.

Introduction

Prenyltransferases הם קבוצה של אנזימים כי להאיץ שרשרת הארכה של diphosphate allylic באמצעות diphosphate isopentenyl (IPP) באמצעות תגובות עיבוי מרובים 1 , 2 . אנזימים מסוג Z לזרז את ההיווצרות של קשרים כפולים cis מן תגובת הדחיסה, בעוד אנזימי E-סוג מזרזי היווצרות קשר כפול טרנס 3. Cis- perrenyltransferases ( CIS -PT, Z- סוג אנזימים) מסווגים באופן קלאסי על פי אורך שרשרת המוצר שלהם לתוך שרשרת קצר (C 15 ), שרשרת בינונית (C 50-55 ), שרשרת ארוכה (C 70-120 ) 4 . DHDDS (synthase דיפוספט dehydrodolichyl) הוא -PT cis ארוך שרשרת איקריוטיים מזרז התארכות שרשרת של דיפוספט farnesyl (FPP, גידול דיפוספט allylic) באמצעות condensations המרובה עם דיפוספט isopentenyl (IPP) 1, 5 , 6 . התוצאה היא היווצרות של dhydosphate dehydrodolichyl, C 55-100 poliprenyl diphosphate המשמש מבשר עבור dolichylpyrophosphate, המולקולה המוביל glycosyl מעורב N- חלבון glycosylation 1 . בקרב היהודים האשכנזים, מוטציה שאינה שמרנית (K42E) ב- DHDDS גורמת לרטוסניטיס רסיסיבי pigmentosa 7 , 8 . לכן, הפרוטוקול הנוכחי פותח על מנת לרכוש מטוהרים DHDDS מתאים ללימודי מכניסטית.

Escherichia coli נחשב המארח הנוח ביותר וחסכוני עבור ביטוי חלבון רקומביננטי, ולכן הוא גם המארח הנפוץ ביותר. עם זאת, כאשר אחד מנסה heterologously overexpress חלבונים E. coli , חלבון ספציפי שיקולים צריך להיעשות. קבלת מקופל כראוי, פעילE חלבונים רקומביננטי מ E. coli , הוא לא עניין פשוט בשל תכונות שונות של חלבונים שונים. גישות רבות פותחו כדי להתגבר על משוכות אלה. כאן, השימוש של היתוך חלבון, אופטימיזציה התנאים התרבות אופטימיזציה קודון שימשו כדי לאפשר overexpression וטיהור של DHDDS האדם פעיל מבחינה תפקודית E. קולי . ראוי לציין, ניסיון קודם overexpress שמרים cis- PT ללא היתוך חלבון לא הצליח בשל חוסר מסיסות מלאה אפילו בנוכחות של חומר ניקוי 12 . הפרוטוקול המתואר הוא פשוט, חסכוני, זמן חוסך ומאפשר אחד כדי לקבל DHDDS ההכנות מתאים ללימודי מכניסטית. בהינתן ההומולוגיה של CIS -PT בין המינים השונים, אנו מציעים כי פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם עבור אחרים cis- eukaryotic גם כן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיבוט של CIS -PT עבור Overexpression ב E. coli

  1. השגת וקטור ביטוי pet-32b, המיועד שיבוט ביטוי ברמה גבוהה של רצפי חלבון התמזגו עם 109 thaoedoxin (TRX) חלבון 17 , ו E. coli קידון אופטימיזציה 18 רצף קידוד של אורך מלא CIS -PT.
  2. תשמור על עצמך כדי להיות אתר מחשוף TEV-פרוטאז (טבק לחרוט וירוס פרוטאז) (ENLYFQ / G, שבו "/" מציין את הנקודה מהחשוף) 9 ואחריו ומקשר גמיש קצר (SGSGSG, כדי לשפר את האתר מחשוף נגישות) במעלה זרם של CIS רצף -PT ( איור 1 א ). כמו כן, הוסף מתאים 5 'ו 3' אתרי הגבלה לשיבוט.
  3. לשכפל את הדנ"א מסונתז לבנות לתוך וקטור pET-32b באמצעות טכניקות קשירת תקן 10 .

2. OverexpreSsion של האדם DHDDS ב E. coli

  1. המרה E. coli T7 להביע תאים המוסמכת עם DXDS TRX- היתוך לבנות בהתאם להוראות היצרן.
  2. פלייט התאים השתנו בהתאם להוראות היצרן על LB אגר בתנאים סלקטיבי ampicillin (200 מ"ג / L).
  3. לחסן מושבות שנבחרו לתוך 100 מ"ל של מדיום LB ב 250 מ"ל צלוחיות Starter תרבויות עם 100 מ"ג / L אמפיצילין ו דגירה לילה ב 37 ° C עם רועד מתמיד בסל"ד 200.
  4. לחסן 80 מ"ל של התרבות לתוך שתי 5 צלוחיות L (40 מ"ל לכל בקבוק), כל אחד המכיל 1.5 ליטר בינוני YT 2x (16 גרם / L טריפטון, 10 גרם / l תמצית שמרים, 5 גרם / L NaCl) עם 100 מ"ג / L אמפיצילין.
  5. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד מתמיד ב 180 סל"ד עד להגיע OD 600 ננומטר = 0.5.
  6. מנמיכים את הטמפרטורה ל 16 מעלות צלזיוס וגורמים לתאים על ידי הוספת 0.5 מ"מ isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ConTinue דוגרים תחת אותו מצב עבור 16-20 שעות עבור ביטוי חלבון.
  7. קציר התאים על ידי צנטריפוגה (10,000 x גרם במשך 10 דקות).
    הערה: ניתן להפסיק את הפרוטוקול כאן; התאים גלולה צריך להישמר ב -80 מעלות צלזיוס עד טיהור.

3. טיהור האדם DHDDS

  1. Resuspend התאים במאגר A (25 מ"מ טריס HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 מ"מ β-mercaptoethanol), 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNase אני, תערובת מעכב פרוטאז.
  2. Homogenize התאים באמצעות homogenizer זכוכית טפלון.
  3. לשבש את התאים באמצעות microfluidizer או שווה ערך ב 12,000 - 15,000 psi 11 .
  4. צנטריפוגה lysate התא ב XG 40,000 במשך 45 דקות ב 4 ° C. לשחזר את supernatant, המכיל את החלק המסיס.
  5. טען את supernatant על 5-10 מ"ל קובלט משותקת מתכת כרומטוגרפיה זיקה (Co 2 + -IMAC) 12 טור עם 10MM imidazole, ואחריו כביסה יסודית עם חיץ ו 10 מ"מ imidazole כדי להפחית מחייב חלבון לא ספציפי.
  6. Elute את חלבונים overexpressed עם חיץ בתוספת של 250 מ"מ imidazole.
  7. הסר imidazole באמצעות טור 53 מ"ל desalting prepal equilibrated עם חיץ א.
  8. הוסף 6xHis- מתויג פרוטאז TEV (1 מ"ג TEV פרוטאז לכל 50 מ"ג חלבון) כדי חלבונים eluted להסיר 6xHis שלהם מתויג TRX היתוך חלבון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. טען את החלבונים שנקטפו על עמודה Co + 2 -IMAC, equilibrated עם חיץ בתוספת 5 imidazole מ"מ, כדי להסיר את 6x מתויג שלו מתויג TRX חלבון היתוך פרוטאז TEV.
  10. לאסוף את הזרימה דרך ולהתרכז 3 - 4 מ"ל באמצעות 30 kDa משקל מולקולרי לחתוך מסנן צנטריפוגלי.
  11. טען את החלבון מרוכזים על גבי סופרדקס-200 גודל-הטור כרומטוגרפיה עמודה equilibrated עם חיץ A לטיהור הסופי. חלבון elutes כמו דימר (~ 76 kDa). בחר שברים רלוונטיים על ידי השוואת פרופיל elution לעקומת כיול עמודה.
  12. להעריך את טוהר ההכנה באמצעות SDS-PAGE.
  13. קביעת ריכוז החלבון הדרוש לניסוי במורד הזרם ואת aliquots פלאש להקפיא של חלבונים מטוהרים מרוכזים בחנקן נוזלי בחנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

4. אנליזה אנליטית של גודל כרומטוגרפיה (SEC)

  1. כדי להבטיח את היכולת של החלבון לסבול להקפיא להפשיר מחזורי, להפשיר aliquot של חלבונים קפואים צנטריפוגות ב 21,000 x גרם במשך 10 דקות כדי להסיר אגרגטים מסיסים. לאסוף את supernatant.
  2. טען את החלבונים על עמודה אנליטית superdex-200 מראש equilibrated עם 25 מ"מ טריס HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 0.02% Triton X-100, 10 מ"מ β- mercaptoethanol, באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה 13 , 14 .
  3. צג פלואורס טריפטופן(Λ ex = 280 nm, λ em = 350 ננומטר) כדי לזהות את פרופיל elution eluting חלבונים. הקפד להיות עקומת כיול תקף להערכת משקל מולקולרי - עקומות כאלה זמינים דרך היצרנים טור ה- SEC.

5. אנזים קינטיקה - פעילות תלויית זמן 15 , 16 , 17

  1. כדי להבטיח את פעילות החלבון מטוהרים, לערבב 5 מיקרומטר של DHDDS מטוהרים עם 10 מיקרומטר FPP ו 50 מיקרומטר 14 C-IPP ליזום את התגובה במאגר עם 0.5 מ"מ MgCl 2 ב 22-30 מעלות צלזיוס.
    הערה: תנאי התגובה המדויקים עשויים להשתנות עם ההכנות של CIS -PTs שונים מ DHDDS. יתר על כן, הפעילות של DHDDS גם תלוי בטמפרטורה [Mg 2 + ].
    זהירות: 14 C-IPP הוא רדיואקטיבי ויש להשתמש בו בהתאם לתקנות הבטיחות המקומיות. משיכה 15 דגימות μL מהתגובה ב 0, 2, 4 ו 6 שעות, לאחר מרווה מיידית של התגובה על ידי תוספת של 15 חיץ μL 20 מ"ל EDTA בתוספת (לריכוז סופי של 10 מ"מ EDTA).
  2. הוסף 1 מ"ל H 2 O- רווי 1-butanol ו מערבולת ביסודיות כדי לחלץ את מוצרי התגובה.
    הערה: פרוטוקול ניתן לעצור כאן את דגימות ניתן לשמור לקריאה מאוחר יותר.
  3. הוסף קוקטייל scintillation על דגימות, באמצעות מונה נצנץ, לכמת מוצרים התגובה בשלב butanol המקיף 14 C, יחד עם רדיואקטיביות של 15 μL מתערובת התגובה, המייצג את הרדיואקטיביות הכוללת.
  4. הפחת את הקריאות רקע נמדד באמצעות 0 ד דוגמאות מכל נקודת זמן לחשב את אחוז 14 C-IPP מנוצל.
  5. חישוב נטו 14 C-IPP שילוב בכל נקודת זמן על ידי חישוב אחוז מנוצל בסך הכל 14 14 נטו C-IPP שילוב עם הזמן צפוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סקירה כללית של מבנה המשמש כאן תהליך טיהור מוצגים באיור 1 . הדגימות המתקבלות בכל שלב טיהור מוצגות באיור 2 . זה ניתוח SDS-PAGE מראה טיהור בשלבים של DHDDS, וכתוצאה מכך מוצר מטוהרים מאוד. איור 3 מציג את התוצאות של ה- SEC האנליטי של האנזים מטוהרים, חושפים כי החלבון הוא ציין רק כ homodimer. איור 4 מציג assay פעילות זמן תלוי מייצג. 14 C- שילוב IPP עולה בבירור מעל 6 שעות, אימות כי האנזים מטוהרים הוא פונקציונלי.

איור 1
איור 1: אדם DHDDS שיבוט וטיהור . ( ב ) המתאר של האדם DHDDS טיהור פרוטוקול המתואר כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: טיהור האדם DHDDS . ניתוח SDS-PAGE של האדם DHDDS טיהור זיקה צעדים. נתיב 1, סמן משקל מולקולרי (kDa); נתיב 2, תמצית גולמית; מסלול 3, Co 2 + -IMAC הזרימה דרך. חץ מציין את החלבון TRX-DHDDS היתוך; נתיב 4, Co 2 + -IMAC eluate; ליין 5, חלבון- TEV פרוטאז תערובת הבאים הדגירה לילה; נתיב 6, Co 2 + -IMAC זרימה דרך הבאים מחשוף TEV; נתיב 7, Co 2 + -IMAC eluate לאחר מחשוף TEV; נתיב 8, מטוהרים האדם DHDDS (אינדיקציהב על ידי חץ) לאחר כרומטוגרפיה הדרה גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ה- SEC האנליטית של DHDDS האדם מטוהרים. הקרינה Tryptophan היה פיקוח כפי שמתואר בפרוטוקול. על פי עקומת כיול של טור זה, DHDDS יוצר הומודימר (77.4 kDa). החץ מציין את עוצמת הוואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4 : Tiאני תלוי של פעילות מטוהרים האדם DHDDS. בפעילות חוץ גופית של DHDDS האדם מטוהרים בתגובה עם 10 מיקרומטר FPP ו 50 מיקרומטר 14 C-IPP כמו מצעים באה לידי ביטוי כמו שילוב IPP לכל חלבון (מול / מול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן לטיהור של DHDDS תפקודית האדם בתאי coli הוא פשוט ויעיל, המאפשר אחד overexpress ולטהר את החלבון ב 3 - 4 ימים לאחר מבנה מתאים זמין. פרוטוקולים כאלה עבור טיהור חלבון הם בעלי משמעות מיוחדת בהתחשב פריצות דרך ברצף הגנום, אשר סיפקה שפע של מידע לגבי הגנטיקה של מחלות רבות 18 , ובכך מחייב את הפיתוח של שיטות תפוקה גבוהה לאפיין מנגנונים פתוגניים ברמת החלבון 19 .

כדי להתגבר על המלכודות הנפוצות בביטוי יתר של חלבון הטטרולוגי וטיהור, נלקחו כאן כמה צעדים, שהם קריטיים כדי להשיג בהצלחה חלבונים מסיסים ופונקציונליים. ראשית, DHDDS היה overexpressed כמו TRX- היתוך. TRX מאפשר את קיפול חלבונים היתוך ומגביר את מסיסות חלבון היתוך, מניעת הכללה בהיווצרות 20 . לאחר מכן, כדי להגדיל את התשואה חלבון, מבנה ה- DNA היה קודון אופטימיזציה עבור ביטוי E. coli 21 . לבסוף, כדי לצמצם עוד יותר את הסבירות של היווצרות הגוף, הביטוי של החלבון היה המושרה ב 16 מעלות צלזיוס כדי להאט את קצב החלבון סינתזה, ככל הנראה מסייעת קיפול חלבונים 22 .

אם ניקח בחשבון את הומולוגיה של -PT cis בין מינים שונים, אנו מציעים פרוטוקול זה ניתן להחיל עבור cis איקריוטיים אחרים -PT גם 1. באמצעות פרוטוקול הנוכחי כנקודת התחלה, ובהינתן הנחיות כלליות קריטית ביטוי DHDDS, שיטה זו יכולה להיות שונה עבור ביטוי אופטימלי של CIS -PTs שונים. לדוגמה, אפשר לנסות שותפים פיוז 'ן שונים (כגון חלבון מחייב maltose) או להמשיך לייעל את תנאי התרבות של חלבון מסוים כדי ללמוד.

<P = "jove_content"> עם המשמעות הביו-רפואית והביוטכנולוגית שלהם 1 , 7 , 8 , שימוש עתידי בפרוטוקול המתואר כדי להשיג כמויות גדולות של DHDDS מטוהרים מטוהרים, יחד עם CIS -PT אחרים, המאפשרים את המרדף אחר אפיון המבני והתפקודי שלהם . לדוגמה, מחקרים מולקולריים נוספים של DHDDS יפתרו את המנגנונים הקשורים לדלקת רטיניטיס הקשורה ל- DHDDS, דבר שעלול להוביל לגילוי ופיתוח של גישות טיפוליות חדשות. בנוסף, כפי -PTs cis פרוקריוטים מעורבים סינתזת דופן חיידקים, קבוצה זו של אנזימים פוטנציאליים מהווה מטרות רומן לסוכני אנטיבקטריאלי חדשים. ואכן, אפיון יסודי של מחקרים אנזירוטיים ופרויקריוטים אנזימים עשוי לאפשר התפתחות רציונלית של תרופות אנטי מיקרוביאלית סלקטיבית עבור CIS- prokaryotic. לבסוף, כמו גומי טבעי מסונתז בY חברים של CIS -PT המשפחה, הגישה המתוארת כאן עשוי למצוא שימוש עתידי טבעי גומי סינתזה תעשייתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי המרכז למצוינות מחקר של מכון המדעים הישראלי (I-CORE) בביולוגיה תאית מבנית (1775/12) והקרן למדע ישראל מעניקה 1721/16 ו - 2338/16 (YH) ו - 825/14 (DK ). התמיכה של הקרן נכסי פילדס DK הוא מוערך מאוד. עבודה זו בוצעה על ידי אילן אדרי ומיכל גולדנברג בהגשמה חלקית של דרישות התזה של הפקולטה לרפואה ע"ש סאקלר, אוניברסיטת תל-אביב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).

Tags

אימונולוגיה גליון 126 אופטימיזציה של קודון overexpression heterologous טיהור חלבון prenyltransferase dhydrodolichyl diphosphate סינתזה polyprenyl
Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Edri, I., Goldenberg, M.,… More

Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter