Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Overekspresjon og rensing av menneske Published: August 3, 2017 doi: 10.3791/56430
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,3, 1,3, 2, 2,4, 2
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University
* These authors contributed equally

Summary

En enkel protokoll for overekspresjon og rensing av kodonoptimalisert human cis- fenyltransferase under ikke-denaturerende betingelser fra Escherichia Coli , er beskrevet, sammen med en enzymatisk aktivitetsanalyse. Denne protokollen kan generaliseres for produksjon av andre cis- prenyltransferase proteiner i kvantitet og kvalitet egnet for mekanistiske studier.

Abstract

Prenyltransferaser (PT) er en gruppe enzymer som katalyserer kjedeforlengelse av allylldifosfat ved anvendelse av isopentenyl-difosfat (IPP) via flere kondensasjonsreaksjoner. DHDDS (dehydrodolichyldifosfat-syntase) er en eukaryotisk langkjedet cis -PT (danner cis- dobbeltbindinger fra kondensasjonsreaksjonen) som katalyserer kjedeforlenging av farnesyldifosfat (FPP, et allylldifosfat) via flere kondensasjoner med isopentenyldifosfat (IPP). DHDDS er av biomedisinsk betydning, da en ikke-konservativ mutasjon (K42E) i enzymet resulterer i retinitt pigmentosa , som i siste instans fører til blindhet. Derfor ble den foreliggende protokollen utviklet for å erverve store mengder renset DHDDS, egnet for mekanistiske studier. Her ble bruken av proteinfusjon, optimaliserte kulturbetingelser og kodonoptimalisering benyttet for å tillate overekspresjon og rensing av funksjonelt aktive humane DHDDS i cis -PT blant forskjellige arter antyder at denne protokollen kan anvendes for annen eukaryotisk cis -PT, så vel som de som er involvert i syntetisk syntese.

Introduction

Prenyltransferaser er en gruppe enzymer som katalyserer kjedeforlengelse av allylldifosfat ved anvendelse av isopentenyl-difosfat (IPP) via flere kondensasjonsreaksjoner 1 , 2 . Z-type enzymer katalyserer dannelsen av cis- dobbeltbindinger fra kondensasjonsreaksjonen, mens E-type enzymer katalyserer trans- dobbeltbindingsdannelse 3 . cis -Prenyltransferases (cis -Pt, Z-type enzymer) er klassisk klassifisert i henhold til deres produkt kjedelengde inn i kortkjedede (C-15), middels kjedelengde (50-55 C), og langkjedede (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyldifosfat-syntase) er en eukaryotisk langkjedet cis -PT som katalyserer kjedeforlenging av farnesyldifosfat (FPP, et allylldifosfat) via flere kondensasjoner med isopentenyldifosfat (IPP) 1, 5 , 6 . Dette resulterer i dannelsen av dehydrodolichyldifosfat, et C 55-100 polyprenyldifosfat som tjener som en forløper for dolichylpyrofosfat, glykosylbærermolekylet involvert i N-koblet proteinglykosylering 1 . Blant Ashkenazi-jøder, resulterer en missens ikke-konservativ mutasjon (K42E) i DHDDS i autosomal recessiv retinitt pigmentosa 7 , 8 . Derfor ble den foreliggende protokollen utviklet for å erverve renset DHDDS egnet for mekanistiske studier.

Escherichia coli anses som den mest praktiske og kostnadseffektive verten for rekombinant proteinuttrykk, og er derfor også den mest brukte verten. Men når man forsøker å heterologt overexpresse proteiner i E. coli , bør proteinspesifikke hensyn gjøres. Skaffe riktig foldet, aktivE rekombinante proteiner fra E. coli , er ikke en enkel sak på grunn av de forskjellige egenskapene til forskjellige proteiner. Tallrike tilnærminger har blitt utviklet for å overvinne disse hindrene. Her ble bruken av proteinfusion, optimaliserte kulturbetingelser og kodonoptimalisering benyttet for å tillate overekspresjon og rensing av funksjonelt aktive humane DHDDS i E. coli . Av tone, et tidligere forsøk på å overuttrykker gjær cis -Pt uten proteinfusjonen var mislykket på grunn av fullstendig uoppløselighet selv i nærvær av vaskemiddel 12. Den beskrevne protokollen er enkel, kostnadseffektiv, tidsbesparende og tillater at man oppnår DHDDS-preparater som er egnet for mekanistiske studier. Gitt homologen av cis -PT blant forskjellige arter, foreslår vi at denne protokollen kan brukes for annen eukaryotisk cis -PT også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 . Kloning av cis -PT for overekspresjon i E. coli

  1. Hent pET-32b ekspresjonsvektor, designet for kloning og ekspansjon på høyt nivå av proteinsekvenser fusjonert med 109aa tioredoksin (TRX) protein 17 og E. coli kodonoptimalisert 18 kodende sekvens av full lengde cis -PT.
  2. Pass på å ha et TEV-protease (spaltningsbrenselprotease) spaltningssted (ENLYFQ / G, hvor "/" indikerer spaltningspunktet) 9 etterfulgt av en kort fleksibel linker (SGSGSG, for å forbedre spaltningsstedet tilgjengelighet) oppstrøms for cis -PT-sekvensen ( Figur 1 A ). Legg også til passende 5 'og 3' restriksjonsseter for kloning.
  3. Klon den syntetiserte DNA-konstruksjonen i pET-32b vektoren ved bruk av standard ligeringsteknikker 10 .

2. OverexpreSsion av Human DHDDS i E. coli

  1. Transform E. coli T7 express kompetente celler med TRX-fusion DHDDS konstruksjonen i henhold til produsentens anvisninger.
  2. Plate de transformerte cellene i henhold til produsentens instruksjoner på LB-agar under ampicillin-selektive forhold (200 mg / L).
  3. Inokulere utvalgte kolonier i 100 ml LB-medium i 250 ml flasker startkulturer med 100 mg / L ampicillin og inkuber natten over ved 37 ° C med konstant risting ved 200 rpm.
  4. Inokuler 80 ml av kulturen i to 5 liter kolber (40 ml per kolbe), hver inneholdende 1,5 liter 2x YT medium (16 g / l trypton, 10 g / l gjærekstrakt, 5 g / l NaCl) med 100 mg / L ampicillin.
  5. Inkubér kulturen ved 37 ° C med konstant risting ved 180 rpm til nå OD 600 nm = 0,5.
  6. Senk temperaturen til 16 ° C og indusere cellene ved å tilsette 0,5 mM isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG). LureTinue inkubering under samme tilstand i 16-20 timer for proteinekspresjon.
  7. Høst cellene ved sentrifugering (10 000 x g i 10 min).
    Merk: Protokollen kan pauses her; Cellepelletene skal holdes ved -80 ° C til rensing.

3. Rensing av humane DHDDS

  1. Resuspender cellene i buffer A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol), 1 μg / ml DNase I og en proteaseinhibitorblanding.
  2. Homogeniser cellene ved hjelp av en glass-Teflon-homogenisator.
  3. Forstyrre cellene ved hjelp av en mikrofluidisator eller tilsvarende ved 12.000 - 15.000 psi 11 .
  4. Sentrifuger cellelysatet ved 40.000 xg i 45 minutter ved 4 ° C. Gjenoppløs supernatanten, som inneholder den oppløselige fraksjonen.
  5. Last supernatanten på en 5 - 10 ml kobolt immobilisert metallaffinitetskromatografi (Co 2+ -IMAC) 12 kolonne med 10MM imidazol, etterfulgt av grundig vask med buffer A og 10 mM imidazol for å redusere ikke-spesifikk proteinbinding.
  6. Løs de overuttrykte proteiner med buffer A tilsatt 250 mM imidazol.
  7. Fjern imidazol ved bruk av en 53 ml preparativ avsaltingskolonne ekvilibrert med buffer A.
  8. Tilsett 6xHis-merket TEV-protease (1 mg TEV-protease pr. 50 mg protein) til de eluerte proteinene for å fjerne deres 6xHis-merkede TRX-fusjonsprotein ved 4 ° C over natten.
  9. Last de spaltede proteiner på en Co 2+ -IMAC-kolonne, ekvilibrert med buffer A tilsatt 5 mM imidazol, for å fjerne det spaltede 6x His-merket TRX-fusjonsprotein og TEV-protease.
  10. Samle gjennomstrømmingen og konsentrere seg til 3-4 ml ved å bruke et 30 kDa molekylvekts cut-off sentrifugalfilter.
  11. Last det konsentrerte proteinet på en superdex-200 størrelsesekskluderingskromatografikolonne ekvilibrert med buffer A for endelig rensing. Proteinet eluerer som en dimer (~ 76 kDa). Velg relevante fraksjoner ved å sammenligne elueringsprofilen til en kolonnekalibreringskurve.
  12. Vurder renheten av preparatet ved hjelp av SDS-PAGE.
  13. Bestem proteinkonsentrasjon som er nødvendig for nedstrøms eksperimentering og flash-fryse alikvoter av rensede, konsentrerte proteiner i flytende nitrogen og lagre ved -80 ° C til bruk.

4. Analytisk størrelse-ekskluderingskromatografi (SEC)

  1. For å sikre proteinets evne til å tåle fryse-tine-sykluser, tine en alikvot av de frosne proteiner og sentrifuge ved 21 000 x g i 10 minutter for å fjerne uoppløselige aggregater. Samle supernatanten.
  2. Last inn proteinene på en superdex-200 analytisk kolonne pre-ekvilibrert med 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol, ved anvendelse av et ultraprestasjonsvæskekromatografisystem 13 , 14 .
  3. Overvåk tryptofan fluorScence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) for å detektere proteinens eluerende elueringsprofil. Pass på at du har en gyldig kalibreringskurve for molekylvekts vurdering - slike kurver er tilgjengelige via SEC-kolonneprodusentene.

5. Enzymkinetikk - tidsavhengig aktivitet 15 , 16 , 17

  1. For å sikre at aktiviteten av det rensede protein, blande 5 uM av rensede DHDDS med 10 pM FPP og 50 pM 14C-IPP for å initiere reaksjonen i buffer A med 0,5 mM MgCl2 ved 22 - 30 ° C.
    Merk: De eksakte reaksjonsbetingelsene kan variere med preparater av cis -PT som er forskjellig fra DHDDS. Videre avhenger aktiviteten til DHDDS av temperaturen og [Mg 2+ ].
    Forsiktig: 14 C-IPP er radioaktiv og skal brukes i henhold til lokale bestemmelser om strålingssikkerhet. Trekk 15 μl prøver fra reaksjonen ved 0, 2, 4 og 6 timer etter umiddelbar slokking av reaksjonen ved tilsetning av 15 μl buffer A tilsatt 20 mM EDTA (til en endelig konsentrasjon på 10 mM EDTA).
  2. Tilsett 1 ml H2O mettet 1-butanol og vortex grundig for å ekstrahere reaksjonsproduktene.
    Merk: Protokollen kan stoppes her og prøvene kan holdes for senere lesing.
  3. Tilsett scintillasjonskocktail til prøvene, og ved bruk av en scintillasjonsteller kvantifiserer reaksjonsprodukter i butanolfasen 14 C sammen med radioaktiviteten på 15 ul fra reaksjonsblandingen, som representerer total radioaktivitet.
  4. Trekk bakgrunnsavlesningene målt ved hjelp av 0 h-prøvene fra hvert tidspunkt og beregne prosentandelen av 14 C-IPP utnyttet.
  5. Beregn netto 14 C-IPP-inkorporering ved hvert tidspunkt ved å beregne prosent brukt fra totalt 14 14 C-IPP inkorporering med tiden forventes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generell oversikt over konstruksjonen anvendt her og renseprosessen er vist i figur 1 . Prøver oppnådd ved hvert rensingstrinn er vist i figur 2 . Denne SDS-PAGE-analysen viser trinnvis rensing av DHDDS, noe som resulterer i et høyt renset produkt. Figur 3 viser resultatene av analytisk SEC av det rensede enzymet, og avslører at proteinet kun blir observert som en homodimer. Figur 4 viser en representativ tidsavhengig aktivitetsanalyse. 14 C-IPP-inkorporering stiger tydelig over 6 timer, og verifiserer at det rensede enzymet er funksjonelt.

Figur 1
Figur 1: Human DHDDS Cloning and Purification . ( B ) Utsikt over den humane DHDDS renseprotokollen beskrevet her. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Rensing av humane DHDDS . SDS-PAGE analyse av human DHDDS affinitetsrensingstrinn. Bane 1, molekylvektmarkør (kDa); Bane 2, rå ekstrakt; Bane 3, Co 2+ -IMAC gjennomstrømning. Pil indikerer TRX-DHDDS-fusjonsproteinet; Bane 4, Co 2+ -IMAC-eluat; Bane 5, protein-TEV-protease-blanding etter inkubasjon over natten Bane 6, Co 2+ -IMAC gjennomstrømning ved å følge TEV-spaltning; Bane 7, Co 2+ -IMAC-eluat etter TEV-spaltning; Bane 8, renset humant DHDDS (indikererEtterfulgt av en pil) etter størrelsesekskluderingskromatografi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Analytisk SEC av renset humant DHDDS. Tryptofanfluorescens ble overvåket som beskrevet i protokollen. I henhold til kalibreringskurven i denne kolonnen danner DHDDS en homodimer (77,4 kDa). Pilen viser tomrumsvolumet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4 : TiMegavhengig aktivitet av renset humant DHDDS. In vitro- aktivitet av renset humant DHDDS i reaksjonen med 10 uM FPP og 50 uM 14 C-IPP som substrater uttrykkes som IPP-inkorporering per protein (mol / mol). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her for rensing av funksjonelle humane DHDDS i E. coli- celler er enkelt og effektivt, slik at man kan overexpresse og rense proteinet i 3 - 4 dager når en egnet konstruksjon er tilgjengelig. Slike protokoller for proteinrensing er av spesiell betydning gitt gjennombruddene i genom-sekvensering, som ga en mengde informasjon om genetikken til mange sykdommer 18 , hvorved det kreves utvikling av høy-gjennomstrømmingsmetoder for å karakterisere patogene mekanismer på proteinnivået 19 .

For å overvinne vanlige fallgruver i heterolog protein overekspresjon og rensing ble flere tiltak tatt her, som er kritiske for å lykkes med å oppnå løselige og funksjonelle proteiner. For det første ble DHDDS overuttrukket som en TRX-fusjon. TRX letter fusjonsproteinet folding og øker fusjonsproteinløseligheten, forhindrer inklusjon bOdy formasjon 20 . For å øke proteinutbyttet ble DNA-konstruksjonen kodet optimert for ekspresjon i E. coli 21 . Til slutt, for ytterligere å redusere sannsynligheten for inklusjon kroppsdannelse, ble uttrykk av proteinet indusert ved 16 ° C for å senke proteinsyntesen, sannsynligvis assisterende proteinfolding 22 .

Tatt i betraktning homologien til cis -PT blant forskjellige arter, foreslår vi at denne protokollen kan brukes for annen eukaryotisk cis -PT også 1 . Ved bruk av den nåværende protokollen som utgangspunkt, og gitt de generelle retningslinjene som er kritiske for DHDDS-uttrykk, kan denne metoden modifiseres for optimal ekspresjon av forskjellige cis -PT. For eksempel kan man forsøke forskjellige fusjonspartnere (som maltose-bindende protein) eller ytterligere optimalisere kulturbetingelsene for det spesifikke proteinet som skal studeres.

<P class = "jove_content"> Med sin biomedisinske og bioteknologiske betydning 1 , 7 , 8 , fremtidig bruk av den beskrevne protokollen for å skaffe store mengder av rensede funksjonelle DHDDS sammen med andre cis -PT, som tillater jakten på deres strukturelle og funksjonelle karakterisering . For eksempel vil ytterligere molekylære studier av DHDDS løse mekanismene som ligger til grunn for DHDDS-relatert retinitt pigmentosa , som potensielt fører til oppdagelse og utvikling av nye terapeutiske tilnærminger. I tillegg, som prokaryotiske cis -PT er involvert i bakteriell veggsyntese, danner denne gruppen av enzymer potensielt nye mål for nye antibakterielle midler. Faktisk kan grundig karakterisering av de eukaryote og prokaryote enzymstudier muliggjøre en rasjonell utvikling av antimikrobielle legemidler selektive for prokaryotisk cis -PT. Til slutt, som naturlig gummi er syntetisert bY medlemmer av cis -PT familien, kan tilnærmingen beskrevet her finne fremtidig bruk i industriell syntese av naturgummi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Israels vitenskapsstiftelsens senter for forskningsekspertis (I-CORE) i strukturell cellebiologi (1775/12) og Israels vitenskapsstiftelse gir 1721/16 og 2338/16 (YH) og 825/14 (DK) ). Støtten fra Fields Estate Foundation til DK er høyt verdsatt. Dette arbeidet ble utført av Ilan Edri og Michal Goldenberg i delvis oppfyllelse av MD-avhandlingskravene til Sackler-fakultetet, Tel Aviv-universitetet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).

Tags

Immunologi utgave 126 kodonoptimalisering heterolog overekspresjon proteinrensing prenyltransferase dehydrodolichyldifosfat-syntase polyprenyl
Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Edri, I., Goldenberg, M.,… More

Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter